Expression chez E. coli

Bi 231: Ingénierie
des Protéines
cours 2
Plan Général
• I. Introduction et rappels.
• II. Purification des protéines.
• III. Surexpression d'une protéine.
• IV. Mutagenèse: techniques et
applications.
• V. L'insuline : exemple d'une stratégie.
• VI. Analyse d'articles.
III. Surexpression d'une protéine.
31 –Cahier des charges.
32 –Expression chez E. coli
- Avantages.
- Organisation générale d'un vecteur
- Exemples de systèmes d'expression.
- Les différentes souches de E. coli existantes
- Les paramètres ajustables lors d'une surexpression
33 –Autres hôtes bactériens : avantages et inconvénients.
34 –Expression chez la levure : Hôtes et vecteurs
disponibles.
35 –Expression dans des cellules Eucaryotes supérieures
animales et végétales.
31 Cahier des charges
(1)
définir le(s) but(s) de cette surexpression :
• tests enzymatiques => purifier la protéine tout en
conservant sa fonction
• production d’anticorps spécifiques => très
grande pureté mais fonctionnalité et structure
non nécessaire
• injection chez homme, animal => Absence
d’impureté immunogène et/ou toxique, stérilité,
absence de particules en suspension, pH, ...
(normes européennes)
31 Cahier des charges
(2)
définir l’origine et caractéristiques de la protéine
surexprimée :
• Procaryotes, Archée, Eucaryotes primitifs,
supérieurs (animal, végétal), ... => modif° post
traduct°les, code génétique (fréquence des
codons).
• Localisation cellulaire.
• Cofacteurs.
• Coexpression
En fonction de ce cahier des charges,
détermination du couple vecteur-hôte
Hôtes :
Vecteurs :
• Bactéries :
• plasmides : ADNdb circulaire
- E. coli
• bactériophages (=virus des
- autres (L. lactis)
bactéries)
• Levure (S. cerevisiae, S.
• Bacculovirus
pombe, ...)
• Sindbis Virus
• Cellules animales (insectes,
• Virus de la vaccine
mammifères).
• EBV
• Cellules végétales et
• TMV
végétaux (Arabidopsis,
OGM).
32 –Expression chez E. coli
Avantages :
• Culture rapide et facile
(x2 /20-30 minutes).
• Génétique bien connue :
- nombreux vecteurs
et souches disponibles.
• milieu de culture défini
Inconvénients :
• modifications post
traductionnelles
=> Méthode « par défaut » : la plus
simple et la mieux définie
32 –Expression chez E. coli
Composition d’un vecteur
• Promoteur
• Origine de réplication
• Site de clivage multiple (insertion du gène
• gène de résistance (sélection)
+ - Système de régulation inductible
- Séquence protéique supplémentaire (purification,
identification, ...)
- Origine de réplication autre
- gène rapporteur
- ...
32 –Expression chez E. coli
Exemples de vecteurs :pET
pET100/D/lacZ
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8836 nucleotides
T7 promoter: bases 209-225
T7 promoter priming site: bases 209-228
lac operator (lacO): bases 228-252
Ribosome binding site (RBS): bases 282-288
Initiation ATG: bases 297-299
Polyhistidine (6xHis) region: bases 309-326
Xpress™ epitope: bases 366-389
EK recognition site: bases 375-389
lacZ ORF: bases 405-3476
T7 reverse priming site: bases 3538-3557
T7 transcription termination region: bases 3499-3627
bla promoter: bases 3928-4026
Ampicillin (bla) resistance gene: bases 4027-4887
pBR322 origin: bases 5032-5705
ROP ORF: bases 6073-6264 (complementary strand)
lacI ORF: bases 7576-8667 (complementary strand)
32 –Expression chez E. coli
Exemples de vecteurs :pBAD
• Topoisomerized vector for 5-minute
TOPO® Cloning of Taq-generated
PCR products
• Enterokinase cleavage site to
remove thioredoxin after protein
purification (if desired)
• C-terminal V5 epitope for detection
and analysis with the Anti-V5
antibodies
• C-terminal 6xHis tag for rapid
purification with ProBond™ resin and
detection with the Anti-His(Cterm)
antibodies
32 –Expression chez E. coli
Exemples de vecteurs :pBAD
32 –Expression chez E. coli
Systéme Gateway®
Permet d'utiliser un
gène placé dans un
vecteur pour des
utilisations et
expressions très
différentes.
Basé la capacité de
recombinaison
spécifique du
bactériophage l.
32 –Expression chez E. coli
Exemples de vecteurs :pBAD
32 –Expression chez E. coli
Souches de Escherichia coli
Souches
But
recherché
BL21
Amplification/
Stabilité des
plasmides
Expression
de protéines
souche
DE3
DH5
DH10
TOP10
souche a-E
souche
B-T1R
souche F'
DH5αF´IQ™
Exemple : souche BL21 DE3 : F- ompT hsdSB (rB-, mB-) gal dcm rne131 (DE3)
-
F : pas de gène pour pillus; ompT: déficit en une protéase ; hsdSB (rB-, mB-)
déficit en une endonucléase ; ...
32 –Expression chez E. coli
Paramètres ajustables :
• Température  si basse certaines protéines sont
stabilisées mais tps de culture augmente beaucoup ...
• Agitation, rapport contenant/contenu  oxygénation.
• Nature du milieu.
•Types de souches (présence/absence de protéases),
co expression avec autres protéines (chaperons) 
stabilise
• ...
33 –Autres hôtes bactériens.
Rare : Bactérie exprimant des protéines ne
pouvant être produites chez E. coli
Car - cofacteur non disponible (chaîne resp.).
- surexpression homologue
- analyse génomique prot memb de
Lactococcus lactis (Kunji BBA 2003, 1610 97).