Outils bioinformatiques pour l`analyse du microenvironnement tumoral
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Outils Bioinformatiques pour l‘Analyse du Microenvironnement Tumoral • Dr. J. Galon • Matthieu CAMUS INSERM U255 Dirigée par : Pr. H. Fridman Centre des Cordeliers Paris VI Immunologie des Tumeurs Background Cellules présentatrices d’Antigènes Cellule Dendritique Stroma Facteurs de croissance Lymphocytes T Effecteurs Lymphocytes T Régulateurs, Lymphocytes B, NK, Macrophages … Cytokines Chemokines Tumeur Micro-Environnement Tumoral -> analyses à Large-échelle pour l’étude des cellules infiltrantes Colon cancer : Approaches parameters DNA MicroArrays (n=12000) 12000 patients 10 CIPHERGEN Collaboration SELDI-TOF (proteomic) FACS Functional Data (n=980) FACS Phenotype Data (n=820) APPLIED Collaboration Taqman PCR LDA (n=48) ALPHELIS Collaboration Tissue MicroArrays (TMA) (1 marqueur cellulaire, deux régions) 10 950 • Base de données (autorisation/authentification/CNIL) • Gestion des données cliniques • Gestion des données biologiques et expérimentales • Modules de connections aux appareils de laboratoire • Requêtes multicritères (listing, analyse) • Connections aux autres bases (MARS, publiques) • Connections aux logiciels d’analyse (Genesis, PathwayExporer) • Modules d’analyses et statistiques (+ 20 versions) 14.12.2005 By B. Mlecnik & R. Molidor V1.5.2 -> 1221 patients inclus -> plus de 500 000 paramètres Databases Pathways Ontology Pubmed MARS (autorisation/authentification/CNIL) DATA Connection Software Genesis TME PhAnS Query FAnS Stats v.1.5.2 14/12/2005 Pathway Explorer ClueGO Knowledge Explorer Material info Clinical info ARACNe mapper Exemple: Analyses FACS Phénotypage 50 marqueurs (Ac fluorescents) Acquisition (cytomètre) Tri (PhAnS 2.0) et stockage des données (TME.db) Analyses Statistiques (StatView, Excel) Clustering Marqueurs/Patients (Genesis) Analyses FACS CD3 SSC (MFI) CD3 (%) CD8 (forme) PhAnS2 PHENOTYPIC ANALYSIS Flow cytometry TME Tri et stockage des données FACS 416 paramètres Global representation of clustered marker expression values (% and MFI) -2 % +2 0 100 MFI 1 104 39 patients Genesis software 616 parameters Représentation et analyse des données FACS Principal Componant Analysis (PCA) Healthy donnors (in vitro stimulation) Patients (A) colon cancer Patients (B) colon cancer Healthy donnors Patients (C) Non-tumoral Analyses Bioinformatiques Vers de nouvelles approches d’analyse globale 1) Nouvelles méthodes de visualisation de groupes fonctionnels • Intégration aux voies de signalisation (PathwayExplorer) • Intégration aux données d’ontologie (ClueGO) 2) Analyse des réseaux d’interactions • Analyse de reconstruction de réseau cellulaire (ARACNe) • Analyse des interactions positive et négatives indirectes 3) Intégration automatique de la connaissance aux données • Cartographie de la bibliographie (KnowledgeExplorer) (15 millions d’articles scientifiques) • Analyse en réseau de prédiction ARACNe (algorithm for the reconstruction of accurate cellular networks) Nat Genet. 2005 (4):382-90. Reverse engineering of regulatory networks in human B cells. Basso K, Margolin AA, Stolovitzky G, Klein U, Dalla-Favera R, Califano A. Cancer Colorectal Un des cancers les plus fréquents 4ème cause de décès dans le monde (environ 500.000 décès par an) Incidence Accrue (+40% ces 20 dernières années) Background Le rôle de l’infiltrat immunitaire dans le contrôle des étapes précoces de l’invasion métastatique (VELIPI) est peu connu chez l’homme et pourrait avoir un impact important sur le devenir clinique des patients. VELIPI : venous emboli (VE) lymphatic invasion (LI) perineural invasion (PI) Observations Préliminaires Analyses univariées de survie sur la population de patients (n = 959): Overall Survival (%) 100 80 [VELIPI ]=no 60 40 20 [VELIPI ]=yes 0 0 25 75 125 175 225 Survival (months) VELIPI est un puissant facteur pronostic (p<10-9) Première Question Quelles sont les différences quantitatives et qualitatives de l’infiltrat immunitaire entre les patients présentant des signes précoces d’invasion métastatique (VELIPI+) par rapport aux patients VELIPI-? Analyses de coupes de tissus Analyses FACS Analyses PCR (Applied-Biosystems). Coupes de Tissus TUMEUR n=377 Les patients VELIPI- presentent une fréquence accrue d’infiltrat immunitaire fort par rapport aux patients VELIPI+. VELIPI VELIPI + FACS : Cellules Totales P<0.05 % positive cells 25 20 * 15 n=39 10 5 0 CD3+ CD14+ CD19+ CD56+ CD3- CD3+ CD56+ Diminution significative de l’infiltrat lymphocytaire T chez les patients VELIPI+. CD45+ CD1a+ Taqman LDA Reponse Immunitaire Adaptadive n = 75 Specific gene/18S RNA (%) 300 600 600 800 CD8a GZM-B IFN-g GNLY 600 200 400 400 400 100 200 200 200 0 0 0 0 VELIPI + + - - + + - - + + - - + + - - Relapse + - + - + - + - + - + - + - + - p<0.05 Les patients VELIPI-/récidive- présentent des réponses immunitaires adaptative plus fortes Conclusions 1 Diminution significative de l’infiltrat (lymphocytes T) chez les patients VELIPI+ par rapport aux patients VELIPI-. Corrélation entre les réponses immunitaires adaptatives conduites par les lymphocytes T CD8 effecteurs et les patients VELIPI- qui ne subiront pas de rechute. Seconde question Les lymphocytes T effecteurs et effecteurs-mémoires sont-ils directement impliqués dans le contrôle des évènement métastatiques précoces? Analyses FACS Analyses des Tissue MicroArrays (TMA) FACS VELIPI - VELIPI + CD45RO Mémoire p<0.05 Marqueurs d’expression significativement differencielle (p<0.05) Entre les patients VELIPI- et VELIPI+ Tissue MicroArrays (TMA) 2 zones représentative du centre de la tumeur sont forées à partir de blocs de tissus inclus en paraffine Les carottes sont déposées dons un bloc récepteur, ensuite découpé pour effectuer des analyses immunohistochimiques (IHC). CD45RO => 6640 IHC Tissue MicroArrays (TMA) CD45RO Tissue CD45RO Analyse de spots de tissus tumoraux par Immunohistochimie (Spot Browser®, ALPHELYS) TMA (n=415) p<0.0001 100 % Survival 80 CD45RO-hi 60 40 20 CD45RO-lo 0 0 40 80 120 160 Survival (months) Différences significatives de survie des patients en fonction de la densité (hi/lo) des lymphocytes T CD45RO+ mémoires infliltrés. Conclusions 2 Cette étude à large-échelle indique un role positif des lymphocytes T effecteurs-mémoires dans le contrôle local de l’invasion métastatique et le devenir clinique des patients. Conclusions Finales • Réseau Multidisciplinaire, approches, techniques, et bioinformatique : fonctionnel et efficace • Validation du concept et de sa faisabilité La nature et la densité de l’infiltrat immunitaire influencent les processus métastatiques précoces et le devenir clinique des patients atteint de cancers colorectaux. Perspectives 1) Quelle est l’importance de la coordination de la réponse immunitaire sur le pronostic clinique? 2) fonctionnalité des lymphocytes infiltrant les tumeurs (activation, proliferation et migration) Merci! Equipe (INSERM U255, Cordeliers) Bioinformatic Laboratory (Graz) • • Jérôme GALON, (CR) Franck PAGES, (MCU-PH) • • • • • • • Anne COSTES, (Assistante-Ingénieur) Aurélia RODI, (Technicienne) Matthieu CAMUS, (4ième année thèse) Amos KIRILOVSKY, (1ière année thèse) Marie TOSOLINI, (1ière année thèse) Pauline BERGER, (Stage Technicienne) Nicolas GOUGELET, (Stage Technicien) • • • • • Wolf-Hervé FRIDMAN (PU-PH) Departement de Chirurgie Digestive (HEGP) • Anne BERGER (PU-PH) • Paul-Henri CUGNENC (PU-PH) Robert MOLIDOR, (PostDoc) Bernhard MLECNIK, (Thèse) Thomas RAMSAUER, (Master) Fatima SANCHEZ-CABO (PostDoc) • Zlatko TRAJANOSKI (PU) Collaborations Industries • • • • Applied-Biosystems (TaqMan-LDA) Ciphergen (SELDI-TOF protéomic) Alphelys (TMA) SISPIA (Informatics) [email protected] [email protected]
