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Les techniques histologiques Ou…les principes fondateurs Les principes fondateurs 1 - Histologie = microscopie !… Mais qu’est ce qu’un microscope ?… • Un microscope est un appareil contenant une (ou une série de) lentille(s), qui grossit l’apparence d’un objet. • Une lentille est un focalisateur de rayonnement Photonique : lentille en verre Convexe Concave De particules subatomiques : lentille électromagnétique Mais qu’est ce qu’un microscope ?… • Un microscope est un appareil contenant une (ou une série de) lentille(s), qui grossit l’apparence d’un objet. • Une lentille est un focalisateur de rayonnement • Un microscope fournit une image, perçue par l’œil. Il faut donc obtenir en sortie du microscope des rayons lumineux. • Pour fournir une image perceptible, il faut que l’objet modifie le rayonnement. Il peut modifier son amplitude (intensité), sa longueur d’onde (couleur), ou sa phase. Le premier « microscope… » Janssen, 1595 Robert Hooke : l’acte de naissance de la cellule Micrographia (1665) « De la structure du liège et des cellules ou des pores de quelques corps spongieux du même genre » REFLECTION Antonin van Leeuwenhoek 1674 : « animalcules » 1683 : bactéries 1830 à 1860 : la théorie cellulaire Brown (1831) : noyau cellulaire des cellules d’orchidée Schwann (1839) : « Recherches microscopiques sur la concordance dans la structure et dans la croissance des animaux et des végétaux » TRANSMISSION Oculaire Objectif (Objet) Condensateur Source de lumière Un Olympus récent… (1998) Le premier Nikon (1900) Quel est donc le principe du microscope ?… GROSSIR… Loupe Rétine Quel est donc le principe du microscope ?… GROSSIR… Loupe Rétine Quel est donc le principe du microscope ?… GROSSIR… Objectif Oculaire Rétine Grossissement = Objectif x Oculaire Mais comment grossir ?… 10 x 100 = ?… Mais comment grossir ?… RESOLUTION Le grossissement peut se faire sans résolution... Photo de journal Photo de livre d’art 100X …si l’information initiale est insuffisante ! Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope Pour un microscope utilisant le rayonnement photonique, un grossissement de plus de 1500 fois donne une image trouble : Quelle que soit la qualité des lentilles, la résolution d’un microscope est limitée. Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope • Abbe utilise une théorie à la mode : il admet que l’image créée par un microscope est liée à des interférences entre les rayons non modifiés par l’objet, et les rayons diffractés par l’objet. • La «Rayon quantité d’information » est donc d’autant Rayon directs plus réfractés importante que des spectres de diffraction d’ordres supérieurs peuvent participer à la formation de l’image. • Les spectres secondaires sont répartis dans l’espace ; le fait de capter un plus grand nombre de rayons doit donc donner une meilleure image... Et ça marche... Le nombre de spectres secondaires récupérés par un objectif dépend de son : ouverture numérique L’ouverture numérique est le sinus de l ’angle que fait le dernier rayon qui pénètre dans l’objectif avec l’axe de celui-ci, multiplié par l ’indice de réfraction du milieu traversé par les rayons lumineux. Sinus car fonction croissante O.N. n.sin n car cela permet de modéliser les performances des objectifs à immersion… et de comprendre le prix de ces objectifs (pensez aux bords…) ou des objectifs à grande distance frontale (pourquoi ?….) ! Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope Dans ce modèle, la distance minimum entre deux points pour qu’ils soient détectés peut alors être évalué dk n.sin n.sin = ouverture numérique de l’objectif = longueur d'onde de la lumière incidente k = coefficient variant entre 0,5 et 1,22 (en fonction des capacités de l'œil, en particulier à distinguer les différences de luminosités, et de l’orientation de la source lumineuse. En règle générale, on prend k = 0,61) Les meilleurs objectifs ont une ouverture numérique de 1,4 ( = 70°, huile à immersion d’indice 1,15 ) : D’où d = 194 nm pour les radiations bleues (450 nm)… C’est la limite de résolution théorique du microscope optique Grosso modo, la résolution est limitée à la moitié de la longueur d’onde du rayonnement Université de Toronto (1938) Porter KR, Claude A & Fullam EF (1945) J. Exp. Med. 81 : 233-246 RCA scope (1956) JEOL (années 1980) Le petit dernier de Philips... UHV-TEM de Jeol Les principes fondateurs 1 - Histologie = microscopie !… 2 - Le tiercé infernal : Fixation/inclusion/contraste Problème : transmission…. Il faut passer au travers de l’objet ! D’où l’idée de le couper en tranches fines - couper implique de durcir… par congélation par inclusion paraffine plastique - inclure implique de maintenir... par fixation chimique - observer implique de contraster... par coloration générale élective par histochimie par immunocytologie D’où le déroulement classique : • • • • Fixation de l’objet Inclusion Coupe Coloration / contraste et enfin… Observation qui sera adapté - en fonction des contraintes des techniques microscopiques - en fonction du but recherché... • • • • Fixation : le pari impossible Inclusion Coupe Coloration / contraste / observation Stabiliser la structure sans l’altérer… - fixateurs coagulants (précipitants) - fixateurs non coagulants (pontants) - Méthanol, éthanol, acétone - Acide acétique, acide picrique - Composés mercurés Glutaraldehyde Formaldehyde Tétroxyde d’osmium • • • • Fixation : le pari impossible Inclusion Coupe Coloration / contraste / observation Stabiliser la structure sans l’altérer… - fixateurs coagulants (précipitants) - fixateurs non coagulants (pontants) Et leurs mélanges : Formol, liquide de Bouin, de Carnoy, de Zencker, ... Gray (1954) dresse un liste de 700 mélanges fixateurs … et précise qu’elle est très incomplète ! Fixer est un art aussi difficile que la cuisine... • • • • Fixation : le pari impossible Inclusion : réussir le melting pot Coupe Coloration / contraste / observation Enrober la structure sans la déformer… Milieu liquide qui peut se solidifier … suffisamment pour être coupé fin ! • Paraffine • Résines plastiques (Araldite, Epon, Métacrylates…) Problème… : ce sont des milieux hydrophobes ! Nécessité de déshydrater après fixation : alcool, acétone,... Inclure demande de la patience... • • • • Fixation : le pari impossible Inclusion : réussir le melting pot Coupe : jouer avec le fil du rasoir Coloration / contraste / observation Trancher la structure suffisamment fin… Optique : 5 à 20 µm Microtome couteau acier Electronique : 50 à 80 nm Ultramicrotome rasoir verre / diamant Couper demande du doigté... Les principes fondateurs 1 - Histologie = microscopie !… 2 - Le tiercé infernal : Fixation/inclusion/contraste - couper implique d’inclure - inclure implique de fixer - observer implique de contraster... 3 - Les principaux types de microscopie Optique Fond clair Contraste de phase Nomarski (contraste d’interférence différentielle) Fond noir Optique Microscopie à fond clair : colorations Hémalun - Eosine Des recettes de cuisine !!! Azan Optique Microscopie à fond clair : colorations électives Des recettes de cuisine !!! Optique Microscopie à fond clair : histochimie Problème particulier : Comment préserver l’activité enzymatique Des recettes de cuisine !!! Optique Microscopie à fluorescence Problème particulier : Comment préserver à la fois l’antigénicité et la structure... & al. : F-microscopies (FRAP, FLIP, FRET…) microscopies à effet tunnel, ... Remarques techniques… Colorants : • Affinité pour les molécules chargées négativement (acides nucléiques…) : - Les colorants sont chargés positivements (« bases ») Exemple : Hématoxyline, Hémalun, - Les structures sont dites basophiles Exemple : noyau, ribosomes (donc REG…) QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. • Affinité pour les molécules chargées positivement : - Les colorants sont chargés négativement (« acide ») Exemple : éosine QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. - Les structures sont dites acidophiles Exemple : cytoplasme Remarques techniques… Artéfacts… : • Rétraction : - espaces non colorés - lié à la fixation / déshydratation REMARQUE : tout espace non coloré… … n’est pas forcément un artéfact ! Remarques techniques… Artéfacts… : • Rétraction : - espaces non colorés - lié à la fixation / déshydratation • Stries / plis : - lié à la coupe / étalement Remarques techniques… Artéfacts… : • Rétraction : - espaces non colorés - lié à la fixation / déshydratation • Stries / plis : - lié à la coupe / étalement • Crapoteries variées et diverses… : - lié à la poussière ambiante, aux colorants, …. Electronique : transmission Coupes Ultrafines (50 à 80 nm = 10 fois la membrane plasmique…) Contraste : Sels de métaux lourds (Acétate d’uranyl, citrate de plomb) Electronique : transmission Apparté : Tomographie... QuickTime™ et un décompresseur Vidéo sont requis pour visualiser cette image. Apparté : Tomographie... QuickTime™ et un décompresseur Vidéo sont requis pour visualiser cette image. Apparté : Tomographie... QuickTime™ et un décompresseur Vidéo sont requis pour visualiser cette image. Apparté : Tomographie... QuickTime™ et un décompresseur Vidéo sont requis pour visualiser cette image. Apparté : Tomographie... QuickTime™ et un décompresseur Photo sont requis pour visualiser cette image. Apparté : Tomographie... Apparté : Tomographie... Electronique : transmission Electronique : balayage ou… le retour de la REFLECTION Electronique : balayage Electronique : balayage
