Apports des marqueurs moléculaires dans l`analyse

Dossier
mt pédiatrie 2012 ; 15 (suppl´ ement 1) : 46-61
Apports des marqueurs moléculaires dans
l’analyse des mécanismes d’acquisition et
dans le suivi des infections nosocomiales
The use of molecular markers for the analysis of initial infection and subsequent
monitoring of nosocomial infections
Philippe Bidet
Édouard Bingen
Université Paris Diderot - Paris-7,
Sorbonne Paris Cité,
Assistance publique des Hôpitaux de
Paris (AP-HP),
hôpital Robert-Debré,
service de microbiologie,
UFR de médecine,
48, boulevard Sérurier,
75019 Paris,
France
<[email protected]>
Résumé. L’investigation des cas d’infections nosocomiales s’apparente à une enquête poli-
cière, visant à retracer la diffusion d’une souche bactérienne épidémique au sein de
l’environnement hospitalier. Le laboratoire joue un rôle important dans ces enquêtes épidé-
miologiques grâce à l’analyse comparative des souches bactériennes par différentes méthodes
de typage. Du fait des nombreux inconvénients des marqueurs phénotypiques (biotypie, anti-
biotypie, sérotypage), des méthodes de typage moléculaire, analysant l’ADN lui-même, sont
préférentiellement utilisées. Ces méthodes de typage permettent de démontrer la transmis-
sion d’une même souche de patients à patients, de distinguer les récidives des réinfections,
d’identifier les voies de contaminations et de suivre la diffusion de clones au sein d’une
population.
Mots clés : génotypage, infection nosocomiale, PCR, AP-PCR, RAPD, REP-PCR, MLST, RFLP,
ribotypage, électrophorèse en champ pulsé
Abstract. The investigation of cases of nosocomial infections is similar to a police investigation,
in that the spread of a bacterial epidemic strain is traced within the hospital environment. The
laboratory plays an important role in these epidemiological studies involving comparative ana-
lysis of bacterial strains using different screening methods. Because of the many drawbacks of
phenotypic markers (biotyping, antibiotyping and serotyping), molecular screening methods,
analysing DNA itself, are promoted. These screening methods are used to demonstrate the
transmission of the same strain from patient to patient, to distinguish between recurrence and
re-infection, to identify the routes of contamination, and to track the spread of clones within
a population.
Key words: genotyping, nosocomial infection, PCR, AP-PCR, RAPD, REP-PCR, MLST, RFLP,
ribotyping, pulsed field gel electrophoresis
Le rôle du laboratoire de micro-
biologie dans un hôpital pédia-
trique ne se limite pas seulement à
l’identification des germes respon-
sables d’infections et à l’étude de
leur sensibilité aux antibiotiques. Son
activité de routine comporte égale-
ment la surveillance des infections
nosocomiales. En effet, les infections
nosocomiales représentent une cause
importante de morbidité et de morta-
lité en milieu hospitalier pédiatrique.
Chez l’enfant, la fréquence des infec-
tions nosocomiales est inversement
corrélée avec l’âge. Elle est ainsi de
22 % chez le nouveau-né, de 11 %
chez l’enfant de moins de deux ans,
4 % entre deux et quatre ans et
3 % chez l’enfant de plus de cinq
ans [1]. La survenue d’une infection
nosocomiale dans un service hospi-
talier exige une série d’investigations
afin de prévenir la survenue de nou-
veaux cas [2]. Sur le plan individuel,
il s’agira de déterminer la voie de
contamination du patient et, lors de
cas groupés, de déterminer s’il s’agit
d’une épidémie et d’en trouver la
source (figure 1) [3, 4]. Dans le cas
des infections bactériennes, les plus
fréquentes, les espèces en cause sont
principalement des staphylocoques,
des entérocoques et des bacilles à
Gram négatif. Ces espèces étant ubi-
quitaires, les voies de contaminations
peuvent être multiples : translocation
doi:10.1684/mtp.2012.0451
mtp
Tirés à part : P. Bidet
46
Pour citer cet article : Bidet P, Bingen É. Apports des marqueurs moléculaires dans l’analyse des mécanismes d’acquisition et dans le suivi des infections
nosocomiales. mt pédiatrie 2012 ; 15(suppl´ ement 1) : 46-61 doi:10.1684/mtp.2012.0451
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Le même ?
Patient A Patient B
E. coli E. coli
Cas épidémiques Cas sporadiques
non reliés
Source commune Transmission croisée
Oui Non
?
Figure 1. Démarche d’investigation des cas groupés d’infections nosocomiales.
à partir de la flore digestive, contamination de dispositifs
médicaux (sondes, cathéters, solutions injectables), trans-
mission manu-portée ou via l’environnement hospitalier
(eau, surfaces, matériel). La première étape de l’enquête
va donc s’attacher à retrouver l’espèce bactérienne en
cause dans les flores du patient et son environnement.
Cependant, ces espèces bactériennes étant fréquemment
isolées, tant comme pathogènes que comme commensaux
ou colonisateurs, la simple identité d’espèce ne permet
pas, à elle seule, de conclure sur la source de l’infection ou
l’existence d’une véritable épidémie. Il faudra démontrer
que les bactéries isolées appartiennent à un même clone,
c’est-à-dire qu’elles sont issues d’une bactérie-mère suffi-
samment proche dans le temps pour partager les mêmes
caractéristiques, liées à un même génome. Le laboratoire
doit donc aller plus loin que la simple identification de
l’espèce. Il doit être capable, au sein d’une même espèce
bactérienne, de distinguer plusieurs «types »présentant
des caractéristiques différentes grâce à des méthodes dites
de «typage ».
Caractéristiques
d’un système de typage idéal
Un système de typage bactérien a donc pour but de
mettre en évidence des caractères variables au sein d’une
même espèce bactérienne (marqueurs épidémiologiques).
Cette capacité à différencier deux souches n’ayant aucun
lien épidémiologique, qui porte le nom de «pouvoir discri-
minant », est la caractéristique la plus importante de tout
système de typage. Il peut être calculé grâce à l’indice de
Hunter qui évalue la probabilité pour que deux souches
non reliées apparaissent différentes en utilisant la méthode
de typage. On comprend bien qu’une méthode de typage
qui ne classerait les isolats qu’en seulement deux ou trois
types différents serait trop peu discriminante et conduirait
à de fausses interprétations d’identités des souches ana-
lysées. Les autres qualités recherchées pour un système
de typage sont la typabilité ou la capacité de typage (la
méthode est applicable à toutes les souches d’une espèce),
la reproductibilité (obtention de résultats identiques pour
une même souche analysée plusieurs fois), l’universalité
ou la versatilité (la méthode peut être utilisée pour typer
plusieurs espèces bactériennes différentes avec le mini-
mum de modification). Enfin, on privilégiera les méthodes
largement et facilement applicables (simples, rapides,
accessibles et peu coûteuses) et celles déjà validées en
situation pratique dans l’investigation épidémiologique.
Les marqueurs phénotypiques
Les premiers outils dont dispose le laboratoire pour
répondre à cette question sont les caractères phénoty-
mt pédiatrie, vol. 15, suppl´ ement 1, novembre 2012 47
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Apports des marqueurs moléculaires
piques les plus simples : aspect des colonies sur milieu
de culture (pigmentation, opacité, mucosité), caractères
biochimiques et sensibilité aux antibiotiques. Mais ces
caractères de base sont pauvres et trompeurs. Pauvres, car
bien souvent peu variables au sein de l’espèce. Trompeurs,
car influencés par les traitements antibiotiques rec¸us par
le patient ou les conditions de culture de la bactérie.
Pour ne prendre que la sensibilité aux antibiotiques, qui
est couramment utilisée, car immédiatement disponible,
elle n’a de sens que pour un germe ayant acquis plu-
sieurs mécanismes de résistance dont la combinaison est
peu fréquente. Mais, face à une bactérie présentant le
phénotype sauvage de sensibilité aux antibiotiques, cette
méthode n’est d’aucun secours. Et la prise d’antibiotique
par le patient peut parfois modifier le phénotype de résis-
tance chez la bactérie qu’il héberge, alors qu’il s’agit
toujours du même clone. D’autres méthodes de typage
phénotypiques peuvent être utilisées : sérotypage (anti-
gènes de surface déterminés par agglutination avec des
antisérums spécifiques), lysotypage (sensibilité aux bacté-
riophages, virus spécifiques de clones bactériens formant
des plages de lyse sur les cultures). Le lysotypage est
actuellement réservé à des laboratoires de référence qui
seuls possèdent la collection de bactériophages adéquats.
Le sérotypage et le sérogroupage sont couramment uti-
lisés pour typer les méningocoques, les salmonelles et
les shigelles. Des antisérums sont aussi à la disposition
des laboratoires pour certains sérogroupes de Escherichia
coli (antigène capsulaire K1 et antigènes somatiques des
E. coli entéropathogènes) et sérotypes de streptocoques
du groupe B. Pour les autres espèces bactériennes, la
possession d’une banque d’antisérums est l’affaire de labo-
ratoires spécialisés. Cependant, le sérotypage classique
est parfois confronté à des biais liés soit à la lecture des
agglutinations, soit à la variabilité d’expression des anti-
gènes par la bactérie selon les conditions de culture. On
voit donc que les méthodes phénotypiques, si elles ont
l’avantage de donner des résultats rapides, sont entachées
d’un grand nombre de biais et de limitations.
Ces limites ont amené les microbiologistes à dévelop-
per des méthodes d’analyse directe de l’ADN génomique
bactérien (caractéristique de la bactérie) qui, lui, reste
stable, quelles que soient les conditions de culture et les
antibiothérapies utilisées. Comme le séquenc¸age complet
du génome bactérien reste encore long et onéreux, les
méthodes de typage utilisées ne vont étudier que cer-
taines régions du génome bactérien. On parlera alors
de marqueurs moléculaires caractérisant un génotype
bactérien.
Les méthodes de typage moléculaire
On peut classer les méthodes de génotypage en trois
catégories :
–les techniques de séquenc¸age de l’ADN ;
–les techniques de restriction enzymatique ;
–les techniques d’amplification génique basées sur
la polymerase chain reaction (PCR).
Alors que les techniques de séquenc¸age donnent,
comme résultat final, une séquence d’ADN sous la forme
d’une chaîne de caractères composés des quatre bases (A,
C, T et G), les autres techniques génèrent des fragments
d’ADN de tailles différentes que l’on fait migrer dans un
champ électrique (électrophorèse en gel d’agarose ou de
polyacrylamide) afin de les séparer en fonction de leurs
tailles. Le résultat final se présente alors sous la forme
d’un profil de bandes, semblable à un «code-barres »
que l’on va comparer à celui obtenu pour une autre
souche bactérienne (figure 2). Certaines techniques vont
analyser le génome dans sa globalité, ou pour être plus
précis, inspecter différents sites dispersés sur l’ensemble
du chromosome : c’est notamment le cas des techniques
de restriction enzymatique. D’autres, au contraire, cible-
ront seulement quelques gènes, ne donnant ainsi qu’une
vision partielle ou focale du génome bactérien. Cepen-
dant, dans tous les cas, si la méthode utilisée ne montre
aucune différence entre les souches analysées, il fau-
dra toujours garder à l’esprit que des différences situées
ailleurs sur le génome, donc non étudiées, peuvent quand
même exister. C’est pour cette raison qu’il est générale-
ment conseillé d’associer plusieurs méthodes de typage
afin d’augmenter la sensibilité et d’obtenir un résultat plus
fiable.
Techniques de séquenc¸age de l’ADN
À défaut de pouvoir séquencer le génome complet
des bactéries, les techniques de génotypage basées sur le
séquenc¸age de l’ADN génomique se limitent à l’analyse
d’un ou de plusieurs gènes présentant un polymorphisme
suffisant pour être exploitable. Ces gènes peuvent être des
gènes de virulence, des gènes codant des antigènes de
surface (on parle alors de sérotypage moléculaire) ou des
gènes dits «de ménage »codant des fonctions de base
de la cellule. Les séquences d’ADN obtenues pour un
même gène chez les différentes souches sont alignées et
comparées afin de repérer des mutations, des délétions
ou des insertions qui les différencieraient. La tech-
nique de multi-locus sequence typing (MLST) combine
le séquenc¸age de plusieurs gènes de ménage (générale-
ment sept) afin d’analyser l’évolution d’une espèce sur
une longue période de temps [5]. Cette méthode permet
de classer les souches en «sequence types »(ST), regrou-
pés en groupes ou complexes clonaux, et est devenue la
méthode de référence pour les études phylogénétiques de
collections de souches [6]. Malgré leur grande fiabilité,
et les comparaisons interlaboratoires qu’elles permettent,
les méthodes de génotypage basées sur le séquenc¸age
présentent plusieurs inconvénients qui limitent leur utilisa-
48 mt pédiatrie, vol. 15, suppl´
ement 1, novembre 2012
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Restriction enzymatique PCR
ADN bactérien
Fragments d’ADN
Séparation des fragments selon
leur taille par électrophorèse
Séquençage des
produits de PCR
s1 s2 s3
-
+
ACTGGTCATTGA
ACTGGTCATTGA
ACTG-TCATCGA
s1
s2
s3
Comparaison des profils de bandes Comparaison des séquences
Figure 2. Principe général des méthodes de génotypage bactérien.
tion dans le typage des bactéries responsables d’infections
nosocomiales. Elles sont d’abord limitées à une seule
espèce bactérienne, ce qui oblige le laboratoire à chan-
ger de méthode pour chaque nouvelle espèce. Ce premier
inconvénient les confine à quelques laboratoires spéciali-
sés effectuant des travaux de recherche sur l’espèce en
question. Elles n’étudient qu’une toute petite partie de
l’ensemble du génome bactérien. Aussi, si elles ne révèlent
aucune différence de séquence sur les gènes étudiés,
cela n’exclut pas que des différences importantes existent
ailleurs sur le génome des bactéries comparées, d’où un
pouvoir discriminant inférieur à celui d’autres méthodes
d’analyse globale du génome comme l’électrophorèse en
champ pulsé. Il existe cependant des cas où un gène peut
présenter un polymorphisme exploitable pour le typage
alors que les techniques d’analyse globale du génome ne
parviennent pas à différencier des souches non reliées,
notamment lorsqu’elles appartiennent à un clone de dif-
fusion mondiale comme c’est le cas des streptocoques du
groupe A de sérotype M1 [7]. Dernier inconvénient de
ces techniques, elles restent encore onéreuses et d’accès
difficile pour beaucoup de laboratoires qui, obligés de
sous-traiter le séquenc¸age proprement dit, n’obtiennent
de résultats que tardivement. Ces inconvénients limitent
donc, jusqu’à présent, l’utilisation de ces méthodes à des
laboratoires de recherche.
Techniques de restriction enzymatique
On appelle «enzyme de restriction »une enzyme
capable de couper l’ADN double brin en des sites spé-
cifiques caractérisés par une séquence d’ADN de quatre à
huit bases. Ces séquences sont généralement des palin-
dromes, c’est-à-dire que la séquence est identique sur
le brin sens et sur le brin antisens. Sur un ADN géno-
mique, une enzyme de restriction va réaliser des coupures
à chaque fois que la séquence du site spécifique est recon-
nue. Le nombre de coupures varie donc selon les enzymes
et dépend de la fréquence avec laquelle le site reconnu est
présent. La taille et le nombre de fragments d’ADN obte-
nus après digestion sont donc un reflet de la séquence
globale du génome digéré. Ces fragments sont séparés
en fonction de leurs tailles par électrophorèse en gel
d’agarose. Après marquage de l’ADN par un agent interca-
lant fluorescent aux ultraviolets (bromure d’éthidium), on
obtient un profil de bandes, spécifique du génome digéré,
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Apports des marqueurs moléculaires
- RFLP : coupures en nombreux fragments
- Ribotypage : hybridation des fragments codant pour l’ARNr 16S et 23S (sonde)
- Électrophorèse en champ pulsé : coupures en peu de fragments
Figure 3. Techniques basées sur la restriction enzymatique de l’ADN.
semblable à un «code-barres ». Les différents profils sont
comparés deux à deux et l’identité de profil entre deux
souches bactériennes permet de conclure à l’identité (ou
la très forte similitude) de leurs génomes donc à un lien
génétique entre les deux souches.
Cette technique simple et peu coûteuse, qui analyse le
polymorphisme de longueur des fragments de restriction
(restriction fragment length polymorphism [RFLP]), a, dans
un premier temps, utilisé des enzymes à haute fréquence
de site de coupure qui généraient un grand nombre de
fragments d’ADN sur un génome bactérien composé de
plusieurs millions de paires de bases [8]. Cela rendait donc
difficile la comparaison des profils du fait d’un nombre de
bandes trop important (>1 000). Pour améliorer la lisibi-
lité des profils, on a donc cherché à réduire le nombre
de bandes des profils, soit en ne rendant visibles que
certaines bandes par des techniques d’hybridation avec
sondes ADN (technique de Southern et ribotypage), soit en
diminuant le nombre de sites de coupure (électrophorèse
en champ pulsé) (figure 3).
Technique de Southern et ribotypage
La technique de Southern consiste à transférer, sur
une membrane de nylon, les fragments d’ADN obtenus
après restriction enzymatique et à les hybrider avec une
sonde ADN (ou ARN) marquée soit par un atome radio-
actif (sonde chaude), soit par une enzyme capable de
transformer un substrat en molécule colorée ou émet-
trice de lumière (sonde froide). On utilise généralement
un film radiographique pour révéler les fragments sur les-
quels la sonde s’est fixée. La sonde ne se fixant que sur
les fragments d’ADN comportant la séquence complé-
mentaire, il y aura autant de fragments rendus visibles
que de copies du gène reconnu par la sonde. Comme
de nombreuses espèces bactériennes possèdent plusieurs
copies des gènes des ARN ribosomaux (ARNr) sur leur
chromosome (par exemple, sept pour E. coli), l’ARNr mar-
qué peut avantageusement servir de sonde. La technique
prend alors le nom de ribotypage [9]. Cette technique
a l’avantage d’être universelle car, les gènes des ARNr
ayant peu évolué au cours du temps, la sonde d’une
50 mt pédiatrie, vol. 15, suppl´
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