TP de Microbiologie Générale (MBG) 2010 Université de Nice Sophia-Antipolis, Faculté des Sciences, LSV2 Travaux Pratiques de Microbiologie Générale MBG, LSV2 2 TRAVAUX PRATIQUES J0 (TP1) Conseils généraux *Le port de la blouse est obligatoire * Apporter une pince fine et un marqueur permanent (pointe fine) * Travailler dans des conditions d’asepsie près de la source de chaleur et en reproduisant les gestes du démonstrateur. Par exemple : comment tenir le tube, le bouchon, la pipette ou l'anse de platine utilisée pour l'ensemencement. * Repérer les boîtes de chaque binôme à l'aide de vos initiales sur le fond de la boîte. A- Croissance d'Escherichia coli en milieu liquide a) Etude cinétique de la croissance bactérienne Il s'agit d'étudier la croissance d'E. coli dans différentes conditions, en milieu liquide non renouvelé. Une suspension d'E. coli, souche DG1, obtenue par culture dans du LB durant une nuit à 37°C (culture mère) est fournie à chaque groupe. Trois conditions de culture seront comparées : tube : milieu riche LB tube : milieu riche LB + NaCl 0,6 M (à préparer) tube : milieu minimum M63 (à compléter avec du Glucose, du MgSO4 et de la thiamine) Chaque tube contient 4 mL de milieu. 1) A t = 0, inoculer à 2% chaque tube, agiter (vortex) et mesurer la DO600 nm 2) Placer les tubes sous agitation à 37°C. 3) Toutes les 30 minutes, mesurer la DO600 nm (les tubes sont vortexés puis introduits dans le spectrophotomètre). Attention, le zéro optique de l'appareil sera effectué par les enseignants avec le milieu correspondant sur les spectrophotomètres. Résultats Tracer les trois courbes de croissance (DO = f (t)) sur papier semi-logarithmique et compléter ce graphe. Déterminer les paramètres de la croissance (g et µ). Conclure. b) Numération bactérienne Pour connaître le nombre de bactéries de la culture, on procède à l'étalement sur milieu gélosé LB de la suspension. On ne peut pas compter plus de quelques centaines de colonies : il faut donc effectuer des dilutions sérielles. 1) Prélever stérilement 100 µL de la culture mère d'E. coli DG1. Travaux Pratiques de Microbiologie Générale MBG, LSV2 3 2) Diluer stérilement de façon sérielle (de 10 en 10) dans un volume final de 1 mL dans le milieu LB stérile jusqu'à la dilution 10-7. (Voir démonstration). 3) Etaler stérilement 100 µL des dilutions 10-5, 10-6, 10-7 sur boîte de milieu LB. 4) Mettre les boîtes à incuber à 37°C pendant 24 heures, en position inversée (couvercle en bas) pour empêcher l'eau de condensation du couvercle de couler sur le milieu gélosé. Résultats J+1 (lecture au TP2) Dénombrer les colonies bactériennes et en déduire le titre de votre culture (nombre de bactéries par ml). Déterminer le nombre moyen de bactéries par ml pour une DO600 nm = 1. B) Réalisation d'un antibiogramme par la méthode de diffusion en milieu solide : Méthode des disques. On veut mesurer la zone d'inhibition de la croissance bactérienne autour d'un « comprimé » d'antibiotique déposé à la surface d'un milieu de culture gélosé. Voir pour la notion de CMI en TP. 1) Diluer stérilement au 1/10 la culture mère d'E. coli DG1 (on prendra la dilution faite pour la numération). 2) Déposer 100 µL sur une boîte de milieu LB. 3) Faire un étalement à l'étaloir (râteau). (Voir démonstration). 4) Application des disques : poser les disques à environ 2 cm de la périphérie de la boîte en appuyant légèrement pour assurer le contact avec le milieu. Les disques contiennent : 30 µg d’ampicilline (Amp30); 30 µg de rifampicine (Rif30); 100 µg de kanamycine (Kan100); 40 µg de bacitracine (B40), 60 µg de chloramphénicol (Cm60). 5) Laisser la boîte 30 minutes sur la paillasse puis incuber à 37°C pendant 24 heures Résultats J+1 (lecture au TP2) Mesurer le diamètre de la zone d'inhibition pour chaque antibiotique et pour chaque concentration. Conclure pour B. subtilis et E. coli. C) Ré-isolement de souches à partir d’une population mixte et étalement d’un prélèvement buccal On réalisera un isolement de souches à partir d'une suspension bactérienne contenant une population mixte de bactéries dans le but d’obtenir des souches « pures ». 1)- Faire un prélèvement avec l'ensemenceur (fil de platine) et un étalement selon la méthode des stries ou des cadrans (ci-après) sur une boîte de milieu LB gélosé. 2)- Utiliser un coton hydrophile sur la langue et ensemencer la boîte de milieu gélosé LB (même technique). 3) - Incuber les boîtes à 37°C pendant la nuit. Résultats à J+1 (TP2) Après incubation de la boîte, que peut-on conclure ? Travaux Pratiques de Microbiologie Générale MBG, LSV2 4 Deux colonies d’aspect différentes seront utilisées pour effectuer une coloration de Gram. Fig.1 Méthode des stries Fig. 2 Carte du plasmide pBS D) Préparation du TP2 a) Réplique sur tampon de velours. - Inoculer les 5 souches bactériennes (fournies par les enseignants) sur une boîte de milieu LB préalablement orientée et divisée en cinq secteurs. Cette boîte servira de "boîte mère" pour les répliques sur tampon de velours. Souches DG1, C600, Hfr P4x6, 2000x74M et PA504. Boîtes pour le TP2 - Les 10 postes couleront soit du milieu LB (300 ml pour 12 boîtes), soit du milieu M63 glucose (250 ml pour 10 boîtes) dépourvu d’histidine (« his »), de proline (« pro ») ou de leucine (« leu »), soit du milieu LB contenant de l'ampicilline (100 µg/ml). Ces milieux gélosés seront fournis à l'état surfondu (45°C) par les enseignants. - Laisser refroidir les boîtes sur les paillasses. b) Préparation de cellules compétentes d'E. coli par traitement au CaCl2 But : E. coli est largement utilisée en génie génétique pour le clonage de fragments d’ADN et la production de protéines hétérologues. Un moyen couramment utilisé pour introduire de l’ADN exogène, le plus souvent sous forme d’un plasmide circulaire, dans le cytoplasme d’E. coli (et non dans le chromosome !) est d’utiliser la transformation bactérienne. On se propose d’introduire un ADN plasmidique , le pBluescript II-KS+ ou pBS (Fig. 2) qui porte un gène conférant la résistance à l'ampicilline (AmpR) chez E. coli. Les cellules ayant reçues ce plasmide ou transformants seront dénombrées ultérieurement (à définir avec les enseignants). Principe de la préparation de cellules artificiellement compétentes : Les cellules d'E. coli sont cultivées jusqu'en phase exponentielle puis concentrées par centrifugation. Ces cellules sont rendues compétentes pour la transformation par resuspension dans une solution de chlorure de calcium. En présence d'ions calcium, les cellules sont capables d'ingérer des petites molécules d'ADN, comme un plasmide. Revoir les notions en TP. Travaux Pratiques de Microbiologie Générale MBG, LSV2 5 1) Une culture bactérienne d’E. coli à DO600nm = 0,4 de volume « Vi » (volume initial) sera fournie au cours du TP. 2) Centrifuger cette suspension bactérienne 5 min à 3000 rpm à 4°C. Jeter le surnageant stérilement et délicatement. 3) Resuspendre délicatement le culot bactérien par la moitié du vol. initial de culture (1/2 Vi) par du CaCl2 50 mM pré-refroidi à 4°C. Attention : les cellules doivent toujours rester à 4°C jusqu’à la transformation à J+1 4) Incuber dans la glace pendant 20 min. 5) Centrifuger 5 min à 3000 rpm à 4°C. Jeter le surnageant stérilement et délicatement. 6) Resuspendre délicatement le culot bactérien par le dixième du vol. initial de la culture (1/10 Vi) par du CaCl2 50 mM (4°C) et stocker au froid jusqu’à utilisation à J+1 TRAVAUX PRATIQUES J+1 (TP2) A) Transformation plasmidique d'E. coli. a. Principe de la transformation : Un choc thermique facilite l'entrée de l'ADN plasmidique dans les cellules d'E. coli rendues artificiellement compétentes. Les cellules traitées sont cultivées dans un milieu liquide non sélectif afin d'obtenir la synthèse de la protéine qui confère la résistance à l'antibiotique puis elles sont sélectionnées sur un milieu LB solide additionné d'antibiotique afin d'identifier les cellules qui contiennent l'ADN plasmidique. 1) - Repérer le tube à hémolyse contenant 10 ng d'ADN plasmidique dilué dans 10 µL d'H2O qui est placé sur la glace (tube à capuchon rouge) et laisser décongeler sur glace les cellules compétentes contenues dans le tube eppendorf 1,5 mL. Attention : un essai témoin « sans ADN » sera réalisé, en suivant exactement la même procédure décrite ci-dessus, mais sur un tube à hémolyse ne contenant pas d’ADN au départ 2) - Transférer 100 µl de cellules décongelées dans le tube contenant l'ADN plasmidique (manipulation en condition stérile). Mélanger doucement (ne pas vortexer). Garder le reste de cellules compétentes présentes dans le tube eppendorf pour effectuer l’étape (b). 3) - Placer le mélange ADN/cellules 30 minutes sur la glace. 4) - Provoquer un choc thermique en plaçant le tube dans un bain marie à 42°C pendant exactement 45 secondes. 5) - Ajouter stérilement 900 µL de milieu LB stérile. Mettre en culture les bactéries transformées à 37°C sous agitation pendant 1 heure. 6) - Sortir, après 1 heure d'incubation à 37°C, les cultures de cellules transformées et témoin. Prélever Travaux Pratiques de Microbiologie Générale MBG, LSV2 6 stérilement 100 µL du tube contenant les bactéries ayant subies la transformation et effectuer stérilement des dilutions sérielles de 10 en 10 jusqu'à 10-2 dans du LB. 7) - Etaler stérilement 100 µL des dilutions 10-1, 10-2 (dilutions des cellules « transformées » ci-dessus) et 100 µL de la suspension bactérienne du tube témoin sur boîte contenant le milieu LB + Ampicilline (100 µg/ml). b. Mesure de la DO600nm d’une dilution de la suspension de cellules compétentes. Effectuer non stérilement une dilution de 100µL de la suspension de cellules compétentes avec 900 µL de LB dans une cuve spectrophotométrique et lire la DO600 nm de la culture de cellules compétentes ainsi diluées. Résultats (Voir avec les enseignants pour la date) Déterminer à partir du coefficient calculé au cours du TP2 (nombre moyen de bactéries par ml pour une DO600nm = 1), le titre de la culture de cellules compétentes fournie. Calculer le nombre total de bactéries transformées résistantes à l'ampicilline. Déterminer le pourcentage de bactéries compétentes transformées. Exprimer le nombre de bactéries transformées par microgramme d'ADN. B) Caractérisation de souches par réplique sur tampon de velours. A F B E D Boîte mère C Après incubation à l’étuve Boîte de milieu sélectif Empreinte de la boîte mère tampon velours stérile A partir de la boîte inoculée lors du premier TP, vous allez tester 5 souches bactériennes et caractériser leur phénotype. Les répliques sur des boîtes de milieux sélectifs s'effectuent à l'aide d'un tampon de velours qui servira d'empreinte de la boîte "mère". On fera toujours coïncider le repère des boîtes ("mère" ou de milieu sélectif) avec celui du tampon de velours. (Voir démonstration). Travaux Pratiques de Microbiologie Générale MBG, LSV2 On effectue des répliques sur 3 milieux sélectifs: 1) M63+glucose +his+pro 2) M63+glucose +leu+pro 3) M63+glucose +leu+his 7 Phénotypes correspondants LeuHisPro- Résultats (Voir avec les enseignants pour la date) : Donner le phénotype de chaque souche C) Préparation de 2 types de coloration et identification de souches bactériennes a) Préparation des lames avant coloration: 1) - Nettoyer très soigneusement la lame à l'eau distillée puis à l'alcool et enfin la passer dans le bec bunzen électrique. Laisser refroidir la lame. 2) - Etaler avec l'anse de platine une gouttelette de culture. Sécher en agitant la lame au dessus de la source de chaleur sans la chauffer (env. 20-30 cm). 3) - Fixation : Verser quelques gouttes d'alcool sur la lame, égoutter, flamber et éteindre immédiatement. (Voir démonstration). b) Coloration de Gram (I) pour E. coli et Bacillus subtilis Faire agir successivement: (Voir démonstration). 1) - Violet de gentiane : quelques gouttes à verser sur la lame. Colorer 1 minute. 2) – Lugol : entraîner le violet avec un excès de Lugol. Laisser agir 45 secondes, puis laver à l'eau. 3) – Différenciation : décolorer à l’alcool/acétone (qui va décolorer les Gram -) et laver à l’eau. 4) - Recolorer à la safranine 30 secondes, puis laver à l'eau distillée et sécher. 5) - Observation au microscope optique (bactéries violettes = Gram +, roses = Gram -). c) Coloration d'un étalement de yaourt au Bleu de méthylène (II). 1) - Etaler du yaourt dans une goutte d'eau et fixer comme décrit plus haut. 2) - Colorer une dizaine de secondes au Bleu de méthylène, puis laver à l'eau distillée. 3) - Observation au microscope optique des différentes bactéries: Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus. (Vous avez les noms des bactéries en Latin). d) Etat frais avec coloration à l’encre de chine (III). Sur E. coli et Bacillus subtilis, faire un état frais et observer au microscope après montage entre lame et lamelle et coloration à l’encre de chine. (Voir démonstration). COMPOSITION DES MILIEUX UTILISES Milieu minimum M63 glucose pH 7,0 KH2PO4 13,6 g/l KOH 4,2 g/l (NH4)2SO4 2 g/l FeSO47H2O 1,08 mg/l Thiamine 1 mg/l Milieu complet LB pH 7,0 Bactotryptone 10 g/l extrait de levures 5 g/l NaCl 5 g/l ± Agar 1,5 g/l Travaux Pratiques de Microbiologie Générale MBG, LSV2 MgSO4,7H2O Glucose ± Agar 246 mg/l (1 mM) 4 g/l 1,5 g/l 8