biologie moléculaire, maldi-tof
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XIX ème journée de Microbiologie Clinique du COL.BVH QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. Place des nouveaux outils dans le diagnostic des bactériémies : Biologie moléculaire, MALDI-TOF-MS Etienne Carbonnelle Service de Microbiologie HEGP Paris Vendredi 20 juin 2014 Conflit d’intérêt : • Actionnaire chez ANDROMAS Suspicion clinique de bactériémie Diagnostic Techniques idéales Identification Rapide Faible coût Sensible Spécifique Universelle Simple Résistance aux anti-microbiens Meilleure prise en charge Antibiothérapie ciblée et adaptée Limiter la transmission (BMR, MST, …), gérer l’isolement Durée d’hospitalisation Apport de la biologie moléculaire Ce qui se dit : Rapidite Indépendant du traitement antibiotique Sensible Intérêt pour la détection des champignons 2006-2007 : Septifast Multiplex PCR Temps réel Mussap M,et al., J Chemother. 2007 Oct;19 Suppl 2:31-4. Les hémocultures vont elles disparaître ? Diagnostic moléculaire des bactériémies Sang Sérum +/- pré-culture (quelques heures) Hémoculture aérobie/anaérobie résine/charbon PCR Temps réel spécifique Multiplex PCR Temps réel FISH Puce PCR/Hybridation PCR/Séquençage PCR/ESI-MS Culture : ATBg et Id PCR Temps réel spécifique (Coxiella, Bartonella, Brucella, …) Multiplex PCR Temps réel PCR/Electrophorèse PCR/Séquençage Liesenfeld et al., Eur J Microbiol Immunol, 2014 Délai de rendu des résultats en fonction des techniques de diagnostic des bactériémies Liesenfeld et al., Eur J Microbiol Immunol, 2014 PCR en temps réel : Septi Fast (Roche) ~ 160 € Limites de la biologie moléculaire Faux négatifs Extaction Présence d’inhibiteurs Faible inoculum Faible volume Faux positifs Persistance d’ADN bactérien Contaminations Bactériémie post prandiale Non adapté aux prélèvements polymicrobiens Panel de microorganismes identifiables restreint Peu de détection de la résistance aux antibiotiques Ne renseigne pas sur le caractère viable des microorganismes Absence de validation clinique Evaluation clinique Utilisable en routine ? http://www.microbe-edu.org/ Pr. A. Philippon http://www.microbe-edu.org/ De la galerie happy…. ….à la spectrométrie de masse 1970 2010 Identification bactérienne Aspect des colonies Examen direct Coloration J1 J1 Place du MALDI-TOF ? Identification phénotypique J2 ou + Résistance Sérologie Autres BM Identification bactérienne, antibiogramme H24 : 2 minutes Tests phénotypiques H48 ou + Résistance Sérologie Autres BM Identification bactérienne, antibiogramme Identification Micro-organisme Antibiogramme Exemple d’identification bactérienne à partir de colonies entières Dépôt des échantillons Acquisition des spectres Analyse des spectres Banque de données Transfert des données au système informatique du laboratoire Identification A1 : Klebsiella pneumoniae A2 : Staphylococcus saprophyticus A3 : etc….. Source MALDI Grille d’extraction + ++ + + Détection + + + + + + + + + + + ++ + + x Désorption Ionisation 10-30 kV Zone d’accélération -20 kV Zone de vol libre de champ Détecteur linéaire Intensité relative Cible métallique Irradiation laser TOF matrice analytes Analyseur TOF m/z TOF : Time Of Flight D’après les feuillets de Biologie VOL N° 295 - JUILLET 2010 Empreintes spectrales obtenues à partir de colonies entières de cinq espèces bactériennes différentes (Matrice -CHCA). Utilisation en routine Laboratoires équipés de MALDI-TOF-MS Toutes les identifications - soit sur colonies - soit directement à partir de Prélèvements - Hémocultures - Urines - ... Les difficultés Phase pré-analytique Suspension de protéines issues de bactéries et des protéines “contaminantes” Limites du MALDI-TOF MS : ne reconnait que les protéines majoritaires Flacon d’hémoculture, les protéines majoritaires sont: Protéines du globule rouge : hémoglobine Protéines du sang, du pus, de l’urine etc… Présence de résine ou de charbon Masquent les protéines des bactéries Nécessité de concentrer les bactéries Obligation de séparer les bactéries des autres constituants avant d’extraire leurs protéines et/ou améliorer l’extraction de leurs protéines Les premiers résultats • • • • • Bactec 9240, Bactec + aerobic et Lytic 10 anaerobic Centrifugation basse vitesse de 1.5ml pendant 5 min. Surnageant mélangé avec 1m d’eau distillée stérile Centrifugation haute vitesse pendant 5 min. pour culoter les bactéries 5µl of d’agent d’extraction pendant 5 min. • • Protocole 1: TFA Protocole 2: acide formique Centrifugation haute vitesse 2 min pour retirer le matériel non lysé Identification OK si > 2/4 spots avec score >1.9 D’après B. La-Scola Les premiers résultats • 584 flacons d’hémoculture testés (resultats comparés à l’identification MALDI-MS sur colonies et/ou phenotypique) • 562 flacons avec un seul morphotype au Gram sur le flacon • Protocol 1 TFA: • • • Protocol 2 acide formique: • • • Gram - : 87/100 (87%) identified Gram +: 94/140 (67%) identified Problèmes: • • • Gram -: 117/124 (94%) identified Gram +: 72/197 (37%) identified Une seul mauvaise identification (S. marcescens identifié comme A. hydrophila) Peu efficace pour les Streptococcus sp. (4/17, 23%) Lent!!!…. D’après B. La-Scola Détection des micro-organismes à partir des prélèvements : les hémocultures D’après M. Drancourt, CMI 2010 L’optimisation • Comparaison aux protocoles existants Gram positive Gram negative Overall (n = 31) (n = 91) (n = 122) Protocol 6 26 (83.8%) 89 (97.8%) 115 (94.3%) LaScola et al. (14) 16 (51.6%) 80 (87.9%) 96 (78.7%) Ferroni et al. (9) 20 (64.5%) 44 (48.3%) 64 (52.5%) Greub et al. (19) 18 (58.1%) 12 (13.2%) 30 (24.6%) Ferreira et al. (8) 19 (61.3%) 17 (18.7%) 36 (29.5%) Stevenson et al. (22) 19 (61.3%) 9 (9.9%) 28 (23%) D’après B. La-Scola Protocole HEGP Utilisation en routine : sur hémoculture et urine Carbonnelle et al, Réanimation 2012 Mycose, April 2014 A partir des hémocultures : PNA-FISH YTL/Sepsityper/Culture MALDI ITS rRNA seq 50 hémocultures positives à levures au Gram PNA-FISH YTL : 48 (96%) (littérature : entre 96 et 99%) MALDI Sepsityper : 28 (56%) score >1.8 (littérature : 42 à 50%) 38 (76%) score >1.5 Amélioration à faire sur le MALDI Sepsityper Hémocultures et MALDI-TOF Efficace dans l’ensemble Différents protocoles validés (commerciaux et maison) En routine dans certains laboratoires MAIS Prend du temps technique Opérateur dépendant Peu efficace sur les mélanges Mêmes difficultés que pour les identifications sur colonies Plus mauvais résultats sur les flacons avec charbon Identification après une courte incubation sur milieux solides 1 goutte Flacons détéctés positifs Incubation pendant 3 à 6h sous CO2 CMI, 15 may 2014 165 Hc, 28 espèces différentes, 10 cultures polymicrobiennes, 13 faux positifs SepsiTyper kit Id espèce : 52,6% Id genre : 71,1% Toutes espèces confondues Résultats : D’après J-B. Zabbe, L. Zanaro, F. Mégraud, E. Bessède Laboratoire de Bactériologie, CHU de Bordeaux Résultats présentés aux JNI, juin 2014 300 flacons ont été inclus, dont 17 faux positifs et 5 polymicrobiens Les identifications sont présentées par rapport à l’identification finale Pour 168 : score > 2 Pour 42 : score > 1,7 Pour 68 : score < 1,7 -73/126 Staphylococcus sp. -72/78 Entérobactéries -1/8 Levures -9/15 Streptococcus sp. -2/5 Pseudomonas sp. -1/1 Acinetobacter sp. -2/3 Bacillus sp. -8/9 Enterococcus sp. -29/126 Staphylococcus sp. -3/78 Enterobactéries -2/10 Anaérobies -4/15 Streptococcus sp. -2/5 Pseudomonas sp. -1/3 Bacillus sp. -1/9 Enterococcus sp. -44/126 Staphylococcus sp. -3/78 Entérobactéries -8/10 Anaérobies -7/8 Levures -2/2 Corynebactéries -2/15 Streptococcus sp. -1/5 Pseudomonas sp. -Autres : 1 59% 14% Espèce Genre 24% Absence d’identification JCM 2012, 50(7)2441-2443 A : Méropénème B : Témoin – C : E. coli NDM-1 D : A. baumanii NDM-1 -26 +18 A B C D 358,5 384,4 406,4 424,5 February 2014, vol 9, Issue 2 Temps : 11,4 vs 56,3h En cours d’étude Détection mecA pour les S. aureus (Cepheid, Alere) Tests rapides résistance antibiotiques Identification Détection BLSE pour les entérobactéries Quel impact dans la prise en charge clinique ? CID 2013:56 (15 april) Conclusions Nouvelles approches techniques Biologie Moléculaire : MALDI : sur l’échantillon primaire dans certaines conditions ciblées Multiplex PCR temps réel sur hémocultures incubation courte sur milieux ou directement sur flacon couplé aux tests simples pour la résistance Progrès à faire Juste prescription Réalisation des hémocultures (volume de remplissage) Remerciements Dr Isabelle Podglajen (HEGP) Dr Emilie Bessède (Bordeaux) Pr Bernard La-Scola (Marseille) Pr Francis Megraud (Bordeaux) MALDI Team de Necker Microbiologie de l’HEGP
