1. Dénombrement de levures

1. Dénombrement de levures
Les résultats Matériel fourni:
▪Pipettes stériles
▪Propipette
▪Pipettes automatiques p200 (avec embouts)
▪Tubes à essai (stériles)
▪Erlenmeyer stérile
▪Chambre Thoma ou Kova
▪Pipettes pasteurs pour étalement
▪Sacs pour déchets
▪H2O stérile (pour dilution)
▪Boîtes de Petri YPD
▪Ethanol
Matériel non fourni:
▪Bec bunsen
▪Balance
▪Cubes de levure
▪Cuvettes pour spectrophotomètre (option)
▪Spectrophotomètre (option)
▪Béchers pour étalement
Concepts et messages
Les microbes qui nous entourent ne sont pas toujours des pathogènes. Bien au contraire! Les petits pains ou la
tresse du dimanche matin sont des exemples bienfaisants d’utilisation de micro-organismes!
•Les levures peuvent se garder facilement
•Taille des microbes
•Travail dans des conditions stériles
•Une levure donne lieu à une colonie
Illustration de l’expérience
A partir de ce résultat, vos élèves peuvent estimer le nombre
de levures vivantes dans un cube de levure
2.9 x 1011 levures !!
0.7 g de levure
dans 10 ml
Etalement de 0.1 ml,
facteur de dilution de 10x 10-3 10-5 10-6 10-7
10-3 10-5
10-6 10-7
•Nombre de micro-organismes

2. Les enzymes de restriction
Le résultat
Matériel fourni:
･Pipettes automatiques (p20) et embouts
･Pipettes automatiques (p200) et embouts
･Tubes de réaction, type Eppendorf
･Appareils d’électrophorèse (source et cuve)
･Bloc chauffant (37°C)
･Tampon d’électrophorèse (TBE 1x)
･Agarose
･Solution de SYBR-safe
･Enzyme de restriction BamHI
･Enzyme de restriction MspI
･Tampon de restriction
･Tampon de charge
･ADN pUC19
･ADN pUC19-TIF1
･Marqueur de taille
･H20 stérile
･Propipettes
Concepts et messages
Illustration de l’expérience
Les enzymes de restriction ont comme peu d’autres
découvertes en biologie révolutionné nos approches
expérimentales. La découvertedes enzymes de restriction a
permis l’essor du génie génétique et de ses applications qui
influencent notre vie au quotidien. Il n’y a pas si longtemps,
nous avons voté sur le génie génétique, et nous serons
certainement de nouveau amener à réfléchir sur d’autres
questionssimilaires.
•Enzymes de restriction
•Fréquence de coupure
•Séparation et visualisation des fragments
Dans le gel il est possible de voir que l’enzyme MspI, qui reconnaît une séquence de 4
paires de bases, coupe beaucoup plus souvent que BamHI, qui coupe une séquence de 6
pairesde bases.
Dans le plasmide pUC19-TIF1, un fragment d’environ5000 paires de bases a été cloné dans
le plasmide d’origine, pUC19. Coupé par BamHI, il est possible de voir deux fragments: le
plasmided’origineet l’insert.
Cartes de restriction des
plasmides utilisés

3. Clonage d'un gène dans un plasmide
Matériel fourni:
▪P20, P200 et pointes jaunes
▪Blocs chauffant
▪Tubes Eppendorf stériles
▪H2O stérile
▪Boîtes LA-X-Gal: (ampicilline,
ampicilline+ chloramphénicol, chloramphénicol)
▪ADN pUC19
▪ADN pHP45-cmR
▪Enzyme de restriction BamH
▪Tampon de digestion (10x)
▪ADN ligase
▪Tampon de ligation (10x)
▪Cellules compétentesEscherichia coli (dh5α)
▪Bloc réfrigérant pour les enzymes
▪Ethanol et râteau pour les étalements
Concepts et messages
Illustration de l’expérience
Le fait de cloner un gène consiste à l’insérer dans un vecteur
(plasmide) et de le multiplier de façon identique à volonté.
Cette technique utilise les outils de génie génétique. Elle
permet de transférer des gènes d’autres espèces dans les
bactéries et de les faire produire, par exemple des facteurs
humainsà des fins thérapeutiques.
•Clonage moléculaire
Les résultats
•restriction, ligation
•transformation bactérienne

4. Transformation de bactéries
Matériel fourni:
▪Pipettes p20 et embouts stériles
▪Pipettes p200 et embouts stériles
▪Pipettes p1000 et embouts stériles
▪Pipettes pasteur pour étalement
▪Bechers pour ethanol
▪Microcentrifugeuse
▪Bain-Marie 37°C
▪Bain-Marie 42°C
▪Tubes à réaction (Eppendorf 1.5ml)
▪Ethanol pour étalement
▪H2O stérile
▪plasmide lux117
▪2 Boîtes de Petri LA
▪2 Boîtes de Petri LA+Amp
▪0.5M CaCl2 (solution 10x, à diluer dans de l'H2O
stérile)
▪Bec bunsen
▪Spectrophotomètre (en option)
▪Cuvettes (en option)
Concepts et messages Illustration de l’expérience
La transformation est un processus naturel qui contribue à
l’évolution des microbes et au transfert de facteurs de
virulences entre bactéries pathogènes
•transformation
Dans cette expérience il y a deux messages importants:
1) la puissance de la sélection
2) l’apport d’un nouveau phénotype.
Les résultats
•sélection
Cette expérience fait partie de l’expérience 3, mais peut très
bien être utilisée toute seule pour démontrer la puissance de
sélection. Cette expérience est appropriée pour des
discussionsautourdes antibiotiques et de l’évolution.
Si vous regardez les boîtes dans le
noir, vous verrez de la lumière
Ici la sélection est énorme. Il est possible de trouver une bactérie
dans 100 millions. Ceci reflète la sélection dans l’environnement
ou lors d’une infection. Cette sélection peut être la résistance à
une substance toxique, l’utilisation d’une substance non-
dégradable et nocive pour l’environnement ou, hélas, l’apparition
d’unebactérie résistanteà un antibiotique.
•bioluminescence
•résistance aux antibiotiques

5. La coloration de Gram
Les résultats
Matériel fourni:
Boîtes de Petri contenant diverses bactéries
Réactifs pour la coloration de Gram
Matériel non fourni:
▪Pissette d’H2O pour les rinçages
▪Bec bunsen
▪Lames
▪huile à immersion
▪microscope (grossissement 40 à 1000 x)
Concepts et messages
Les bactéries peuvent être groupées en 2 catégories selon la méthode de
coloration de Gram. Cette technique a été mise au point en 1884 par Hans
Christian Gram, un bactériologiste danois. Après coloration, les bactéries Gram+
deviennent violettes alors que les bactéries Gram- apparaissent en rose.
La coloration de Gram permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi
bactérienne, et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier. L’
avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un
produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme.
Illustration de l’expérience
•Coloration de Gram
•Analyses médicales
•Visualisation des bactéries
Étaler et fixer le prélèvement à la chaleur
1) Coloration par le violet de gentiane. Laisser agir 1 minute. Rincer
2) Etaler le lugol et laisser agir 1 minute. Rincer
3) Décoloration (rapide) à l'alcool ~ 5 à 10 secondes. Rincer
4) Recoloration à la safranine. Laisser agir 30 secondes. Rincer. Sécher
Observer avec une goutte d'huile à immersion (grossissement x1000)
Frottis de bouche