PROPOSITION DE SUJET DE STAGE M2 – 2016/2017 Intitulé Evolution de la spécificité symbiotique fixatrice d'azote chez les lupins (Fabacées): Analyse de l'expression de gènes candidats. Équipe d'accueil UMR 6553 ECOBIO, Université de Rennes 1/CNRS Équipe Mécanismes à l’Origine de la Biodiversité (MOB) Encadrants Cabello-Hurtado, Francisco (MCF-HDR) : [email protected] Aïnouche, Abdelkader (MCF) : [email protected] Contexte Scientifique La nutrition azotée est un facteur essentiel de la croissance et du développement des plantes. Les légumineuses (Fabaceae) représentent la plus importante famille de plantes capables d’établir une symbiose mutualiste avec des bactéries fixatrices d’azote appartenant au groupe des rhizobia. Ce type de symbiose est un processus clef du bon fonctionnement des écosystèmes naturels et agricoles. L’établissement de cette association plante/bactérie est contrôlée par une cascade génétique complexe dont certains gènes et leurs interactions sont encore peu ou pas connus. C’est notamment le cas des gènes responsables de la spécificité symbiotique, c’est-à-dire de la reconnaissance du partenaire symbiotique. En effet, certaines espèces de légumineuses peuvent établir une symbiose avec différentes bactéries, alors que d’autres espèces du même genre sont restreintes à une seule et unique espèce bactérienne. L’identification précise des gènes et mécanismes responsables de cette spécificité symbiotique devrait permettre une meilleure compréhension de ces processus et de leurs implications écologiques et agronomiques. Objectifs L’objectif au sein de l’équipe d’accueil est d’identifier les gènes impliqués dans ce type de relation spécifique. Pour cela, nous étudions un nouveau genre modèle au sein des légumineuses : les lupins (Lupinus ; Génistoidées ; Légumineuses). Ces derniers sont nodulés par des bactéries du genre Bradyrhizobium, se caractérisent par une nodulation atypique, et présentent plusieurs cas de changement de spécificité symbiotique entre espèces proches, constituant ainsi un système original pour aborder ces questions. Dans ce cadre, une expérience d’inoculation croisée entre trois espèces de lupins et deux souches de bactéries compatibles ou non a été menée dans le cadre d’un projet de doctorat en cours, et l’ARN des nodules formés dans les différentes conditions a été séquencé (RNA-seq). Ces données ont servi à la réalisation des transcriptomes des nodules de ces différentes espèces ainsi qu’à la détection des gènes différentiellement exprimés en fonction de la bactérie présente, parmi lesquels différents gènes symbiotiques. Les objectifs de ce stage sont : (i) de confirmer les résultats obtenus par RNA-seq via qPCR, (ii) d’étudier l’expression des gènes d’intérêts (ceux les plus susceptibles d’être impliqués dans les changements de partenaire symbiotiques) à différents stades de la nodulation, et (iii) d’analyser le polymorphisme des séquences et l’histoire évolutive de ces gènes chez les légumineuses (évolution moléculaire ; phylogénie). Techniques utilisées Quantification de l’expression des gènes par PCR en temps réel (qPCR) afin d’obtenir le profil d’expression des gènes symbiotiques aux différents stades de symbiose et en fonction du partenaire symbiotique, et ainsi déterminer les candidats potentiels, gènes et copies de gènes, impliqués dans les changements de partenaires symbiotiques chez les lupins ; et mieux orienter les travaux ultérieurs. Méthodes bioinformatiques pour la manipulation et le traitement des séquences d’ADN et de leurs protéines prédites pour évaluer l’évolution des gènes candidats au niveau moléculaire, rechercher les signatures de sélection adaptative/neutre/, et finalement explorer l’évolution de ces gènes par comparaison à leurs homologues des légumineuses modèles. Méthodes d’analyse phylogénétique en vue de retracer la dynamique évolutive des gènes candidats (et de leurs copies orthologues versus paralogues) dans le contexte des légumineuses. Ce stage permettra ainsi au/à la stagiaire d’intégrer une équipe transdisciplinaire dans un contexte de partenariat international (France/Espagne) sur une thématique d’intérêt majeur pour la productivité des écosystèmes naturels et des agroécosystèmes. Le/la stagiaire sera amené(e) à faire l’apprentissage et pratiquer : (i) différentes techniques de laboratoire (extraction d’ARN, qPCR); (ii) et différentes méthodes et outils bioinformatiques pour l’analyse moléculaire et évolutive des séquences (nucléotidiques et protéiques), le traitement des données sur l’expression des gènes. Le/la stagiaire aura à exploiter les ressources génomiques publiques disponibles pour les légumineuses modèles afin d’analyser et interpréter ses résultats dans le contexte plus large de la famille des légumineuse. Il travaillera en étroite collaboration et en complémentarité avec le doctorant en charge du projet sur la spécifité symbiotique, et les résultats devraient pouvoir être valorisés dans une publication. Bibliographie Quelques révisions sur le sujet : [1] Oldroyd G.E.D. (2013) Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants. Nature Reviews - Microbiology 11: 252-263. doi: 10.1038/nrmicro2990 [2] De Mita S., Streng A., Bisseling T., Geurts R. (2014) Evolution of a symbiotic receptor through gene duplications in the legume-rhizobium mutualism. New Phytologist 201: 961-972. doi: 10.1111/nph.12549 Quelques publications pertinentes du laboratoire dans le domaine : [1] Mahé F, Markova D, Pasquet R, Misset MT, Aïnouche A. (2011) Isolation, phylogeny and evolution of the SymRK gene in the legume genus Lupinus L. Mol. Phylogenet. Evol. 60: 49–61. doi: 10.1016/j.ympev.2011.04.017 [2] Mahé F, Pascual H, Coriton O, Huteau V, Navarro Perris A, Misset M-T, Aïnouche A (2011) New data and phylogenetic placement of the enigmatic Old World lupin: Lupinus mariae-josephi H. Pascual. Genetic Resources and Crop Evolution 58: 101-114. doi: 10.1007/s10722-010-9580-6 [3] Mahé F, Markova D, Lesniewska K, Ksiazkiewicz M, Nagowska B, Misset MT, Wolko B, Ainouche A (2011) Comparative analysis of the Symbiotic-RK genomic region between Lupinus and model legumes. In B. Naganowska, P. Kachlicki and B. Wolko editors; 13th Proceedings of the International Lupin Conference: Lupin crops – an opportunity for today, a promise for the future, Polish Academy of Sciences, Poznań (Poland), page 54-59. [4] Martin GE, Rousseau-Gueutin M, Cordonnier S, Lima O, Michon-Coudouel S, Naquin D, de Carvalho JF, Aïnouche M, Salmon A, Aïnouche A (2014) The first complete chloroplast genome of the Genistoid legume Lupinus luteus: evidence for a novel major lineage-specific rearrangement and new insights regarding plastome evolution in the legume family. Annals of Botany 113: 11971210. doi: 10.1093/aob/mcu050 [5] Cabello-Hurtado F, Keller J, Ley J., Sanchez-Lucas R, Jorrín-Novo JV, Aïnouche A (2016) Proteomics for exploiting diversity of lupin seed storage proteins and their use as nutraceuticals for health and welfare. Journal of Proteomics 143: 57-68. doi: 10.1016/j.jprot.2016.03.026