République Algérienne Démocratique et Populaire Effets Des

République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université d’Es-Senia Oran
Faculté des Sciences
Département de Biologie
Mémoire de Magister
Option : Microbiologie Alimentaire
Thème
Effets Des Antibiotiques Commercialisés En Algérie Sur La
Croissance Des Bifidobactéries
Présenté par Mr ZERROUKI Mohammed Houcine
Soutenue le …./…./….
Devant le jury:
Pr. AOUES. A
Professeur
Président
Université d’Oran
Pr. CHEKROUNE. A
Professeur
Examinateur
Université d’Oran
Dr. BEKADA A
MCA
Examinateur
Université de Relizane
Dr. HADADJI M.
MCA
Directeur
Université d’Oran
Co-Directeur
Université d’Oran
Pr. BENSOLTANE A. Professeur
2011/2012
Résumé
Les Bifidobactéries sont tout au long de la vie habitants naturels du
tractus gastro-intestinale chez l’homme, dés les premiers jours suivant la
naissance.
Les bifidobactéries isolés à partir des deux yaourts fabriqués en Algérie
se présentent sous forme de bacilles à gram positif incurvées, souvent bifides,
elles sont anaérobies strictes. Le profil fermentaire des carbohydrates montre
que deux souches appartiennent à l’éspèce animalis et les deux autres à
l’éspèce longum. Leur température de croissance se situe entre 37°C et 45°C,
elles résistent à quatre antibiotiques (Vancomycine ; Kanamycine ; Néomycine
et Streptomycine) et elles sont sensibles à l’ampicilline ; pénicilline G ;
Cloxacilline, Erythromycine ; Chloramphénicol et la tétracycline.
Les bifidobactéries exposées à des conditions de stress successives
peuvent modifient leur sensibilité aux antibiotiques et par suite leur effet
probiotiques.
Mots clés : Caractérisation, Bifidobactéries, Yaourt, Probiotiques.
Summary
Bifidobacteria are throughout life natural inhabitants of the gastro-intestinal tract
in
humans,
during
the
first
days
after
birth.
The bibfdobacteria isolated from two yoghurt made in Algeria are in the form of
curved gram-positive bacilli, often bifid, they are anaerobic fermentation of
carbohydrates strictes.The profil shows that two strains belong to the species
animalis and the other two the longum species. their Temperature growth is
between 37 ° C and 45 ° C, they are resistant to four antibiotics (Vancomycin;
Kanamycine, neomycin and streptomycin) and are sensitive to the ampicillin,
penicillin G, Cloxacillin, erythromycin, chloramphenicol and tetracycline.
Bifidobacteria exposed to successive stress conditions can change their
sensitivity
to
antibiotics
and
after
their
probiotic
Keywords: Characterization, Bifidobacteria, Yogurt, Probiotic.
effect.
‫الملخص‬
‫إن بكتٍرٌب انبٍفٍذوش هً انفهىرة انطبٍعٍت نهجهبز انهضمً عىذ االوطبن عهى مذ انعصىر‪.‬‬
‫بكتٍرٌب انبٍفٍذوش انمعسونت مه انٍبورث انمصىع ببنجسائر تظهر بشكم عصىٌبث مىحىٍت ‪ ،‬مىجبت انغراو‬
‫‪ ،‬الهىائٍت إجببرٌب‪.‬‬
‫انىمط انتخمري ٌبٍه ضالنتٍه تذخم ضمه جىص ‪ animalis‬وضالنتٍه ضمه جىص ‪ ، longum‬درجت‬
‫حرارة ومىهب تكىن بٍه ‪ 37‬درجت مئىٌت و ‪ 45‬درجت مئىٌت ‪ ،‬تقبوو أربعت مضبداث حٍىٌت ( فبنكىمطٍه‪،‬‬
‫كبوبمٍطه ‪ ،‬وٍىمطٍه و ضترابتىمطٍه ) وهً حطبضت نألمبطٍهٍه ‪ ،‬بٍىٍطٍهٍه‬
‫‪ ، G‬كهىكساضٍهٍه ‪،‬‬
‫إرٌثرومٍطٍه كهىرامفٍىٍكىل وتٍتراضٍكهٍه ‪.‬‬
‫إن تعرض بكتٍرٌب انبٍفٍذوش نظروف قبضٍت متتبنٍت قذ ٌؤدي إنى تغٍٍر مقبومتهب نهمضبداث انحٍىٌت‬
‫وببنتبنً تغٍٍر مفعىنهب انطىذي انحٍىي‪.‬‬
‫انكهمبث انمفتبحٍت ‪ :‬انخصبئص ‪ ،‬انٍبوورث‪ ،‬انطبوذاث انحٍىٌت ‪ ،‬بكتٍرٌب انبٍفٍذوش‬
Remerciement
Ce travail a été réalisé dans le Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et
Industrielle sous la direction de Monsieur Hadadji Miloud, Maître de conférence de
microbiologie, au Département de Biologie, à l’Université d’Oran. Je lui exprime toute ma
reconnaissance, ma gratitude pour son soutien, ses conseils judicieux, sa disponibilité pour
mener à bien ce travail qu’il trouve ici mes sincères remerciements.
Mes vifs remerciements à tous les membres de jury pour avoir accepter de juger ce
travail :
Mes sincères remerciements vont à Monsieur Bensoltane Ahmed Professeur de
microbiologie, à l’Université d’Oran, ma gratitude pour son soutien, ses conseils judicieux, sa
disponibilité pour mener à bien ce travail qu’il trouve ici mes sincères remerciements.
Je remercie Monsieur Aoues Abdelkader, Professeur de Biochimie à l’Université
d’Oran qui a accepté de présider ce jury dont je lui exprime ma haute considération.
Mes vifs et sincères remerciement vont Monsieur Chekroune Abdallah Professeur de
physiologie de la nutrition, à l’Université d’Oran d’avoir accepté d’examiner ce travail.
Je remercie vivement Monsieur Bekkada Ahmed Maître de conférence de
microbiologie à l’Université de Relizane pour ces encouragements, ces conseils, et d’avoir
accepté d’examiner ce travail.
Je remercie toute l'équipe du Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle
sous la direction du Professeur Bensoltane Ahmed.
Je tiens a remercie toutes les personnes qui ont contribué pour mener à bien ce travail.
Sommaire
Sommaire
Introduction…………………………………………………………………………1
Rappel bibliographique…………………………………………………………….3
I-Définition……………………………………………….………………………….3
II- Historique des probiotiques…………………………………………………….4
III- Les bifidobactéries …………………………………………………………….12
III-1- Ecologie……………………………………………………………………….14
III-2- Propriétés phénotypiques ………………………………………….………16
III-2-1- Morphologie………………………………………………………………..16
III-2-2- La composition de la paroi cellulaire……………………..………………18
III-3-Propriétés physiologique……………………………………………………..20
III-3-1-Température optimal ………………………………………………………20
III-3-2-Sensibilité au pH…………………………………………………………….20
III-3-3-Anaérobiose………………………………………………………………….20
III-4- Besoins nutritionnels …………………………………………………………21
III-4-1- Besoin en acides aminés et source de carbone ……………………………21
III-4-2- Besoins en sels minéraux et vitamines ……………………………………21
III-5- Métabolismes des bifidobactéries……………………………………………22
III-5-1- Métabolismes des carbohydrates ………………………………………….22
III-5-2- Activité protéolytique ……………………………………………………..23
III-5-3- Activité uréasique……………………………………..…………………..25
IV- La génétique des bifidobactéries………………………………………………25
IV-1- Contenu en guanine+cytosine (G+C%)……………………………………25
IV-2- Plasmides …………………………………………………………………….26
I-1-Définitions d’antibiotique …………………………………………………….27
I-2-Classification, mécanisme et spectre d’action des antibiotiques……………27
3 Sommaire
I-2-1-Les inhibiteurs de la synthèse du peptidoglycane………………………….27
I-2-1-(a) Les bêta-actamines………………………………………………………27
I-2-1-(b) Les antibiotiques phosphoriques………………………………………32
I-2-2-Les inhibiteurs de la synthèse protéique…………………………………...33
I-2-2-(a) Les aminosides ou aminoglycosides …………………………………….33
I-2-2-(b) Les tétracyclines ou cyclines ……………………………………………33 I-2-2-(c) Les phénicoles ……………………………………………..…………….34
I-2-2-(d) Les macrolides, les lincosamides et les streptogramines (MLS)……34
I-2-2-(e) L’acide fusidique ………………………………………………………36
I-2-3-Les inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques……………………..36
I-2-3-(a) Les quinolones ………………………………………………………….36
I-2-3-(b) Les rifamycines ………………………………………………………..37
I-2-3-(c) Les dérivés 5-nitro-imidazolés ………………………………………..37
I-2-3-(d) La mupirocine…………………………………………………………37
I-2-3-(e) La novobiocine …………………………………………………………37
I-2-3-(f) Les nitrofuranes…………………………………………………………37
I-2-4-Les inhibiteurs de la synthèse des folates…………………………………38
I-2-4-(a)Les sulfamides ………………………………………………………….38
I-2-5-Les antibiotiques qui provoquent l’altération des membranes…………39
I-2-5-(a) Les polymyxines ……………………………………………………….39
I-2-5-(b)La gramicidine …………………………………………………………39
II- la résistance bactérienne aux antibiotiques …………………………………39
II-1- Définitions …………………………………………………………………..40
II-2- Les types de résistance ……………………………………………………...40
II-3- Les niveaux de résistance ……………………………………………………40
II-4- Mécanisme d’apparition des résistances……………………………………..40
II-5- Le support génétique de la résistance ………………………………..…….41
II-6- Les résistances mutationnelles ou mutations chromosomiques…………....41
II-7- Les résistances extra-chromosomiques……………………………….…..41
4 Sommaire
II-8-Les transposons………………………………………………………………43
III-Les mécanismes de la résistance bactérienne ……………………………….43
III-1- Les enzymes inactivant les antibiotiques…………………………………45
III-2-Résistance par diminution de la perméabilité……………………………..46
III-4-Résistance par modification de la cible…………………………………….47
III-5-Les bactéries multi-résistantes……………………………………..………48
IV- LES PHENOTYPES DE RESISTANCE DES BACILLES GRAM NEGATIF
AUX ANTIBIOTIQUES……………………………………………………………49
IV-1- Les résistances naturelles…………………………………..………………49
VI-2- Résistance acquise …………………………………………………………..51
Matériel et Méthodes……………………………………………………………..53
1. Matériel biologique……………………………………………………………..53
2. Les milieux de culture ………………………………………………………….53
I/ Isolement et identification des Bifidobacterium………………………………53
1. Isolement et purification des Bifidobacterium………………………………..53
2. Conservation des souches……………………………………………………….54
3. identification physiologique et biochimique………………………………….54
3.1 Croissance à 45°C ……………………………………………………………..54
3.2 Test de croissance en aérobiose ………………………………………………54
3.3 Test de croissance en milieu à pH 3,5 et à pH 8,5 …………………………..54
3.4 La production de CO2 de la fermentation du glucose ………………………54
3.5 Test de la nitrate réductase ……………………………………………………56
8.6 Test d’uréase ………………………………………………..…………………56
4. Profil fermentaire……………………………………………………………….56
5 Sommaire
II/ Etude probiotique des souches de Bifidobacterium isolées………………….57
1/ Effet du milieu hyperacide (pH 2) sur la viabilité des bifidobactéries ……57
2/ Etude de la sensibilité des Bifidobacterium aux antibiotiques …………..57
2-1/ Préparation d’inoculum bactériens ………………………………………57
2-2/ La méthode de diffusion sur gélose (méthode des disques) …………….58
2-3/ Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) des
antibiotiques ……………………………………………………………………..58 Résultats……………………………………………………………………..61
1- Isolement et pré-identification des Bifidobacterium…………………………61
2- Tests d’identification physiologiques et biochimiques des Bifidobacterium 61
Profil fermentaire………………………………………………………………...64
II/ Etude probiotique des souches de Bifidobacterium isolées………………….66
1/ Effet du milieu hyperacide (pH 2) sur la viabilité des bifidobactéries ……66
2/ Etude de la sensibilité des Bifidobacterium aux antibiotiques …………….66
Discussion………………………………………………………………………….72
Conclusion………………………………………………………………………….74
Perspectives…………………………………………………………………………75
Références……………………………………………………………………………76
6 Liste des Abréviations
Liste des Abréviations
ADN :
ARN :
ATP :
B. :
CO2 :
F6PPK :
G+C :
HCl :
j. :
kDa :
h:
Lb. :
min. :
ml:
mM :
mg :
NaCl :
NaOH :
O2 :
p/v :
pH :
PM :
sp. :
St. :
Subsp
ufc :
UI :
Vol :
°C :
°D :
µ:
µg :
%:
Acide Désoxyribonucléique
Acide Ribonucléique
Adénosine Triphosphate
Bifidobacterium
gaz carbonique
fructose-6-phosphokétolase
guanine+cytosine
Chlorure d’hydrogène
jours
Kilodalton
heure
Lactobacillus
minute
millilitre
millimole
milligramme.
Chlorure de sodium
hydroxyde de sodium
Oxygène
poids/volume
potentiel d'hydrogène
pois moléculaire
espèce
Streptococcus
sous espèce
unité formant colonie
Unité Internationale
volume
degré Celsius
degré Dornique
micron
microgramme
pour cent
Liste des tableaux
Liste des tableaux
Tableau 1 : La liste d’espèces du genre Bifidobacterium et leur habitat
p17
Tableau 2: Spectre d’action des macrolides, lincosamides et streptogramines
p35
Tableau3: Principaux mécanismes de résistance acquise aux antibiotiques
p43
Tableau 4 Principales caractéristiques des bêtalactamases
p45
Tableau(5) Entérabactéries et bêta-lactamines
p48
Tableau 6: Attitudes des entérobactéries vis à vis desbêta-lactamines
p49
Tableau 7: Résultats des tests physiologiques et biochimiques des souches de
bifidobactérie (Bif AC1, Bif AC2, Bif SA1 et Bif SA2).
p58
Tableau 8 : Résultats du test de fermentation des sucres par les souches de
bifidobactérie (Bif AC1, Bif AC2, Bif SA1 et Bif SA2).
p60
Tableau 9 : Résultats de viabilité des souches de bifidobactérie (Bif AC1, Bif AC2,
Bif SA1 et Bif SA2) dans le milieu hyperacide pH2.
p61
Tableau 10 : Résultats du test d’antibiogramme des souches de bifidobactérie (Bif
AC1, Bif AC2, Bif SA1 et Bif SA2).
p61
Tableau 11 : Concentration minimale inhibitrice (CMI) en µg/ml des antibiotiques
pour les souches de Bifidobacterium avant le stresse en milieu acide (pH2).
p63
Tableau 12 : Concentration minimale inhibitrice (CMI) en µg/ml des antibiotiques
pour les souches de Bifidobacterium après le stresse en milieu acide (pH2).
p63
Liste des figures
Liste des figures :
Figure 1 : Observation microscopique des cellules de Bifidobacterium sp.
p19
Figure 2 : Représentation schématique de principales étapes de la voie fermentative
du glucose chez les Bifidobacterium.
p24
Figure 3: Schéma résume les étapes suivies pour l’isolement des bifidobactéries des
yaourts probiotiques
p51
Figure 4 : Schéma simplifié des étapes de préparation l’inoculum bactérien
p55
Figure 5 : Schéma simplifié des étapes de la méthode de dilution en milieu liquide
pour la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)
p56
Figure 6 : Observations macro et microscopiques souches de Bifidobacterium
p57
Figure 7: Résultats du test d’Uréase des souches de Bifidobacterium
Figure 8 : Profil fermentaire des souches de Bifidobacterium :
Figure 9: Résultats du test d’antibiogramme des souches de Bifidobacterium
p58
p59
p62
Figure 10: Histogramme concentration minimale inhibitrice (CMI) µg/ml des
antibiotiques pour les souches de Bifidobacterium avant le stresse en milieu acide
(pH2).
p64
Figure 11: Histogramme concentration minimale inhibitrice (CMI) µg/ml des
antibiotiques pour les souches de Bifidobacterium aprés le stresse en milieu acide
(pH2).
p64
Figure 12: Histogramme concentration minimale inhibitrice (CMI) µg/ml des
antibiotiques pour la souche Bifidobacterium Bif AC1 avant et après le stresse en
milieu acide (pH2).
p65
Figure 13: Histogramme concentration minimale inhibitrice (CMI) µg/ml des
antibiotiques pour la souche Bifidobacterium Bif AC2 avant et après le stresse en
milieu acide (pH2).
p65
Figure 14: Histogramme concentration minimale inhibitrice (CMI) µg/ml des
antibiotiques pour la souche Bifidobacterium Bif SA1 avant et après le stresse en
milieu acide (pH2).
p66
Figure 15: Histogramme concentration minimale inhibitrice (CMI) µg/ml des
antibiotiques pour la souche Bifidobacterium Bif AC2 avant et après le stresse en
milieu acide (pH2).
p66
Introduction
Introduction
Les bifidobactéries forment le plus important groupe de bactéries intestinales
humaines, spécialement chez les nourrissons allaités au sein (Horvath et Barrangou,
2010), elles forment le plus important groupe pour la santé de l’homme. Leur
découverte remonte au début du siècle lorsqu’Henri Tissier les a isolées de selles
d'enfants nourris au lait maternel (Tissier, 1900). Elles s’installent dans un court temps
après la naissance et devient le groupe dominant des bactéries (92%) de la microflore
de nouveau-né allaité au sein.
Ces bactéries sont anaérobies, Gram positives, asporulés immobiles, sont des
bâtonnets à aspect variable, cellules courtes, coccoidales, ramifiées, bifurquées,
spatulées, isolés ou en chaîne, disposé en palissades. Leur nom provient de leur forme
en Y ou V que les cellules présentent dans certaines conditions de culture. Les
bifidobactéries métabolisent les carbohydrates en utilisant une enzyme appelée
fructose 6 phosphate phosphokétolase (F6PPK) retrouvée uniquement chez ce genre
bactérien (Scardovi, 1986).
Les conditions optimales de croissance des bifidobactéries d’origine humaine se
situent à des températures comprises entre 37°C et 41°C, et des valeurs de pH entre 6,5
et 7 tandis que ceux d’origine animale la température de croissance est de 45°C et le
pH est de 3 (Hadadji et al, 2005).
Certaines propriétés des bifidobactéries ont favorisé leur utilisation dans des
produits alimentaires appelés probiotiques (Brigidi et al, 2000) tels que les laits
fermentés, fromages et le lait en poudre, la charcuterie L’effet probiotiques des
bifidobactéries dépend de leur taux de survie non seulement dans les aliments mais
également dans le tractus gastro-intestinal (Marteau et al., 2001; Gagnon et al., 2004
Shah, 2006). Pour cette raison, il devient nécessaire d’étudier leurs comportent envers;
les antibiotiques et d’évaluer la population de bifidobactéries dans les produits
fermentés afin de s’assurer d’un apport en probiotiques suffisant pour obtenir les effets
bénéfiques escomptés.
1
Introduction
L’objectif principal de notre travail est l’étude de comportement des souches de
bifidobactéries utilisées dans les yaourts commercialisé en Algérie envers des
antibiotiques couramment utilisés.
Pour atteindre cet objectif, notre travail comporte les étapes suivantes :

L’isolement
et
caractérisation
microbiologique
et
biochimique
bifidobactéries.

Etude de certains facteurs physiologique des souches identifiées.

Comportement des souches identifiées envers des antibiotiques.
2
des
Rappel bibliographique
Rappel bibliographique
Les probiotiques et les bifidobactéries
I-Définition
Les probiotiques sont des micro-organismes utiles qui constituent la flore
buccale, intestinale et vaginale. Leur présence permet notamment de contrer la
prolifération des micro-organismes nuisibles qui peuvent, par exemple, provoquer des
diarrhées infectieuses ou des vaginites. Les probiotiques contribuent également à la
digestion des aliments. Plus particulièrement, il est établi que les produits laitiers
fermentés, comme le yogourt, facilitent la digestion du lactose (DeVresse et al., 2001)
notamment chez les personnes qui y sont intolérantes. Les suppléments de certains
probiotiques, les lactobacilles notamment, ont aussi cet effet, mais à un degré moindre.
Dans un organisme sain, le tube digestif est colonisé par environ
100 000 milliards de bactéries appartenant à 400 espèces différentes. De 30
à 40 espèces de ces bactéries représentent 99 % de la flore qui forme un écosystème
stable essentiel au maintien d’une bonne santé. Tout événement qui perturbe
l’équilibre de la flore intestinale peut provoquer une diarrhée. Il peut s’agir d’une
maladie (infection, déficience du système immunitaire), mais aussi d’un traitement
médical, notamment des antibiotiques.
Les probiotiques agissent par (Haddad et al., 2005) principaux mécanismes
(Penner et al ., 2005). Le premier consiste à moduler l’activité du système immunitaire
intestinal. Les probiotiques renforcent l’immunité lorsqu’elle est faible, par exemple
au moment du développement du système immunitaire chez l’enfant, ou de son
vieillissement chez les personnes âgées. Ils diminuent également la sur-activation du
système immunitaire, notamment dans les cas d’allergies ou de maladies
inflammatoires de l’intestin. En second lieu, les probiotiques augmentent la fonction
de barrière de la muqueuse intestinale, par exemple en accentuant la production de
mucus ou des anticorps de type IgA. Finalement, les probiotiques ont des effets
3
Rappel bibliographique
antimicrobiens directs, en prenant la place des bactéries pathogènes (phénomène de
compétition) et en empêchant leur adhésion aux parois intestinales.
Les bactéries lactiques comptent parmi les principaux probiotiques. Leur nom
générique vient du fait qu’elles produisent de l’acide lactique. Elles comprennent,
notamment, les lactobacilles (bactéries du genre Lactobacillus), les bifidobactéries
(bactéries du genre Bifidobacterium) et certains streptocoques (bactéries du genre
Streptococcus). Ce sont des bactéries de ce type qui servent généralement à la
production du yogourt (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus), de la
choucroute, des légumes lactofermentés et du salami (Lactobacillus plantarum).
La levure de bière active (ou « vivante ») est également un probiotique. Elle est
constituée de champignons microscopiques, généralement de l’espèce Saccharomyces
cerevisiae. Ces micro-organismes, qui ne sont pas pathogènes, digèrent le sucre et
l’amidon des céréales, créant un milieu riche en protéines et en vitamines,
principalement en vitamines B (il s’agit de l’une des plus importantes sources
naturelles de thiamine, une vitamine B essentielle au métabolisme des hydrates de
carbone et des gras). Le milieu créé par la levure est séché à froid et réduit en poudre,
laquelle est vendue en vrac ou en sachets, ou sous forme de capsules ou de comprimés.
Tous les essais cliniques ayant porté sur la diarrhée ont été menés avec la souche de
levure de bière Saccharomyces cerevisiae Hansen CBS 5926, appelée Saccharomyces
boulardii ou levure boulardii dans le commerce.
II- Historique des probiotiques
Dans le Caucase, en Europe de l'Est, en Russie et au Moyen-Orient, où l’on
consomme des produits laitiers fermentés depuis des centaines d'années, on a toujours
considéré que ces aliments étaient source de santé et de longévité.
C’est vers la fin du XIXe siècle que des microbiologistes se rendent compte que
la composition de la flore intestinale des personnes en bonne santé diffère de celles des
personnes malades.
Au début du XXe siècle, Elie Metchnikoff, lauréat d'un prix Nobel, découvre
qu'on peut contrecarrer les effets des bactéries pathogènes en consommant des
4
Rappel bibliographique
bactéries lactiques. Sur la foi de ces études, la consommation de produits laitiers
fermentés augmente sensiblement en Europe et en Amérique du Nord jusqu'aux
années 1920, pour ensuite diminuer.
Au début des années 1920, en Indochine, un microbiologiste français du nom
d’Henri Boulard a isole une nouvelle souche de levure à laquelle il donne son nom,
Saccharomyces boulardii.
Au début des années 1960, la recherche sur les probiotiques connait un regain
d’intérêt et les chercheurs étudient de façon approfondie les effets des bactéries
intestinales sur des animaux dont on a détruit la flore.
De nos jours, les probiotiques font l’objet de recherches intensives et on trouve
de plus en plus, dans le commerce, des préparations renfermant divers microorganismes bénéfiques. On ajoute parfois à ces produits des fibres destinées à favoriser
la production de micro-organismes (des fructo-oligosaccharides, par exemple, comme
l’inuline, extraite de la racine de chicorée). On donne à de telles fibres le nom de
prébiotiques parce qu’elles favorisent la multiplication des colonies de probiotiques.
Les « symbiotiques », quant à eux, sont des produits qui renferment à la fois des
probiotiques et des prébiotiques.
La consommation de produits laitiers fermentés varie beaucoup selon les pays.
En Amérique du Nord, la quantité moyenne de yogourt consommée est de 4 kilos par
an, tandis qu’elle s’élève à 33 kilos en France.
Prévenir et traiter la diarrhée infectieuse (en complément de la réhydratation). Il
existe plusieurs types de diarrhées infectieuses selon l’agent pathogène responsable
(virus, bactérie, parasite). La plus commune est la diarrhée aiguë causée par la
gastroentérite d’origine virale, qui touche aussi bien les enfants que les adultes. Les
plus récentes synthèses s’accordent à dire que des bactéries lactiques, en particulier
Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophillus,
Bifidobacterium bifidus et la levure Sacharomyces boulardii peuvent réduire les
risques de contracter ce type de diarrhée infectieuse, tant chez les enfants que chez les
adultes (Szajewska et al ., 2001; Huang et al 2002; Martínez-Cañavate et al., 2009). Ils
5
Rappel bibliographique
peuvent également diminuer sa durée, après qu’elle se soit déclenchée. Des essais avec
des associations de probiotiques (Saccharomyces boulardii) et d’antibiotiques
remportent aussi un certain succès pour le traitement des nourrissons.
Prévenir la diarrhée du voyageur. Les probiotiques font preuve d’une certaine
efficacité pour prévenir la diarrhée du voyageur (Cohen et al., 2007). Elle touche de
15 % à 60 % des voyageurs à destination des pays en voie de développement et elle est
généralement due à une infection par une souche pathogène de la bactérie Escherichia
coli. En s’appuyant sur 12 études cliniques, la méta-analyse la plus récente11sur
l’utilisation prophylactique des probiotiques parvient à la conclusion que des doses
quotidiennes d’au moins 10 milliards UFC de Saccharomyces boulardii ou d’un
mélange de Lactobacillus rhamnosus GG et Bifibobacterium bifidus, offrent une
protection contre la tourista. Les auteurs confirment également l’innocuité d’une telle
utilisation.
Par ailleurs, la Commission E allemande a approuvé l’usage de la levure
boulardii pour prévenir et traiter la diarrhée des voyageurs. Soulager les symptômes
du syndrome de l’intestin irritable. L’effet des probiotiques sur les symptômes du
syndrome de l’intestin irritable a fait l’objet de nombreuses études, particulièrement
depuis le début des années 2000 (Borowiec, 2007, Dughera et al., 2007). Les métaanalyses les plus récentes concluent qu’ils améliorent globalement l’état des malades,
en atténuant notamment la fréquence et l’intensité des douleurs abdominales, les
flatulences, les ballonnements et en régularisant le transit intestinal (McFarland et al.,
2008; Nikfar et al., 2008). La plupart des études admettent qu’il est difficile de
quantifier l’importance des bienfaits, car l’hétérogénéité des probiotiques étudiés, de
leur dose et de leur durée d’administration est grande. On peut noter toutefois que des
résultats positifs ont été obtenus avec Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus
plantarum,
Bifidobacterium
infantis,
Streptococcus
faecium,
Streptococcus
thremophilus, Saccharomyces boulardii et le mélange de bactéries lactiques.
Prévenir les complications d’un traitement aux antibiotiques (diarrhée et
infection par Clostridium difficile). En 2006, une méta-analyse indiquait que le risque
6
Rappel bibliographique
de diarrhée associé à la prise d’antibiotiques pouvait être réduit par la prise
concomitante de probiotiques (McFarland et al., 2006). Ces résultats confirmaient
ceux de méta-analyses antérieures (D'Souza et al., 2002., Hawrelak et al., 2005).
Parmi les espèces étudiées, seules Saccharomyces boulardii, Lactobacillus
rhamnosus GG et certaines combinaisons de deux probiotiques ont eu des effets
significatifs.
Plus récemment, des résultats positifs ont aussi été obtenus avec Lactobacillus
plantarum et une méta-analyse ciblant les études faites avec des lactobacilles est
arrivée à la conclusion que les espèces Lactobacillus rhamnosus GG et Lactobacillus
gasser, administrées seules, ou la combinaison de Lactobacillus acidophilus avec
Lactobacillus casei ou Lactobacillus bulgaricus réduisaient les risques de diarrhées
induites par les antibiotiques chez les adultes, mais pas chez les enfants (Kale-Pradhan
et al., 2010). Les études sur l’utilisation des probiotiques pour lutter contre l’infection
par Clostridium difficile sont moins nombreuses et la variabilité des protocoles ne
permet pas de tirer de conclusion définitive sur leur efficacité. Néanmoins,
l’association de la levure Saccharonmyces boulardii et d’un antibiotique, généralement
de la vancomycine, permettrait de diminuer la récurrence des infections.
Prévenir les infections nosocomiales ou associées à un traitement médical. Les
résultats d’un essai clinique auprès d’enfants âgés de 1 mois à 1 ½ an hospitalisés pour
diverses raisons ont indiqué que Lactobacillus GG avait pour effet d’atténuer de façon
significative le risque de contracter une infection gastro-intestinale nosocomiale
(infection contractée spécifiquement à l’hôpital) (Szajewska et al., 2001). Une étude
pilote récente confirme l’innocuité de la souche Lactobacillus. casei chez les enfants
dans le contexte des soins intensifs.
Chez des personnes ayant subi une intervention chirurgicale de l’abdomen,
l’administration de probiotiques ou de symbiotiques (une combinaison de prébiotiques
et de probiotiques) permettrait de réduire les risques de pneumonie et de cholangite
ainsi que la durée du séjour postopératoire à l’hôpital et du traitement antibiotique
(Pitsouni et al., 2009). D’autre part, dans le cas particulier de la transplantation de foie,
7
Rappel bibliographique
les bienfaits d’un traitement aux probiotiques pour prévenir les infections et les
complications postopératoires restent à démontrer (Gurusamy et al., 2008).
Dans un essai mené auprès de patients nourris par intubation, un traitement à la
levure boulardii (2 000 mg par jour) a contribué à diminuer les risques de diarrhée
associés à cette procédure médicale (Bleichner et al., 1997). Notez que la commission
allemande a approuvé l’usage de la levure boulardii pour prévenir les infections
gastro-intestinales causées par l’intubation.
Prévenir les rechutes de colite ulcéreuse. Les causes de la colite ulcéreuse sont
mal connues. Plusieurs études se sont penchées sur l’utilisation des probiotiques pour
traiter cette maladie (Kruis et al., 1997; Furrie et al., 2005). Les espèces les plus
étudiées sont les souches non pathogènes d’Escherichia coli, les bactéries du genre
Bifidobacterium et un mélange de bactéries lactiques incluant des bifidibactéries,
commercialisé sous le nom de VSL#3. En 2010, une méta-analyse a conclu qu’aucun
probiotique n’était plus efficace que le traitement classique pour traiter la phase active
de la maladie. Par contre, certaines espèces de bactéries se sont avérées utiles pour
prolonger les phases de rémission, en particulier les bifidobactéries.
Prévenir la récidive en cas de pouchite. La pouchite, une inflammation
récidivante de la poche iléale, est une conséquence fréquente du traitement chirurgical
(coloproctectomie) de la colite ulcéreuse. Les résultats de plusieurs essais cliniques
avec placebo menés sur des sujets souffrant de pouchite récidivante indiquent qu’une
préparation particulière (VSL#3®) composée de 4 souches de lactobacilles, de
3 souches de bifidobactéries et d’une souche de streptocoques aide à prolonger la
période de rémission et permet de prévenir les rechutes (Gionchetti et al., 2003;
Lammers et al 2005, Holubar et al., 2010). Des traitements au Lactobacillus GG et au
lait fermenté (Cultura®) ont eu moins de succès.
Infections à Helicobacter pylori. L'infection à Helicobacter pylori est très
répandue. Elle est la cause de nombreuses gastrites et de la plupart des ulcères
gastroduodénaux. En 2009, les études sur l’efficacité des probiotiques pour aider à
guérir cette infection ont fait l’objet de 2 méta-analyses. L’une d’elles (10 études,
8
Rappel bibliographique
963 participants) a montré que les bactéries lactiques de laits fermentés (lactobacilles
et bifidobactéries), combinées à la trithérapie classique, augmentent de 5 % à 15 % les
chances de guérison (Sachdeva et al., 2009). L’autre (8 études, 1 372 participants) a
conclu que les lactobacilles améliorent non seulement le taux de réussite du traitement
classique, mais qu’ils atténuent aussi ses effets indésirables (Zou et al., 2009).
D’autre part, 2 études cliniques de faible envergure ont montré, chez des
enfants, qu’une supplémentassions par Lactobacillus rhamnosus GG ou par la levure
Saccharomyces boulardii n’améliore pas l’efficacité du traitement classique
(Szajewska et al., 2009; Hurduc et al., 2009). Par contre, la levure atténue ses effets
secondaires.
Traiter les infections vaginales ou en prévenir la récurrence. Un déséquilibre de
la flore vaginale crée un terrain propice au développement d’agents pathogènes et se
traduit généralement par une vaginite.
Dans une revue systématique publiée en 2009, des chercheurs ont comparé
l’efficacité de différents traitements contre la vaginose bactérienne, une des causes les
plus fréquentes de vaginite (Oduyebo et al., 2009). Ils ont conclu que l’utilisation
locale de lactobacilles est plus efficace que les antibiotiques prescrits par voie orale
(clindamycine, métronidazole). En outre, les antibiotiques donnent de meilleurs
résultats s’ils sont combinés à des suppléments alimentaires de lactobacilles. Aucune
des études cliniques entreprises depuis la publication de cette revue n’est venue
contredire ces conclusions (Martinez et al., 2009).
En ce qui concerne l’infection à levure (Candida albicans), une autre cause
fréquente de vaginite, une synthèse de 2003 indiquait que les données sur l’utilisation
des probiotiques pour prévenir et traiter cette infection étaient encourageantes, mais
insuffisantes. Or, une étude récente (2009) vient renforcer ces conclusions en montrant
que l’adjonction de lactobacilles renforcerait le traitement classique au fluconazole
(Martinez et al ., 2009) Prévenir la diarrhée causée par une radiothérapie de l’abdomen
ou de la région pelvienne. Des études cliniques ont obtenu des résultats encourageants
avec les bactéries lactiques Lactobacillus rhamnosus (Antibiophilus®), Lactobacillus
9
Rappel bibliographique
acidophilus et le produit VSL#3® (Salminen et al., 1988; Delia et al., 2002).
Toutefois, le nombre limité d’études et leur hétérogénéité ne permettent pas de
conclure de façon définitive (Fuccio et al., 2009).
Prévenir l’eczéma atopique chez les enfants à risque. Des études cliniques
publiées au cours des deux dernières années montrent que des suppléments de
Lactobacillus F19, de Lactobacillus sakei ou d’une combinaison de Bifidobacterium
bifidum et de Lactococcus lactis (Ecologic® Panda) réduisent l’incidence de l’eczéma
chez des enfants plus à risque d’en être atteints (West et al., 2009; Woo et al., 2010).
Des études antérieures avaient montré un effet préventif similaire de
Lactobacillus GG. Par contre, la combinaison Bifidobacterium longum et
Lactobacillus rhamnosus ne semble pas avoir d’effet, aux doses testées (10 millions
UFC chacune), sur l’incidence de l’eczéma de jeunes enfants asiatiques, ni sur leur
sensibilité aux allergènes (Soh et al ; 2009). Il est à noter que le traitement est parfois
administré à la mère pendant la grossesse et poursuivi chez l’enfant après sa naissance.
Stimuler le système immunitaire. Il existe aujourd’hui des preuves
expérimentales et cliniques que l’interaction des probiotiques avec le système
immunitaire ne se limite pas au système digestif (Gill et al., 2001; Saavedra et al.,
2004; Borchers et al., 2009). Les résultats de plusieurs essais cliniques indiquent que
les bactéries lactiques stimulent la production de divers anticorps dans l’organisme
humain (Arunachalam et al., 2000; Sheih, 2001). Par exemple, des suppléments de
Lactobacillus GG ont procuré une protection légère, mais significative, contre les
infections du système respiratoire (Siempos et al., 2010).
Par leur action régulatrice sur le système immunitaire, les bactéries lactiques
pourraient également atténuer l’intensité de la rhinite allergique, en particulier chez les
enfants constipées (Wang et al., 2004, Ouwehand et al., 2009; Ivory et al., 2008).
L’idée d’utiliser des probiotiques pour le traitement de la constipation est née de trois
observations :
A. la composition de la flore intestinale des personnes en souffrant diffère
parfois de celles qui ont un transit régulier;
10
Rappel bibliographique
B. on a déjà remarqué que l’administration de Bifibobacterium lactis accélérait
le transit intestinal;
C. les probiotiques acidifient l’intérieur de l’intestin, ce qui a pour effet
d’augmenter son péristaltisme. En 2010, une méta-analyse indiquait que les preuves
scientifiques sont encore insuffisantes pour apporter une conclusion définitive
(Chmielewska et al., 2010).
Néanmoins, les résultats des 6 études retenues montraient que des souches de
Bifidobacterium lactis, Lactobacillus casei et d’Escherichia coli amélioraient la
consistance des selles et leur fréquence chez les adultes et qu’une souche de
Lactobacillus casei produisait ces effets chez les enfants.
Maladie de Crohn. Quand cela s’avère nécessaire, les personnes atteintes de la
maladie de Crohn peuvent bénéficier d’un traitement chirurgical. Il existe néanmoins
des cas de récidives dans les années qui suivent la chirurgie. Comme la maladie est
associée à un déséquilibre de la flore intestinale, une supplémentation par des
probiotiques a été une solution envisagée pour réduire le nombre des rechutes. Une
méta-analyse récente (2010) conclut que les travaux sur cette question méritent d’être
poursuivis, bien que les probiotiques n’aient démontré aucun effet positif, jusqu’à
présent (Doherty et al., 2010).
Traiter l’eczéma atopique chez les enfants. En 2008, une méta-analyse de
10 études cliniques (678 participants) concluait que les probiotiques pouvaient avoir
un léger effet dans le traitement de l’eczéma, en particulier dans le cas d’atteintes
modérées à graves (Michail et al., 2008). En 2009, une revue systématique de la
littérature scientifique sur le sujet infirmait cette conclusion en indiquant qu’ils ne
réduisaient pas de façon significative les manifestations de l’eczéma (Boyle et al.,
2009). Aux vues des résultats, les auteurs ne recommandaient pas l’utilisation des
probiotiques pour le traitement de l’eczéma, mais n’excluaient pas que des souches
différentes de celles étudiées jusqu’à présent puissent avoir un effet.
Réduction du taux de cholestérol. Les résultats de quelques études portant sur le
sujet sont arrivés à des résultats mitigés (Marteau et al., 2002). Une étude récente
11
Rappel bibliographique
(43 patients) indique que la prise de probiotiques, en conjonction avec du sélénium,
pourrait réduire le cholestérol sanguin total de 12 % après 1 an de traitement (Hlivak P
et al., 2005).
Cancer. Une étude épidémiologique et des études cliniques indiquent que les
probiotiques pourraient être utiles pour prévenir le cancer et ralentir la progression des
tumeurs (cancer de la vessie), mais ces données restent préliminaires (Penner et al.,
2005; Marteau et al ., 2002).
III- Les bifidobactéries
Les bifidobactéries ont été découverts pour la première fois dans les fèces
infantiles nourris au lait maternel par Tissier (1900), qui a isolé une bactérie avec une
forme étrange et caractéristique de Y et l'a appelée Bacillus bifidus communis. Cette
bactérie était anaérobie, Gram positif et n'a pas développé de gaz pendant sa
croissance.
Depuis leur première description, la classification de ces bactéries n'a cessée
d'être révisée passant du genre Bacillus, à celui de Bacteroïdes (Castellani et
Chalmers, 1919), Lactobacillus (Hollande ,1920), Bifidobacterium (Orla-Jensen
,1924), Bacterium (Lehmann et Neumann, 1927), Tissieria (Pribram, 1929), Nocardia
(Vuillemin, 1931), Actinomyces (Nannizzi, 1934), Actinobacterium (Puntoni, 1937) et
Corynebacterium (Olsen, 1949).
En raison des similitudes entre les bifidobactéries et les bactéries du genre
Lactobacillus, ils ont été inclus dans ce genre comme classifier dans la 7e édition du
manuel de Bergey de la bactériologie déterminative (Breed et al., 1957).
Dehnert (1957) décrit l'existence des biotypes multiples des bifidobactéries et a
proposé un arrangement pour la différenciation entre les souches basées sur leurs
modèles de fermentation d'hydrate de carbone. Durant la même année Cummins et al
ont examiné la composition de la paroi cellulaire de plusieurs souches de
bifidobactérie et ont conclu que ces bactéries sont différentes de toutes les bactéries
Gram positif précédemment examinées.
La classification taxonomique des
bifidobactéries était donc à revoir et le sujet à été relancé de nouveau à l’investigation.
12
Rappel bibliographique
En 1963, Reuter a effectué des tests biochimiques et sérologiques sur des
souches de bifidobacteries isolées des fèces d'enfants et d’adultes et a proposé
l'arrangement suivant pour l'identification de ces bactéries: des bactéries aux formes
bacillaires ,anaérobie , Gram positif, ressemblaient à des lactobacilles, excepté la
variabilité morphologique, elles fermentent le glucose en produisant de l'acide acétique
et de l'acide lactique d'un rapport 2:1 et fermentent 11 sucres additionnel des sucres
déjà étudiés. Sur cette base il conclut que ces bactéries devraient être classées dans la
tribu Lactobacilleae , famille Lactobacillaceae dans le genre Bifidobacterium.
Scardovi et Trovatelli (1965) et De Vries et al. (1967) ont découvert une
nouvelle voie de fermentation des hexoses chez les bifidobacteries, qui ne se trouve
pas dans aucune des espèces du genre Lactobacillus. L'enzyme principale de cette voie
est une fructose-6-phosphate phosphoketolase qui clive le fructose-6-phosphate en
érythrose-4-phosphate et en acétyle phosphate. En 1970, Scardovi et al. ont
commencés a appliqué intensivement le procédé d'hybridation ADN-ADN afin
d'évaluer la validité des espèces de bifidobacteries précédemment décrite et pour
identifier de nouveaux groupes de séquences ADN homologique parmi les souches
qu'ils isolaient dans des diverses niches écologiques. Cette technique d’identification
est une avance significative en bactériologie déterminative et a aidé à résoudre une
grande partie de la confusion précédemment rencontré quand a la différenciation
d'espèce de Bifidobacterium qui a été faite principalement sur le profil fermentaire
d'hydrate de carbone.
Dans la 8e édition du manuel de Bergey du déterminatif de la bactériologie
(Rogosa, 1974), les bifidobacteries ont été classifiées dans le genre Bifidobacterium en
utilisant le même nom proposé par Orla-Jensen. Le genre a comporté huit espèces; il a
été inclus dans la famille des Actinomycetaceae d'ordre Actinomycetales.
Une autre correction à la classification a été apportée après l'introduction de
l'électrophorèse des protéines cellulaires solubles sur le gel de polyacrylammide
comme critère d'identification d'espèce (Biavati et al., 1982).
13
Rappel bibliographique
La nouvelle description d'espèce et les remises en ordre apportées à la
classification précédente ont contribué à l'identification de 24 espèces rapportées dans
la première édition du manuel de Bergey de la bactériologie systématique (Scardovi,
1986).
Stackebrandt et al. (1997), par l'analyse de RNAr 16S, ont proposé une
structure hiérarchique rassemblant le genre Bifidobacterium avec le genre Gardnerella
dans une seule famille Bifidobacteriaceae dans l’ordre de Bifidobacteriales. De nos
jours cette famille comporte 6 genres: Aeriscardovia, Alloscardovia, Bifidobacterium,
Gardnerella, Parascardovia et Scardovia (Euzéby, 2007).
Avec l’utilisation des techniques de la biologie moléculaire (l'analyse des
séquences des ARNr 16S, l'analyse des séquences des gènes codant pour la protéine du
choc thermique de 60 kDa (Hsp60), contenu G+C d’ADN), on dénombre aujourd'hui
31 espèces de bifidobactéries de diverses origines. La liste des espèces et leurs habitats
sont rapportés dans le tableau 1.
III-1- Ecologie :
Les bifidobactéries sont des habitants naturels de la flore intestinale humaine.
Ces microorganismes sont les bactéries intestinales majeures chez les bébés nourris au
lait maternel (Rasic et Kurmann, 1983). B. breve et B. infantis sont des espèce typique
des bébés nourris au lait maternel ou aux formules lactées pour nourrissons tandis que
B. bifidum , B. catenulatum , B. longum et B. pseudocatenulatum sont présents dans les
fèces des
nouveau-né et/ou dans les fèces d'adulte. B. adolescentis a été isolés
seulement dans les fèces d’adulte (Corzo-Martínez et al., 2012).
L'habitat des bifidobactéries n'est cependant pas restreint à l'intestin. Quelques
espèces comme B. bifidum, B. breve ou B. longum biovar infantis peuvent également
coloniser le vagin de la femme. B. dentium a pour habitat la cavité orale de l'homme,
mais cette espèce est également retrouvée dans les fèces et dans le vagin. Les espèces
douées du plus fort pouvoir pathogène potentiel sont B. dentium isolé notamment des
caries dentaires (Scardovi et Crociani., 1974) et des abcès et B. scardovii isolé de
14
Rappel bibliographique
divers prélèvements d'origine humaine (sang d'une femme âgée de 50 ans, urines de
patients âgés, hanche d'une femme de 44 ans) (Hoyles et al., 2002).
Chez les animaux quelques espèces sont apparemment une présence spécifique.
B. merycicum et B. ruminantium sont isolés des bovins. B. choerinum, B.
psychraerophilum et B. thermacidophilum subsp. porcinum sont présents chez les
porcs. B. gallinarum et B.
pullorum sont associés aux volailles. B. cuniculi, B.
saeculare et B. magnum sont isolés des lapins. B. asteroides, B. coryneforme et B.
indicum sont hébergés dans l'intestin des abeilles. En revanche, B. animalis subsp.
animalis, B. boum, B. longum, B. pseudolongum, B. thermophilum sont isolés de
diverses espèces animales. Bifidobacterium tsurumiense une nouvelle espèce isolée par
Okamoto et al., (2008) Des plaques dentaires des hamsters nourris durant six semaines
avec une alimentation riche en sucres.
Douze espèces de Bifidobacterium ont été isolées dans des eaux d'égout et
parmi ces derniers B. minimum et B. subtile n'ont pas été trouvés ailleurs. B. animalis
subsp. lactis est principalement isolé des laits fermentés. B. thermacidophilum subsp.
thermacidophilum isoler des digeste anaérobie. B. crudilactis isolé dans le lait cru et
des fromages fabriqués au lait cru récemment décrit par Delcenserie et al. (2007). Les
habitats dans lesquels les bifidobactéries ont été isolés sont énumérés dans le tableau 1.
15
Rappel bibliographique
III-2- Propriétés phénotypiques :
III-2-1- Morphologie :
Les membres du genre Bifidobacterium montrent des formes bacillaires qui
développent des ramifications donnant des formes en V, Y, X (Figure 1). Cependant,
leur polymorphisme dépend principalement du milieu de culture et des conditions de
croissance. Les niveaux de N-acetylglucosamine, qui est impliqué dans la synthèse de
peptidoglycanes, affectent l'embranchement des bifidobactéries. Tandis que des
niveaux plus bas de N-glucosamine et d'acides aminés produisent la forme plus
fortement embranchée, les milieux favorables et riches en éléments de croissance
produisent des formes bacillaires plus longtemps. Les colonies constituées par les
bifidobactéries sont lisses, convexes, crèmes ou blanches, scintillant et de la régularité
molle. Les cellules de B. angulatum montrent l'arrangement de V ou de palissade,
tandis que les cellules B. animalis montrent la portion centrale agrandie. B. asteroides
exposés des arrangements à la forme étoile peu communs (Shah et Lankaputhra,
2002).
16
Rappel bibliographique
Tableau 1 : La liste d’espèces du genre Bifidobacterium et leur habitat (Biavati et al.,
2000; Ait abdeslam, 2008).
nomenclature
référence
Nouvelle
référence
Source
nomenclature
B. adolescentis
Reuter (1963).
Fèces d'homme adulte; rumen de bovin;
eaux usées; le vagin de la femme.
B. angulatum
Scardovi et Crociani (1974).
Fèces d'homme adulte; eaux usées.
B. animalis
(Mitsuoka, 1969) Scardovi et
B. animalis subsp.
Masco et al.
fèces de rat, de poulet, de lapin, de veau
Trovatelli (1974).
animalis
(2004).
et du cochon d’Inde; eaux usées.
B. asteroides
Scardovi et Trovatelli (1969)
Intestin d’ Apis mellifera
B. bifidum
(Tissier,
les fèces de l'homme (nouveau-né et
1900) Orla-Jensen
adulte) et de veau d’allaitement ; vagin
(1924).
de la femme.
B. boum
Scardovi et al. (1979).
Rumen de bovin; fèces de porcelet.
B. breve
Reuter (1963).
Les fèces d'enfant en bas âge et de veau
d’allaitement ; vagin de la femme; eaux
usées.
B. catenulatum
Scardovi et Crociani (1974).
Les fèces de l'homme (nouveau-né et
adulte) ; eaux usées.
B. choerinum
Scardovi et al. (1979).
Les fèces de porcelet; eaux usées.
B. coryneforme
(ex Scadovi et trovatelli ,1969)
Intestin d’ Apis mellifera.
Biavati et al. (1982).
B. crudilactis
Delcenserie et al. (2007).
fromages au lait cru.
B. cuniculi
Scardovi et al. (1979).
Les fèces de lapin.
B. denticolens
Crociani et al. (1996).
B. dentium
Parascardovia
Jian et Dong
denticolens
(2002).
Scardovi et Crociani (1974).
Carie dentaire de l’homme.
Carie dentaire et cavité buccale de
l’homme; fèces d'homme adulte; abcès
et appendice.
B. gallicum
Lauer (1990).
Les fèces de l’homme.
B. gallinarum
Watabe et al. (1983).
Caecum de poulet.
B. globosum
(ex Scardovi et al. 1969)
B.
Biavati et al. (1982)
subsp. globosum
B. indicum
pseudolongum
Yaeshima et
Les fèces de porc, poulet, taureau, rat,
al. (1992).
veau et de cochon d’Inde.
Intestin d’Apis cerana et A. dorsata.
Scardovi et Trovatelli (1969).
17
Rappel bibliographique
III-2-2- La composition de la paroi cellulaire :
La paroi cellulaire des bifidobactéries a une structure spécifique aux bactéries
Gram positives. Elle est constituée d’une épaisse couche de muréine (peptidoglycanes)
entremêlée de longues chaînes de polysaccharides ainsi que de protéines et d’acides
lipoteichoïque.
Le glucose et le galactose et souvent le rhamnose sont repérés comme
composant des polysaccharides de la paroi cellulaire des bifidobactéries, avec des
différences qualitatives et quantitatives parmi l'espèce, les souches et les conditions de
croissance (Arunachalam, 1999).
Abbad Andaloussi et al (1995) ont décrit que la production des polysaccharides
extracellulaires par B. longum cultivé dans des milieux lait écrémé et de peptonelevure-lactose peuvent avoir une structure résultant des sous-unités répétées du
glucose, du galactose et des un peu d'acides uroniques et d’hexosamines.
Les acides lipoteichoique forment des liaisons avec des chaînes de
polysaccharide sont considérés important pour l'adhérence des cellules à la paroi
intestinale. Plusieurs espèces de
bifidobactéries ont des lipoglycans de diverses
structures, avec L-alanine au lieu de D-isomère habituel (Iwasaki et al., 1990).
Les études immunochimiques ont indiqué que les acides lipoteichoiques sont un
antigène commun dans le genre Bifidobacterium ; d'ailleurs, les protéines et les acides
lipoteichoique déterminent le caractère hydrophobe de la surface des bifidobactéries
(Op Den Camp et al., 1985). Les études sur la nature des enzymes d’hydrolyses de la
paroi cellulaire des espèces de Bifidobacterium ont indiqué qu’il y a un nombre
différent de telles enzymes variables dans leur poids moléculaire dans chaque souche
(Lee et Yoon, 1998).
18
Rappel bibliographique
(a)
(b)
(c)
(d)
Figure 1 : Observation microscopique des cellules de Bifidobacterium sp.
Observation au microscope optique :
(a): Bifidobacterium adolescentis (Bar:10µm).(Anonyme, 2008).
(b): Bifidobacterium animalis (x500) (Trojanova et al., 2006).
Observation au microscope électronique:
(c): Bifidobacterium sp. (Bar: 1µm) (Biavati et al., 2000).
(d): Bifidobacterium breve (Bar: 1µm). (Anonyme, 2006).
19
Rappel bibliographique
III-3-Propriétés physiologique :
III-3-1-Température optimal :
La température optimale pour la croissance des bifidobactéries est de 36- 43 °C,
alors qu'aucune croissance ne se produit en-dessous de 20 °C et au-dessus de 46 °C, à
l’ exception de B. thermophilum, B. thermacidophilum subsp. Thermacidophilum et B.
thermacidophilum subsp. porcinum qui sont capable de croitre aux états modérément
thermophiles (47°C, 49,5°C et 46,5°C) (Scardovi et al., 1979 ; Dong et al., 2000 ; Zhu
et al.,2003) et B. psychraerophilum cultive à température de 4°C (Simpson et al. ,
2004).
Les bifidobactéries d'origine humaine révèlent une croissance optimale entre
36°C et 38°C, tandis que les bifidobactéries d'origine animale démontrent une
croissance optimale entre 41°C et 43°C. La croissance à 45°C semble distinguer entre
les espèces animales et humaines (Shah, 1997 ; Gavini et al., 1991).
III-3-2-Sensibilité au pH :
Bifidobactéries sont des micro-organismes non acido-résistants. L'optimum pH
est entre 6,5 et 7,0. Aucune croissance n'est enregistrée à pH plus bas que 4,5 et plus
fortement qu’à 8,5. Seulement B. thermacidophilum subsp. thermacidophilum a une
croissance retardée à pH 4 (Dong et al., 2000) et B. animalis subsp. animalis et B.
animalis subsp. lactis
peuvent survivre exposer au pH 3,5 pendant 3 heures
(Matsumoto et al., 2004).
III-3-3-Anaérobiose :
Les bifidobactéries sont anaérobies. Cependant la sensibilité à l’oxygène parmi
les espèces diffère selon leur origine, soit humaine ou animale. Les espèces d’origine
humaine sont plus sensibles que les espèces d’origine animale. L’exposition à l'air
pendant 4 jours à une température de 20°C permet la survie de beaucoup d'espèces
d'origine animale (B. pseudolongum subsp. pseudolongum et B. thermophilum)
(Beerens et al., 2000). Bifidobacterium psychraerophilum cultive faiblement en
aérobiose (Simpson et al., 2004) et B. animalis subsp lactis capable de croître en
présence d'une concentration d'oxygène. (Meile et al., 1997; Masco et al., 2004).
20
Rappel bibliographique
III-4- Besoins nutritionnels :
III-4-1- Besoin en acides aminés et source de carbone :
Les bifidobactéries sont des microorganismes aux exigences nutritionnelles
élevées. La cystéine et la cystine sont des sources essentielles d'azote pour les
bifidobactéries (Ravula et Shah, 1998). Certaines espèces de bifidobactéries peuvent
aussi utiliser les sels d'ammonium comme source d'azote (Scardovi, 1986). Ces
espèces, lorsqu’elles croissent sans source d’azote organique, rejettent des taux
considérables d’acides aminés dans le milieu. Par exemple, B. bifidum peut produire
jusqu’à 150 mg/litre de thréonine. En général, les acides aminés les plus souvent
produits sont l’alanine, la valine, l’acide aspartique et la thréonine (Matteuzzi et al.,
1978).
Ces bactéries ne réduisent pas les nitrates et sont incapables de former de
l'indole, de liquéfier la gélatine, de fermenter le glycérol ou d'utiliser les acides
aminés, les acides gras et les acides organiques comme sources de carbone. Toutefois,
les carbonates ou les bicarbonates sont des sources de carbone utilisées par les
bifidobactéries (scardovi, 1986). L'utilisation des hydrates de carbone comme source
de carbone varie d'une espèce à l'autre. L'espèce B. infantis peut fermenter quatre types
de hydrate de carbone alors que l'espèce B. adolescentis peut en fermenter plus de 19
(Shah, 1997). Toutes les souches d'origine humaine sont capables d'utiliser le glucose,
le galactose, le lactose et généralement le fructose comme source de carbone.
III-4-2- Besoins en sels minéraux et vitamines :
Les besoins en minéraux ont été étudiés surtout chez B. bifidum. Cette espèce a
besoin de fer, de magnésium et de manganèse (Bezkorovainy et Topouzian, 1981).
La plupart des espèces de bifidobactéries d'origine humaine sont capables de
produire des vitamines telles que la thiamine (B1), riboflavine (B2), pyridoxine (B6),
acide folique (B9), cobalamine (B12) , acide ascorbique (C), acide nicotinique (PP) et
biotine (H). Toutefois, cette capacité est variable selon les espèces et les souches de la
même espèce. B. bifidum et B. infantis sont des grandes producteurs des vitamines
21
Rappel bibliographique
alors que B. breve et B. longum sont de faibles producteurs et certaines souches de
l’espèce B. adolescentis ne synthétisant aucune vitamine (Deguchi et al., 1985).
Les capacités synthétisant ces vitamines pourraient être importantes pour l’hôte
(animaux ou humains); les approvisionnements de vitamine pour le hôte ne peuvent
être affectés car la demande des vitamines par ces bactéries serait minimum ou zéro
dans le système gastro-intestinal. (Shah et Lankaputhra, 2002).
III-5- Métabolismes des bifidobactéries :
III-5-1- Métabolismes des carbohydrates :
La voie de fermentation des sucres par les bifidobactéries diffère des bactéries
homofermentaires et hétérofermentaires. En effet, celles-ci sont dépourvues des
enzymes aldolase et glucose-6-phosphate déshydrogénase qui sont impliquées dans la
glycolyse et la voie des hexoses monophosphates .Une voie alternative utilisée pour la
dégradation du glucose, implique la fructose-6-phosphokétolase (F6PPK) est une
enzyme typique des bifidobactéries. Le dosage de cette enzyme est d'ailleurs à l'origine
d'un test d'identification du genre Bifidobacterium (Scardovi, 1986), qui est absente
chez d'autres bactéries Gram-positives telles que Lactobacillus, Arthrobacter,
Propionibacterium, Corynebacterium et Actinomycetaceae, qui pourraient être
morphologiquement confondus avec les bifidobactéries (Shah et Lankaputhra ,2002).
Cette enzyme scinde le fructose-6-phosphate en acétyle-1-phosphate et en
érythrose-4-phosphate. Par la suite, ces métabolites intermédiaires sont transformés en
acide acétique et en acide lactique (Figure 2). Les bifidobactéries ne produisent ni
l’acide butyrique ni l‘acide propionique et le CO2 est synthétisé seulement lors de la
dégradation du gluconate (Scardovi, 1986). En théorie, les bifidobactéries produisent
des acides acétique et lactique dans un ratio de 3:2, mais on observe parfois une
perturbation de ce dernier. Il arrive que le pyruvate soit clivé en acide formique et en
acétyle-1-phosphate plutôt qu'en acide lactique. De plus, l'acétyle-1-phosphate est
parfois réduit en éthanol, ce qui génère l'apparition d'acétate, d'acide formique et
d'éthanol dans le métabolisme (De Vries et Stouthamer, 1968 ; Ruas-Madiedo et
al.,2005 ).
22
Rappel bibliographique
III-5-2- Activité protéolytique :
Les Bifidobacterium sont comparables aux bactéries lactiques par la présence
d'une activité générale d’aminopeptidase, des dipeptidases et probablement
iminopeptidases et des tripeptidases (Bockelmann et Fobker, 1991; Eggimann et
Bachmann, 1980; Meyer et Jordi, 1987).
Minagawa et al. (1985) ont dressés un profil de l'activité des exopeptidases
d'extraits cellulaires de cinq souches d'origine humaine. Une forte activité hydrolytique
sur les peptides contenant de la leucine, phénylalanine, tyrosine, ou de la valine en
position N-terminale a été observée. L'activité enzymatique contre les dipeptides
contenant de la proline en position N-terminale serait particulièrement élevée. Cheng
et Nagasawa (1984 ; 1985) ont identifié et purifié des exopeptidases, une leucine
aminopeptidase et une proline iminopeptidase à partir d'extraits cellulaires de
Bifidobacterium breve. Desjardins et al. (1990) ont détecté une activité leucine
aminopeptidase sur la plupart des souches d'origine humaine qu'ils ont testés.
El-Soda et al. (1992) ont observés une activité hydrolytique semblable à celle
de Lb. casei chez certaines espèces de bifidobactéries (B. infantis, B. longum, et B.
adolescentis). Ils ont confirmé la présence d'aminopeptidase, d’iminopeptidase et
d’une aminopeptidase, dipeptidase, tripeptidase et d’une carboxypeptidase.
23
Rappel bibliographique
2 Glucoses
2ATP
1
2ADP
Fructose-6-P
Fructose-6-P
2Pi
2
Erythrose-4-P
3
Acétyle-P
8
ATP
Sedoheptulose-7-P
Glycéraldéhyde-3-P
ADP
Acétate
4
Xylulose-5-P
Ribose-5-P
5
Ribulose-5-P
6
Xylulose-5-P
2Pi
7
2 Glycéraldéhyde-3-P
2 Acétyle-P
2NAD
2NADH2
2Pi
8
ADP
ATP
9
2NADH2
4ADP
2NAD
4ATP
2 Acétate
2 Lactate
24
Figure 2 : Représentation schématique de principales
étapes de la voie fermentative du glucose chez les
Bifidobacterium.
( Rasic et Kurmann ,1983).
1 : hexokinase et fructose-6-phosphate isomerase,
2 : fructose-6-phosphate phosphoketolase,
3 : transaldolase,
4 : transketolase,
5 : ribose-5-phosphate isomerase,
6 : ribulose-5-phosphate-3-epimerase,
7 : xylulose-5-phosphoketolase,
8 : acétate kinase,
9 : Les mêmes enzymes appliqués dans la voie
homofermentative.
Rappel bibliographique
Des souches de Bifidobacterium (B. angulatum ATCC 27535, B. breve NCFB
2258 et B. bifidum NCFB 2715) ont montré une activité protéolytique faible dans du
lait de chamelle non fermenté pendant le stockage à 4°C. Cependant ; cette activité a
augmenté brusquement après le 9e jour jusqu'à la fin de la période de stockage chez
toutes les souches excepté B. breve NCFB 2258 (Abu-Tarbaoush, 1998).
Une étude réalisé par Shihata et Shah (2000) sur le profile protéolytique des
ferments du yaourt (Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus), Lb. acidophilus et des espèces probiotiques de Bifidobacterium a
démontré que les bifidobacteries ont des niveaux élevés de l'activité intracellulaire
d'aminopeptidase mais d’une activité protéolytique très faible comparé de celle des
ferments du yaourt.
III-5-3- Activité uréasique :
Les souches les plus fréquemment uréolytiques sont celles appartenant à
l’espèce B. suis (80% des souches sont uréolytiques). Toutes les autres espèces
possèdent également des souches uréolytiques sauf B. cuniculi. Les bifidobactéries
d’origine humaine sont moins souvent uréolytiques (moins de 10 %) (Crociani et
Matteuzi, 1982).
IV- La génétique des bifidobactéries :
IV-1- Contenu en guanine+cytosine (G+C%) :
Les bifidobactéries ont un pourcentage en base G+C plus élevé que la plupart
des autres espèces bactériennes. Ce taux est en général supérieur à 55% par rapport
aux bases A+T. Jian et al., (2001) ont classé les bifidobactéries en 3 groupes : les
bifidobacteries riches en G+C (55-67%), les bifidobacteries pauvres G+C (45%) et
les bifidobactéries ayant un % G+C intermédiaire (55%). Cette classification à été
annulée par (Jian et Dong, 2002) en reclassant
Bifidobacterium inopinatum et
Bifidobacterium denticolens dans deux nouveaux genres Parascardovia inopinata et
Scardovia denticolens qui ont respectivement 45% et 55% de contenu G+C.
25
Rappel bibliographique
IV-2- Plasmides :
Un bon nombre de bactéries, incluant celles appartenant au genre
Bifidobacterium possèdent de l'ADN extrachromosomique. Les plasmides bactériens
ne sont généralement pas essentiels pour la survie de la cellule. Par contre, ils peuvent
procurer un avantage sélectif à l'hôte pour l'occupation de niches écologiques
particulières où, par exemple, les sources énergétiques sont restreintes (voies
cataboliques spécifiques) ou encore lorsque la cellule est en présence d'agents sélectifs
(résistance aux antibiotiques).
L’analyse des souches de bifidobactéries ont indiqué que les ADN
extrachromosomique sont plus rares que chez d’autre espèce de la flore intestinale
(Sgorbati et al., 1982; Iwata et Morishita, 1989; Park et al., 1997) , et dans des cas où
ils sont présent, leur taille est petit. Néanmoins 10 plasmides de Bifidobacterium
longum ont été complètement séquencés jusqu'ici: pMB1 (Rossi et al., 1996) , pKJ36
et pKJ50 (Park et al., 1997, 1999) , pBLO1 (Schell et al., 2002) , pNAC1, pNAC2 et
pNAC3 (Corneau et al., 2004) , pTB6 (Tanaka et al., 2005) , et pDOJH10S (Lee et
O'Sullivan, 2006) , et pB44 (GenBank numéro d'accession NC004443). En outre, cinq
plasmides d'autres espèces de Bifidobacterium ont été également séquencés: pVS809
de Bifidobacterium globosum (Mattarelli et al.,
1994) , pCIBb1 (O'Riordan et
Fitzgerald, 1999), pNBb1 (GenBank numéro d'accession E17316) du Bifidobacterium
breve , pAP1 du Bifidobacterium asteroides (GenBank numéro d'accession Y11549)
et p4M du
Bifidobacterium
pseudocatenulatum (GenBank numéro d'accession
NC003527).
26
Rappel bibliographique
Les antibiotiques
I-1-Définitions d’antibiotique
En 1942, Waksman a défini l’antibiotique comme étant toute substance produite par des
micro-organismes et capable, à faible concentration, d’empêcher la croissance
d’autres micro-organismes ou de les détruire Thompson, J.K.,Collins, M.A, and
Meller,W.D.(1996).
D’après les bactériologistes, les antibiotiques sont des composés naturels ou chimiques qui
agissent à faibles doses sur les micro-organismes et qui n’ont pas de toxicité sur
l’hôte. Armmuzzi,A. et al.(2001).
I-2-Classification, mécanisme et spectre d’action des antibiotiques
Les antibiotiques agissent par : Ennahar, S., et al., (1998).
-
l’inhibition de la synthèse du peptidoglycane,
-
l’inhibition de la synthèse protéique,
-
l’inhibition de la synthèse des acides nucléiques,
-
l’inhibition de la synthèse des folates,
-
l’altération des membranes.
I-2-1-Les inhibiteurs de la synthèse du peptidoglycane
I-2-1-(a) Les bêta-lactamines
Elles sont des acides plus ou moins forts qui traversent difficilement la membrane
bactérienne. Elles ont une action bactéricide. Les cibles sont les protéines liant les
pénicillines (PLP). Elles correspondent à une fonction enzymatique :
transpeptidases, glycosylases, peptidases. Thompson, J. et al.(1996).
.
27
Rappel bibliographique
Les bêta-lactamines agissent sur la membrane des bactéries. En effet elles se
fixent aux protéines liant les pénicillines (les transpeptidases et les carboxypeptidases),
indispensables à la formation du peptidoglycane. L’inhibition de ces enzymes fait
accumuler des précurseurs du peptidoglycane qui activent le système autolytique de la
bactérie (la muréine-hydrolase), entrainant ainsi sa lyse.
Les bêta-lactamines n’agissent donc que sur les bactéries en croissance. Ennahar, S., et al.,
(1998).
La classification
Elles sont divisées en plusieurs groupes :
Les pénames : Dans ce groupe, nous pouvons citer :

Les pénicillines à spectre étroit (pénicillines G et V) : elles sont actives sur les
bactéries Gram positif (cocci et bacilles), les cocci Gram négatif, la majorité des
anaérobies, les spirochètes et les tréponèmes. Mais elles sont inactives sur les bacilles
Gram négatif, Bacteroïdes fragilis, les Chlamydiae, les mycobactéries, les rickettsies,
les mycoplasmes et les gonocoques. Cintas,L.M., et al.,(2000).

Les pénicillines à spectre étroit mais résistantes aux pénicillinases
staphylococciques : il s’agit des pénicillines du groupe M inactives sur la plupart des
bactéries Gram négatif résistantes à la pénicilline G et sur les entérocoques mais très
efficaces sur les staphylocoques producteurs de pénicillinases. Nous retrouvons dans
ce groupe :
La méticilline (actuellement retirée du marché en raison des accidents
rénaux).
Le groupe des isoxazoylpénicillines (oxacilline, cloxacilline, dicloxacilline).
TenBrinck,B., et al.,(1994).

Les
pénicillines
à
spectre
élargi
vers
les
bacilles
Gram
négatif
(Escherichia, Proteus, Bordetella, Brucella, Shigella…) : il s’agit des pénicillines du
groupe A. Elles sont sensibles à certaines bêtalactamases telles que les bêtalactamases
staphylococciques, mais actives sur certains cocci Gram positif (Streptocoques,
Diplococcus
pneumoniae), et sur certains bacilles Gram positif (Listeria,
28
Rappel bibliographique
Clostridium). Elles sont en règle générale résistantes sur les cocci Gram négatif, et
habituellement sensibles sur les bacilles Gram négatif (Salmonella, Shigella,
Escherichia…). Ces pénicillines ont celles du groupe de l’ampicilline. Armmuzzi,A. ,
et al.(2001).
. Nous distinguons les produits suivants :

-
l’association ampicilline + probenicide,
-
la pro-ampicilline : Métacilline,
-
la bacampicilline,
-
la pivampicilline,
-
la métampicilline,
-
l’amoxicilline,
-
l’association amoxicilline + acide clavulanique.
Les pénicillines à spectre élargi vers les entérobactéries multirésistantes et vers les
Pseudomonas : il s’agit des N-acylpénicillines (antipyocyaniques). Elles sont sensibles
aux bêtalactamases mais actives sur les entérobactéries, les Pseudomonas. Reccio, I.,
et al., (2000).
Les principaux produits sont :
-
Les carboxypénicillines (la carbénicilline, la carfécilline, la ticarcilline,
l’association ticarcilline + acide clavulanique),
-
Les uréidopénicillines (la mézlocilline, l’azlocilline, l’apalcilline, la
pipéracilline, l’association pipéracilline + tazobactam).
-
Les amidinopénicillines : dans ce groupe, nous pouvons citer la mécillinam et la
pivmécillinam actives sur les bacilles Gram négatif uniquement, à l’exception du
Pseudomonas. Toutefois les Serratia et les Proteus sont rarement sensibles. Raccach,
M., et al. (1989).Les pénèmes Ils ont une action bactéricide. TenBrinck,B., et
al.,(1994).
Ils sont divisés en :
-
oxapénèmes,
-
carbapénèmes (imipénème, méropénème)
29
Rappel bibliographique
-
sulfopénèmes.
Les pénèmes sont actifs sur les entérobactéries, sur quelques souches de Pseudomonas et sur
certaines bactéries Gram positif. Par contre, certaines bactéries résistent à leur action.
Il s’agit des staphylocoques sécréteurs de pénicillinases, de Pseudomonas maltophila
et de Pseudomonas cepati. Thompson, et al.(1996).
Les céphèmes : Concernant leur classification, on distingue : Benkerroum,N., et al.,(2000).
* les oxacéphèmes,
* les céphalosporines,
* les céphamycines ou 7-alpha-méthoxycéphèmes,
* les carbacéphèmes.
►
Les oxacéphèmes : Le lamoxactam est l’un des principaux produits.
►
Les céphalosporines : Elles sont bactéricides et bactériostatiques.
Selon leur classification, nous pouvons distinguer :
ère
*
Céphalosporines de 1
génération
Nous avons 10 molécules : la céfalotine, la céfalexine, la céfatrizine, la céfaclor, la
céfazoline, la céfapirine, la céfradine, la céfadroxil, la céfacétrile, et la céfaloridine.
Reccio, I., et al., (2000).
Elles sont actives sur les bactéries Gram positif (streptocoque bêta-hémolytique,
Haemophilus, pneumocoque, staphylocoque sauf méti-R), et sur quelques bacilles
Gram
négatif.
Par
contre:
Citrobacter,
Enterobacter,
Pseudomonas
sont
pratiquement toujours résistants Armmuzzi,A. , et al.(2001).
ème
*
Céphalosporines de 2
génération,
On distingue les molécules suivantes : la céfamandole, la céfoxitine, et la céfuroxine.
Elles ontune grande efficacité vis-à-vis de certaines souches de bactéries Gram négatif
(Escherichia, Klebsiella, Proteus) et une efficacité amoindrie vis-à-vis des bactéries
Gram positif (pneumocoque, streptocoque). TenBrinck,B., et al.,(1994).
30
Rappel bibliographique
Cependant, certaines bactéries sont souvent résistantes. Il s’agit du Streptococcus D,
du Staphylococcus méti-R, du Pseudomonas et d’Acinetobacter. Pulsani, S.R., et al.
(1979).
ème
*
Céphalosporines de 3
génération,
Leur classification est la suivante : la céfépime, la céfopérazone, la céfotaxime, la
céfotétan, la cefpirome, la cefsulodine, la ceftazidime, la ceftizoxime, la ceftriaxone,
la céfixime, la céfotiam et la cefpodoxime. Thompson, J.K., et al.(1996).
Les céphalosporines de 3ème génération sont moins actives sur les bactéries
Gram positif et plus actives sur les entérobactéries. Elles sont actives sur de nombreux
bacilles Gram négatif, Pseudomonas, Bacteroides fragilisetles entérobactéries
(Escherichia, Citrobacter, Enterobacte, Proteus, Serratia…) Benkerroum, N., et
al.(1993).
►
Les céphamycines (ou 7-alpha-méthoxycéphèmes)
C’est une autre forme de classification pour les molécules classées par ailleurs.
On peut avoir : la céfoxitine, la céfotétan et la cefmétazole.
►
Les carbacéphème:s : On peut citer le loracarbef.
Monolactames
Les monolactames sont isolés de Chromobacterium violaceum, et sont résistants aux bêtalactamases. Ils sont des inactivateurs des céphalosporinases. Dans cette classe,
nous pouvons citer les molécules suivantes : le carumonam, le dichoate de
tigemonan et l’aztréonam (qui est le seul produit utilisé en clinique)
Benkerroum, N., et al.(1993).
Ils sont actifs sur les Enterobacteriaceae, le Pseudomonas, la plupart des cocci Gram négatif.
Les bactéries à Gram positif et les anaérobies sont toujours résistantes. Reccio, I., et
al., (2000).
31
Rappel bibliographique
Les inhibiteurs de bêta-lactamases
Dans cette catégorie, nous pouvons citer : l’acide clavulanique (qui peut être associé à
l’amoxicilline et à la ticarcilline), le tazlobactam (qui est associé à la pipéracilline) et
le sulbactam (qui peut être associé à l’ampicilline). Ces inhibiteurs ont une faible
activité intrinsèque. Thompson, J.K., et al.(1996).
I-2-1-(b) Les antibiotiques phosphoriques :
La fosfomycine
Elle est un antibiotique bactéricide. Elle possède
une action
bactéricide. Elle agit en inhibant la pyruvyl-transférase cytoplasmique, responsable
de la formation de l’acide N-Acétyl Muramique. Elle inhibe donc le premier stade de
la synthèse du peptidoglycane Savadogo, A., et al.(2004).
Certaines bactéries sont habituellement sensibles telles que: le Streptococcus pneumoniae,
le Neisseria meningitidis, l’Escherichia coli, le Citrobacter, le Klebsiella, le Proteus
mirabilis, l’Enterobacter, et l’Haemophilus sp. Raccach, M., et al. (1989).
Par contre d’autres sont résistantes telles que : les streptocoques A, B, D; l’Acinetobacter, le
Proteus morgani. Savadogo, A., Ouattara, C.A.T., Bassole, I.H.N.,and Traore, S.A et
al.(2004).
La bacitracine C’est un surfactif polypeptide cyclique (peptolide) très toxique.
Benkerroum,N., et al.,(2000).
Elle interfère avec les phospholipides de la paroi bactérienne et pertube la perméabilité
membranaire en empêchant la déphosphorilation du phospholipide indispensable à la
synthèse du peptidoglycane. Le spectre inclut les bactéries Gram positif (surtout
Staphylococcus aureus). Aslim, B., et al. (2004).
Les glycopeptides Ils sont des antistaphylococciques. On peut distinguer :
-
la vancomycine,
-
la teichoplasmine.
Ces antibiotiques inhibent la 2ème phase de la synthèse de la paroi des bactéries en
croissance, et ce après fixation précoce et irréversible aux parois bactériennes. Pulsani,
S.R., et al. (1979).
32
Rappel bibliographique
En effet, elles recouvrent le D-Ala-D-Ala terminal du pentapeptide-disaccharide
prêt à être incorporé dans le peptidoglycane en cours d’élongation. En raison de leur
volume, les glycopeptides vont ainsi empêcher l’action des glycosyltransférases et des
transpeptidases et bloquer l’élongation du peptidoglycane. Aslim, B., et al. (2004).
Il concerne les bactéries Gram positif car ils ne peuvent pas traverser la
membrane externe à cause de leur masse trop grande pour passer par les porines.
Les glycopeptides sont actifs contre les staphylocoques, les pneumocoques, les
streptocoques, les entérocoques et le Listeria… Savadogo, A., et al.(2004).
I-2-2-Les inhibiteurs de la synthèse protéique
I-2-2-(a) Les aminosides ou aminoglycosides Elles sont bactériostatiques à
faibles doses et bactéricides à fortes doses.
Elles se fixent sur des sites de la subunité 30S et ou 50S des ribosomes bactériens
entraînant une déformation du ribosome. Ce qui perturbe la synthèse des protéines. Les
aminosides induisent également des erreurs de lecture de l’ARN messager provoquant
ainsi la synthèse de protéines anormales. Pulsani, S.R., et al (1979).
Le spectre d’action : Il englobe les bactéries Gram positif et négatif.
On peut citer : Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Escherichia
Enterobacter,
Proteus,
Pseudomonas
aeruginosa,
coli, Klebsiella,
Acinetobacter,
Salmonella,
Shighella… Reccio, I., et al., (2000).
Par contre, les streptocoques, les pneumocoques, les méningocoques, les
tréponèmes, les Bacteroides, les Clostridium, les Legionella, le mycoplasme, les
Pseudomonas sont toujours résistants Benkerroum, N., et al.(1993).
I-2-2-(b) Les tétracyclines ou cyclines : Elles sont bactériostatiques ou
bactéricides.
La classification
ère
-
Les tétracyclines de 1
génération ou d’extraction
Nous avons les molécules telles que : l’oxytétracycline et la tétracycline
33
Rappel bibliographique
-
Tétracyclines de 2ème génération ou synthétiques. Dans ce groupe, nous avons les
molécules suivantes: la doxycycline, la lymécycline, la métacycline et la minocycline.
Aslim, B., et al. (2004).
Les tétracyclines se fixent sur la sous unité 30S du ribosome et inhibent la
fixation de l’aminoacyl-tARN sur son site ribosomal. Benkerroum,N., et
al.,(2000).
Elles ont un spectre large et sont efficaces contre : les Chlamydiae, les
rickettsies, les Vibrio cholerae, les Brucella, les Treponema pallidum, les
Pasteurella multicida, et les Yersinia…
Certaines bactéries sont toujours résistantes tels que : les staphylocoques, les
Neisseria et les entérobactéries. Savadogo, A., et al.(2004).
I-2-2-(c) Les phénicoles On distingue :
-
Le chloramphénicol
Il est un antibiotique à large spectre extrait de Streptomyces venezuelae en 1947
par Ehrlich. De nos jours il est obtenu par synthèse. Il est bactériostatique mais peut
être bactéricide sur certaines bactéries. Il se fixe à l’ARNr 23S sur la sous unité
50S du ribosome et inhibe la formation des liaisons peptidiques. Ses antagonistes
compétitifs sont les macrolides et les lincosamides. Aslim, B., et al (2004).
-
Le thiamphénicol
Il est un dérivé soufré du chloramphénicol et a un spectre identique à celui de
ce dernier.
I-2-2-(d) Les macrolides, les lincosamides et les streptogramines (MLS)
Ils sont bactériostatiques ou bactéricides selon leur concentration. Ils se fixent sur
la sous unité 50S et bloquent les réactions de transpeptidation et / ou de translocation.
Le spectre d’action Il est résumé dans le tableau 2.
34
Rappel bibliographique
Tableau 2: Spectre d’action des macrolides, lincosamides et streptogramines Savadogo, A.,
et al.(2004).
Habituellement
sensibles
Macrolides
Lincosamides
Streptogramines
streptocoque
staphylocoque,
bactéries
pyogenes,
streptocoque,
positif,
staphylocoque
Clostridium,
Streptococcus
méti-S,
Bacteroides
pneumoniae,
leptospires…
Gram
Staphylococcus
Parfois sensibles
Streptococcus
pneumoniae,
Neisseria
Pneumocoques
Toujours résistants
staphylocoques
gonocoques,
Méti-R,
méningocoques,
entérobactéries,
Haemophilus
La classification
-
les macrolides
Les principaux macrolides sont : l’érythromycine, l’oléandomycine, la sporéamicine, la
roxithromycine,
la
dirithromycine,
la
clarithromycine,
la
flurithromycine,
l’azithromycine, la leucomycine, la josamycine, la spiramycine, la midécamycine,
la rokitamycine et la miocamycine. Ennahar, S., et al, (1998).
-
les lincosamides
Les principaux lincosamides sont : la lincomycine, la clindamycine et la pirlimycine
(en cours de développement)
-
les streptogramines
Les principales
streptogramines
sont : la
virginiamycine,
la
pristinamycine et
l’association quinupristine + dalfopristine. Ennahar, S., et al., (1998).
35
Rappel bibliographique
I-2-2-(e) L’acide fusidique
De structure stéroïdique, il a été isolé de Fusidium coccineum en 1962. Il a un
effet bactériostatique. Il inhibe la synthèse des protéines en agissant sur le
facteur G (substance responsable de la translocation de la chaîne des peptides
durant la synthèse des protéines); ceci entraîne le blocage de la traduction de
l’ARN messager au niveau de la sous unité 50S du ribosome. Benkerroum, N., et
al.(1993).
Il est actif sur les bactéries à Gram positif, les cocci à Gram négatif, les Neisseria, les
Clostridium, les corynebactéries et les bactéries anaérobies Gram positif. Il est
particulièrement actif contre des staphylocoques. Aslim, B., et al. (2004).
I-2-3-Les inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques
I-2-3-(a) Les quinolones Elles ont une action bactéricide.
Elles sont classées en 3 générations :
ère
-
les quinolones de 1
génération
Nous pouvons citer : l’acide nalidixique, l’acide pipémidique, l’acide oxolinique, la
rosoxacine et la fluméquine. Reccio, I., et al., (2000).
-
les quinolones de 2ème génération (fluoroquinolones).
Parmi celles-ci, nous distinguons : la péfloxacine, la norfloxacine, l’ofloxacine, la
ciprofloxacine, la loméfloxacine et l’énoxacine. Ennahar, S., et al, (1998).
ème
-
les quinolones de 3
génération (fluoroquinolones) : la sparfloxacine
Après pénétration des quinolones dans la membrane externe des bactéries, elles
inhibent la réplication de l’ADN. En effet, les quinolones agissent sur les topoisomérases
(gyrase, topoisomérase de type 1) qui sont des enzymes régulant les changements de
formes topologiques de l’ADN. Il s’en suit alors la formation d’un complexe
ADN-Gyrase-Quinolone. Ainsi elles empêchent la réplication, transcription,
recombinaison, réparation au niveau du noyau cellulaire inhibant donc la synthèse
de l’ADN. Reccio, I., et al., (2000).
36
Rappel bibliographique
I-2-3-(b) Les rifamycines
Les principales rifamycines du marché sont : la rifampicine, la rifabutine et la rifamycine
TenBrinck,B., et al.,(1994).
Elles sont bactéricides. Elles se fixent sur l’ARN polymérase en formant un complexe
irréversible. Ainsi elles inhibent la RNA-polymérase bactérienne et bloquent la
formation de l’ARN messager. Il est très large. On a entre autres : la plupart des
cocci Gram positif (streptocoques, pneumocoques, staphylocoques..), les Neisseria,
les Haemophylus influenzae, les Listeria, les Clostridium, les Escherichia coli, les
Enterobacter, les Proteus, les Serratia, les Klebsiella, les Acinetobacter, les
Providencia, les Brucella, les Salmonella, les Shigella, les Pseudomonas aeruginosa…
Savadogo, A., et al.(2004).
I-2-3-(c) Les dérivés 5-nitro-imidazolés
Dans ce groupe, nous pouvons citer : la métronidazole qui est le chef de file, la
mimorazole, l’ornidazole, la tinidazole et la secnidazole.
Ils ont une action bactériostatique et bactéricide liée à la lipophilie de la molécule et se
fixent sur l’ADN. Armmuzzi,A. , et al.(2001).
I-2-3-(d) La mupirocine
La mupirocine inhibe l’isoleucyl-ARN-synthétase qui permet la synthèse de l’ARN de
transfert. Elle est active sur les staphylocoques. Ennahar, S., et al., (1998).
I-2-3-(e) La novobiocine
Elle est bactériostatique mais le mécanisme d’action n’est pas bien élucidé.
Parmi les germes sensibles on peut citer : les staphylocoques, les Haemophilus, les
Neisseria. Aslim, B., et al (2004).
I-2-3-(f) Les nitrofuranes
Nous pouvons citer :
-
les nitrofuranes résorbables : la nitrofurantoïne
-
les nitrofuranes non résorbables : la nifuroxazide, la nifurzide.
Elles ont une action bactéricide en inhibant le fonctionnement normal de
l’ADN bactérien. Reccio, I., et al (2000).
37
Rappel bibliographique
Habituellement sensibles : staphylocoque, streptocoque D, Escherichia coli
Parfois sensibles : Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus
Toujours résistants : Pseudomonas Pulsani, S.R et al. (1979).
I-2-4-Les inhibiteurs de la synthèse des folates
I-2-4-(a)Les sulfamides
Les sulfamides sont bactériostatiques. La bactérie édifie l’acide folique à partir de
l’acide para-amino-benzoïque, l’acide glutamique et la ptéridine grâce à une
enzyme appelée la dihydrofolique acide synthétase. Pulsani, S.R., et al. (1979).
L’acide folique ainsi secretée doit être réduite par une hydrofolate réductase en
tétrahydrofolate acide synthétase. Cintas,L.M., et al (2000).
Les sulfamides inhibent la dihydrofolique acide synthétase et bloquent ainsi la
synthèse de l’acide folique. Cintas,L.M., et al (2000).
Le triméthoprime et la pyriméthamine inhibent l’hydrofolate réductase et bloquent
également la synthèse de l’acide folique. Ceci explique la synergie d’action entre
sulfamides et triméthoprimes. Ennahar, S., et al (1998).
-
Les sulfamides seuls Dans ce groupe nous pouvons citer : la sulfadiazine, la
sulfaméthoxazole, la sulfadoxine (+pyriméthamine), la sulfaméthizol, la
sulfanilamide, la sulfacétamide, la sulfadiazine argentique, la sulfaguanidine, la
salazosulfa-pyridine, la mésalazine et l’olsalazine. Benkerroum, et al (1993).
-
Les associations sulfamides + triméthoprime
Les préparations disponibles sont : le cotrimoxazole (association sulfaméthoxazole +
triméthoprime) et l’association sulfadiazine + triméthoprime. Armmuzzi,A. , et al
(2001).
38
Rappel bibliographique
I-2-5-Les antibiotiques qui provoquent l’altération des membranes
I-2-5-(a) Les polymyxines
Elles appartiennent à la classe des polypeptides cycliques et sont extraites de
Bacilluspolyxema. Cintas,L.M., et al (2000).
On distingue 5 types de polymyxines :
*
polymyxine A,
*
polymyxine B,
*
polymyxine C,
*
polymyxine D,
*
polymyxine E (colistine).
Les polymyxines A, D, C sont trop toxiques ; c’est pour cette raison que seules les
polymyxines B et E sont utilisées. Cabo, M.L., et al (1999).
Les polymyxines pénètrent dans la bactérie et se fixent sur les phospholipides
des membranes externes et cytoplasmiques. Ceci entraîne la désorganisation de
celles-ci. Ivanova, I et al (1998).
Elles
sont actives
contre
les germes
Gram
négatif : Escherichia
coli,
Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Vibrio, Shigella… Pulsani, S.R., et al (1979).
I-2-5-(b)La gramicidine
Elle
réagit
également
avec
les
phospholipides
et
détruit
la
membrane
cytoplasmique. Elle est active sur les bactéries Gram positif. Aslim, B. et al (2004).
II- la résistance bactérienne aux antibiotiques
Pour être efficace, un antibiotique doit pénétrer dans la bactérie, sans être détruit ni être
modifié,
se fixer sur une cible et perturber la physiologie bactérienne. Un
antibiotique peut être caractérisé par son spectre d’action. Cabo, M.L et al (1999).
Normalement les espèces bactériennes n’appartenant pas au spectre d’action d’un
antibiotique sont les seules résistantes à cet antibiotique. Tagg, J.R., et al (1976).
39
Rappel bibliographique
Depuis l’émergence de nouvelles molécules d’antibiotiques dans la thérapeutique, on
constate que beaucoup de bactéries appartenant au spectre d’action d’un
antibiotique ne sont plus sensibles à ce dernier. TenBrinck,B., et al (1994).
II-1- Définitions
Une souche bactérienne est dite résistante à un antibiotique lorsqu’elle peut croître en
présence d’une concentration plus élevée de cet antibiotique que la concentration
qui inhibe la majorité des souches de la même espèce (tableau 3). Pulsani, S.R et al
(1979).
II-2- Les types de résistance :
- résistances naturelles : leur mécanisme sur le génome bactérien, est constant dans
un taxon et est généralement chromosomique. Elles correspondent à la résistance
de toutes les souches d’une même espèce bactérienne à un antibiotique.
Elles sont dues soit à une absence de cible pour l’antibiotique soit à une
imperméabilité de la paroi à cet antibiotique. Cadirci, H et al (2005).
Par exemple les entérobactéries sont résistantes aux macrolides.
-
résistances acquises dues à des modifications génétiques, chromosomiques ou
plasmidiques. Elles ne concernent que quelques souches, d’une même espèce,
normalement sensibles à un antibiotique donné. Cintas,L.M., et al (2000).
II-3- Les niveaux de résistance
On parle de résistance de bas niveau lorsque la croissance des bactéries est arrêtée par
de faibles doses d’antibiotique et de résistance de haut niveau lorsque cette
croissance bactérienne est stoppée par de fortes concentrations d’antibiotique. Cabo,
M.L et al (1999).
II-4- Mécanisme d’apparition des résistances :
-
la transmission verticale
Lorsque les conditions de vie deviennent désagréables, la bactérie peut muter et
transmettre à sa descendance la résistance. Tagg, J.R., et al (1976).
40
Rappel bibliographique
-
la transmission horizontale
Les bactéries
peuvent
être
parasitées
par
des
virus dont
l’ADN
code une multirésistance aux antibiotiques. Elle est responsable de la majorité
des résistances. Tagg, J.R., et al (1976).
II-5- Le support génétique de la résistance
La résistance naturelle est sur le génome bactérien.
La résistance acquise est due à une mutation chromosomique ou à une acquisition de
gène (résistance extra-chromosomique). TenBrinck,B et al(1994).
II-6- Les résistances mutationnelles ou mutations chromosomiques
Elles sont dues aux mutations de gènes existants. Elles sont :
-
spontanées : elles existent avant l’utilisation d’antibiotique et ne sont donc pas
provoquées par la présence d’antibiotique. Tagg, J.R., et al (1976).
-
stables : elles se transmettent verticalement dans le clone bactérien.
- spécifiques : elles ne concernent qu’un seul antibiotique ou qu’une famille
d’antibiotiques. Dans ce cas, la résistance à un antibiotique peut aboutir à une
résistance croisée pour des antibiotiques appartenant à une même famille.
-
rares : le taux de mutation est faible et est de l’ordre de 10 –7 et 10-8 .
Les résistances chromosomiques sont rares en clinique. Cabo, M.L., et al (1999).
II-7- Les résistances extra-chromosomiques
Elles ont pour support un plasmide ou un transposon. Ce mécanisme de résistance est
certainement le plus fréquent en clinique (80 à 90% de souches résistantes).
La résistance plasmidique concerne la plupart des antibiotiques sauf les
rifamycines, les polypeptides, les nitrofuranes, les quinolones, les glycopeptides.
Elles ont les caractéristiques suivantes :
- elles sont fréquentes : c’est cette forme de résistance qui est la plus souvent
rencontrée.
- elles sont contagieuses et ont une transmission horizontale entre bactéries
cohabitantes de même espèce ou d’espèces différentes.
41
Rappel bibliographique
-
elles peuvent concerner plusieurs antibiotiques ou plusieurs familles d’antibiotiques
et peuvent entraîner des polyrésistances. Cintas,L.M., et al (2000).
Apparition du phénomène en clinique
En 1955 au Japon est apparue une épidémie de dysenterie bacillaire due à Shigella
flexneri
résistante
à
plusieurs
antibiotiques simultanément
(streptomycine, chloramphénicol, tétracycline, sulfamides). Pulsani, S.R., et al
(1979).
Les plasmides
Ce sont des molécules d’ADN bicartenaires, circulaires extra-chromosomiques, douées de
réplication autonome, qui sont transmises de façon stable au cours des générations et
qui peuvent exister séparément du chromosome bactérien ou y être intégrées. Tagg,
J.R et al (1976).
Une bactérie pathogène est fréquemment résistante aux antibiotiques parce qu’elle
contient un plasmide de résistance porteur d’un ou de plusieurs gènes de résistance
: ce sont des plasmides R (plasmides de résistance). Aslim, B. et al (2004).
Un plasmide R dans une cellule peut être rapidement transmis à d’autres cellules
par des mécanismes d’échange génétique tels que la conjugaison (par simple contact
entre bactéries ou par contagion directe), la transduction (par l’intermédiaire d’un
vecteur qui peut être un virus de bactérie, un bactériophage), la transformation.
Le facteur de résistance est formé de plusieurs déterminants génétiques :
-
caractères de résistance (souvent à plusieurs antibiotiques à la fois),
-
gènes de transfert d’une bactérie résistante à une bactérie sensible,
-
d’autres gènes éventuels.
Les plasmides de résistance peuvent conférer la résistance à un ou plusieurs
antibiotiques appartenant à des familles différentes.
Les plasmides de résistance sont rencontrés principalement chez les staphylocoques
(chez qui ils sont transmis par transduction) et les bacilles Gram négatif (chez qui
ils sont transmis par conjugaison). Cabo, M.L et al (1999).
42
Rappel bibliographique
II-8-Les transposons
Les transposons sont des séquences d’ADN capables de promouvoir leur translocation
d’un réplicon sur un autre (transposition intermoléculaire) ou en un autre site du
même réplicon (transposition intra-moléculaire), en absence d’homologie entre les
ADN qui interagissent et
indépendamment des fonctions de
recombinaison
réciproque de la bactérie-hôte. Aslim, B. et al (2004).
Le caractère transposable chez la majorité des gènes est responsable de l’apparition des
souches multi-résistantes. Cadirci, H et al (2005).
III-Les mécanismes de la résistance bactérienne Les bactéries se défendent contre
les antibiotiques par :
-
réduction de la quantité d’antibiotique atteignant la cible par diminution de la
perméabilité (obstruction ou disparition des porines) ou par apparition de
systèmes d’efflux (protéines jouant le rôle de pompe à extrusion qui expulsent
l’antibiotique dès qu’il apparaît dans la cellule bactérienne), Cintas,L.M., et al (2000).
- inactivation de l’antibiotique par destruction ou modification de la molécule par
ajout de radicaux,
-
modification de la cible de l’antibiotique. Nunez, M., et al (1996).
43
Rappel bibliographique
Tableau 3: Principaux mécanismes de résistance acquise aux antibiotiques
Armmuzzi,A. , et al(2001).
T y p e s
d e
r é s i s t a n c eM é c a n i s m e s
A l t é r a t i o n
d e
l a
d e
r é s i s t a n c e
c i b l e
- aminosides
- Altération des protéines ribosomales
- bêta-lactamines
- Altération ou nouvelle PLP
- macrolides, lincosamides, streptogramines
- Méthylation de l’ARN ribosomal
- quinolones
- Altération de la topo-isomérase II et IV
- rifampicine
- Altération de l’ARN-polymérase
- sulfamides
- DHPS insensible
- tétracyclines
- Protection ribosomale
- triméthoprime
- DHFR insensible
- glycopeptides
- Modification de la structure du précurseur du peptidoglycane
Détoxification enzymatique
- Aminosides
- Acétyltransférases, adénylyl-ransférase, phosphotransférases
- Bêta-lactamines
- chloramphénicol
- Macrolides
- Lincosamides
- Streptogramines A, B
- Bêta-lactamases
- Acétyltransférases
- Estérases, phosphotransférases
- Nucléotidyltransférases
- Acétyltransférases, hydrolases
Modification de la per méabilit é
- Altération des protéines des membranes externes (porines)
-Bêta-lactamines, quinolones, chloramphénicol, tétracyclines, triméthoprimes, sulfamides, polymixines
-Erythromycine, lincosamides, quinolones, tétracyclines.
- Efflux actif, nouveaux système de transport membranaire
ARN : acide ribonucléique ; PLP : protéines liant la pénicilline ; DHFR : dihydrofolate
réductase, DHPS : dihydroptéroate synthétase. Nunez, M., et al (1996).
44
Rappel bibliographique
III-1- Les enzymes inactivant les antibiotiques
L’inactivation se fait par modification ou par hydrolyse de l’antibiotique.
Leurs substrats sont les bêtalactamines, les aminosides, le chloramphénicol, les macrolides,
les lincosamides et les streptogramines. Pulsani, S.R., et al (1979).
Les bêtalactamases
Les bactéries résistantes élaborent les bêtalactamases qui sont des enzymes qui
agissent sur la structure de l’antibiotique par ouverture du cycle bêta lactame. Ainsi
ces enzymes hydrolysent les bêtalactamines (tableau 4).
Parmi ces bêtalactamases, on peut citer principalement les pénicillinases (qui
détruisent les pénicillines) et les céphalosporinases (qui détruisent les céphalosporines).
Les pénicillinases ont pour substrat préférentiel les pénicillines G, les aminopénicillines,
les carboxypénicillines et les uréidopénicillines. TenBrinck,B., et al(1994).
Les céphalosporinase hydrolysent principalement les céphalosporines de 1ère génération et
certaines céphalosporines de 2ème génération mais aussi les pénicillines G et les
aminopénicillines. Cadirci, H., et al (2005).
Les bêtalactamases sont définis par certains caractères qui sont :
-la
localisation :
elle
est
extracellulaire
pour
les
bactéries
Gram
positif
et
périplasmique pour les bactéries Gram négatif. Nunez, M., et al (1996).
-
la biogenèse : elle est inductible (pénicillinase de Staphylococcus aureus et
céphalosporinase des bactéries Gram négatif) ou constitutive (pénicillinase des
bactéries Gram positif). Aslim, B. et al (2004).
-
le déterminisme génétique : il est chromosomique (céphalosporinases) ou
plasmidique (pénicillinases des bactéries Gram négatif). Nunez, M., et al (1996).
-
la sensibilité aux inhibiteurs tels que l’acide clavulanique (les pénicillinases sont
inhibées, les céphalosporinases résistent). TenBrinck,B., et al (1994).
45
Rappel bibliographique
Tableau 4 Principales caractéristiques des bêtalactamases
Extracellulaire
Périplasmique
Chromosomique
Plasmique
Inductible
Constitutive
Inhibée par l’acide
clavulanique
Pénicillinases de
Pénicillinases des Céphalosporinases
S. aureus
+
+
+
-
Gram négatif
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Les bêtalactamases sont généralement contrôlées par le chromosome ou par le
plasmide. Raccach, M., et al (1989).
III-2-
Résistance par diminution de la perméabilité
Pour être efficace tout antibiotique doit d’abord pénétrer dans la cellule bactérienne. Tout
facteur altérant la perméabilité cause une résistance. Ce mécanisme ne concerne que
les bactéries Gram positif car les antibiotiques diffusent de façon libre à travers le
peptidoglycane. Armmuzzi,A. , et al (2001).
Chez les bactéries Gram négatif, les polysaccharides de la membrane externe forment une
barrière qui s’oppose à la pénétration des antibiotiques. Mais les porines (protéines
formant des canaux) permettent le passage des molécules hydrophiles (pénicillines
à large spectre, céphalosporines, aminosides, phénicolés, tétracyclines). Cabo, M.L.,
et al (1999).
Des mutations entraînent des résistances acquises souvent croisées à plusieurs
familles
d’antibiotiques chez les entérobactéries (Escherichia coli, Proteus
mirabilis, Salmonella, Serratia). Aslim, B. et al (2004).
Une modification de la composition des lipopolysaccharides semble être la cause de la
résistance des Pseudomonas aux bêtalactamines. Nunez, M., et al (1996).
Une modification d’une porine spécifique entraîne une résistance isolée à l’imipenem
chez Pseudomonas aeruginosa. Aslim, B. et al (2004).
46
Rappel bibliographique
Un mécanisme oxydatif permet le transport actif des aminosides à travers la membrane
cytoplasmique. Ce mécanisme peut être inactivé par mutation ; ceci entraîne
une résistance croisée à tous les aminosides. Aslim, B. et al (2004).
Les résistances peuvent également être causées par un défaut de perméabilité aux
antibiotiques
(phénicolés, quinolones, sulfamides, triméthoprime),
par
intracellulaire
une insuffisance
de
par
rapide ou
sécrétion
ou
concentration
efflux
(tétracyclines).
Armmuzzi,A. , et al (2001).
III-4-Résistance par modification de la cible
Pour être efficace un
antibiotique doit se fixer sur sa cible. Toute modification ou
altération de cette cible entraîne une résistance. Aslim, B. et al (2004).
-
Modification des protéines de liaison à la pénicilline (PLP)
Les PLP sont des enzymes qui interviennent dans l’assemblage du peptidoglycane. La
fixation des bêtalactamines inactive ces enzymes entraînant ainsi le blocage de
la synthèse du peptidoglycane. Ainsi la bactérie est donc privée de paroi. Pulsani,
S.R., et al (1979).
Ce sont des résistances mutationnelles (staphylocoques, entérocoques) ou acquises par
transformation (pneumocoques). Raccach, M., et al (1989).
-
Modification de la cible ribosomale
Les ribosomes étant des lieux de synthèse protéique, ils peuvent être altérés par la
fixation d’un antibiotique. Gratia, A. (1946).
Toute modification acquise par mutation de la cible ribosomale diminue l’affinité du site
de fixation de l’antibiotique et rend la bactérie résistante. Ainsi on peut observer
des résistances aux tétracyclines, macrolides, lincosamides, phénicolés, fucidine et
plus rarement aux aminosides. Raccach, M., et al (1989).
47
Rappel bibliographique
-
Altération de la synthèse des acides nucléiques
L’inhibition de l’action de l’ADN gyrase, indispensable à la réplication de l’ADN, permet
aux quinolones d’avoir un effet bactéricide. Des mutations
peuvent
entraîner la production d’enzymes insensibles à ces antibiotiques. Barefoot,
S.F. et al (1983).
Les rifampicines bloquent l’action de l’ARN polymérase nécessaire à la synthèse de
l’ARN messager. La production de transcriptase modifiée est la cause des
résistances acquises par mutation. Cintas,L.M., et al (2000).
Enterococcus
faecalis est résistant naturellement aux sulfamides tandis que
Acinetobacter, Pseudomonas, Mycobacterium, Enterococcus le sont au triméthoprime.
Barefoot, S.F. et al (1983).
Les résistances sont acquises par mutation ou codées par des plasmides ou des
transposons. Nunez, M., et al(1996).
III-5-Les bactéries multi-résistantes
Elles sont résistantes à plusieurs familles d’antibiotiques.
-
Streptococcus pneumoniae : de sensibilité diminuée à la pénicilline pour
lesquels la CMI de la pénicilline dépasse 0,06 mg/l. Les souches pour lesquelles cette
CMI dépasse 1 mg/l sont résistantes. Pette, J.W. et al (1950).
-
Staphylocoques méticillino-résistants (Staph. Méti R ou SARM) : dont la
résistance est due à une modification des protéines de liaison à la pénicilline. Elles
sont
résistantes
aux
bêtalactamines
et
aux
fluoroquinolones.
Les
glycopeptides et les synergistines restent actifs. Pette, J.W. et al (1950).
-
Les
entérobactéries
et
les
souches
de
Pseudomonas
productrices de céphalosporinase déréprimée : e l l e s sont résistantes aux
bêtalactamines, uréidopénicillines, carboxypénicillines, céphalosporines de 3ème
génération, monobactames. Mais elles sont sensibles à l’imipénème et aux
ème
dernières céphalosporines de 3
génération (cefpirome, cefépime). Pette, J.W. et al
(1950).
48
Rappel bibliographique
Les Pseudomonas sont résistants aux pénicillines A,
ère
1
G et M, aux céphalosporines de
ème
et 2
génération et à la plupart des céphalosporines de
3ème
génération.
Mais ils sont sensibles aux carboxypénicillines, aux uréidopénicillines, aux
céphèmes et aux céphalosporines de 3ème
génération dites antipyocyaniques
(cefsulodine, céfépime, cefpirome). Cintas,L.M., et al (2000).
Les
souches
hyperproductrices
de
céphalosporinases
sont
résistantes
aux
carboxypénicillines et uréidopénicillines.
Certaines souches bactériennes sont résistantes à l’imipémème.
Les entérobactéries productrices de bêtalactamase à spectre étendu (Klebsiella,
Enterobacter…) sont résistantes à toutes les bêtalactamines sauf l’imipénème et les
céphamycines. Pette, J.W. et al (1950).
-
Les Acinetobacter sont naturellement résistants à de nombreux antibiotiques
(pénicillines, céphalosporines, aminosides, quinolones). Seuls l’imipénème, les
carboxypénicillines, les uréidopénicillines associées à un inhibiteur restent actifs.
Pette, J.W. et al (1950).
IV- LES PHENOTYPES DE RESISTANCE DES BACILLES GRAM NEGATIF
AUX ANTIBIOTIQUES
IV-1- Les résistances naturelles
Les entérobactéries ont une résistance naturelle vis à vis de la pénicilline G et peuvent
être divisées en 4 groupes en fonction de leur comportement vis à vis des
bêta- lactamines (tableau 5) Cadirci, H., et al (2005).
:
49
Rappel bibliographique
Tableau(5) Entérabactéries et bêta-lactamines Barefoot, S.F.and Klaenhammer, T.R.,
(1983).
Groupe 1
Groupe 2
Groupe 3
Groupe 4
E. coli
Klebsiella
Enterobacter
Yersinia
Proteus
mirabilis Citrobacter
Salmonella Shigella diversus Levinea
Serratia
Morganella
Providencia
* Les entérobactéries du groupe 1 : elles sont sensibles aux bêta-lactamines (exceptées
les pénicillines G et M). Le phénotype sauvage est sensible aux aminopénicillines.
* Les entérobactéries du groupe 2 : elles produisent à bas niveau une pénicillinase
naturelle
et sont
résistantes
aux aminopénicillines,
uréidopénicillines
et carboxypénicillines. Pulsani, S.R et al (1979).
* Les entérobactéries du groupe 3 : elles secrètent à bas niveau une céphalosporinase
naturelle et sont résistantes aux aminopénicillines et aux céphalosporines de
1ère génération.
* Les entérobactéries du groupe 4 : elles sont résistantes aux aminopénicillines,
uréidopénicillines, carboxypénicillines et aux céphalosporines de 1ère génération
par l’action associée d’une pénicillinase et d’une céphalosporinase naturelle produite
à bas niveau. Raccach, M et al (1989).
50
Rappel bibliographique
Tableau 6: Attitudes des entérobactéries vis à vis desbêta-lactamines Raccach, M., et al
(1989).
Groupe de bêtaLactamines
Amino Carboxy
Uréido C1G C3G
Carbapénèmes
Mécanismes de
Résistance
Groupe 1
S
S
S
S
S
S
Groupe 2
R
R
I
S
S
S
Groupe 3
R
S
S
R
S
S
absence de bêta- pénicillinase céphalosporinase
lactamase
Groupe 4
R
R
I
R
S
S
pénicillinase +
céphalosporinase
Amino : aminopénicilline, Carboxy : carboxypénicilline,
Uréido : uréidopénicilline, C1G : céphalosporine de 1ère génération,
C3G : céphalosporine de 3ème
génération, S : sensible, I : intermédiaire, R :
résistant
VI-2- Résistance acquise : Phénotypes de résistance des bacilles Gram négatif aux bêtalactamines
Nous avons identifié 6 phénotypes qui sont :
-
phénotype sensibles (P.S.)
Les souches de ce phénotype sont sensibles aux bêta-lactamines. Il s’agit
des entérobactéries du groupe 1.
-
phénotype pénicillinase de bas niveau (P.B.N.)
Les souches sont résistantes à l’amoxicilline et sensibles à l’association amoxicilline +
acide clavulanique, à la céfalotine et à la ceftriaxone. Pette, J.W. et al (1950).
-
phénotype pénicillinase haut niveau (P.H.N.)
Les souches sont résistantes à l’amoxicilline, à l’association amoxicilline + acide
clavulanique, à la céfalotine mais sont sensibles à la ceftriaxone. Barefoot, S.F.
et al (1983).
51
Rappel bibliographique
Les
phénotype pénicillinase résistante aux inhibiteurs des bêta-lactamases (T.R.I.)
souches
sont résistantes à l’amoxicilline, l’association amoxicilline +
acide clavulanique mais sont sensibles à la céfalotine et à la ceftriaxone.
-
Phénotype céphalosporinase inductible (C.Ind.) Cintas,L.M., et al (2000).
Les souches de ce phénotype sont résistantes à l’amoxicilline, à l’association
amoxicilline + acide clavulanique, à la céfalotine mais sont sensibles à la
ceftriaxone et à la ticarcilline. Barefoot, S.F. et al (1983).
-
phénotype céphalosporinase déréprimée (C.D.)
Les souches sont résistantes à l’amoxicilline, à l’association amoxicilline + acide
clavulanique, à la ticarcilline, à la céfalotine et à la ceftriaxone mais elles sont
sensibles au mécillinam. Cadirci, H., et al (2005).
-
phénotype bêta-lactamase à spectre élargi (B.L.S.E.)
Les souches de ce phénotype sont résistantes à l’amoxicilline, à l’association
amoxicilline + acide clavulanique, à la céfalotine et à la ceftriaxone.
Benkerroum, N., et al(1993).
52
Matériel et Méthodes
Matériel et Méthodes
1. Matériel biologique:
Les souches de Bifidobacterium utilisées dans cette étude ont été isolées de
deux
yaourts probiotiques, Yaourt Soumame et le Yaourt Activia produits et
commercialisés en Algérie.
2. Les milieux de culture :
Les milieux de cultures utilisés lors cette étude sont MRS (De Man et al., 1960)
additionnées de la cystéine chlorhydrique avec une concentration finale de 0,05% (p/v)
et milieu Beerens (Beerens, 1990). Les milieux utilisés étaient soit du milieu liquide,
soit du milieu solide additionné d'Agar à 1,5% pour les milieux solide et 0,7% pour les
géloses molles (composition voir l’annexe).
I/ Isolement et identification des Bifidobacterium
1. Isolement et purification des Bifidobacterium
A partir de 10 gramme de chaque yaourts probiotiques bien homogénéisés nous
avons réalisé une série de dilution décimale dans une solution Ringer-cystéine (¼)
(Martin-Diana et al., 2003)(composition voir l’annexe). Cent microlites des dilutions
(10-5, 10-6 et 10-7) sont ensemencés sur gélose Beerens. Les boites sont incubées à
37°C pendant 48 à 72 heures en anaérobiose (GENbag, bioMérieux- France). Ensuite,
on prend de chaque boite 10 colonies isolées de forme caractéristique sur lesquelles
sera effectuée une coloration de Gram et une recherche de la catalase. Les bactéries
aux formes bacillaires polymorphes à Gram-positive et catalase-négatif sont retenues
et repiquées sur le bouillon MRS-cys (Figure 3).
A partir des cultures en bouillons nous avons effectué une série de repiquage
sur le milieu MRS-cys gélosés pour but d’avoir des cultures pure. L’opération est
renouvelée en prenant chaque fois au hasard une colonie isolée. Ceci conduit à obtenir
une culture dont la pureté est estimée par observation microscopique après coloration
de Gram.
51
Matériel et Méthodes
2. Conservation des souches :
Les souches sont cultivées sur leurs milieux gélosés inclinés à 37°C pendant
48h. Ensuite les tubes sont conservés à 4°C. Les cultures sont repiquées toutes les
deux semaines.
La conservation des souches à long terme fut préparée en ajoutant à une culture jeune
du glycérol stérile et d’une solution de lait écrémé stérile dans des rapports d'un 2:5:5.
Le mélange fut ensuite congelé à -20°C. Avant toutes utilisations des souches, une
culture congelée était réactivée et repiquée sur son milieu à 37°C pendant 2 nuits
successives (Bolduc et al., 2006).
3. identification physiologique et biochimique :
3.1 Croissance à 45°C :
Les souches de bifidobactéries ont été ensemencées sur le milieu bouillon
MRS-cys et incubées à 45°C pendant 48h en anaérobiose.
3.2 Test de croissance en aérobiose :
Nous avons préparé une culture sur le milieu MRS-cys gélosé pour les souches
de bifidobactérie et ont été incubées à 37°C en aérobiose pendant 72 h.
3.3 Test de croissance en milieu à pH 3,5 et à pH 8,5 :
Ce test a été réalisé sur milieu bouillon MRS-cys à pH 3,5 et à pH 8,5. Ensuite,
les tubes ont été incubés à 37°C pendant 48h en anaérobiose.
3.4 La production de CO2 de la fermentation du glucose : (Garvie, 1984)
Pour déterminer la production de CO2 de la fermentation de glucose par les
souches de bifidobactérie, nous avons ensemencé des colonies d’une culture pure dans
le milieu bouillon MRS-cys contenant une cloche de Durham et incubé à 37°C pendant
24h en anaérobiose. La présence de gaz dans la cloche indique qu’il y a production de
CO2 .
52
Matériel et Méthodes
Figure 3: Schéma résume les étapes suivies pour l’isolement des bifidobactéries des yaourts
probiotiques
53
Matériel et Méthodes
3.5 Test de la nitrate réductase : (Marchal et al., 1991)
Les souches de bifidobactérie ont été ensemencés en bouillon nitrate (1% de
nitrate de potassium), après une incubation à 37°C en anaérobiose, on ajoute 5 goutte
de réactif (Nit1) et 5 goutte de réactif (Nit2) (voire l’annexe).

Si le milieu devient rouge donc la bactérie est nitrate réductase positive.

Si le milieu reste incolore, on ajoute un peu de poudre de zinc. Le milieu
devient rouge donc le zinc a réduit les nitrates de milieu et la bactérie est nitrate
réductase négative. Le milieu est incolore la bactérie est nitrate réductase positive.
8.6 Test d’uréase :
Pour réaliser ce test nous avons employés le milieu Urée-tryptophane
(composition voir l’annexe). Nous avons préparés une suspension dense d’une culture
de bifidobactérie et on l’a ensemencé dans le milieu. L’incubation a été faite à 37°C en
anaérobiose. Les résultats du test sont comme suite

L’apparition de la couleur rouge ça signifié que le test est positive.

L’apparition de la couleur jaune ça signifié que le test est négative.
4. Profil fermentaire :
Plusieurs colonies isolées d’une culture pure ont été repiquées dans 5ml de
milieu MRS-cys bouillon, incubé à 37°C pendant 24 h. La culture a été centrifugée à
3100 tr/min pendant 10 minutes (centrifugeuse Jouan B3.10, France), lavée deux fois
avec 2 ml solution Ringer cystéine(¼). En suit, le culot a été suspendu dans 5 ml de la
même solution. Cinquante microlitre de la suspension a été inoculer dans 5 ml de
milieu MRS-cys bouillon sans glucose et extrait de viande dans lequel on avait
additionnés des sucres a testés (Lév.: Lévulose; Gly.: Glycérol; Gal.: Galactose; Rh.:
Rhamnose; Man.: Mannose; Fru.: Fructose; Xyl.: Xylose; Mann.: Mannitol; Sal.:
Salicine; Tré.: Tréhalose; Méli.: Mélibiose; Inu.: Inuline; Mal.: Maltose; Sac.:
Saccharose; Mél.: Mélizitose; Lac.: Lactose; Am.: Amidon; Ara.: Arabinose; Sor.:
Sorbitol; Rib.: Ribose; Raf.: Raffinose) avec une concentration finale de 2 % (p/v).
Les tubes ont été recouverts avec 1 ml de l’huile de paraffine stérile pour obtenir
l’anaérobiose et incuber à 37°C pendant 24 à 48 h. La fermentation des sucres a été
54
Matériel et Méthodes
révélée par l’addition d’un indicateur coloré de pH (pourpre de bromocrésol à 0,004%
(p/v)).
II/ Etude probiotique des souches de Bifidobacterium isolées
1/ Effet du milieu hyperacide (pH 2) sur la viabilité des bifidobactéries :
Dix (10) ml d’une culture jeune sur MRS-cystéine de chaque souche de
Bifidobacterium ont été centrifugés à 3100 tr/min pendant 15 minutes. Les culots (les
cellules bactériennes) ont été resuspendues en volume égal dans le bouillon MRScystéine ajusté à pH 2 avec du HCl 1M. Ensuit les suspensions bactériennes ont été
incubées à 37˚C dans des conditions anaérobies pendant 60 minutes.
La viabilité des souches de Bifidobacterium étaient déterminées avant et après
l'incubation en diluant des échantillons dans la solution Ringer-cystéine (¼) et
ensemencé par étalement sur gélose MRS-cystéine. Des boite de Pétri ont été incubés
dans des conditions anaérobies à 37˚C pendant 24-48 h. Les boites qui contiennent
entre 30 et 300 colonies sont retenu pour le dénombrement.
2/ Etude de la sensibilité des Bifidobacterium aux antibiotiques :
La sensibilité des Bifidobacterium aux antibiotiques: Ampicilline (AM;
10µg), Pénicilline G (P; µg10), Cloxacilline (OX; 5µg), Erythromycine (E; 15UI)
Vancomycine (VA; 30µg), Chloramphénicol (C; µg30), Tétracycline (TE; 30UI),
Kanamycin (Kan; µg 30), Néomycine (N; 30UI) et Streptomycine (S; 10UI)
(Diagnostique Pasteur –France) a été déterminées par deux méthodes

La méthode de diffusion sur gélose (méthode des disques).

La méthode de dilution en milieu liquide.
2-1/ Préparation d’inoculum bactériens
L’inoculum a été préparé en suspendant des colonies de Bifidobacterium dans
5ml d’eau physiologique cystéiné. La suspension est ajustée pour obtenir une turbidité
équivalant à 1 à l’échelle de Mac Farland, suivi d’une dilution à 1:10 (≈107
bactéries/ml) (figure 4).
55
Matériel et Méthodes
2-2/ La méthode de diffusion sur gélose (méthode des disques) :
L’ensemencés d’inoculum a été réalisé par écouvillonnage sur milieu MRScystéine gélose molle (agar 0,7%). Après séchage à température ambiante, des disques
d’antibiotiques sont déposés à la surface du milieu (Mättö et al. 2007). Les boites sont
incubées à des conditions anaérobies à 37°C pendant 24-48 h suivi de la mesure des
diamètres des zones d'inhibition, y compris le diamètre du disque (en millimètre).
2-3/ Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) des
antibiotiques :
La détermination de la CMI des antibiotiques testés a été réalisée par la méthode de
dilution en milieu liquide des souches de Bifidobacterium avant et après le stresse en
milieu acide pH2. On distribue dans un premier temps, dans une série de tubes stériles,
sous un même volume (1ml), des concentrations décroissantes (en progression
géométrique de raison 2) d’antibiotiques (2000µg jusqu'à 0,24µg). Puis on ajoute 8ml
bouillon MRS-cystéine et 1 ml d’inoculum. Après incubation 24 à 48 heures en
anaérobiose, la concentration de l’antibiotique la plus faible pour laquelle la croissance
bactérienne n’est plus visible à l’œil est considérée comme Concentration Minimale
d’Inhibition (CMI) (figure 5).
56
Matériel et Méthodes
Figure 4 : Schéma simplifié des étapes de préparation l’inoculum bactérien
57
Matériel et Méthodes
Figure 5 : Schéma simplifié des étapes de la méthode de dilution en milieu liquide pour la
Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’antibiotiques
58
Résultats
Résultats :
1- Isolement et pré-identification des Bifidobacterium:
La caractérisation des souches isolées passe obligatoirement par une série de
purification.
Aspect morphologique
- L’examen macroscopique des isolats bactériens cultivés sur milieu MRS-cys
pendant 48h en anaérobiose nous montrent des petites colonies blanchâtres (de 1 à 1,5
mm) à pourtour régulier et opaque (Figure 6 (AetB)).
- L’observation microscopique nous permet d’authentifier la forme cellulaire des
souches isolées.
les souches isolées sélectionnées présentent les caractères morphologiques des
des espèces de Bifidobacterium : bâtonnets Gram positive, de forme allongé ou courte
incurvés, effilés et bifurqués et leur arrangement isolées et en amas (Figure 6 (AetB)).
La figure 6 représente Observations macro et microscopiques souches de
Bifidobacterium (Bif AC1 et Bif SA1).
2- Tests d’identification physiologiques et biochimiques des Bifidobacterium
Les résultats des testes biochimiques et enzymatiques nous montres que toutes
les souches isolées sont Catalase, Uréase (La figure 7) et Nitrate réductase négatives.
Les souches Bif AC1et Bif AC2 ont montrées une croissance à 45°C et les
souches Bif SA1 et Bif SA2 ont montrées une croissance très lente à 45°C.
Le tableau 7 résume l’ensemble des résultats.
59
Résultats
a
A’
A
b
B’
B
Figure 6 : Observations macro et microscopiques souches de
Bifidobacterium :
1 et 2 : L’aspect des colonies des souches Bif AC2 et Bif SA 1 enssemencé sur milieu MRScys gélosé, incubées à 37°C pendant 48 heures en anaérobiose.
1’ et 2’ : Les formes cellulaires des souches Bif AC1 et Bif SA1 après coloration de Gram
observé sous le microscope optique (X 1000).
(a): forme bifurqué et (b) forme enflé et incurvé
60
Résultats
1
2
3
4
Figure 7: Résultats du test d’ Uréase des souches de Bifidobacterium :
1 : Bif AC1, 2 : Bif AC2, 3: Bif SA 1 et 4 : Bif SA 2.
Coloration jaune : Résultat négative
Tableau 7 : Résultats des tests physiologiques et biochimiques des souches de bifidobactérie
(Bif AC1, Bif AC2, Bif SA1 et Bif SA2).
Souches
Bif AC1
Bif AC 2
Bif SA 1
Bif SA 2
Tests
Uréase
Nitrate réductase
Catalase
Croissance à 45°C
+
+
+/+/Croissance à pH = 3,5
+/+/Croissance à pH = 8,5
Croissance en aérobiose
Production de CO2 à partir du glucose.
+ : réaction positif ; - : réaction négatif ; +/- : observation d’un trouble par très dense.
61
Résultats
3- Profil fermentaire
L’identification des souches au niveau de l’espèce repose sur l’étude du Profil
fermentaire de différents sucres qui sont représenté par la figure 8 et le tableau8.
T
A
T
T
A’
A’’
T
B
Figure 8 : Profil fermentaire des souches de Bifidobacterium :
A, A’ et A’’: Bif AC1
B : Bif SA 1
T : Témoin ; Lév.: Lévulose; Gly.: Glycérol; Gal.: Galactose; Rh.: Rhamnose; Man.: Mannose; Fru.: Fructose; Xyl.:
Xylose; Mann.: Mannitol; Sal.: Salicine; Tré.: Tréhalose; Méli.: Mélibiose; Inu.: Inuline; Mal.: Maltose; Sac.:
Saccharose; Mél.: Mélizitose; Lac.: Lactose; Am.: Amidon; Ara.: Arabinose; Sor.: Sorbitol; Rib.: Ribose; Raf.:
Raffinose ; Rh : Rhamnose.
Coloration jaune : milieu acidifié (réaction positif); Coloration violette : milieu non acidifié (réaction négatif) ;
62
Résultats
Tableau 8 : Résultats du test de fermentation des sucres par les souches de bifidobactérie (Bif
AC1, Bif AC2, Bif SA1 et Bif SA2).
Souches
Sucres
Sorbitol
Arabinose
Raffinose
Ribose
Amidon
Lactose
Inuline
Mélizitose
Saccharose
Maltose
Tréhalose
Mélibiose
Mannitol
Salicine
Xylose
Mannose
Fructose
Galactose
Lévulose
Glycérol
Rhamnose
Bif AC1
Bif AC 2
Bif SA 1
Bif SA 2
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
NR
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
NR
+
+
+
+
+
+
+
NR
NR
+
+
+
+
+
+/-
+
+
+
+
+
+
NR
NR
+
+
+
+
+
+/-
+ : réaction positif ; - : réaction négatif ; +/- : réaction positif mais lente ; NR : Non réalisé.
63
Résultats
II/ Etude probiotique des souches de Bifidobacterium isolées
1/ Effet du milieu hyperacide (pH 2) sur la viabilité des bifidobactéries :
Les souches ont montrées une résistance au milieu acide mais avec une
diminution moyenne de 3x101 UFC/ml pour les souches Bif AC1 et Bif AC2, et 102
UFC/ml des souches Bif SA1 et Bif SA2 (tableau 9)
Tableau 9 : Résultats de viabilité des souches de bifidobactérie (Bif AC1,
Bif AC2, Bif SA1 et Bif SA2) dans le milieu hyperacide pH2.
Dénombrement des souches
Souches
0 minutes
Après 60 minutes
8
Bif AC1
6 x10 UFC/ml
3 x107 UFC/ml
Bif AC2
3 x108 UFC/ml
4 x107 UFC/ml
Bif SA1
2 x108 UFC/ml
1 x106 UFC/ml
Bif SA2
4 x108 UFC/ml
8 x106 UFC/ml
2/ Etude de la sensibilité des Bifidobacterium aux antibiotiques :
La méthode de diffusion sur gélose (méthode des disques) :
Les souches Bifidobacterium ont montrées une sensibilité vis-à-vis les
antibiotiques testés avec une différance de diamètre, sauf quelques qui sont les
Vancomycine, Kanamycine, Néomycine, Streptomycine (tableau 10 et figure 9).
Souches
Antibiotiques
Ampicilline
Pénicilline G
Cloxacilline
Érythromycine
Vancomycine
Chloramphénicol
Tétracycline
Kanamycine
Néomycine
Streptomycine
Bif AC1
Bif AC2
Diamètre en
mm de la zone
d’inhibition
17
30
20
20
0
22
20
0
0
0
Bif SA1
Diamètre en
mm de la zone
d’inhibition
S
S
S
S
R
S
S
R
R
R
Bif SA2
Diamètre en
mm de la zone
d’inhibition
17
30
20
20
0
22
20
0
0
0
S
S
S
S
R
S
S
R
R
R
18
30
20
20
0
23
20
0
0
0
R : Résistante ; S : Sensible ; mm : millimètre
64
Diamètre en mm
de la zone
d’inhibition
S
S
S
S
R
S
S
R
R
R
18,5
30
20
20
0
23
20
0
0
0
S
S
S
S
R
S
S
R
R
R
Résultats
O
E
E
V
S
S
O
A
V
A
A
B
P
K
N
C
T
K
S
V
C
D
Figure 9: Résultats du test d’antibiogramme des souches
de Bifidobacterium :
A: Bif AC1; B: Bif AC2; C: Bif SA1; D: Bif AC2
V: Vancomycine; T: Tétracycline; E: Erythromycine; S: Streptomycine. A: Ampicilline ;
C: Chlorophinicole; N: Néomycine; P: Pénicilline G; K: Kanamycine; O: Cloxacilline.
65
Résultats
Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) des
antibiotiques :
Les résultats des testes pour la détermination de la CMI des antibiotiques vis-àvis des souches de Bifidobacterium avant et après le stresse à pH2 sont présentés dans
les tableaux (11 et 12) et les figures (10, 11, 12, 13, 14 et 15). Toutes les valeurs de la
CMI des antibiotiques ont diminué après le traitement acide à l’exception de
Cloxacilline, Vancomycine et Tétracycline et Néomycine.
Tableau 11 : Concentration minimale inhibitrice (CMI) en µg/ml des
antibiotiques pour les souches de Bifidobacterium avant le stresse en
milieu acide (pH2).
souches
Antibiotiques
Ampicilline
Pénicilline G
Cloxacilline
Érythromycine
Vancomycine
Chloramphénicol
Tétracycline
Kanamycine
Néomycine
Streptomycine
Bif AC1
Bif AC2
Bif SA1
Bif SA2
15,62
3,90
3,90
3,90
500
7,81
31,25
500
250
250
15,62
3,90
3,90
3,90
500
7,81
31,25
500
250
250
15,62
3,90
3,90
3,90
250
7,81
31,25
500
250
250
15,62
3,90
3,90
3,90
250
7,81
31,25
500
250
250
Tableau 12 : Concentration minimale inhibitrice (CMI) en µg/ml des
antibiotiques pour les souches de Bifidobacterium après le stresse en
milieu acide (pH2).
Souches
Antibiotiques
Bif AC1
Bif AC2
Bif SA1
Bif SA2
Ampicilline
Pénicilline G
Cloxacilline
Érythromycine
Vancomycine
Chloramphénicol
Tétracycline
Kanamycine
Néomycine
Streptomycine
0,97
1,95
3,9
1,95
500
1,95
31,25
250
250
125
0,97
1,95
3,9
1,95
500
1,95
31,25
250
250
125
0,97
1,95
3,9
1,95
250
1,95
31,25
250
250
62,5
0,97
1,95
3,9
1,95
250
1,95
31,25
250
250
62,5
66
concentration minimale inhibitrice (CMI)
µg/ml
Résultats
510
480
450
420
390
360
330
300
270
240
210
180
150
120
90
60
30
0
AM
P
OX
E
VA
C
TE
Antibiotiques
K
N
S
Figure 10: Histograme concentration minimale inhibitrice
(CMI) µg/ml des antibiotiques pour les souches de
Bifidobacterium avant le stresse en milieu acide (pH2).
concentration minimale inhibitrice (CMI)
µg/ml
Bif AC1
Bif AC2
Bif SA1
Bif SA2
510
480
450
420
390
360
330
300
270
240
210
180
150
120
90
60
30
0
AM
P
OX
E
VA
C
Antibiotiques
TE
K
N
S
Figure 11: Histograme concentration minimale inhibitrice
(CMI) µg/ml des antibiotiques pour les souches de
Bifidobacterium aprés le stresse en milieu acide (pH2).
Bif AC1
Bif AC2
67
Bif SA1
Bif SA2
concentration minimale inhibitrice (CMI)
µg/ml
Résultats
510
480
450
420
390
360
330
300
270
240
210
180
150
120
90
60
30
0
AM
P
OX
E
VA C TE
Antibiotiques
K
N
S
Figure 12: Histograme concentration minimale inhibitrice
(CMI) µg/ml des antibiotiques pour la souches Bifidobacterium
Bif AC1 avant et aprés le stresse en milieu acide (pH2).
concentration minimale inhibitrice (CMI)
µg/ml
Bif AC1 non stressé
Bif AC1 stressé
510
480
450
420
390
360
330
300
270
240
210
180
150
120
90
60
30
0
AM
P
OX
E
VA
C
TE
K
N
S
Antibiotiques
Figure 13: Histograme concentration minimale inhibitrice
(CMI) µg/ml des antibiotiques pour la souches Bifidobacterium
Bif AC2 avant et aprés le stresse en milieu acide (pH2).
Bif AC2 non stressé
Bif AC2 stressé
68
concentration minimale inhibitrice (CMI)
µg/ml
Résultats
510
480
450
420
390
360
330
300
270
240
210
180
150
120
90
60
30
0
AM
P
OX
E
VA C TE
Antibiotiques
K
N
S
Figure 14: Histograme concentration minimale inhibitrice
(CMI) µg/ml des antibiotiques pour la souches Bifidobacterium
Bif SA1 avant et aprés le stresse en milieu acide (pH2).
concentration minimale inhibitrice (CMI)
µg/ml
Bif SA1 non stressé
Bif SA1 stressé
510
480
450
420
390
360
330
300
270
240
210
180
150
120
90
60
30
0
AM
P
OX
E
VA C TE
Antibiotiques
K
N
S
Figure 15: Histograme concentration minimale inhibitrice
(CMI) µg/ml des antibiotiques pour la souches Bifidobacterium
Bif AC2 avant et aprés le stresse en milieu acide (pH2).
Bif SA2 non stressé
69
Bif SA2 stressé
Discussion
Discussion
Les bifidobactéries demeurent un composant majeur de la microflore intestinale.
En fonction des aliments consommés et de quelques autres conditions, les niveaux de
bifidobactéries dans l’intestin demeurent relativement stables pendant l’ensemble de la
vie adulte. Il est bénéfique pour la santé de maintenir des niveaux suffisants de
bifidobactéries. Neamoins leur isolement nécessite des conditions assez spécifiques, qui
mettent en jeu des systèmes d’anaérobiose comme les anaerocult ou les gas-pack et des
milieux de cultures très riches tel que TPY, milieu Beerens, MRS cystéine, milieu
Columbia modifié (Scardovi, 1986 ; Hadadji et al., 2005). Quelque soit le milieu utilisé
est toujours additionné d’un agent réducteur cystéine chlorhydrique et un antibiotique
d’acide nalidixique.
Les souches isolées à partir du yaourt Activia et Soumame se développaient sur le
milieu MRS additionné de 0.05% cysteine chloridrique ,ont formées de petites colonies
blanchâtres à contour régulier et aspect variable.
Les cellules formant les colonies sont Gram positive, caractérisées par des formes
variables, mais souvent des formes bifides qui sont typiques aux bifidobactéries. Le
pléomorphisme observé chez les bifidobactéries est souvent associé à la composition du
milieu de culture. Des études ont démontré que la morphologie cellulaire des
bifidobactéries est influencée par la nature de la source de carbone présente dans le
milieu de culture (Vlkova et al., 2005).
Les souches purifiées sont catalase-, urease -,nitrate reductase – elles ne produisent
pas de CO2 lors de la fermentation des sucres et ne se multiplient pas en aérobioses .
Toutes les souches ne se développent pas dans le milieu a pH alcalin. Deux souches (Bif
AC1 et BifAC2) peuvent croitrent en milieu a pH 3,5 tan disques les deux autres (Bif
SA1et Bif SA2) ne tolèrent pas ce pH acide.
Les souches isolées et purifiées ont pu croitre à une température de 45°C ce qui
confirme qu’elles sont des bactéries thermophiles. D’après les résultats tests
70
Discussion
biochimiques et physiologiques qui sont en accord avec plusieurs auteurs (Tannok.,
1999 ; Vlkova et al., 2004 ; Adrian et al., 2007., Zinedine et Faid., 2007) les souches
isolées à partir du yaourt commercialisé en Algérie appartiennent au genre
Bifidobacterium.
La différenciation des espèces de bifidobactéries repose sur la fermentation des
carbohydrates. En effet, (Schell et al., 2002) a démontré que la souche NCC 2705 de
bifidobacterium longum possède des gènes codant
pour des enzymes ( fumarase,
oxoglutarate déhydrogénase, et le malate déhydrogénase) qui permettent la dégradation
de plusieurs sucres ( arabinose, , xylose, ribose, cellobiose, melibiose, maltose, raffinose
et mannose). Les résultats montrent que toutes les souches fermentent certains sucres
(glucose, fructose, maltose, raffinose, saccharose, xylose, galactose et le lactose).
Les souches Bif SA1 et Bif SA2 du yaourt Soumame fermentent l’arabinose. Cette
propriété semble distinguer l’espèce longum des autres espèces.
Les deux autres souches Bif AC1 et Bif AC2 de Activia ne fermentent ni
l’arabinose, ni le sorbitol.
Selon le profile fermentaire des quatres souches et en comparaison avec le profil
fermentaire du genre Bifidobacterium décrit par Scardovi, 1986 et Tamime et al, 1995 ;
Zineddine et Faid., 2007 a conduit à identifier deux espèces de bifidobacterium : l’espèce
longum qui regroupe les souches Bif SA1 et Bif SA2 et L’espèce Animalis pour les
souches Bif AC1 et AC2.
L’étude de certains facteurs tel que la température et le pH est indispensable pour
l’optimisation des conditions de croissance.
L’effet du pH sur la croissance microbienne agit sur l’activité enzymatique, la
perméabilité cellulaire de certains nutriments qui dépend de l’équilibre ionique.
Les résultats de la viabilité de nos souches dans le milieu hyperacide après 1heure
d’incubation ont montré que le nombre de cellules bactériennes diminue dun log pour les
71
Discussion
souches (Bif AC1 et Bif AC2) et de deux log pour les souches (Bif SA1 et Bif SA2)..Les
bifidobactéries sont généralement sensible a des pH inférieurs à 4,6 (Boylston et al,
2004). Matsumoto et al., (2004) ont indiqué que la tolérance des souches de
Bifidobacterium
longum,
Bifidobacterium
adolescentis
et
Bifidobacterium
pseudocatenulatum à des pH acides est très limité, une diminution significative de la
viabilité des souches dans un milieu a pH 3 après seulement une heure d’incubation.
Une croissance modérée et un ralentissement significatif de croissance des souches
isolées à partir des selles et de la solution de réhydratation saline est obtenue dans le
milieu à pH 8 et une inhibition totale dans le milieu a pH 8,5
La croissance optimum pour les différentes souches est obtenue dans le milieu à
pH 6,5.
Ces résultats confirment que les bifidobactéries préfèrent les milieux neutres ou
légèrement acides a des pH compris entre 5 et 8 comme a été signalé par plusieurs
auteurs (Romond et al., 1992 ;Akalin et al., 2004 ; Collado et al., 2006 ; Waddington et
al., 2010).
L’antibiothérapie peut affectée significativement l’équilibre microbien intestinale,
et réduit spécialement la viabilité des Bifidobactéries indigènes. Un grand nombre de
bactéries lactique et de Bifidobactéries utilisés dans ls produits fermentés acquis leurs
mécanismes de résistance par des mutations (Saylers et al., 2004).
Les souches isolées à partir des selles résistent à l’acide nalidixique, la
néomycine, rifampicine, streptomycine et la vancomycine .Ces antibiotiques sont
utilisés comme agents sélectifs dans les milieux synthétiques pour l’isolement et le
dénombrement des bifidobactéries (Ventura, 2004). Ce critère d’antibiorésistance est
utilisé comme marqueur de sélection des bifidobactéries (Levy et Marshall.,2004). Les
bifidobactéries sont munies aussi d’une antibiorésistance très élevée envers certains
groupes d’antibiotiques comme les aminosides (Néomycine, Paramomycine ,
Kanamycine) et d’autres qui font partie de la famille des Bêta-lactamines
72
Discussion
(Vancomycine, Gentamicine) (Delgado et al., 2005). Cette antibiorésistance a été
observée notamment chez nos souches.
Le comportement des quatre souches isolées a partir de deux yaourt différent
vis-a vis des antibiotiques testés par la méthode de diffusion est la même puisque
toutes les souches ont montrées une résistance au (Vancomycine, Kanamycine,
néomycin et Streptomycin) et sont sensibles au( Ampicilline, Penicilline G,
Cloxacilline, erythromycine, chloramphénicol et la tétracycline) ces résultats
concordent avec ceux cités par plusieurs auteurs ( Kheader et al., 2004 ; Delgado et
al., 2005 ; Salim Amor et al., 2007)
La sensibilité des bifidobactéries à la chloramphénicol a été signalée par
plusieurs auteurs (Kurmann, 1984 ; Scardovi, 1986 ; Delcenserie et al., 2002) chez
des souches d’origines diverses . Le critère d’antibiorésistance a intensifié l’utilisation
des antibiotiques dans la détermination du genre et dans la connaissance des souches
(Hadadji., 2007).
Les résultats du calcul de la concentration minimale inhibitrice de chaque
antibiotiotque pour les quatre souches s’accordent avec ceux trouvés par la méthode de
diffusion. En effet la CMI des antibiotiques Vancomycine, Kanamycine, néomycin et
Streptomycin varie entre 250 et 500ug/ml pour toutes les souches, tandisque elle varie
entre 3,90 et 31,25 ug/ml pour ls autres antibiotiques ; les memes résultats ont été
trouvé dans les conditions de stress en milieu hyperacide.
73
Conclusion et perspectives
Conclusion
Les bifidobactéries vivent naturellement en grande quantité dans le colon
humain, ou elles ont rôle dans le maintien de l’équilibre de la microflore, c’est la
raison première pour laquelle on pense que les bifidobactéries ingérées sous forme de
laits fermentés peuvent apporter des bienfaits pour la santé du consommateur en effets
les recherches conduites à ce jour semblent indique que les laits fermentés par ces
micro-organismes pourraient avoir des effets positifs sur la santé particulièrement ce
qui concerne l’amélioration de la durée du transit gastro-intestinal, la diminution des
risques du cancer du colon et de cancer du sein la prévention de la diarrhée et la
modulation du système immunitaire.
Dans ce travail, nous avons essayé de suivre le comportement des souches de
bifidobactéries isolées à partir de deux types de yaourt au BA commercialisés en Algerie,
L’évaluation des de ces souches de bifidobactéries envers les antibiotiques, dans
l’objectif d’éviter une antibiothérapie qui inhibe ou détruit ces bactéries très bénéfique
pour l’homme. Cette approche est effectuée par les étapes suivantes :
L’isolement des souches de bifidobactéries, la purification, l’identification
phénotypique des souches isolées par les tests usuels : Gram, catalase et certains tests
physiologique et l’utilisation
de milieu sélectif pour les bifidobactéries confirme
l’appartenance de nos souches au genre Bifidobacterium.
La fermentation des différents carbohydrates révèle leur appartenance à deux
espèces longum et animalis utilisées couramment dans la fabrication des yaourts au
Bifidobacterium.
L’étude de comportement des deux espèces envers une gamme d’antibiotiques
communément utilisé a révélée que toutes les souches résistent à quatre antibiotiques et
elles sensibles aux autre que ca soit par la méthode de diffusion ou par la méthode de
dilution en calculant la concentration minimale.
74
Conclusion et perspectives
Perspectives
Afin de proposer un lait fermenté et a caractère thérapeutique contenant des
souches qui ne seront pas affectées par les antibiotiques nous suggérons :
-Une identification génotypique de ces souches de bifidobactéries.
-Tester une gamme plus large d’antibiotiques
-Tester les effets des antibiotiques sur les souches de bifidobactéries in vivo
74
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Résumé
Les Bifidobactéries sont tout au long de la vie habitants naturels du
tractus gastro-intestinale chez l’homme, dés les premiers jours suivant la
naissance.
Les bifidobactéries isolés à partir des deux yaourts fabriqués en Algérie
se présentent sous forme de bacilles à gram positif incurvées, souvent bifides,
elles sont anaérobies strictes. Le profil fermentaire des carbohydrates montre
que deux souches appartiennent à l’éspèce animalis et les deux autres à
l’éspèce longum. Leur température de croissance se situe entre 37°C et 45°C,
elles résistent à quatre antibiotiques (Vancomycine ; Kanamycine ; Néomycine
et Streptomycine) et elles sont sensibles à l’ampicilline ; pénicilline G ;
Cloxacilline, Erythromycine ; Chloramphénicol et la tétracycline.
Les bifidobactéries exposées à des conditions de stress successives
peuvent modifient leur sensibilité aux antibiotiques et par suite leur effet
probiotiques.
Mots clés :
Caractérisation; Bifidobactéries; Yaourt; Probiotiques; Estomac; Acidite; Lait
Fermentes; Antibiotiques; Flore intestinale; Resistance.