Génétique moléculaire

INTRODUCTION A LA GENETIQUE MOLECULAIRE
I/Introduction.
Système modèle  Résultats reproductifs  Analyse quantitative
1) La logique mendélienne.
Mendel est responsable de la transformation de la génétique empirique en génétique formelle.
Mendel a construit son modèle sur quatre critères :
- Petite taille.
- Pousse vite.
- Contrôle total des croisements.
- Reproduction rapide.
Obtention d’une espèce simple à manipuler.
Les pois ont été choisis pour leurs caractères :
- Facilement repérable.
- Chacun peut se retrouver uniquement sous deux formes.
- Indépendant des conditions extérieures.
Permet l’indentification et l’utilisation de lignées pures (donnent le même caractère aux descendants).
Après le 1er croisement on
déduit :
Information cachée.
Information perdue.
La dominance/récessivité
n’explique pas la définition de
la transmission du caractère.
Après le 2ème croisement on
déduit que l’information était
cachée.
L’étage des gamètes nous
montrent la différence entre
génotype et phénotype.
2) La découverte des chromosomes.
Les progrès en microscopie on permit l’identification de structures en bâtons appelés
chromosomes.
Les chromosomes, pendant la gamétogenèse, suivent le modèle de Mendel.
Dans un chromosome on retrouve deux fois plus de protéines que d’ADN, l’hypothèse que les
protéines portent l’information génétique est donc adoptée.
La fécondation est la transmission des chromosomes porteurs de l’information génétique.
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II/ L’ADN porteur de l’information génétique.
Deux expériences ont permet la mise en évidence de l’ADN porteur de l’information génétique :
- L’expérience d’Avery.
- L’expérience de Hershey et Chase.
1) L’expérience d’Avery.
Avery a mené son expérience sur des
pneumocoques :
S : pathogènes virulents (coque).
R : mutants non pathogènes.
Sr : S tués par la chaleur (vaccin).
Les résultats obtenus sont :
Injection R : non pathogène.
Injection S : pathogène.
Injection Sr : non pathogène.
Injection Sr + R : pathogène.
Les cellules Sr tués ont transmis leurs
substituants aux cellules R qui ont pu
compléter leur génome et fabriquer leur
coque protectrice.
Afin d’identifier le substituant responsable de la formation de la coque chez les mutants R on lyse S :
- Injection protéines S dans R : non pathogène.
- Injection lipides S dans R : non pathogène.
- Injection glucides S dans R : non pathogène.
- Injection ARN S dans R : non pathogène.
- Injection ADN S dans R : pathogène.
L’ADN est responsable de la formation de la coque par transmission des gènes et donc il est le
porteur de l’information génétique.
2) L’expérience de Hershey et Chase.
L’expérience de Hershey et Chase se base sur l’action de
bactériophage (virus) sur un phage (bactérie).
La différence entre protéines et ADN se trouvant sur deux
atomes : S pour les protéines (met) et P pour l’ADN :
Marquage 35S sur le 1er bactériophage.
Marquage 32P sur le 2ème bactériophage.
Après séparation puis centrifugation, on obtient les résultats
suivant :
1er bactériophage : radioactivité dans le surnageant.
2ème bactériophage : radioactivité dans le culot.
La centrifugation sépare les éléments selon la masse les
protéines et l’ADN se retrouvent donc au fond du tube.
La radioactivité présente dans le surnageant indique que le virus n’a pas transmis ses protéines.
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La radioactivité présente dans le culot indique que le virus a transmis son ADN.
L’ADN est donc porteur de l’information génétique du virus nécessaire à sa réplication.
3) La composition de l’ADN.
L’ADN est un polymère de nucléotides formés par un désoxyribose et de bases liés par liaisons
phosphodiesters (Friedrich Miescher).
Les nucléotides sont classés en deux groupes de par leurs bases azotées :
- Les nucléotides puriques : A + G.
- Les nucléotides pyrimidiques : T + C.
La présence d’un méthyl sur T et non sur U permet la différenciation entre ADN et ARN (ARN=OH).
4) La structure de l’ADN.
L’information est codée par la composition en bases azotées, on a autant de A que de T et autant
de C que de G.
Mais pour comprendre le fonctionnement de l’ADN il faut concevoir sa forme tridimensionnelle.
Observation aux rayons X :
- Les rayons X permettent l’observation atomique.
- Ils sont diffusés sur un cristal d’ADN (pas de mouvements moléculaires).
- On obtient une croix diffractée conséquence de la présence d’une double hélice de sens
inverse.
L’ADN est une double hélice de diamètre égal à 2nm avec une rotation tous les 3.4nm.
A partir de ces données Crick et Watson ont créé différents modèles :
- Echecs :
 Bases à l’extérieur : écartement des deux brins.
 Brins identiques : changement de diamètre (purines ≠ pyrimidines).
- Adopté :
 Bases au centre de l’hélice.
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 Liées par liaisons hydrogènes (A=T ; C=G).
 Deux brins complémentaires antiparallèles.
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III/ Taille des génomes.
Dimensions de l’ADN :
- Phage : 3000 pb.
- Bactérie : 106 pb.
- Homme : 2.109 pb = 2.1011km pour 1014 cellules.
Compaction de l’ADN indispensable.
1) Compaction de l’ADN.
Chez les procaryotes il y a un super enroulement du chromosome circulaire par des protéines
motrices.
Chez les eucaryotes l’ADN se condense grâce à des protéines associées : les histones.
Les histones s’organisent en nucléosomes autour duquel s’enroule l’ADN lié aux charges positives
des acides aminés Nterm des histones (1tour = 160pb).
L’histone H1 permet la structure en super hélice de 30 nm.
IV/ La réplication de l’ADN.
1) Mécanisme général.
La réplication :
- Se fait entre les deux brins.
- Forme une bulle de réplication (observable au MET).
- Est semi-conservative (un brin ancien et un brin nouveau).
L’expérience de Meselson et Stahl :
- Utilisation de deux isotopes 14N (plus léger) et 15N.
- Bactéries au 14N ont un ADN plus léger donc moins dense (V14ADN = V15ADN).
- Utilisation d’un gradient de densité au CsCl et centrifugation.
- Formation de deux bandes témoins (L’ADN léger migre moins loin que le lourd).
A pour but de montrer le caractère semi-conservatif de l’ADN.
La présence d’ADN hybride après insertion des bactéries au 15N dans un milieu de 14N montre la
présence d’un brin léger et d’un brin lourd : l’ADN est semi-conservative.
2) Mécanisme moléculaire.
Après purification de l’ADN on obtient la principale enzyme de réplication : la DNA polymérase.
Un didésoxynucléotide avec 2 OH en moins ne permet pas la réplication (ddNTP), c’est un
terminateur de chaine, un inhibiteur de la réplication utilisé comme antiviral (AZT).
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La DNA polymérase :
- Utilise des désoxynucléotides à trois phosphates (dNTP) qui amènent de l’énergie.
- A besoin d’une amorce de nucléotides (ne peut se répliquer sur un simple brin).
- Réplique en extension de l’amorce 5’ 3’.
L’hélicase déroule la double hélice par rotation en hydrolysant de l'ATP.
Le 3’ OH forme une liaison covalente avec le phosphore très électropositif qui casse sa liaison
phosphodiester libérant ainsi de l’énergie.
3) Mécanismes de transcription.
V/Les outils enzymatiques.
1) Les enzymes de restrictions.
Une enzyme de restriction permet de cliver l'ADN, elle reconnait une séquence spécifique :
- Endonucléase : hydrolyse les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l'intérieur
d'un acide nucléique
- Exonucléase : dégrade l'ADN à partir de l'une de ses extrémités.
Ces enzymes proviennent de micro-organisme, bactéries le plus souvent.
La nomenclature (ECO RI) :
- E : Escherichia (genre)
- Co : Coli (espèce)
- R : Ry 13 (souche).
- I pour dire que c'est la première découverte chez cette bactérie.
Il y a trois types d'enzyme :
- Type 1 : reconnaît une séquence, se déplace et lyse quelques dizaines de nucléotides après
avoir parcouru 1000 à 5000 bases.
- Type 2 : reconnaît et lyse un site de restriction qui lui est spécifique.
- Type 3 : clive une vingtaine de nucléotides plus loin que le site de reconnaissance.
La plupart des sites de restrictions sont des séquences inversées : palindromes.
Extrémités cohésives (permet d’ajouter une séquence)
bouts francs
On parle d’extrémité débordante là où il y a un excès de nucléotides.
Plus la séquence est petite, plus il y aura de sites de restrictions.
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2) La visualisation des fragments de restriction.
Visualisation par électrophorèse en fonction de la taille et de la charge de la protéine.
On compare ces données à une courbe étalon afin de nous donner la taille exact du fragment.
L’électrophorèse montre le contraste entre un ADN clivé ou non.
3) Carte de restriction.
Comme chaque enzyme à une cible particulière, l’identification des sites de coupures permet
d’établir une carte de restriction.
Les points de coupure sont établis d’après la longueur des fragments.
La taille des fragments est obtenue par électrophorèse.
VI/ Les vecteurs de clonage.
Organisme donneur donne le gène d'intérêt, qui est ensuite inséré dans un fragment d'ADN
molécule vecteur (plasmide capable de réplication autonome), pour obtenir de l'ADN recombinant.
Le vecteur de clonage :
- Accepte l’ADN étranger.
- Peut se répliquer dans son hôte.
- Possède des marqueurs de sélection.
Le plasmide est utilisé comme vecteur de clonage, il possède une origine de réplication, un site de
résistance à un antibiotique et un polylinker (site multiple de clonage).
Manipulation de clonage :
- Isolation du gène d'intérêt par enzyme de restriction et électrophorèse.
- Coupure du plasmide par les mêmes enzymes, et intégration du gène d'intérêt par action de
ligases.
- Intégration du gène d’intérêt à la place d’un marqueur de sélection.
- Sélection en fonction des marqueurs (les plasmides qui ont intégré le gène d'intérêt ont perdu un
marqueur de sélection).
- Intégration du plasmide recombinant dans une cellule.
Production de la protéine désirée par le gène du plasmide recombinant dans la cellule.
Exemple :
- Dans le plasmide original le gène Lac2 est fonctionnel il y à donc hydrolyse du lactose et
libération du substrat (X-isopropilthio-béta-D-galactoside(IPTG)) : coloration bleue.
- Dans le plasmide recombinant le gène Lac2 est non fonctionnel il n’y a pas d’hydrolyse et
pas de libération du substrat : pas de coloration.
Le génie génétique :
- Outils et techniques permettant :
 D'identifier.
 Isoler.
 Transférer.
 Modifier de manière à contrôler le matériel génétique.
- Deux principes fondamentaux :
 Code génétique universel.
 Clonage d'un gène.
Chaque organisme peut lire et réaliser l’information génétique d’un autre organisme.
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