ÉCOLE NATIONALE VÉTÉRINAIRE D’ALFORT Année 2015 ÉCOLOGIE ÉVOLUTIVE DU TRANSFERT MATERNEL D’ANTICORPS CHEZ LES OISEAUX THÈSE Pour le DOCTORAT VÉTÉRINAIRE Présentée et soutenue publiquement devant LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE CRÉTEIL le…………… 17 décembre 2015 par Salomé POLLET Née le 30 décembre 1990 à Strasbourg (Bas-Rhin) JURY Président : Pr. HEZODE Professeur à la Faculté de Médecine de CRÉTEIL Membres Directeur : Mme LE ROUX Delphine Maître de conférences à l’ENVA. Immunologie. Assesseur : Mme ABITBOL Marie Maître de conférences à l’ENVA. Génétique clinique et médicale. REMERCIEMENTS Au Professeur de la Faculté de Médecine de Créteil, Qui nous a fait l'honneur d'accepter la Présidence du Jury de cette thèse, Hommage respectueux. À M. Thierry BOULINIER, Docteur vétérinaire et Directeur de recherches au Centre d'Ecologie Fonctionnelle et Evolutive de Montpellier, Qui a été à l’origine de mon intérêt pour le domaine de l’immuno-écologie, et qui m’a accueillie dans son équipe de recherche, Ma plus sincère gratitude. À Mme Delphine LE ROUX, Maître de conférences à l'Ecole nationale vétérinaire d'Alfort, Qui a accepté de diriger ce travail de thèse, Tous mes remerciements et ma reconnaissance. À Mme Marie ABITBOL, Maître de conférences à l’Ecole nationale vétérinaire d’Alfort, Qui a accepté d’être l’assesseur de ce travail et de participer à sa correction, Mes remerciements distingués. Je tiens à remercier les personnes impliquées dans le projet de recherche ANR EVEMATA (Écologie évolutive du transfert maternel d’anticorps). Merci à Elsa Jourdain (INRA Theix) qui m’a conseillée et soutenue à de nombreuses étapes de ce travail, à Patrick Gasqui (INRA Theix) pour son aide sur des questions statistique, à Bertrand Bed'Hom (INRA Jouy-en-Josas), Marie-Hélène Pinard-van der Laan (INRA Jouy-en-Josas), Yannick Baumard (INRA Tours), David Gourichon (INRA Tours) pour leur expertise et leurs conseils judicieux. Pour les analyses de laboratoire, je remercie Stéphanie Lesceu (IDVet) et les techniciens d’IDVet, ainsi que les personnels de la plate-forme d'Analyses Chimiques en Ecologie, et le Service des Marqueurs Génétiques en Ecologie du Centre d'Ecologie Fonctionnelle et Evolutive de Montpellier, et tout particulièrement Marie-Pierre Dubois. Un grand merci également aux personnes qui ont participé à l’analyse de certaines données de sélection sur les poules de l’INRA : Romain Garnier, Elsa Jourdain, Vincent Staszewski, Jeremy Tornos, Elisa Lobato, Audrey Arnal, Theo Chades. Enfin, je dédie ce travail : Aux animaux. À mes proches. TABLE DES MATIERES LISTE DES FIGURES ........................................................................................................... 7 LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... 9 LISTE DES ABRÉVIATIONS ............................................................................................ 11 GLOSSAIRE D’ÉVOLUTION ............................................................................................ 13 GLOSSAIRE DE STATISTIQUES .................................................................................... 15 INTRODUCTION ................................................................................................................. 17 PREMIÈRE PARTIE : ASPECTS GÉNÉRAUX DE L’IMMUNITÉ MATERNELLE CHEZ LES OISEAUX ....................................................... 21 1. Introduction de la première partie .................................................................................. 23 2. Cadre de l’étude du transfert d’anticorps maternels en écologie évolutive ................ 25 2.1. Le transfert d’anticorps de la mère au jeune en tant qu’effet maternel ....................... 25 2.1.1. Définition des effets maternels .......................................................................... 25 2.1.2. Importance de cet effet maternel pour le développement du jeune ................... 25 2.1.3. Particularités des effets maternels en termes d’évolution ................................. 26 2.2. Une composante génétique au transfert d’anticorps maternels ? ................................ 27 2.3. Perspectives de l’étude du transfert maternel d’anticorps ........................................... 28 3. Données sur les anticorps aviaires ................................................................................... 29 3.1. Structure moléculaire ................................................................................................. 29 3.1.1. Structure générale d’une immunoglobuline ...................................................... 29 3.1.2. Les différentes classes d’immunoglobulines chez les Oiseaux ......................... 31 3.1.3. Structure des IgY ............................................................................................... 32 1 3.1.4. Gènes des IgY ................................................................................................... 34 A) Organisation générale des gènes des immunoglobulines et mécanismes de genèse du répertoire d’anticorps......................................................................... 34 B) Organisation du locus IGHC........................................................................... 36 3.2. Fonctions assurées par les IgY ................................................................................... 38 3.2.1. Support de l’immunité adaptative ..................................................................... 38 3.2.2. Reconnaissance des motifs antigéniques ........................................................... 38 3.2.3. Suppression de l’activité pathogénique ............................................................. 38 3.2.4. Réactions d’hypersensibilité ............................................................................. 39 3.2.5. Mise en place d’une mémoire immunitaire ....................................................... 39 4. Modalités de transfert des immunoglobulines aviaires ................................................. 41 4.1. Anticorps transférés .................................................................................................. 41 4.2. Etapes de la transmission des IgY ............................................................................. 41 4.3. Taux d’anticorps dans l’œuf ..................................................................................... 44 4.4. Catabolisme des anticorps maternels ........................................................................ 44 4.5. Bases moléculaires de la persistance des anticorps maternels .................................. 45 DEUXIÈME PARTIE : EXPLORATION DE LA VARIABILITÉ GÉNÉTIQUE DU TAUX DE TRANSFERT MATERNEL D’ANTICORPS CHEZ LA POULE À TRAVERS L’ANALYSE D’UNE EXPÉRIENCE DE SÉLECTION .................................................................................................... 49 1. Introduction de la deuxième partie .......................................................................... 51 2. Matériel et méthodes ................................................................................................. 53 2.1. Evaluation de la répétabilité des taux de transfert d'anticorps de poules sélectionnées sur des critères immunologiques ...................................................................................... 53 2.1.1. Choix des lignées .............................................................................................. 53 2.1.2. Conditions d’élevage ......................................................................................... 56 2 2.1.3. Protocole d’échantillonnage .............................................................................. 56 2.1.4. Extraction des anticorps spécifiques du jaune d’œuf ........................................ 56 2.1.5. Estimation des quantités d’anticorps ................................................................. 57 A) Technique utilisée .............................................................................................. 57 B) Mesure des anticorps anti-IBV .......................................................................... 60 C) Mesure des anticorps anti-NDV ........................................................................ 63 D) Mesure de la répétabilité inter-plaques et inter-extractions ............................. 63 2.1.6. Analyses statistiques ......................................................................................... 63 A) Transformations opérées sur les données .......................................................... 63 B) Etude de la relation entre quantité d'anticorps dans le plasma et dans les œufs, et caractérisation du taux de transfert des femelles ............................................... 64 C) Recherche d'un effet lignée sur la capacité à transmettre des anticorps .......... 64 D) Recherche d'un effet individuel sur la capacité à transmettre des anticorps .... 64 2.2. Sélection sur la capacité à transmettre des anticorps dans le jaune d’œuf ................. 65 2.2.1. Plan expérimental .............................................................................................. 65 2.2.2. Conditions d’élevage ......................................................................................... 67 2.2.3. Estimation des quantités d’anticorps ................................................................. 67 2.2.4. Analyses statistiques ......................................................................................... 67 3. Résultats ..................................................................................................................... 69 3.1. Evaluation de la répétabilité des taux de transfert d'anticorps de poules sélectionnées sur des critères immunologiques ............................................................................... 69 3.1.1. Relation entre quantités d’anticorps dans le plasma et les œufs ....................... 69 3.1.2. Effet lignée sur la capacité à transmettre des anticorps dans l’œuf .................. 71 A) Comparaison des pentes de régression entre lignées ........................................ 71 B) Comparaison des résidus entre lignées et ANCOVA sur les régressions .......... 71 3.1.3. Effet individuel sur la capacité à transmettre des anticorps dans l’œuf ............ 75 A) Corrélation entre résidus pour les deux mois d'échantillonnage ...................... 75 B) Corrélation entre résidus pour les deux anticorps recherchés ......................... 75 3.2. Sélection sur la capacité à transmettre des anticorps dans le jaune d’œuf ................ 78 3.2.1. Résidus moyens par année ................................................................................ 78 3.2.2. Distribution des résidus avant et après sélection ............................................... 78 3.2.3. Corrélation des résidus entre mère et fille ......................................................... 78 3 4. Discussion ................................................................................................................... 81 4.1. Corrélation des taux d’anticorps dans l’œuf et dans le plasma ................................. 81 4.2. Différences de taux de transfert entre lignées ........................................................... 81 4.3. Répétabilité du taux de transfert dans le temps et pour différents antigènes ............ 82 4.4. Autres facteurs influençant le taux de transfert d’anticorps maternels ..................... 82 4.5. Divergence entre lignées ........................................................................................... 83 5. Conclusion et perspectives ........................................................................................ 84 5.1 Bilan des deux expériences ........................................................................................ 84 5.2. Perspectives : autres composantes du transfert d’anticorps maternels ..................... 84 TROISIÈME PARTIE : COMPARAISON INTER-ESPÈCES DE LA STRUCTURE MOLÉCULAIRE DES ANTICORPS EN FONCTION DE LEUR PERSISTANCE CHEZ LE JEUNE .................................................. 87 1. Introduction de la troisième partie .......................................................................... 89 2. Etude de la persistance des anticorps maternels en lien avec les traits d’histoire de vie ........................................................................................................................... 91 2.1. Théorie des traits d’histoire de vie appliquée à l’immuno-écologie ......................... 91 2.2. Estimation des coûts associés à la réponse immunitaire ........................................... 92 2.3. Disparités de persistance des anticorps maternels entre espèces .............................. 94 2.3.1. Etudes réalisées chez une espèce aviaire à la fois ............................................. 94 2.3.2. Etude comparative entre trois espèces .............................................................. 94 2.4. Lien entre la persistance des anticorps maternels et les voies de catabolisme ......... 99 2.5. Identification des motifs génétiques impliqués dans l’interaction FcRY-IgY ........ 101 4 3. Matériel et méthodes ............................................................................................... 103 3.1. Espèces étudiées ...................................................................................................... 103 3.2. Extraction de l’ADN génomique ............................................................................ 103 3.3. Recherche d’amorces de PCR ................................................................................. 103 3.4. Réalisation de la PCR ............................................................................................. 104 4. Résultats et discussion ............................................................................................. 107 4.1. Alignements de séquences ...................................................................................... 107 4.2. PCR ......................................................................................................................... 111 5. Perspectives .............................................................................................................. 113 CONCLUSION..................................................................................................................... 115 BIBLIOGRAPHIE .............................................................................................................. 119 5 6 LISTE DES FIGURES Figure 1 : Principaux mécanismes de la réponse immunitaire ................................................ 24 Figure 2 : Structure générale d’un anticorps ........................................................................... 30 Figure 3 : Comparaison de la structure des IgG, IgY et IgE ................................................... 33 Figure 4 : Comparaison des mécanismes aviaires et mammaliens de diversification du répertoire d’anticorps .............................................................................................. 35 Figure 5 : Organisation du locus IGHC .................................................................................. 37 Figure 6 : Mécanismes d’action des anticorps contre les agents pathogènes ......................... 40 Figure 7 : Etapes de la transmission maternelle d’anticorps ................................................... 43 Figure 8 : Comparaison structurelle du FcRn et du FcRY ...................................................... 46 Figure 9 : Mécanisme de recyclage des IgG mammaliennes par le FcRn .............................. 47 Figure 10 : Protocole de la première expérience ..................................................................... 55 Figure 11 : Illustration de deux techniques ELISA ................................................................ 59 Figure 12 : Courbes de régression logistique PI = f(-log(dilution)) ....................................... 62 Figure 13 : Protocole de la seconde expérience ...................................................................... 66 Figure 14 : Résidus de la régression ln(titre d'anticorps dans l'œuf) en fonction du ln(titre d'anticorps dans le plasma) pour IBV et NDV ..................................................... 70 Figure 15 : Régression ln(titre d'anticorps dans l'œuf) en fonction du ln(titre d'anticorps dans le plasma) selon les lignées pour IBV en février et juin ...................................... 72 Figure 16 : Régression ln(titre d'anticorps dans l'œuf) en fonction du ln(titre d'anticorps dans le plasma) selon les lignées pour NDV en février et juin .................................... 73 Figure 17 : Distribution des résidus de régression selon les lignées ....................................... 74 Figure 18 : Relation entre les résidus de régression aux deux mois d’échantillonnage .......... 76 Figure 19 : Relation entre les résidus de régression pour les deux anticorps recherchés ....... 77 Figure 20 : Variation des résidus moyens selon la lignée, en fonction de l’année ................. 79 Figure 21 : Distribution des résidus en début et en fin de sélection ....................................... 79 Figure 22 : Régression mère-fille sur les résidus des régressions œuf-plasma ....................... 80 Figure 23 : Relations entre traits d’histoire de vie et voies de la réponse immunitaire .......... 93 Figure 24 : Courbes de décroissance des taux d’anticorps maternels anti-NDV en fonction du nombre de jours écoulés depuis l’éclosion ........................................................... 96 Figure 25 : Puffin cendré (Calonectris diomedea) .................................................................. 98 Figure 26 : Structure du complexe FcRY-IgY ...................................................................... 102 7 Figure 27 : Couples d’amorces PCR ..................................................................................... 106 Figure 28 : Alignement de séquences des domaines terminaux du Fc de l’IgY ................... 108 Figure 29 : Alignement de séquences du domaine FNII du FcRY ....................................... 109 Figure 30 : Alignement de séquences des domaines CTL5-6 du FcRY ............................... 110 Figure 31 : Gels de PCR ....................................................................................................... 112 8 LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Exemple d’échantillons en dilutions sériées ........................................................ 61 Tableau 2 : Comparaison des modes de vie et des persistances en anticorps anti-NDV chez trois espèces aviaires ............................................................................................ 95 Tableau 3 : Comparaison de la persistance sérique de plusieurs anticorps anti-VEGF chez la Souris .................................................................................................................. 100 Tableau 4 : Amorces de PCR utilisées .................................................................................. 105 9 10 LISTE DES ABRÉVIATIONS Å : Angström ADCC : Cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps CDR : Région déterminant la complémentarité (« complementary-determining region ») CH : Domaine constant de la chaîne lourde des immunoglobulines CL : Domaine constant de la chaîne légère des immunoglobulines CMH : Complexe majeur d’histocompatibilité CTL : Domaine de type C riche en lectines du FcRY CysR : Domaine terminal riche en cystéines du FcRY dNTP : Mélange des quatre désoxyribonucléotides DO : Densité optique ED50 : Dilution effective ELISA : Dosage d’immunoadsorption par enzyme liée (« Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ») F : Coefficient du test de Fisher Fab : Fragment de liaison à l’antigène (« antigen binding ») Fc : Fragment cristallisable FcRn : Récepteur mammalien du Fc des IgG FcRY : Récepteur aviaire du Fc des IgY FNII : Domaine fibronectine de type 2 du FcRY g : Gramme h : Heure H : Chaîne lourde (« heavy ») des immunoglobulines HRP : Peroxydase de raifort (« Horse Radish Peroxidase ») IBV : Virus de la bronchite infectieuse (« avian Infectious Bronchitis Virus ») Ig : Immunoglobuline INRA : Institut National de la Recherche Agronomique j : Jour kb : Kilobase kDa : Kilodalton L : Chaîne légère (« light ») des immunoglobulines m : Mili 11 min : Minute µ : Micro NCBI : National Center for Biotechnology Information NDV : Virus de la maladie de Newcastle (« Newcastle Disease Virus ») NK : Lymphocytes « natural killer » Nm : Nanomètre p : P-value pb : Paire de bases PCR : Réaction de polymérisation en chaîne (« Polymerase Chain Reaction ») PBS : Solution saline (« Phosphate-Buffered Saline ») PI : Pourcentage d’inhibition r : Coefficient de détermination sec : Secondes S/P : Ratio « sample over positive » Taq : Thermus aquaticus Tm : Température de fusion tr : Tour VEGF : Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (« Vascular Endothelium Growth Factor ») VH : Domaine variable de la chaîne lourde des immunoglobulines VIH : Virus de l’immunodéficience humaine VL : Domaine variable de la chaîne légère des immunoglobulines WNV : Virus du West-Nile (« West-Nile Virus ») 12 GLOSSAIRE D’ÉVOLUTION Adaptation : Modification d’un caractère induisant un avantage ou une fonction particulière aux individus qui le portent. Effet fondateur : Changement des fréquences alléliques d’une sous-population tirée d’un faible échantillon de la population d’origine, ayant évolué sans contact avec cette dernière. Effet génétique additif : Mécanisme de transmission quantitative où les effets conjoints d’allèles à deux loci (ou plus) valent la somme de leurs effets individuels. Évolution : Théorie expliquant la diversification du monde vivant à partir d’une origine commune, dont les différences sont issues de l’accumulation de modifications dans les générations successives. / Micro-évolution : Changement des fréquences alléliques d’une population au cours du temps. / Macro-évolution : Changements observables sur l’échelle de temps paléontologique. Évolvabilité : Potentiel d’une population à accumuler des changements adaptatifs. Héritabilité : Proportion de variation phénotypique d’un caractère liée à l’existence de différences génétiques dans une population. Au sens large, correspond à la variance génétique totale divisée par la variance phénotypique. Au sens strict, correspond à la variance génétique additive divisée par la variance phénotypique. Pression de sélection : Phénomène à l’origine de l’évolution des espèces sous certaines contraintes environnementales. Sélection naturelle : Processus induisant la survie et la reproduction préférentielles des individus possédant des caractères les rendant plus adaptés à leur milieu. Valeur sélective : Espérance de la contribution d’un individu à la formation du lot génétique des générations suivantes ; capacité d’un organisme à survivre et se reproduire. Variance génétique additive : Part de la variance phénotypique expliquée par les effets génétiques additifs. Virulence : Caractère quantitatif mesurant la diminution dans la valeur sélective d’un hôte suite à une infection par un parasite. 13 14 GLOSSAIRE DE STATISTIQUES Analyse de covariance : Détermination de l’effet d’une ou plusieurs variable(s) indépendante(s) catégorielle(s) sur une variable dépendante continue, sans prendre compte de la variance due aux autres covariables. Coefficient de corrélation : Mesure d’une relation statistique entre deux variables ou points d’observation. Différents types de coefficients de corrélation existent, e.g. coefficient de Pearson, de Spearman. Hétéroscédasticité : Dispersion des résidus de façon inhomogène sur tout le spectre des valeurs des variables. Plusieurs phénomènes peuvent être à l’origine d’hétéroscédasticité dans un jeu de données : non-normalité d’une des variables, relation de dépendance entre les variables, variation de l’erreur de mesure selon les niveaux des variables (pour une variable catégorielle). Méthode des moindres carrés : Outil statistique permettant de comparer la distribution de données expérimentales à un modèle mathématique. Régression linéaire : Modèle qui relie les variables expliquées et les variables explicatives par une fonction de type linéaire. Répétabilité : Pour plusieurs mesures du même caractère à différents intervalles de temps, obtention d’un résultat similaire sur les mesures répétées. Résidu de régression : Pour chaque point, différence entre la valeur observée et la valeur prédite par le modèle de régression. 15 16 INTRODUCTION Le système immunitaire, arsenal de défense de l’organisme d’une extraordinaire complexité, a été forgé par des millénaires d’évolution au contact des micro-organismes. Dans le cadre des relations hôte-parasite, la production d'anticorps correspond à une adaptation particulièrement plastique de l’organisme en réponse à des pressions sélectives changeantes. Chez l’Homme, le répertoire immunitaire, c’est-à-dire le nombre d’anticorps spécifiques pouvant être produit par un individu, est au moins de l’ordre de 108. Le transfert de ces anticorps au jeune permet sa protection à un stade où il n’est pas encore apte à produire ses propres défenses immunitaires. Chez les Vertébrés, le transfert d'anticorps de la mère au jeune est un effet transgénérationnel dont les implications en écologie évolutive sont de plus en plus étudiées (Grindstaff et al., 2003 ; Boulinier & Staszewski, 2008 ; Hasselquist & Nilsson, 2009). Bien que les mécanismes physiologiques sous-tendant ce transfert soient connus depuis longtemps (Brambell, 1970), un tel processus pourrait avoir des implications évolutives et écologiques, jusqu'à présent négligées. Par exemple, on ne sait pas s'il existe une variabilité génétique de la capacité de la mère à transmettre des anticorps (Boulinier & Staszewski, 2008), ou une base génétique permettant d'expliquer une variabilité de la capacité à maintenir dans le temps un taux d'anticorps maternels plasmatiques (Ramos et al., 2014). Les deux éléments cités sont d'une importance capitale pour l'étude des implications évolutives de la réponse immunitaire. Le concept « One Health » est fondé sur un effort collaboratif de plusieurs disciplines afin d’optimiser la santé humaine, animale, ainsi que celle de l’environnement (Osburn et al., 2009). Il serait intéressant d’envisager ces composantes dans un contexte basé sur la notion d’écosystème, où des processus évolutifs façonnent en permanence les interactions entre espèces (Kaplan et al., 2009). L’étude des mécanismes immunitaires sous un angle écologique, appelée immuno-écologie, vise à appréhender comment la sélection naturelle a engendré l’apparition d’innovations dans la fonction immunitaire, et leurs conséquences dans les interactions entre hôtes et parasites. Chez les Oiseaux (clade regroupant plus de 9000 espèces), le transfert maternel d'anticorps a été étudié principalement chez la Poule, à des fins d’améliorations zootechniques. En populations naturelles, quelques études ont porté sur le transfert maternel 17 de testostérone ou de caroténoïdes (e.g. Gil et al., 1999 ; Biard et al., 2007), mais très peu se sont penchées sur le passage d’anticorps de la mère au jeune. Pourtant, ce caractère pourrait influencer de façon importante les dynamiques d’évolution des espèces, et son étude est relativement aisée. En effet, chez les Oiseaux, le transfert d’anticorps s'effectue via l'œuf, ce qui simplifie considérablement les possibilités d'investigation. Mon travail s’est focalisé sur le transfert de l'immunité maternelle aviaire, étant donné l'existence de données physiologiques dans ce clade. Dans une première partie, le transfert maternel d'anticorps est développé dans un cadre général, synthétisant les connaissances actuelles sur le sujet. Deux axes d'étude sont ensuite étudiés plus en détail : le taux de transfert d'anticorps de la mère au jeune, et la persistance plasmatique de ces anticorps chez le jeune après la naissance. La deuxième partie présente une expérience réalisée chez la Poule visant à attester de l'existence d'une variabilité du taux de transfert d'anticorps. La troisième partie explore le fait que des disparités entre espèces dans la persistance des anticorps maternels pourraient être liées à des différences dans la structure moléculaire des immunoglobulines, et propose un cadre théorique à cette étude. 18 19 20 PREMIÈRE PARTIE : ASPECTS GÉNÉRAUX DE L’IMMUNITÉ MATERNELLE CHEZ LES OISEAUX 21 22 1. Introduction de la première partie Le système immunitaire des animaux permet le maintien de l’intégrité de l’organisme, et vise à le défendre contre des agents du non-soi (organismes invasifs, molécules) ou des cellules du soi modifié (cellule infectée par un agent pathogène ou cellule cancéreuse). Il permet ainsi la reconnaissance des organismes étrangers, limite leur propagation, et dans certains cas, aboutit à leur élimination. Chez les Vertébrés, il se divise en deux parties : système immunitaire inné et acquis. L'immunité innée permet la reconnaissance des agents pathogènes bactériens et viraux grâce à des motifs non spécifiques, mais ne procure pas de protection sur le long terme. A l'inverse, l'immunité acquise, reposant sur des mécanismes moléculaires spécifiques de reconnaissance, offre une réponse dirigée spécifiquement contre l’agent pathogène et repose sur une mémoire qui permet une réponse accrue et accélérée lors des rencontres ultérieures avec cet agent pathogène. Les différentes voies du système immunitaire sont schématisées à la Figure 1. La première ligne de défense contre les agresseurs est constituée des barrières physiques que sont la peau et les muqueuses. Ensuite, des acteurs de l’immunité innée sont mobilisés. Le système du complément est composé de protéines formant un complexe d’attaque membranaire, conduisant à la lyse d’une cellule reconnue comme étrangère. Les macrophages et les monocytes, sont mobilisés rapidement lors d’une infection et usent de leurs propriétés phagocytaires afin de neutraliser les envahisseurs. Les lymphocytes NK (« natural killer ») sont également recrutés lors de l’infection, et sont impliqués dans la lyse de cellules infectées, ainsi que dans la synthèse de cytokines qui vont diriger la réponse des lymphocytes B et T dans la réponse immunitaire acquise. Dans le cas où les défenses immunitaires innées n’arrivent pas à endiguer l’infection, une réponse spécifique se met rapidement en place. L’immunité acquise repose sur deux mécanismes, la réponse cellulaire et la réponse humorale. La première met en jeu une interaction entre un antigène et un lymphocyte T, qui peut être effecteur et activer des macrophages par la libération de cytokines, ou cytotoxique et avoir une action lytique directe. La seconde implique la liaison entre un antigène et des récepteurs cellulaires des lymphocytes B, qui se différencient ensuite, avec ou sans la médiation de lymphocytes T, en cellules productrices d’anticorps. Dans le cadre des relations hôtes-parasites, les Vertébrés ont développé une réponse immunitaire humorale, à travers la production d'anticorps spécifiques contre des agents pathogènes donnés. Etant donné que les parasites exercent une pression de sélection* déterminante sur la survie et les performances de reproduction de leurs hôtes, des mécanismes de défense sophistiqués ont évolué en retour (van Baalen, 1998). Le transfert d'anticorps maternels est un phénomène évolutif ancien, apparu avec les premiers Vertébrés Gnathostomes (-460 millions d’années), et retrouvé chez de nombreuses espèces (Grindstaff et al., 2003). Dans ce texte, le terme de parasite décrit tout organisme qui diminue la valeur sélective* de son hôte en l’infectant, qu’il s’agisse de micro-organismes (e.g. virus, bactéries) ou de macro-organismes (e.g. helminthes). Il sera utilisé de concert avec le terme voisin d’agent pathogène, qui peut être défini comme tout organisme à l’origine de virulence* chez son hôte après infection (Méthot & Alizon, 2014). 23 Figure 1 : Principaux mécanismes de la réponse immunitaire D’après Abbas et al., 2013. L’immunité innée, mettant en jeu les barrières épithéliales, le système du complément et différents acteurs cellulaires (phagocytes, cellules dendritiques, lymphocytes NK) est la première forme de réponse immunitaire à intervenir dans les heures suivant l’infection par un agent pathogène. Après un délai de quelques jours, l’immunité adaptative prend le relais : des lymphocytes B se différencient en plasmocytes et sécrètent des anticorps qui reconnaissent des motifs antigéniques, et des lymphocytes T effecteurs détruisent les cellules infectées. 24 2. Cadre de l’étude du transfert d’anticorps maternels en écologie évolutive 2.1. Le transfert d’anticorps de la mère au jeune en tant qu’effet maternel 2.1.1. Définition des effets maternels Le terme d'effet parental décrit tout effet que les parents ont sur le phénotype de leur progéniture, et qui ne sont pas imputables au génotype du descendant (Bernardo, 1996). Il s’agit donc d’influences épigénétiques que les parents ont sur le phénotype de leur descendance, en parallèle de la transmission de matériel génétique (Badyaev, 2008) De nombreux types d'effets parentaux ont été décrits (e.g. choix du site de nidification, soins parentaux), et ce dans des taxons très variés (Mousseau & Fox, 1998). Dans la majorité des cas, c'est la mère qui influence le développement de sa progéniture, et on définit un effet maternel comme l'influence causale du génotype ou du phénotype maternel sur le phénotype du descendant (Wolf & Wade, 2009). Nous nous intéressons à l'investissement immunitaire de la mère au jeune, reflété à travers la transmission d'anticorps maternels. Cet effet maternel est l'un des premiers à avoir été mis en évidence, à travers les travaux de Paul Ehrlich en 1892 sur la transmission passive d'anticorps de la mère au fœtus et son importance dans la protection du jeune dans les premiers stades de vie. Contrairement à d'autres effets maternels, comme le transfert d'hormones (Groothuis et al., 2005), les mécanismes physiologiques sous-tendant la transmission d'anticorps maternels sont relativement bien connus (Brambell, 1970 ; Rose et al., 1974). Pourtant, l'intégration de ces connaissances dans le cadre de l'écologie et de l'évolution de la réponse immunitaire maternelle a été peu envisagée pour l'instant (Gasparini et al., 2001 ; Grindstaff et al., 2003). 2.1.2. Importance de cet effet maternel pour le développement du jeune Les anticorps produits par la mère reflètent l'environnement parasitaire auquel elle a été soumise lors de la conception du jeune. Ainsi, le transfert maternel d'anticorps consiste en un partage d'informations environnementales, d'autant plus utile que les jeunes sont souvent exposés aux mêmes parasites que leurs parents (Boulinier & Staszewski, 2008 ; Garnier et al., 2012b). Cet effet maternel peut être considéré comme une forme de plasticité phénotypique, de par la capacité de réponse aux pressions environnementales qu'il induit (Agrawal, 2001). L'importance du système immunitaire dans la lutte contre les agents pathogènes et la complexité de ce système ont été abondamment étudiées. Face à une infection, on observe une 25 combinaison de mécanismes de la réponse immunitaire innée, mise en place très rapidement, et de la réponse acquise suite au contact avec un parasite, plus spécifique et espacée dans le temps. La production d'anticorps maternels permet un transfert transgénérationnel de cette réponse immunitaire acquise, spécifique d'un agent pathogène donné. Les anticorps maternels protègent le jeune contre des agents pathogènes à un stade où son système immunitaire est encore immature, et ne lui permet pas de se défendre seul, c’està-dire dans les premières semaines (voire mois) de vie. Ils confèrent donc une immunité passive au jeune ; cette protection est à la fois quantitative (taux d’anticorps total) et qualitative (diversité des chaînes lourdes et légères d’anticorps transmis). Mais outre ce rôle passif de protection, il semblerait que les anticorps maternels exercent une stimulation active de la réponse humorale et déterminent en partie certaines caractéristiques importantes du développement de l'immunité du jeune (Lemke & Lange, 2002), et de l'adulte (Lemke et al., 2009). Des exemples de ces caractéristiques sont la régulation de l’expression de certaines classes d’anticorps, ou le façonnement du répertoire immunitaire via la formation d’un réseau d’interactions entre les lymphocytes B et T. Par ailleurs, l’acquisition d’anticorps maternels est corrélée à une augmentation du taux de croissance du jeune, sans doute liée à un compromis énergétique du fait que le jeune ait moins d’énergie à investir dans la protection au profit des fonctions de croissance (Heeb et al., 1998). Ainsi, le transfert d’anticorps de la mère au jeune est un effet maternel qui survient relativement tardivement dans le développement embryonnaire, mais qui a un impact durable sur l’établissement de la réponse immunitaire individuelle, tout en favorisant le développement du jeune. Néanmoins, par son effet immunosuppresseur sur la maturation des lymphocytes B (Carlier & Truyens, 1995), ou « effet de blocage », cet avantage adaptatif est limité dans le temps, et la décroissance des anticorps circulants après la naissance laisse place au développement autonome de l'immunité du jeune. Il existe donc un compromis quant à l’investissement de la mère dans la protection du jeune, qui mène à la transmission d’une quantité optimale d’anticorps. Par exemple, il a été montré chez le Diamant mandarin que de trop forts niveaux d’anticorps transférés par la mère impactent négativement la production d’anticorps endogènes par le jeune, à la fois à court et à long terme (Merrill & Grindstaff, 2014). Des coûts inhérents à la production et au transfert de ces anticorps existent chez la mère ; néanmoins, ils sont limités, en comparaison avec les dépenses énergétiques relatives à d'autres aspects de la réponse immunitaire comme l'immunité innée (Klasing & Leshchinsky, 1999). L'investissement dans la réponse immunitaire du jeune est par contre d'une importance cruciale pour ce dernier, et pourrait lui procurer des avantages adaptatifs, car le jeune est exposé à un environnement parasitaire proche de celui de la mère dans le nid (Boulinier & Staszewski, 2008). 2.1.3. Particularités des effets maternels en termes d’évolution Des facteurs non-génétiques fournis par la mère tels les anticorps maternels peuvent avoir un impact majeur sur la valeur sélective des descendants (Mousseau & Fox, 1998), et 26 donc influencer des processus micro-évolutifs variés. En effet, la présence d'un effet maternel englobe toute forme d'influence de la mère sur le phénotype du descendant, en parallèle de la transmission directe de son patrimoine génétique. La valeur sélective du descendant peut alors être affectée par une combinaison de ses propres gènes et des caractères phénotypiques des parents (Kirkpatrick & Lande, 1989). Sous certaines conditions, les effets maternels, en modifiant à la fois les variations du développement du jeune et les pressions de sélection associées à ces variations, peuvent être des vecteurs plus efficaces d'innovations évolutives que les systèmes de transmission purement génétique (Gluckman et al., 2007). C'est d'autant plus vrai dans le cas des facteurs maternels non-génétiques, qui sont des véhicules pour la transmission de caractères phénotypiques plastiques (Day & Bonduriansky, 2011). Un autre niveau de complexité peut entrer en jeu dans les niveaux d'interconnexion entre facteurs environnementaux et génétiques. Dans le cas où ce sont des différences génétiques qui régulent la variation d'un trait phénotypique qui est un effet maternel, on parle d'effet génétique indirect (Wolf et al., 1998). Ce phénomène est susceptible d'altérer de façon importante le taux attendu d'évolution : en effet, si l'effet maternel a un impact positif sur la survie du jeune, le fait qu'il soit sélectionné va induire des changements plus drastiques dans la valeur moyenne de la variance génétique additive qu'en son absence. Ainsi, les phénotypes maternels et juvéniles co-évoluent, et les effets maternels sont forgés par la sélection à la fois sur les parents et leurs descendants (Grindstaff et al., 2003). 2.2. Une composante génétique au transfert d’anticorps maternels ? Chez les Vertébrés, le développement des différents axes de la réponse immunitaire permet de contrer le fardeau que les pathogènes exercent sur la valeur sélective de leur hôte, c’est-à-dire sur ses capacités de survie et de reproduction (Garnier et al., 2012a). Ainsi, les effets maternels sont de plus en plus envisagés dans un cadre adaptatif (Kirkpatrick & Lande, 1989 ; Mousseau & Fox, 1998 ; Hasselquist & Nilsson, 2009). Néanmoins, la variation génétique existant sur un caractère correspond dans certains cas à un compromis où des effets phénotypiques maternels positifs peuvent être associés à des conséquences négatives sur le phénotype du descendant – par exemple le compromis rendement laitier / taille du veau à la naissance chez la vache -, ceci résultant du fait qu’on ne peut obtenir à la fois une maximisation du phénotype de la mère et du descendant (Roff, 2002). De plus en plus de données laissent penser qu’il existe une composante génétique aux effets maternels et qu’ils ne peuvent donc pas être traités comme des sources de variation purement environnementale (Räsänen & Kruuk, 2007). Chez les Ruminants, on a pu mettre en évidence une base génétique au transfert d’anticorps maternels (Grindstaff et al., 2003). Dans tous les cas, il apparaît crucial d'avoir une compréhension globale des modalités de transfert des molécules effectrices impliquées dans cet effet maternel. Cela nous permettrait de mieux identifier les implications écologiques et évolutives du transfert d'anticorps en tant qu'effet maternel ayant potentiellement une portée adaptative. 27 2.3. Perspectives de l’étude du transfert maternel d’anticorps Les implications de l’étude du transfert maternel d’anticorps sont nombreuses, et touchent des domaines variés, tels l’épidémiologie, la santé animale et humaine, la dynamique des populations ou la biologie de la conservation. L'étude de la transmission maternelle d'anticorps a des applications directes en santé animale et humaine. Par exemple, l'effet de blocage précédemment cité définit une période critique en stratégie vaccinale, où la présence des anticorps maternels rend caduque toute vaccination. En agro-alimentaire, une meilleure compréhension de l'immunité post-natale pourrait permettre de réduire l'utilisation d'antibiotiques en supplémentant les animaux avec des anticorps par voie orale, ainsi que d'affiner les protocoles de vaccination des mères (Zaheer & Saheed, 2003) ou de sélectionner des lignées de poules avec une production augmentée d'anticorps maternels (Martin et al., 1990). Certaines approches thérapeutiques en médecine humaine pourraient également bénéficier de ces connaissances, par exemple la thérapie vaccinale du VIH (Ko et al., 2014), ou la production d’anticorps thérapeutiques monoclonaux (Nishibori et al., 2006). L’utilisation des anticorps aviaires, produits en forte quantité dans le jaune d’œuf, permet aussi de diminuer l’utilisation d’animaux dans des recherches thérapeutiques et diagnostiques à visée d’amélioration de la santé humaine, s’inscrivant dans le cadre de la règle des 3R (« raffiner, réduire, remplacer » : Russell & Burch, 1959). Les effets maternels peuvent jouer un rôle prépondérant dans les dynamiques de populations, dans le sens où ils peuvent générer des changements phénotypiques rapides sur de courtes échelles de temps. Il est aisé d'envisager un fort intérêt de ces mécanismes en environnement perturbé, d'autant plus dans le contexte actuel des perturbations climatiques. Par exemple, la compréhension des mécanismes favorisant la réponse immunitaire face à des agents pathogènes émergents semble primordiale pour appréhender les répercussions sur la distribution des espèces (Van Hemert et al., 2014), notamment dans le cas où les changements climatiques bouleversent les interactions entre espèces. Cela pourrait avoir des applications pratiques en biologie de la conservation (Boulinier & Staszewski, 2008), d'autant plus que les maladies infectieuses sont considérées comme une menace majeure pour les espèces menacées de disparition (Daszak et al., 2000). L'utilisation de la vaccination en tant que mesure de conservation (Haydon et al., 2006) pourrait être d'autant plus judicieuse qu'elle induit une persistance prolongée d'anticorps maternels chez certaines espèces. Enfin, d'un point de vue méthodologique, la compréhension de l'influence des effets maternels sur la survie des descendants a été un point longtemps négligé en écologie. L'absence de leur prise en compte dans l'analyse de données sur le phénotype des descendants a pu être un biais dans certaines études (Bernardo, 1996 ; Räsänen & Kruuk, 2007). Enfin, l’étude du transfert maternel d’anticorps s’intègre également dans un cadre de travail plus classique en écologie et évolution. Il a par exemple été montré que ce type d’effet maternel joue un rôle important dans les phénomènes de spéciation, notamment via l’expansion des barrières géographiques d'une population suite à des perturbations épidémiologiques de la répartition de parasites (Duckworth, 2009). 28 3. Données sur les anticorps aviaires 3.1. Structure moléculaire 3.1.1. Structure générale d’une immunoglobuline Source de cette partie : Davison et al., 2008. Les immunoglobulines sont des glycoprotéines constituées de quatre chaînes polypeptidiques, deux chaînes lourdes (ou H, « heavy ») et deux chaînes légères (ou L, « light »), identiques, qui forment une unité monomérique de base (Figure 2). Les chaînes lourdes et légères sont constituées de domaines, chacun composé d’environ 115 acides aminés. La structure tertiaire des immunoglobulines est liée à l’existence de résidus cystéine et méthionine, hautement conservés, qui forment des ponts disulfures inter-chaînes (entre chaînes lourdes et légères, et entre les deux chaînes lourdes) et intra-chaînes, ainsi que des liaisons non covalentes. A l’extrémité amino-terminale, des régions variables (VL sur les chaînes légères, VH sur les chaînes lourdes) sont caractérisées par une forte variation des résidus, en particulier au niveau de régions hypervariables (CDR, « complementarity-determining regions ») ; sur le reste de la molécule jusqu’à l’extrémité carboxy-terminale, des régions constantes (CL sur les chaînes légères, CH sur les chaînes lourdes) sont beaucoup plus conservées d’une immunoglobuline à l’autre. Les immunoglobulines peuvent être soit sous forme membranaire (exprimées à la surface des lymphocytes B), soit sous forme soluble, sécrétées dans le milieu extracellulaire (on parle alors d’anticorps). Dans le premier cas, elles comportent une région transmembranaire située à l’extrémité carboxy-terminale de la chaîne lourde. Par digestion enzymatique avec la papaïne, deux structures particulières ont pu être identifiées au sein de la molécule d’immunoglobuline. Le fragment Fab (« antigen binding ») présente une grande variabilité et est le siège de la fixation des antigènes. Le fragment Fc (« cristallisable ») est relativement constant et se fixe aux récepteurs des cellules effectrices de la réponse immunitaire ou de leurs intermédiaires (cellules présentatrices d’antigènes). 29 Figure 2 : Structure générale d’un anticorps Adapté d’après Coico & Sunshine, 2009. (a) Organisation des domaines d’une molécule d’anticorps. (b) Repliement des domaines et activités biologiques correspondantes. VH : domaine variable de la chaîne lourde. VL : domaine variable de la chaîne légère. CH : domaine constant de la chaîne lourde. CL : domaine constant de la chaîne légère. S-S : pont disulfure. CHO : signature de glycosylation. NH3+ : extrémité amino-terminale. COO- : extrémité carboxy-terminale. 30 3.1.2. Les différentes classes d’immunoglobulines chez les Oiseaux Les immunoglobulines peuvent présenter différents types de régions constantes au niveau de leur chaîne lourde, nommés isotypes ou classes. Ces isotypes confèrent des fonctions différentes aux immunoglobulines produites. Trois isotypes d’immunoglobulines ont été identifiés chez les Oiseaux : IgY, IgM et IgA. Chez les Mammifères, les IgG sont les équivalents fonctionnels des IgY aviaires, et deux isotypes supplémentaires existent, les IgD et IgE, mais ils ne semblent pas présents chez les Oiseaux (Davison et al., 2008). Les IgY (istoype υ) sont la principale forme d’anticorps retrouvée dans la circulation sanguine lors de la mise en place d’une réponse immunitaire humorale. C’est aussi la classe majeure d’anticorps qui est transférée de la mère au jeune, et c’est son étude qui va faire l’objet du reste de ce travail. Les IgM (isotype μ) sont les anticorps majoritaires exprimés à la surface des lymphocytes B. Ils existent sous deux formes : une forme polymérique soluble, circulante, et une forme monomérique membranaire. Il s’agit du premier isotype à être exprimé lors du développement embryonnaire. C’est également le premier à être mobilisé lors de la rencontre initiale avec un agent pathogène, mais de façon transitoire, avant que la commutation isotypique (c’est-à-dire le passage à la sécrétion d’autres isotypes d’anticorps après maturation du lymphocyte B) ne s’opère. Les IgA (isotype α) sont retrouvés de façon prédominante dans les sécrétions corporelles, sous forme dimérique, et assurent une protection locale au niveau des muqueuses en contact avec le milieu extérieur. Par ailleurs, deux types de chaînes légères peuvent être rencontrés pour chacun de ces isotypes chez les Mammifères, dénommés κ et λ. Chez les Oiseaux, seule la chaîne légère λ a été identifiée (Davison et al., 2008). 31 3.1.3. Structure des IgY Les IgY sont les équivalents fonctionnels des IgG des Mammifères, elles sont synthétisées en grandes quantités lors de phénomènes infectieux et peuvent se lier à des épitopes spécifiques d’agents pathogènes. C'est la principale forme d'anticorps circulants retrouvée chez les Oiseaux, à l'issue du changement de l'isotype dominant (passage des IgM aux IgY dans les jours/semaines suivant une infection). Isolées à l’origine dans le jaune d'œuf (Y pour « egg yolk », Klemperer 1893), les IgY sont également retrouvées chez les reptiles, les amphibiens et les poissons dipneustes. En comparaison avec les IgG mammaliennes, les IgY ont un poids moléculaire plus élevé (180 kilodaltons, ou kDa, contre 150 kDa), leur partie constante est composée de 4 domaines et non 3, et n’ont pas de région de pontage bien définie, ce qui les rend plus rigides. Chez les Ansériformes (e.g. Canard, Oie), certains reptiles et les poissons Dipneustes, une forme tronquée d’IgY (IgYΔFc), dépourvue des domaines terminaux CH3 et CH4, a été identifiée (Lundqvist et al., 2006). Elle conserve la propriété de fixer des antigènes, mais n’a pas de fonction effectrice du fait du manque de la portion Fc. La forme tronquée est aussi transmise de la mère au jeune, bien qu’en des proportions moindres que l’IgY intacte (Liu & Higgins, 1990). On pense que les IgY ont évolué en tant que précurseur des IgE et des IgG mammaliennes (Figure 3 ; Warr et al., 1995). En effet, les IgY sont structurellement très proches des IgE. En outre, la comparaison des parties constantes des chaînes lourdes des IgG et des IgY montre que les domaines CH2 et CH3 des IgG ont une séquence similaire aux domaines CH3 et CH4 des IgY. Le domaine CH2 des IgY n’a pas d’équivalent structurel à proprement parler chez les IgG, mais il pourrait avoir été à l’origine de la formation de la région pontée des IgG suite à une condensation. 32 Figure 3 : Comparaison de la structure des IgG, IgY et IgE Adapté d’après Warr et al., 1995. Les IgY sont structurellement semblables aux IgE, bien que leurs fonctions biologiques soit équivalente à celles des IgG. VH : domaine variable de la chaîne lourde. VL : domaine variable de la chaîne légère. CH : domaine constant de la chaîne lourde. CL : domaine constant de la chaîne légère. γ, ν et ε : nomenclature des isotypes correspondant aux IgG, IgE et IgY. 33 3.1.4. Gènes des IgY A) Organisation générale des gènes des immunoglobulines et mécanismes de genèse du répertoire d’anticorps Les loci des chaînes lourdes et légères sont positionnés à différents endroits du génome. Les gènes codant la partie constante des chaînes lourdes, et aboutissant à la synthèse des différents isotypes des Ig, sont regroupés sur un locus, le locus IGHC (ImmunoGlobulin Heavy Chain), qui sera décrit plus en détail en B). La partie variable de la chaîne légère est issue de quelques segments VL (segment variable, un chez la Poule : Reynaud et al., 1985 ; quatre gènes fonctionnels chez le Canard : Pandey et al., 1993) et d’un segment JL (segment de jonction). Ainsi, chez les Oiseaux, l’événement de réarrangement sur le locus de la chaîne légère génère un faible nombre de combinaisons VJL, en contraste avec les Mammifères, où de nombreux gènes VL peuvent s’associer à plusieurs segments de jonction. La partie variable de la chaîne lourde est codée par trois segments géniques, qui sont VH (segment variable), DH (segment générant la diversité) et JH (segment de jonction). Chez la Poule, cette partie est issu de la combinaison de plusieurs segments VH à forte homologie, d’un unique segment JH et de multiples segments DH, plus variés ; de même que pour le domaine variable de la chaîne légère, cela génère une diversité bien moins grande que chez les Mammifères, où de nombreuses familles de segments VH, DH et JH ont été répertoriées (Parvari et al., 1988). Chez les Mammifères, le réarrangement VDJH a lieu avant celui touchant les portions VDJL : la formation de la partie variable des chaînes lourdes est un pré-requis pour celle, subséquente, des chaînes légères. Chez les Oiseaux, le réarrangement de ces deux portions a lieu de façon concomitante. Etant donné la diversité bien plus réduite au niveau des séquences des chaînes légères chez les Oiseaux, cela n’impacte pas négativement la genèse du répertoire d’anticorps (Davison et al., 2008). Une famille de pseudogènes a été localisée en amont du locus codant la chaîne légère (Thompson & Neiman, 1987). Des fragments issus de ces pseudogènes sont incorporés au sein des segments VL réarrangés ; ce processus, nommé conversion génique, augmente grandement la diversité des anticorps produits et n’a été retrouvé que dans le règne aviaire. De tels mécanismes de diversification semblent également mis en jeu dans le cas des chaînes lourdes. Par contre, des événements d’hypermutation somatique n’ont pas été répertoriés chez les Oiseaux. L’ensemble des éléments comparatifs de diversification des anticorps entre Oiseaux et Mammifères est présenté sur la Figure 4. Une hypothèse pouvant expliquer l’existence de ces particularités serait que le génome aviaire a subi des événements évolutifs inédits, menant à des délétions importantes et le réarrangement entier de l’ADN ; en effet, le génome aviaire fait la moitié de la taille de celui des Mammifères et des Amphibiens, et est principalement composé de microchromosomes (Zhao et al., 2000). 34 Figure 4 : Comparaison des mécanismes aviaires et mammaliens de diversification du répertoire d’anticorps D’après Schade et al., 2005. a) locus de la chaîne légère de la Souris b) locus de la chaîne légère de la Poule V : segment variable, J : segment de jonction, L : séquence leader, ψV : pseudogènes du segment variable C : segment de la partie constante. 35 B) Organisation du locus IGHC Le locus IGHC contient les gènes des chaînes lourdes des IgY, IgM et IgA, il est situé sur le chromosome E18C15W15 chez la poule (Zhao et al., 2000). La taille complète du locus IGHC est de 67 kb (kilobases). Chaque isotype est codé par un gène distinct. L’organisation atypique de ce locus est caractérisée par le fait que les gènes codant la partie constante des chaînes lourdes des IgY, des IgA et des IgM se suivent, mais que l’ordre transcriptionnel est inversé dans le cas de l’IgA (Figure 5). Le gène υ de la chaîne lourde de l’IgY est composé de trois exons séparés par deux introns, correspondant respectivement aux domaines CH1-CH2 (condensés en un exon), CH3 et CH4. Chez le Canard, le gène υ est composé de 7 exons (4 exons correspondant aux domaines de la partie constante de la chaîne lourde, et 3 exons correspondant à des séquences de terminaison), et aboutit, par le biais de processus d’épissage alternatif, à la formation de l’IgY entière et de sa forme tronquée, l’IgYΔFc (Magor et al., 1994). 36 Figure 5 : Organisation du locus IGHC Adapté d’après Zhao et al., 2000. Les flèches représentent l’orientation transcriptionnelle des gènes. Les symboles μ, α et υ désignent respectivement les chaînes lourdes des IgM, IgA et IgY. JH : segment de jonction, C : domaine de la partie constante de la chaîne lourde, kb : kilobase. 37 3.2. Fonctions assurées par les IgY Source de cette partie : Davison et al., 2008. 3.2.1. Support de l’immunité adaptative Les anticorps sont produits par les plasmocytes, issus de la différenciation des lymphocytes B en réponse à un agent pathogène. Ils possèdent la propriété de reconnaître spécifiquement des agents pathogènes et de les présenter aux effecteurs permettant leur élimination. Ainsi, l’anticorps constitue un pont moléculaire entre l’agent pathogène reconnu, et les agents du système immunitaire (cellules effectrices et molécules) qui sont en charge de sa dégradation. 3.2.2. Reconnaissance des motifs antigéniques Les anticorps n’interagissent pas avec l’ensemble de l’agent pathogène. Les sites spécifiques des agents pathogènes reconnus par les anticorps sont nommés épitopes, ou déterminants antigéniques. Un antigène possède deux particularités : celle d’induire une réponse immunitaire acquise (immunogénicité), et celle de se lier spécifiquement aux produits finaux des réponses immunitaires, c’est-à-dire les anticorps et les récepteurs des surfaces cellulaires (antigénicité). Cette interaction, basée sur des liaisons non covalentes (liaisons hydrogènes, hydrophobes, ioniques, forces de van der Waals) aboutit à la formation d’un complexe immun. Au niveau de la région variable, des sites de fixation à l’antigène sont présents. L’association des domaines VL et VH forme le site de liaison à l’antigène, à l’origine de la spécificité de l’anticorps en question, principalement au niveau des CDR. Ce site peut fixer des épitopes de 6 à 9 acides amines ou carbohydrates. 3.2.3. Suppression de l’activité pathogénique La région constante est reconnue par les effecteurs cellulaires, par des récepteurs à la surface des phagocytes et des cellules inflammatoires ; elle interagit également avec les protéines du système du complément. L’activité des agents pathogènes peut être supprimée de différentes façons (Figure 6) : Par neutralisation Les anticorps se fixent sur des fragments de l’agent pathogène et l’empêchent d’assurer ses fonctions biologiques, inhibant ainsi sa propagation. C’est principalement le cas pour des virus, dont la réplication est bloquée par ce biais. 38 Par activation de la voie du complément La voie classique du complément est activée par liaison avec le complexe anticorpsantigène. La molécule C1q se fixe à deux IgY au niveau de leur Fc, puis stimule par des réactions en cascade l’activité d’enzymes aboutissant à la formation d’un complexe d’attaque membranaire sur l’agent pathogène ou la cellule infectée. Par fixation à des types cellulaires variés Le premier mécanisme mis en jeu est celui de la cytotoxicité. Des cellules activées, telles les lymphocytes NK, libèrent des granules contenant des enzymes protéolytiques. Ce mécanisme est nommé ADCC (« antibody dependant cytotoxicity » pour cytotoxicité dépendante des anticorps). La reconnaissance des cellules infectées se fait par la liaison du Fc des anticorps fixés en surface à des récepteurs membranaires des cellules effectrices. Un second mécanisme est celui de l’opsonisation, ou facilitation de la phagocytose. Les effecteurs cellulaires impliqués dans ce contexte sont les macrophages et les neutrophiles. Les macrophages sont issus des monocytes (globules blancs circulants présents dans la circulation périphérique), ils réalisent la phagocytose des agents pathogènes. Ils sont impliqués à la fois dans l'immunité innée et dans l'immunité adaptative. Dans le premier cas, ils disposent de mécanismes propres pour reconnaître les agents pathogènes ; dans le second cas, ils coopèrent avec les lymphocytes. Les neutrophiles peuvent migrer directement jusqu'au site lésionnel et possèdent des activités phagocytaire et microbicide. 3.2.4. Réactions d’hypersensibilité Il a été montré que les IgY sont impliqués dans des réactions anaphylactiques (Faith & Clem, 1973). Cette propriété, en plus de leur proximité structurelle, est un argument supplémentaire en faveur de l’évolution des IgE à partir des IgY. 3.2.5. Mise en place d’une mémoire immunitaire Lors d'une primo-infection, la réponse immunitaire à médiation humorale met quelques jours à quelques semaines à se mettre en place (durée variable selon les espèces et les agents pathogènes rencontrés), le temps que l'expansion lymphocytaire puisse se réaliser. Les clones lymphocytaires sélectionnés comprennent aussi des cellules mémoire, qui sont aptes à répondre avec rapidité aux rencontres ultérieures avec l’agent pathogène. Cette propriété est utilisée dans l’établissement d’une réponse vaccinale. 39 Figure 6 : Mécanismes d’action des anticorps contre les agents pathogènes D’après Boujard et al., 2015. FcR : récepteurs de la portion constante des anticorps ; NK : lymphocyte « natural killer » ; Eo : granulocyte éosinophile ; Ne : granulocyte neutrophile ; C3b : protéine du complément issue de la lyse de C3, se fixant sur la membrane cellulaire 40 4. Modalités de transfert des immunoglobulines aviaires 4.1. Anticorps transférés Contrairement aux Mammifères chez lesquels les anticorps maternels sont transférés via le placenta, le colostrum et le lait, chez la majorité des Oiseaux, ce transfert a lieu uniquement pendant la formation de l’œuf (Brambell, 1970). Les différentes classes d’anticorps sont contenus dans des parties séparées de l'œuf : les IgY (et une faible portion des IgM), stockés dans le jaune d'œuf, traversent l'endoderme au niveau de la vésicule vitelline pour finir dans la circulation sanguine, alors que les IgA et la majeure partie des IgM sont contenus dans les fluides amniotiques (blanc d'œuf) et ingérés pour conférer une protection locale au niveau du tube digestif, en plus d'être une source de protéines (Rose et al., 1974). Certains Oiseaux (pigeons, flamants) peuvent en outre transmettre des anticorps à leurs poussins par le biais du lait de jabot. 4.2. Etapes de la transmission des IgY La transmission des IgY de la mère au jeune se fait selon deux étapes (Figure 7) : - Du plasma au jaune d’œuf : Dans une première étape, un passage d’anticorps a lieu depuis le sérum de la mère à travers l'épithélium folliculaire de l'utérus jusqu'au jaune d'œuf par un phénomène supposé actif (Kowalczyk et al., 1985) ; l'implication d'un récepteur cellulaire dans cette étape reste encore hypothétique, mais elle est soutenue par des travaux sur l'absence de passage d'anticorps hétérologues et des IgM (Tressler & Roth, 1987) ainsi que expériences de mutagenèse sur des résidus à l'interface CH3-CH4 (Murai et al., 2013) qui indiquent une forte sélectivité du transfert. Le fragment Fc de l’IgY semble être le siège du transport, notamment au niveau de motifs spécifiques : résidus 251-254 à l’interface CH2-CH3 (Leu-Tyr-Ile-Ser, ou motif LYIS) et 429-432 au niveau du CH3 (His-Glu-Ala-Leu, ou motif HEAL) (Morrison et al., 2001). Néanmoins, une faible proportion des IgYΔFc circulantes, dépourvues du Fc, est aussi incorporée dans le jaune d’œuf, sans doute par endocytose (Kitaguchi et al., 2008). De plus, les IgY sont des molécules volumineuses (poids moléculaire de 180 kDa), il est donc peu probable qu'elles puissent diffuser de façon passive. Le passage des IgY à travers l’épithélium folliculaire met environ 6 jours chez la poule (Kowalczyk et al., 1985). 41 - Du jaune d’œuf à l’embryon : Dans une seconde étape, le passage des IgY du jaune d'œuf à la circulation embryonnaire du jeune débute à partir du 8e jour de vie in ovo (Kramer & Cho, 1970), via l'absorption des IgY par un récepteur présent sur la membrane vitelline, le FcRY (chicken yolk sac IgY receptor) (West et al., 2004). A l'issue de ce transfert, on estime que 10 % de la quantité totale d'IgY déposée dans le jaune d'œuf est absorbée par le jeune (Kowalczyk et al., 1985), le reste servant probablement de source nutritive pour l'embryon. Le passage des anticorps du jaune d'œuf à l'embryon se produit à un taux d'abord assez faible, de l’ordre de 25 μg/j, avant d'augmenter fortement quelques jours avant l'éclosion, jusqu’à plus de 600 μg/j dans les 3 jours avant l’éclosion, aboutissant à un taux plasmatique à la naissance de 1-2 mg/mL chez le poussin (Kowalczyk et al., 1985). 42 Figure 7 : Etapes de la transmission maternelle d’anticorps Adapté d’après West et al., 2004. FcRY : récepteur des IgY ; ? : mécanisme de transfert inconnu. 43 4.3. Taux d’anticorps dans l’œuf Le taux d’anticorps transférés au jaune d’œuf semble proportionnel à celui du sérum de la mère (Hamal et al., 2006). Chez la Poule, des taux d’IgY dans l’œuf de l’ordre de 8 à 25 mg/mL ont été retrouvés ; en comparaison, les taux d’IgM et d’IgA, respectivement estimés à 0,15 et 0,5 mg/mL dans le jaune d’œuf, sont négligeables (Rose et al., 1974 ; Kowalczyk et al., 1985). Il est possible d’extraire, à partir d’un œuf de poule, entre 100 et 200 mg d’IgY (Schade et al., 1994). Divers facteurs semblent influencer la quantité d'anticorps transmis : ainsi, des restrictions alimentaires pendant la période de ponte induiraient un transfert d'anticorps spécifiques significativement plus limité, en raison du coût de ce transfert au détriment des fonctions de maintenance de la mère (Ismail et al. 2013), mais ces mécanismes limitant le transfert sont mal connus. Peu d'études ont porté sur la variabilité de la quantité d'anticorps transmis de la mère au jeune. Cela peut s'expliquer par le fait que le transfert d'anticorps maternels a longtemps été vu comme un phénomène passif, réalisé à un taux supposé invariant d'environ 30% (Brambell, 1970 ; Hamal et al., 2006). Selon cette vision, les mères ayant les réponses humorales les plus fortes transmettraient davantage d'anticorps à leurs petits par défaut. Or s'il existe une variabilité individuelle dans le transfert d'anticorps maternel, cela indiquerait qu'il existe une base génétique à ce transfert, où la sélection naturelle ou artificielle peut s'opérer (Grindstaff et al., 2003). De plus, étant donné que des mécanismes indépendants sont impliqués dans la production et dans le transfert d'anticorps, le taux de transfert d'anticorps pourrait être un caractère ouvert à la sélection. Des variations conséquentes de taux d’anticorps dans l’œuf ont été rapportées pour des espèces différentes (e.g. Addison et al., 2009), et pour différentes lignées de poules (e.g. Abdel-Moneim & Abdel-Gawad, 2006). Une étude récente (Coakley et al., 2014) a conclu que, sur la population étudiée, il existait une variabilité inter-individuelle dans le taux d'anticorps transmis au jeune, associée à une répétabilité de ce taux chez le même individu. Ce résultat suggère que la capacité d'une femelle à produire des anticorps et celle de les transférer au jeune sont deux caractères indépendants, qui pourraient donc exprimer des réponses différentes à la sélection. Cet aspect sera étudié chez la poule dans la partie 2. 4.4. Catabolisme des anticorps maternels Chez la poule, les IgY retrouvés chez le jeune à l’éclosion correspondent en totalité aux anticorps transférés par la mère via le jaune d’œuf. Ce n’est qu’à partir du 6 e jour postéclosion que le jeune commence à produire ses propres anticorps (Lawrence et al., 1981). Après la naissance, le taux d'anticorps circulants, issus de la mère, décroît rapidement dans les premiers jours puis augmente en réponse au développement de l'immunité propre du jeune (Davison et al., 2008). 44 4.5. Bases moléculaires de la persistance des anticorps maternels Un récepteur mammalien, le FcRn, est responsable non seulement du transfert des IgG de la mère au jeune, mais participe également au recyclage des anticorps maternels, évitant leur dégradation. Chez les Oiseaux, on a pu montrer que le récepteur FcRY est aussi impliqué dans des mécanismes de recyclage des anticorps, ceci pouvant expliquer leur persistance sérique (Tesar et al., 2008). D'autres récepteurs sont impliqués dans la capture et la dégradation des IgY : CHIR-AB1 (bifunctional chicken immunoglobulin receptor 1), ggFCR (Gallus gallus Fc receptor), ... Ces récepteurs étant exprimés à la surface des lymphocytes B, ils n'interviennent donc que quand le système immunitaire du jeune est fonctionnel (Tian & Zhang, 2012). Le FcRY est structurellement différent du FcRn présent chez les Mammifères, mais ces deux récepteurs auraient suivi une évolution fonctionnelle convergente (West et al., 2004). Tandis que le FcRn est un récepteur de type CMH1-like (CMH : complexe majeur d’histocompatibilité), la structure du FcRY s’apparente à celle d’une phospholipase A2 (Figure 8). Le rôle du FcRn dans l'homéostasie des IgG a été amplement étudié (Roopenian & Akilesh, 2007 ; Ghetie & Ward, 2002). En particulier, le fait que des souris déficientes en FcRn voient leur concentration d'anticorps diminuée, aux stades juvénile et adulte, par rapport à des animaux non déficients, suggère que le FcRn joue un rôle-clé dans la persistance sérique des anticorps maternels et l'inhibition de leur dégradation (Roopenian et al., 2003). Des analyses cristallographiques ont montré que le FcRn se fixe sur le fragment Fc des IgG, plus précisément entre les domaines CH2 et CH3 (Martin et al., 2001), et que des mutations sur plusieurs histidines de cette région affectent de façon importante l'affinité pH-dépendante de la liaison (Raghavan et al., 1995). Par ailleurs, il a été montré que le FcRY se lie à la partie constante terminale des chaînes lourdes d'IgY (He & Bjorkman, 2011), et que la partie de reconnaissance de l'antigène n'influe pas sur cette liaison (West et al., 2004). Les histidines médiant l'affinité au niveau du FcRn n'ont cependant pas été retrouvées sur le FcRY, suggérant d'autres modalités structurales de fonctionnement (Parvari et al., 1988). Bien que différant dans leurs structures, les fonctions assurées par ces récepteurs quant au recyclage des anticorps maternels chez le jeune sont similaires (Figure 9). L’activité de ces deux récepteurs est pH-spécifique : la liaison avec les immunoglobulines est effective à un pH de 6,5-7, lors de leur internalisation par des vésicules d’endocytose. Les immunoglobulines sont ensuite libérées une fois au contact du sang, qui a un pH un peu plus basique (Tesar et al., 2008 ; He & Bjorkman, 2011). 45 Figure 8 : Comparaison structurelle du FcRn et du FcRY D’après West et al., 2004. MHC : complexe majeur d’histocompatibilité ; PLA2E : récepteur de la phospholipase A2 ; DEC-205 : récepteur des cellules dendritiques ; Endo180 : récepteur du collagène ; MR : récepteur du mannose. PLA2, DEC-205, Endo180 et MR sont des membres de la famille des récepteurs du mannose. 46 Figure 9 : Mécanisme de recyclage des IgG mammaliennes par le FcRn Adapté d’après Roopenian & Akilesh, 2007. a) Des protéines solubles sont internalisées par pinocytose dans une vésicule d’endocytose. Au début, le pH est neutre et les IgG ne s’associent pas au FcRn présent sur la membrane. b) La fusion de la vésicule d’endocytose avec d’autres vésicules aboutit à la formation d’un endosome dont le pH est acide, ce qui entraîne la liaison entre les IgG et le FcRn. c) Les protéines non liées à un récepteur (par exemple, IgG en excès) peuvent être dégradées ; l’endosome s’acidifie progressivement pour devenir un lysosome. d) Les IgG peuvent également être recyclées : fixées sur le FcRn, elles échappent à la voie lysosomale et sont reconduites vers un des pôles de la cellule. e) Après fusion de la paroi de la vésicule avec la membrane plasmique, le pH augmente et les IgG se dissocient du FcRn. Le même mécanisme est utilisé pour le recyclage des IgY par le FcRY aviaire. Il peut être réalisé au pôle apical tout comme au pôle basal de la cellule. 47 48 DEUXIÈME PARTIE : EXPLORATION DE LA VARIABILITÉ GÉNÉTIQUE DU TAUX DE TRANSFERT MATERNEL D’ANTICORPS CHEZ LA POULE À TRAVERS L’ANALYSE D’UNE EXPÉRIENCE DE SÉLECTION 49 50 1. Introduction de la deuxième partie Le transfert d’anticorps chez les Oiseaux a été étudié à travers ses composantes physiologiques, mais on connaît mal la variabilité associée à ce phénomène. Certains auteurs ont suggéré une base génétique potentielle au transfert maternel d'anticorps (Grindstaff et al., 2003). En outre, il est admis qu'il existe une variabilité génétique individuelle dans la capacité à produire des anticorps (Sorci et al., 1997), mise en évidence à travers des expériences sur des lignées de poules sélectionnées (e.g. Minozzi et al., 2008b). En revanche, le fait que le transfert des anticorps maternels soit aussi contrôlé génétiquement a été peu étudié. Il a été montré que les femelles ayant davantage d'anticorps circulants transfèrent plus d'anticorps dans le jaune d'œuf (Gasparini et al., 2002 : exemple pour une espèce sauvage en population naturelle), mais il reste à évaluer s'il existe une variabilité du taux de transfert indépendamment de la production d'anticorps de la mère. Nous avons cherché à déterminer s'il existait une composante génétique au transfert d'anticorps maternels, en évaluant la variabilité inter-individuelle et la répétabilité intraindividuelle de ce caractère. Dans ce but, une expérimentation en conditions contrôlées a été réalisée, ce qui nous a permis de limiter l'impact environnemental sur la variation du taux de transfert d'anticorps. Afin d'explorer si le taux de transfert d'anticorps variait entre femelles, nous avons étudié le transfert d'anticorps spécifiques contre deux agents pathogènes aviaires : le virus de la maladie de Newcastle (NDV) et le virus de la bronchite infectieuse (IBV). Ces deux microorganismes touchent à la fois la faune sauvage et les oiseaux domestiques, et ont des retombées économiques très importantes en élevage. Dans le cas d'une infection par des souches vélogènes (hautement pathogènes), ces maladies peuvent induire de fortes mortalités dans les populations. Pour l'IBV, des formes aiguës se manifestant par des symptômes respiratoires ou rénaux touchent les jeunes animaux, et l'infection des poules pondeuses se traduit généralement par une diminution de la performance dans la production d'œufs (OIE, 2012). Pour le NDV, les symptômes sont très variables selon la souche infectante, pouvant aller de formes à haute mortalité accompagnées de lésions nerveuses, intestinales ou respiratoires, à des formes plus légères voire asymptomatiques (OIE, 2012). Deux expériences ont été conduites sur des poules à l’INRA de Theix : une expérience pilote sur la répétabilité du taux de transfert d'anticorps intra- et inter-lignées, et une expérience de sélection sur ce caractère maternel pendant 5 générations. Le travail a porté sur l’analyse rétrospective des données de ces deux expériences, la première ayant été réalisée en 2007, et la deuxième conduite de 2010 à 2015. J’ai réalisé l’analyse des données de 2007 (préalablement transformées en concentrations d’anticorps à l’INRA), ainsi que des données de 2010 à 2015. De plus, dans la deuxième expérience, des dosages d’anticorps ont été réalisés par mes soins pour la dernière année d’échantillonnage. 51 52 2. Matériel et méthodes 2.1. Evaluation de la répétabilité des taux de transfert d'anticorps de poules sélectionnées sur des critères immunologiques 2.1.1. Choix des lignées Quatre lignées de poules White Leghorn issues de la même population reproduite à l'INRA (Institut National de la Recherche Agronomique) de Nouzilly ont été utilisées. Le protocole expérimental est décrit à la Figure 10A. Les lignées ont été sélectionnées au cours de 12 générations sur différents critères de la réponse immunitaire (Pinard-van der Laan, 2002 ; Minozzi et al., 2008a), à savoir : - Lignée 1 : forte réponse humorale contre le NDV mesurée par un test d'inhibition de l'hémagglutination à 6 semaines d'âge, après vaccination à 3 semaines avec un vaccin atténué NDV contre la souche virale Hitchner B1 (Intervet). Le principe du test d’inhibition de l’hémagglutination est le suivant (cf. Figure 10B) : le NDV possède à sa surface des hémagglutinines, qui sont des protéines pouvant se fixer aux érythrocytes, au niveau de résidus d’acide sialique sur leur surface, et les agglomérer en réseaux. Cela se traduit par la formation d’une couche fine de couleur rose en surface du puits, sans sédimentation (réaction d’hémagglutination positive) ; dans le cas contraire, on observe une tache rouge au fond du puits (réaction d’hémagglutination négative). Dans le test, le virus est d’abord mis en présence d’un échantillon contenant les anticorps spécifiques à doser, dirigés contre les hémagglutinines. Dans un second temps, des érythrocytes sont rajoutés dans la solution. Si les anticorps sont présents dans l’échantillon, ils se fixent au virus, masquant les sites d’interaction avec les érythrocytes, et la réaction d’hémagglutination est inhibée. La quantité de particules virales présente dans l’échantillon peut être déterminée à partir de différents niveaux de dilution. - Lignée 2 : forte réponse immunitaire à médiation cellulaire mesurée par la réponse à 24h (heures) d'intervalle à la phytohémagglutinine à 9 semaines d'âge. La phytohémagglutinine est un mitogène d’origine végétale. Elle est injectée en sous-cutané, et une mesure de l’œdème local est réalisée après un délai de 24h afin de mesurer l’activité de division des lymphocytes T. - Lignée 3 : activité phagocytaire élevée mesurée par le test de clairance du carbone à 12 semaines d'âge. 53 Une encre de carbone est injectée par voie intraveineuse. Des prélèvements sanguins sont effectués à 5 et 15 minutes post-injection et une mesure d’absorbance permet de déterminer la demi-vie du carbone, corrélé à un index phagocytaire, qui mesure la quantité de cellules du système réticulo-endothélial actives dans le sang. - Lignée 4 : lignée contrôle issue de croisements aléatoires, rajoutée en plus pour pouvoir évaluer l’effet de divergence des trois lignées comparé à une lignée non sélectionnée. Les caractères de la réponse immunologique qui ont fait l’objet de la sélection ont été mesurés sur tous les animaux des trois premières lignées. Une étude réalisée sur ces lignées (Pinard-van der Laan, 2002) n’a trouvé aucune corrélation significative entre des caractères non sélectionnés. En outre, les trois caractères de la réponse immunitaire ne semblent pas être corrélés entre eux. 54 Figure 10 : Protocole de la première expérience A. Plan expérimental B. Principe du test d’inhibition de l’hémagglutination (sélection de la lignée 1) 55 2.1.2. Conditions d’élevage Tous les oiseaux ont été vaccinés contre le NDV à 3 semaines d'âge, et contre l'IBV aux jours 1 et 63 post-éclosion. Ils ont également été vaccinés contre d'autres maladies des volailles : maladie de Gumboro, maladie de Marek, encéphalomyélite aviaire et rhinotrachéite infectieuse. L'étude, réalisée en 2007, a porté sur un total de 168 femelles, réparties de façon quasiéquitable entre les lignées (n = 42, 42, 20 et 44 respectivement). Les animaux ont été gardés dans la même salle, chacun dans une cage individuelle, nourris ad libitum avec un accès libre à l'eau, et exposés à un éclairage artificiel constant de 16h par jour. Tous les individus ont commencé à pondre à partir de la 22e semaine. A l’issue de l’expérience, 105 individus ayant des données collectées de façon complète pour les deux mois d’échantillonnage ont été pris en compte dans les analyses (n = 25, 28, 23 et 29 dans l’ordre respectif des lignées). 2.1.3. Protocole d’échantillonnage Pour chaque individu, un échantillon sanguin et un œuf ont été collectés, à deux reprises, respectivement à 24 et 41 semaines d'âge. Les prises de sang ont été réalisées sur la veine brachiale avec des seringues préalablement héparinées. Les œufs correspondant à la journée d'échantillonnage ont été prélevés, et dans les cas où la poule n'avait pas pondu, l'œuf de la veille a été récolté. Pour la première session de collecte, les plasmas et les jaunes d'œufs ont été congelés à -20°C avant analyse, tandis qu'ils ont été directement analysés pour la deuxième session. 2.1.4. Extraction des anticorps spécifiques du jaune d’œuf Les anticorps totaux ont été extraits des jaunes d'œufs en suivant une méthode d'extraction au chloroforme modifiée (Mohammed et al., 1986). Pour chaque individu, une quantité de 0,8 g de jaune d'œuf a été prélevée puis diluée de façon équimolaire dans un tampon PBS (Phosphate-Buffered Saline). Le mélange a été vortexé pendant 4 minutes, puis dilué au 1:1 dans du chloroforme, avant d'être centrifugé pendant 15 minutes à 6000 tr/min (tours/minute). A l'issue de ce processus, le mélange a été séparé en trois phases : le surnageant contenant les anticorps dans du PBS (phase prélevée pour les analyses), un dépôt lipidique central et la phase la plus dense contenant du chloroforme et des caroténoïdes. 56 2.1.5. Estimation des quantités d’anticorps A) Technique utilisée Les analyses immunologiques ont été conduites sur les plasmas des poules et les extraits d'anticorps des œufs correspondants. Des tests ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) spécifiques des antigènes étudiés ont été utilisés pour la détection des anticorps, en suivant les instructions de la notice des tests. Le principe de ces tests repose sur le fait que l'anticorps recherché est quantifié par liaison à son antigène associé, fixé sur les parois des puits de la plaque d'ELISA. La présence des anticorps spécifiques est ensuite révélée par l'ajout d'anticorps marqués par une enzyme ; une mesure de la densité optique (DO) de chaque puits permet d'estimer la quantité d'anticorps présente dans l'échantillon. Deux types de tests ELISA ont été utilisés (Figure 11) : - Test ELISA compétitif : Le principe de ce test repose sur la compétition entre les anticorps à doser et des anticorps conjugués à une enzyme, qui vont se fixer sur les mêmes portions d’antigènes. L’échantillon contenant les anticorps à doser (Ac1) est ajouté dans un puits sur lequel est fixé son antigène spécifique. Les anticorps présents forment un complexe antigène-anticorps, masquant les sites de liaison à l’antigène. Après rinçage, on dépose des anticorps spécifiques monoclonaux (Ac2) conjugués à une enzyme (ici, la peroxydase de raifort, ou HRP), qui vont se fixer sur les sites antigéniques restés vacants à l’étape précédente. Un autre lavage est réalisé, et une solution de révélation contenant un substrat spécifique à l’enzyme est rajoutée : elle induit un changement de coloration proportionnel à la quantité d’anticorps (Ac2) conjugués à l’enzyme fixée sur les antigènes du puits. Les valeurs de DO, mesurées à l’aide d’un spectrophotomètre à 450 nm (nanomètres), sont ensuite corrigées avec les valeurs des témoins positifs et négatifs et converties en pourcentages d'inhibition (PI) selon les recommandations du kit : avec DOcneg la densité optique moyenne des contrôles négatifs DOsample la densité optique de l'échantillon Ainsi, des valeurs élevées de PI traduisent des concentrations en anticorps (Ac1) élevées, à l'inverse des densités optiques, d'autant plus élevées que l'anticorps recherché est en faible concentration (en effet, c'est l'anticorps conjugué (Ac2) qui est dosé par cette technique). 57 - Test ELISA indirect : Le principe de ce test repose sur une fixation secondaire des anticorps à doser par un anticorps spécifique de la portion variable de ces derniers. La première étape de ce test est similaire à celle du test compétitif. Pour la seconde étape, des anticorps anti-anticorps de Poule, couplés à une enzyme (ici, la HRP conjuguée à une protéine G), sont déposés dans les puits ; ils se lient à la partie variable des anticorps primaires que l’on cherche à doser. De même, une solution de révélation ajoutée après lavage induit un changement de coloration de la solution, cette fois-ci proportionnel à la quantité d’anticorps à doser. De même, les valeurs de DO sont corrigées avec celles des témoins positifs et négatifs et converties en ratio « sample over positive » (S/P) selon les recommandations du kit : avec DOcneg la densité optique moyenne des contrôles négatifs DOsample la densité optique de l'échantillon DOcpos la densité optique moyenne des contrôles positifs Dans ce cas, les valeurs de S/P et de densité optique croissent avec des concentrations en anticorps plus élevées. 58 Figure 11 : Illustration de deux techniques ELISA Principe de la mise en évidence d’anticorps spécifiques par ELISA indirecte (à gauche) et par ELISA compétitive (à droite). Le signe (+) indique une réaction positive dans la cupule (présence d’anticorps dans l’échantillon) ; le signe (-) indique une réaction négative (absence d’anticorps dans l’échantillon). L’étape 1. correspond à l’ajout de l’échantillon à doser. L’étape 2. correspond à l’ajout d’un réactif permettant de mettre en évidence la liaison anticorps-antigène. L’étape 3. correspond à l’ajout d’un substrat entraînant une réaction de luminescence avec le réactif de l’étape précédente. 59 B) Mesure des anticorps anti-IBV Dans un premier temps, un test ELISA compétitif (Svanovir, Suède) avait été utilisé, mais les valeurs obtenues étaient toutes très élevées, ne permettant pas de différencier les échantillons de façon quantitative. Nous avons ensuite opté pour un autre kit ELISA compétitif (IDVet, France). Ce test a d'abord été utilisé avec la dilution standard suggérée par la notice (1/10e), mais des valeurs élevées de densités optiques, correspondant également à une saturation des sites antigéniques, ont été mesurées. Il a donc été décidé de réaliser des dilutions successives sur les extraits d'œufs et les plasmas, afin d’obtenir des niveaux de dilution permettant une meilleure discrimination des valeurs. Les valeurs de PI (pourcentage d’inhibition) mesurées à plusieurs dilutions ont été utilisées pour étalonner une courbe PI = f (-log(dilution)). Nous avons modélisé une courbe de régression logistique à 4 paramètres (Huet et al., 1988) : avec x = log(1/z) où z est la dilution θ = (θ1,θ2,θ3,θ4) les paramètres estimés par minimisation de la somme des carrés soit avec Yij le j-ème réplicat du PI de l'échantillon à la dilution zi Les paramètres de la régression étaient les suivants : θ1 était le PI minimum de l'échantillon testé à plusieurs dilutions, θ2 était le PI maximum, θ3 était un paramètre relié à la pente de la courbe et θ4 correspondait à la dilution effective (ou ED50, c'est-à-dire la dilution à laquelle l'échantillon testé est à la moitié de son activité optimale, soit la dilution correspondant à un PI de 50%). Une comparaison de sous-modèles a permis de déterminer que le modèle le plus performant était celui où le minimum, le maximum et le paramètre de pente étaient fixés. Un sous-panel d'échantillons a été sélectionné afin d'obtenir des données empiriques : ces échantillons ont été testés avec le kit ELISA compétitif à plusieurs dilutions (exemple pour un plasma et un extrait d’œuf : Tableau 1) et leurs courbes d'étalonnage ont pu être établies. Ces données ont été rentrées dans le modèle et ont servi à établir des prédictions pour tous les individus, comme illustré sur la Figure 12. L'hypothèse essentielle à la modélisation de ces courbes était que les pentes des droites dans la portion linéaire de la régression logistique soient parallèles entre elles. Cette hypothèse étant vérifiée, nous avons utilisé la valeur de dilution correspondant à un PI de 50% afin de calculer le titre en anticorps t par : avec x50 = log(1/z50), où z50 est la dilution correspondant à un PI de 50%. 60 Tableau 1 : Exemple d’échantillons en dilutions sériées Echantillon Dilution PI (%) Individu n° 54 - 1/10e - 1/20e - 1/40e - 1/160e - 1/10e - 1/20e - 1/40e - 1/160e - 1/320e - 1/640e 89,16 85,77 75,35 43,18 83,81 81,60 78,67 67,26 47,36 24,75 Plasma (Février) Individu n°12 Extrait d’œuf (Février) 61 Figure 12 : Courbes de régression logistique PI = f(-log(dilution)) A) En haut : Courbe empirique tracée à partir d’échantillons d’extraits d’œufs. B) En bas : Courbe modélisée après ajustement des paramètres. 62 C) Mesure des anticorps anti-NDV Des tests compétitifs commercialisés par Svanovir (Suède) et IDVet (France) ont d’abord été utilisés aux dilutions recommandées, mais, de même que pour IBV, une saturation trop importante des valeurs a été observée. Des dilutions sériées ont été effectuées avec le test compétitif d'IDVet, mais l'hypothèse de parallélisme des pentes des droites dans la portion linéaire n'était pas respectée, et ce kit n'a donc pas pu servir pour établir un dosage quantitatif des anticorps anti-NDV. Etant donné qu’un test ELISA indirect pour le dosage des anticorps anti-NDV a été nouvellement commercialisé par IDVet, les échantillons ont été analysés avec ce kit. Ceci a permis d’obtenir des données quantitatives, car les valeurs de DO et de S/P étaient directement proportionnelles à la quantité d’anticorps présents dans l’échantillon. Ce test indirect a donné un étalement des données satisfaisant à la dilution 1/100e pour les extraits d’œufs et les plasmas. Pour les données NDV, nous avons utilisé une formule fournie par le kit indirect pour passer des données en S/P à celles en titres : D) Mesure de la répétabilité inter- plaques et inter-extractions La répétabilité de mesure des quantités d'anticorps a été évaluée à partir de tables d'ANOVA sur deux répétitions de chaque mesure. Elles ont été effectuées à partir des valeurs obtenues pour la dilution recommandée par les kits ELISA (IDVet) compétitif, pour IBV, et indirect, pour NDV. La répétabilité inter-plaques était élevée, à la fois pour les plasmas (IBV : r = 0.95, F = 46.1, n = 23, NDV : r = 0.95, F = 49.9, n = 24) et les extraits de jaune d'œuf (IBV : r = 0.99, F = 353.4, n = 30, NDV : r = 0.95, F = 41.4, n = 32), et il en était de même pour la répétabilité inter-extractions (IBV : r = 0.98, F = 83.8, n = 15, NDV : r = 0.98, F = 73.2, n = 15). 2.1.6. Analyses statistiques A) Transformations opérées sur les données Puisque que nous cherchions à analyser les résidus des droites de régression, il était d'une importance primordiale que les données respectent les hypothèses sous-jacentes au modèle linéaire (notamment distribution des variables se rapprochant de la normalité, et hétéroscédasticité des résidus) afin que les résidus soient estimés de façon convenable. La transformation des données en ln(titre) a permis d'obtenir la répartition adéquate des données, vérifiée par analyse graphique. 63 B) Etude de la relation entre quantité d'anticorps dans le plasma et dans les œufs, et caractérisation du taux de transfert des femelles Nous avons réalisé des régressions femelle-œuf pour chaque lignée et chaque anticorps. Le modèle linéaire utilisé était le suivant : yi = axi + b + εi avec yi la quantité d'anticorps mesurée dans le plasma de la i-ème femelle xi la quantité d'anticorps mesurée dans le jaune d'œuf correspondant a et b les paramètres estimés par la méthode des moindres carrés εi un terme d'erreur, dont l'ensemble est supposé suivre une loi normale de paramètres 0 et σ². Le taux d'anticorps transférés dans le jaune d'œuf a été modélisé par les résidus de la droite de régression, qui sont obtenus pour chaque individu i par εi = yi – ŷi, avec yi la valeur mesurée de la quantité en anticorps dans l'œuf et ŷi celle estimée à partir des paramètres de régression par ŷi= axi + b. Cette modélisation nous a permis de comparer le taux de transfert d'une poule à celui des autres individus du même groupe. C) Recherche d'un effet lignée sur la capacité à transmettre des anticorps Nous avons dans un premier temps déterminé si les pentes des régressions linéaires effectuées étaient différentes entre les lignées. Pour cela, nous avons réalisé une analyse de covariance (ANCOVA) du taux d'anticorps dans l'œuf en fonction de celui dans le plasma, de la lignée, et de l'interaction entre le taux d'anticorps dans le plasma et la lignée. D) Recherche d'un effet individuel sur la capacité à transmettre des anticorps Nous avons recherché s'il y avait des corrélations positives entre les résidus de la régression femelle-œuf, à la fois (a) aux deux mois de collecte et (b) pour les deux types d'anticorps spécifiques mesurés. 64 2.2. Sélection sur la capacité à transmettre des anticorps dans le jaune d’œuf 2.2.1. Plan expérimental L'expérience de sélection a été menée de 2010 à 2014. Une population de base de 89 individus issus de croisements aléatoires a été utilisée. Chaque année, 10 individus ayant les résidus de la régression linéaire des quantités d’anticorps anti-IBV dans le jaune d’œuf et fonction de celles dans le plasma les plus élevés (lignée AC+), et 10 individus les plus bas (lignée AC-), ont été sélectionnés pour servir de reproducteurs. Entre 4 et 10 de leurs descendants femelles ont été choisis pour fonder la population de l'année suivante. De plus, une lignée contrôle a été rajoutée à l'expérience pour tester la divergence des lignées sélectionnées par rapport à des individus issus de croisements aléatoires. La Figure 13 présente le protocole utilisé pour cette étude. 65 Figure 13 : Protocole de la seconde expérience 66 2.2.2. Conditions d’élevage Les animaux ont été élevés et vaccinés dans des conditions similaires à celles décrites pour l'expérience menée en 2007. 2.2.3. Estimation des quantités d’anticorps Les prélèvements et les extractions ont été réalisés de la même manière que pour l'expérience menée en 2007. Les dosages ont été réalisés pour les anticorps anti-IBV avec un test ELISA compétitif (IDVet, France), à la dilution recommandée par le kit. La première année, les anticorps anti-NDV avaient également été mesurés avec un test compétitif, mais les régressions œuf-plasma n’étant pas satisfaisantes, il a été décidé de ne conduire les analyses de sélection que sur les données IBV. La sélection a été arrêtée en 2015, mais les données de la dernière année n’ont pas encore pu être obtenues dans leur intégralité ; dans les analyses présentées, la dernière année de sélection correspond donc aux données de 2014. 2.2.4. Analyses statistiques Le caractère phénotypique étudié (taux de transfert d'anticorps maternels anti-IBV) a été modélisé par les résidus de la régression linéaire du taux d'anticorps dans le jaune d'œuf en fonction de celui dans le plasma. Nous avons suivi la variation du résidu moyen dans chaque lignée, et nous avons pu comparer la réponse à la sélection opérée entre 2010 et 2014. Pour les deux études, les analyses statistiques ont été conduites avec le logiciel R 2.14.1. (R Development Core Team, 2012). Un seuil de significativité à 5 % a été utilisé. 67 68 3. Résultats 3.1. Evaluation de la répétabilité des taux de transfert d'anticorps de poules sélectionnées sur des critères immunologiques 3.1.1. Relation entre quantités d’anticorps dans le plasma et les œufs Sur la Figure 14, la corrélation entre les quantités d'anticorps retrouvées dans le plasma et dans le jaune d'œuf était très forte (IBV : R2 = 0,82 pour février et R2 = 0,86 pour juin / NDV : R2 = 0,87 pour février), sauf pour le dernier résultat (NDV : R2 = 0,28 pour juin), indépendamment de la lignée. Il y avait une disparité temporelle observée pour les deux anticorps spécifiques testés : tandis que la corrélation restait marquée pour IBV entre février et juin, elle diminuait nettement pour NDV. Sur notre population, il existe donc une relation significative entre la quantité d’anticorps plasmatiques et celle dans le jaune d’œuf pour IBV aux deux mois d’étude et pour NDV en février, et ce résultat a été retrouvé pour toutes les lignées. 69 Figure 14 : Résidus de la régression ln(titre d'anticorps dans l'œuf) en fonction du ln(titre d'anticorps dans le plasma) pour IBV et NDV 70 3.1.2. Effet lignée sur la capacité à transmettre des anticorps dans l’œuf A) Comparaison des pentes de régression entre lignées Les Figures 15 et 16 présentent les droites de régression œuf-plasma par lignée. Les ordonnées à l’origine étaient assez proches, ce qui indiquerait que les moyennes des taux de plasma ne différaient pas entre eux. Le fait que certaines droites de régression s'entrecroisent entre lignées suggérait qu'il y avait un effet de l'interaction entre la quantité d'anticorps dans le plasma et la lignée sur la pente de la droite de régression. En effectuant une analyse de covariance du taux d'anticorps dans l'œuf en fonction de celui dans le plasma, de la lignée, et de l'interaction de ces deux termes, il a été possible d'investiguer l'ampleur de cet effet. B) Comparaison des résidus entre lignées et ANCOVA sur les régressions Il existait une hétérogénéité dans la répartition des résidus entre lignée, comme illustré sur la Figure 17. Une analyse de covariance (ANCOVA) a indiqué qu'il existait un effet significatif de la lignée sur le taux d'anticorps dans le jaune d'œuf après avoir contrôlé pour le taux dans le plasma (IBV février : F7,97 = 76,31 et p < 2e-16, IBV juin : F7,97 = 108,5 et p < 2e16, NDV février : F7,129 = 154,2 et p = 2,2e-10), sauf pour NDV en juin (F7,97 = 8,19 et p = 0,038). Les variances entre lignées étaient suffisamment proches pour ne pas expliquer à elles seules les différences observées. Les moyennes des taux plasmatiques en anticorps chez les femelles des différentes lignées étaient comparables pour IBV (one-way ANOVA: F3,101 = 1,844 et p = 0,14 pour février, F3,101 = 1,455 et p = 0,23 pour juin), mais pas pour NDV (F3,101 = 9,85 et p < 1e-4 pour février, F3,101 = 3,41 et p = 0,020 pour juin). Il y avait donc un effet lignée au niveau du taux de transfert d'anticorps maternels, qui était modérément significatif entre certaines lignées et retrouvé de façon non systématique. 71 Figure 15 : Régression ln(titre d'anticorps dans l'œuf) en fonction du ln(titre d'anticorps dans le plasma) selon les lignées pour IBV en février et juin 72 Figure 16 : Régression ln(titre d'anticorps dans l'œuf) en fonction du ln(titre d'anticorps dans le plasma) selon les lignées pour NDV en février et juin 73 Figure 17 : Distribution des résidus de régression selon les lignées 74 3.1.3. Effet individuel sur la capacité à transmettre des anticorps dans l’œuf A) Corrélation entre résidus pour les deux mois d'échantillonnage Il n'y avait pas de corrélation entre les résidus obtenus aux deux mois d'échantillonnage pour IBV et pour NDV (Figure 18). Cela indique une absence de répétabilité du taux de transfert au sein d'un même individu. Ce résultat était valable pour les 4 lignées. B) Corrélation entre résidus pour les deux anticorps recherchés De même, il n’existait pas de corrélation entre les résidus de régression pour IBV et NDV, comme illustré sur la Figure 19, et ce également pour les 4 lignées. Ainsi, il ne semble pas y avoir d'effet d'association entre le transfert de ces deux types d'anticorps spécifiques, sur les deux antigènes testés. 75 Figure 18 : Relation entre les résidus de régression aux deux mois d’échantillonnage 76 Figure 19 : Relation entre les résidus de régression pour les deux anticorps recherchés 77 3.2. Sélection sur la capacité à transmettre des anticorps dans le jaune d’œuf 3.2.1. Résidus moyens par année La moyenne des résidus - exprimés sur une échelle 0-1 pour normaliser les données fluctue d'année en année, que ce soit pour le résidu moyen global ou pour les moyennes de chaque lignée (Figure 20). Cela est à relier au résultat précédent montrant une absence de répétabilité des résidus entre février et juin pour l'expérience pilote (Figure 19). Bien que l'expérience pilote laissait présager ce résultat, la sélection a quand même été menée jusqu'au bout pour voir si un effet à long terme pouvait être détecté. Les résidus moyens des deux lignées sélectionnées semblaient commencer à diverger lors de la dernière année. Les variances entre la première et la dernière année de sélection étaient comparables (F90,82 = 0,991, p = 0,9) mais les moyennes différaient (test de Wilcoxon : W = 485, p < 2e-16). 3.2.2. Distribution des résidus avant et après sélection La Figure 21 présente la distribution des résidus en début et en fin de sélection, pour les deux lignées. Tandis que les résidus de la population initiale de 2010 étaient distribués avec un pic fort de valeurs autour de 0, les distributions des lignées AC+ et AC- en 2014 étaient plus étalées, mais ne semblent pas avoir divergé de façon significative et leurs moyennes étaient comparables (test de Wilcoxon : W = 929, p = 0,5). 3.2.3. Corrélation des résidus entre mère et fille Il n’y avait pas de corrélation entre les résidus de la régression œuf-plasma entre les mères et leurs filles, pour les générations 1 et 2 de sélection, comme l’illustre la Figure 22. Sur ce graphique, pour chaque mère correspond le résidu de ses descendantes filles (entre 1 et 5 descendants par femelle). Le même cas de figure a été retrouvé pour les autres années. 78 Figure 20 : Variation des résidus moyens selon la lignée, en fonction de l’année Figure 21 : Distribution des résidus en début et en fin de sélection 79 Figure 22 : Régression mère-fille sur les résidus des régressions œuf-plasma Données 2010-2011 utilisées. Le même type de relation a été retrouvé pour les autres années. 80 4. Discussion 4.1. Corrélation des taux d'anticorps dans l'œuf et dans le plasma Plusieurs études ont montré une corrélation nette entre la quantité d'anticorps maternels retrouvés dans le jaune d'œuf et le taux d'anticorps circulant dans le plasma des mères (Kramer & Cho, 1970 ; Hamal et al,. 2006 ; Hargitai et al., 2006), et nous avons retrouvé la même relation pour les anticorps anti-IBV aux deux mois d’échantillonnage, et pour ceux anti-NDV en février. La signification biologique de ce résultat est que le taux d'anticorps plasmatique est un facteur prépondérant qui influence le taux d'anticorps transmis dans le jaune d'œuf. En outre, les corrélations positives retrouvées dans notre étude peuvent être liées à une puissance statistique suffisante et au design expérimental conduit. Le choix de deux échantillonnages espacés à 4 mois permet d’avoir une vision relativement large de la réponse immunitaire des femelles dans le temps. La corrélation plus réduite retrouvée pour les anticorps anti-NDV en juin peut s’expliquer par des différences inter-individuelles marquées au niveau de l’état corporel des animaux. En effet, sur la Figure 16, la majorité des points sont regroupés autour d’une droite de régression, et seuls 5 animaux ont des valeurs de quantités d’anticorps dans l’œuf très basses, traduisant un transfert d’anticorps dans l’œuf quasi-nul. Or les techniciens en charge de l’élevage avaient remarqué que certains oiseaux étaient très faibles en fin d’étude. Des notes d’état corporel avaient été relevées mais ont malheureusement été perdues suite à des problèmes sur un serveur informatique. Ainsi, nous n’avons pas pu vérifier que les individus ayant transmis peu d’anticorps anti-NDV en juin étaient en mauvais état de santé, mais c’est une hypothèse probable, étant donné que le transfert maternel d’anticorps repose sur un compromis entre l’investissement pour la reproduction et celui pour des fonctions de maintenance de l’individu. Si un individu est en mauvais état de santé, il aura tendance à moins transmettre d’anticorps dédiés à la protection du jeune, et garder davantage d’énergie pour sa propre survie. Ce résultat n’a pas été retrouvé pour les anticorps anti-IBV, illustrant les disparités de transfert entre différents anticorps spécifiques. Une variabilité au niveau du taux de transfert de différents anticorps spécifiques avait déjà été relevée dans d’autres études (Gharaibeh et al., 2008 ; Cheng & Lamont, 1988). 4.2. Différences de taux de transfert entre lignées Dans la littérature, pour des lignées sélectionnées sur des critères de la réponse immunitaire, une différence significative a été rapportée au niveau du ratio entre quantité d'anticorps dans l'œuf et dans le plasma (Abdel-Moneim & Abdel-Gawad, 2006 ; Hamal et al., 2006 ; Adeleke et al., 2015), ou simplement de la quantité d'anticorps dans l'œuf (Okuliarova et al., 2014). Néanmoins, l'absence d'analyses statistiques ou des tailles d'échantillons faibles limitent la portée de ces études. De plus, certaines d'études ayant comparé les taux d'anticorps dans l'œuf n'ont pas pris en compte le taux plasmatique de la mère (Hammouda et al., 2012 ; Addison et al., 2009 en interspécifique). 81 Notre étude nous a permis de constater une différence significative entre les lignées au niveau du taux d'anticorps dans l'œuf, en contrôlant pour le taux dans le plasma, ce qui suggère que les lignées, élevées dans les mêmes conditions, diffèreraient génétiquement pour le taux d'anticorps transmis dans l'œuf. Ainsi, la sélection sur des critères d'immunocompétence aurait pu affecter la capacité à transférer des anticorps. Néanmoins, bien que l’élevage soit commun, il pouvait exister des interactions particulières entre animaux ou un accès aux ressources qui a fait que tous les individus ne partageaient pas exactement le même environnement, ce qui a pu engendrer une variabilité d’origine environnementale pour ce caractère. En ce qui concerne les caractères de la réponse immunitaire suivie, il est à noter que la lignée 1, sélectionnée pour une forte production d’anticorps anti-NDV, ne transférait pas significativement plus d’anticorps au jaune d’œuf que les autres lignées. Cela signifie que la sélection sur la production d’anticorps n’influence pas le taux de transfert. 4.3. Répétabilité du taux de transfert dans le temps et pour différents antigènes Sur notre population d'étude, il n'y avait pas de répétabilité des taux d'anticorps transmis chez un même individu entre deux mois d'échantillonnage. L’estimation de la répétabilité d’un caractère est classiquement utilisée en tant qu’indicateur de son héritabilité (Falconer & Mackay, 1996). Ainsi, dans notre cas, cela suggère que le taux de transfert d’anticorps anti-NDV et IBV n’est pas héritable. Cependant, il est probable que la dynamique temporelle de la réponse immunitaire influence la concentration en anticorps mesurée dans le jaune d'œuf à quelques mois d'intervalle. Nos résultats indiquent que les taux mesurés à différents mois n’étaient pas consistants entre individus. De même, aucune corrélation entre les taux d'anticorps anti-IBV et anti-NDV transférés n’a été retrouvée. On peut penser qu'il existe une variabilité inter-individuelle dans la réponse vaccinale (donc dans les taux mesurés dans le plasma des femelles), et dans l'immunocompétence pour différents antigènes, et même pour un antigène donné (eg. Nakajima et al., 2000). Pour ces deux résultats, il pouvait donc exister une variabilité intra-individuelle des taux d'anticorps transférés, pour différents antigènes ou à différents moments de la réponse immunitaire, mais il est aussi possible que les résidus de régression que nous avons utilisé pour modéliser le taux de transfert aient été influencés par des erreurs de mesure, même faibles. 4.4. Autres facteurs influençant le taux de transfert d'anticorps maternels D'autres facteurs peuvent moduler le taux d'anticorps transmis de la mère au jeune. Des corrélations ont été montrées entre le taux d'anticorps dans l'œuf et l'état corporel de la femelle (Hargitai et al., 2006 ; Karell et al., 2008), l'âge de la femelle (Grindstaff et al., 2003), l'ordre de ponte (Groothuis et al., 2006), le sexe du juvénile (Martyka et al., 2011). Cependant, ces études n’ont pas corrigé le taux mesuré dans l'œuf avec celui circulant chez la femelle, comme c’est le cas chez nous. Il a été décidé de ne pas prendre en compte ces facteurs dans notre étude. Par exemple, dans notre cas, l'ordre de ponte n'a pas été d'une grande importance puisque des dosages d'anticorps réalisés dans des œufs pondus à un jour d'intervalle montraient des quantités très similaires (Vincent Staszewski, comm. pers.). 82 4.5. Divergence entre lignées On constate que les lignées sélectionnées pour les plus faibles et les plus forts résidus de régression ont peu divergé. Il est possible que la sélection n'ait pas été effectuée sur un nombre suffisamment élevé de générations pour pouvoir détecter un effet de la sélection. De plus, les effets maternels peuvent également induire des décalages temporels dans la réponse évolutive à la sélection (Räsänen & Kruuk, 2007), ce qui expliquerait que nous n'ayons pas retrouvé d'effet de divergence marqué, et même un inversement des valeurs de résidus pour les lignées fortes et faibles en 2013. Une autre explication serait qu'il pourrait exister un effet fondateur dans la population initiale de 2010. Par ailleurs, les moyennes des résidus fluctuaient entre années, et ceci est sans doute lié au fait qu’il n’y avait pas de répétabilité du caractère étudié. Il faut aussi garder à l’esprit que les analyses de l’expérience de sélection ont été réalisées sur des valeurs de PI issu d’un kit compétitif à une dilution, avec un certain niveau de saturation des données. Il serait judicieux de refaire les analyses avec des valeurs en titres issues de dilutions sériées, au moins pour la première et la dernière année de sélection, afin de mieux quantifier les échantillons. La conclusion principale de cette expérience est que la sélection n'a pas opéré sur le caractère de transfert d'anticorps maternels, et en particulier sur la mesure choisie pour attester de ce caractère phénotypique (résidus de régression œuf-plasma). L’absence de répétabilité entre les mesures de février et juin 2007, en plus du fait que la sélection n’ait pas agi lors de la deuxième expérience, tend à faire penser que le taux de transfert d’anticorps maternels n’est pas un caractère héritable chez la Poule, bien qu’il puisse reposer sur une base génétique, du fait de l’effet lignée constaté. Ces résultats sont valables sur notre population, et peuvent être considérés comme fiables étant donné la bonne puissance statistique (notamment en termes de tailles d’échantillons) de l’étude. En effet, une étude a conclu à l’existence d’une variabilité importante du taux de transfert maternel d’anticorps chez la Caille du Japon avec une taille d’échantillon de 38 individus (Coakley et al., 2014). Cependant, il est possible que le caractère phénotypique de taux de transfert d’anticorps soit fixé et ait une faible capacité d’évolution. En effet, il a été montré que les caractères majeurs impliqués dans la détermination de la valeur sélective des individus, comme c’est le cas ici, ont une héritabilité très faible, du fait d’une déplétion de variance génétique additive (Fisher, 1930 ; Mousseau & Roff, 1987 ; Price & Schulter, 1991). Etant donné l’intense sélection directionnelle causée par la pression parasitaire, les défenses immunitaires semblent contraintes dans leurs réponses évolutives à court terme (héritabilité) comme à long terme (évolvabilité) (Christe et al., 2010). 83 5. Conclusion et perspectives 4.1. Bilan des deux expériences Nous avons cherché à établir s'il existait une composante génétique au taux de transfert d'anticorps maternels, en mesurant le changement des quantités d'anticorps anti-IBV dans le plasma et le jaune d'œuf de femelles vaccinées contre cet agent pathogène. L'expérience opérée en 2007 montrait une différence significative de cette réponse humorale entre lignées sélectionnées sur des critères immunologiques, suggérant qu'il existait assez de variabilité pour effectuer une sélection sur des taux de transfert forts et faibles. En revanche, l'absence de corrélation entre les mesures à plusieurs mois d'intervalle et pour deux antigènes différents indiquait que ce caractère n'est pas stable pour une femelle, et donc augurait mal de son héritabilité. Nous n'avons pas pu mettre en évidence une réponse à la sélection sur le caractère phénotypique de taux de transfert d'anticorps maternels. Il semble en revanche important de prendre en compte les interactions avec d'autres caractères, immunitaires ou non, qui pourraient être corrélés génétiquement avec le taux de transfert d'anticorps. Il est aussi probable que d'autres molécules transférées dans le jaune d'œuf, notamment des hormones, influencent le taux de transfert des anticorps (Okuliarova et al., 2014). Enfin, des études suggèrent l'importance de coupler l'étude de plusieurs caractères maternels (Postma et al., 2014). 4.2. Perspectives : autres composantes du transfert d'anticorps maternels Nous avons cherché à évaluer la répétabilité du transfert d'anticorps maternels au niveau de la quantité d'anticorps déposée dans le jaune d'œuf. Néanmoins, des aspects qualitatifs peuvent également être pris en compte, notamment sur la capacité de ces anticorps à protéger le jeune contre les pathogènes. Cette capacité est réalisée à deux échelles : dans la reconnaissance des molécules antigéniques au niveau de la partie variable, et dans l'affinité aux récepteurs à l’origine du recyclage, et donc de la persistance chez le jeune, de ces anticorps, au niveau de la partie constante terminale qui se fixe aux récepteurs. Le premier point est peu sujet à variation, puisqu'une maturation pour des sites de fixation aux antigènes très spécifiques est réalisée dans des organes spécialisés (thymus, bourse de Fabricius). En revanche, on peut penser qu'une variabilité au niveau de certaines régions impliquées dans la reconnaissance entre la portion constante terminale des immunoglobulines et leur récepteur influe sur l'affinité entre ces deux molécules. En outre, nous avons étudié la première partie du transfert d'anticorps, impliquant un investissement d'origine maternelle ; il est également important de prendre en compte l'absorption des IgY par le jeune, ce qui n'a pas été testé ici. Cette seconde étape du transfert d'anticorps peut varier selon des facteurs physiologiques tels que la densité de récepteurs sur les cellules épithéliales, l'affinité des IgY avec leur récepteur, ou les taux métaboliques. 84 Une autre problématique importante s’impose au vu de nos résultats, qui amènent à se demander si un caractère sans composante génétique claire peut avoir un avantage évolutif. Plusieurs auteurs ont souligné que même en l’absence de composante génétique, les effets maternels induisent des conséquences évolutives, dans le sens où ils modifient les phénotypes sur lesquels la sélection va ensuite agir (Kirkpatrick & Lande, 1989 ; Räsänen & Kruuk, 2007). Ainsi, les effets maternels pourraient avoir un avantage adaptatif, particulièrement en environnement hétérogène, en augmentant la valeur sélective des descendants (Bernardo, 1996). On peut citer l’exemple de la colonisation du Roselin familier aux Etats-Unis : entre la population native du Montana et celle introduite en Alabama, les périodes d’incubation des deux populations ont divergé, avec un avantage pour la survie des jeunes en environnement plus aride, sans qu’une base génétique à ce caractère ait pu être mise en évidence (Badyaev et al., 2003). Par ailleurs, dans le cadre de l’émergence de stratégies de défense variées contre les parasites, la nature plastique du transfert maternel d’anticorps est un facteur-clé de l’évolution de ce caratère, qui est sensible à des modifications liées à l’infection, telles que la virulence du parasite ou le taux de rémission suite à un épisode infectieux (Garnier et al., 2012a). Dans tous les cas, le transfert maternel d’anticorps, tout comme d’autres effets maternels, gagnerait à être pris en compte plus fréquemment dans l’étude d’un panel varié de processus en écologie évolutive. 85 86 TROISIÈME PARTIE : COMPARAISON INTER-ESPÈCES DE LA STRUCTURE MOLÉCULAIRE DES ANTICORPS EN FONCTION DE LEUR PERSISTANCE CHEZ LE JEUNE 87 88 1. Introduction de la troisième partie L’existence de la biodiversité sur Terre est en partie le reflet de la multiplicité des stratégies d’histoires de vie chez les espèces (Ricklefs & Wikelski, 2002). On parle de trait d’histoire de vie pour désigner tout caractère d’ordre anatomique, physiologique, comportemental ou écologique qui influe la survie et le succès reproducteur des individus (e.g. âge à la première reproduction, taille de la portée, longévité). Dans la nature, seule une infime partie des combinaisons possibles des caractères est représentée. Cela s’explique par le fait que des compromis ont été forgés par l’évolution dans la coexistence entre plusieurs de ces traits d’histoire de vie. Le système immunitaire est un des mécanismes physiologiques majeurs modelant la survie d’un individu au cours d’une infection. Mais il est également impliqué dans le succès reproducteur d’un individu, via la protection que peuvent apporter des facteurs immuns transmis au jeune. En effet, l’immunité conférée au jeune joue un rôle crucial dans sa survie avant que son système immunitaire ne soit mature. Les caractéristiques physiologiques du transfert maternel d’anticorps, telle la persistance sérique de ces anticorps chez le jeune, qui détermine un seuil de protection contre les agents pathogènes, sont des traits d’histoire de vie intimement liés à la valeur sélective d’un individu. A ce titre, puisque l’investissement dans tous les caratères ne peut pas être maximisé, l’optimisation de la protection immunitaire du juvénile est le résultat d’un compromis au niveau de l’allocation de ressources énergétiques avec d’autres fonctions (Lochmiller & Deerenberg, 2000). Ainsi, l’investissement maternel dans la protection du jeune est le résultat non seulement de l’existence de contraintes physiologiques sur la survie de la mère, mais également d’un compromis entre reproduction présente et future. Par exemple, pour des espèces à faible fécondité ou produisant peu de descendants, il s’avère plus avantageux d’investir des ressources dans la survie du juvénile jusqu’au stade adulte (reproduction future) qu’à la reproduction propre de l’individu parental. L’étude de traits d’histoire de vie physiologiques dans le cadre de la compréhension des disparités de modes de vie entre espèces est particulièrement judicieuse, si l’on considère que ces caractères ont évolué vers des états de contrainte en réponse à des stimuli environnementaux spécifiques (Ricklefs & Wikelski, 2002). La variabilité du transfert d’anticorps entre espèces n’a pour le moment été que très peu étudiée (Addison et al., 2009), et l’objet de cette partie est de fournir un cadre théorique pour appréhender une comparaison interspécifique de ce transfert dans le cadre de relations forgées par l’écologie et l’évolution. 89 90 2. Etude de la persistance des anticorps maternels en lien avec les traits d’histoire de vie 2.1. Théorie des traits d’histoire de vie appliquée à l’immuno-écologie Le mode de vie de nombreuses espèces peut être décrit en termes de rythme de vie. Les espèces à rythme de vie rapide (« fast pace-of-life ») sont caractérisées par une durée de vie plutôt courte, une activité métabolique élevée, un fort taux de mortalité juvénile, un temps d’incubation court, une croissance rapide, et un fort investissement dans la reproduction (taille de portée importante, peu d’épisodes de reproduction). A l’inverse, les espèces à rythme de vie lent (« slow pace-of-life ») présentent plutôt une longévité élevée, un taux de mortalité juvénile plus réduit, un temps d’incubation plus long, une croissance plus lente, des tailles de portée limitées, plusieurs événements reproductifs étalés sur le temps, et un fort investissement parental. Entre ces deux types extrêmes assez caricaturaux, il existe tout un continuum d’espèces dont le mode de vie se rapproche plus ou moins d’un de ces pôles. Cette description se rapproche du modèle évolutif r/K (MacArthur & Wilson, 1967), qui ajoute en plus une dimension écologique au mode de vie des espèces : les espèces utilisant une stratégie r (durée de vie courte, reproduction rapide et intense) seraient pionnières en environnement perturbé, tandis que celles adoptant une stratégie K (durée de vie élevée, reproduction tardive et plus épisodique) seraient plus adaptées à des environnements stables. D’après la théorie des traits d’histoire de vie, il existe un compromis entre l’investissement énergétique pour les différents traits d’histoire de vie ; notamment, l’investissement dans l’immunité du jeune se fait aux dépens de celui d’autres caractères physiologiques. Ainsi, la variabilité dans l’expression d’un trait, ici la réponse immunitaire juvénile, est la résultante de stratégies d’allocation entre caratères (Staszewski & Boulinier, 2004). Chez l’adulte, la production d’anticorps est associée à des coûts énergétiques (Lochmiller & Deerenberg, 2000), tout comme cela doit être le cas pour le transfert d’anticorps au jeune, qui nécessite la production et la maintenance de récepteurs particuliers. Ainsi, selon le mode de vie des espèces, l’évolution a pu faire émerger différentes stratégies de coexistence des traits d’histoire de vie (Ricklefs & Wikelski, 2002). Tandis que des espèces à rythme de vie rapide favorisent leur reproduction à court terme contre leur survie et leur reproduction a long-terme, l'inverse est valable pour les espèces à rythme de vie lent (Promislow & Harvey, 1990). Ainsi, la survie individuelle jusqu’à un âge offrant la possibilité de multiples événements de reproduction semble plus avantageuse pour maximiser la valeur sélective des espèces à rythme de vie lent qu’un investissement ponctuel dans une reproduction. Or la survie lors d’un épisode infectieux est fortement influencée par l’établissement d’une réponse immunitaire solide, tout d’abord innée lors de la première rencontre avec l’agent pathogène, puis acquise avec le développement d’une mémoire immunitaire spécifique. L’investissement dans l’immunité, notamment acquise, serait donc une stratégie évolutive très favorable pour les espèces à rythme de vie lent, contrairement aux espèces à rythme de vie rapide, qui n’ont pas cette contrainte forte de survie prolongée pour pouvoir se reproduire efficacement (Lochmiller & Deerenberg, 2000). 91 2.2. Estimation des coûts associés à la réponse immunitaire Pour des espèces à rythme de vie rapide, l'investissement immunitaire aurait tendance à être réalisé à travers l'établissement d'une réponse immunitaire inflammatoire, peu spécifique, tandis que pour des espèces à rythme de vie plus lent, les réponses acquises et spécifiques prédominent (Figure 23 ; Lee, 2006). En particulier, pour des espèces longévives, la réponse immunitaire innée est coûteuse en énergie, comparé à l'immunité acquise qui repose sur une mémoire, réduisant les coûts associés à la rencontre répétée des mêmes parasites, dont la probabilité augmente avec la durée de vie de l'individu (Garnier et al., 2012b). Chez le jeune, on estime que l’utilisation des ressources pour l’immunité induit des pertes des capacités de croissance environ proportionnelles à l’énergie allouée pour la réponse immunitaire, freinant le développement du juvénile (Rivera et al., 1998). Le transfert maternel d’immunité permettrait donc de ne pas détourner les ressources du jeune des fonctions de croissance. On pense également que le gain de croissance auparavant observé en élevage avec la prise d’antibiotiques dans les premières semaines de vie pourrait être expliqué par une réallocation des réserves énergétiques dans la prise de poids plutôt que dans le maintien des défenses immunitaires (Rouara et al., 1991). En revanche, les coûts imputables aux infections peuvent surpasser de loin celui lié à l’établissement d’une réponse immunitaire. Par exemple, des symptômes classiques en cas de parasitisme sont une perte de poids et une inhibition de la croissance, menant à une diminution des capacités reproductives, impactant alors de façon négative la valeur sélective (Lochmiller & Deerenberg, 2000). Les avis sont contrastés quant au coût effectif à opérer une réponse immunitaire. En règle générale, les défenses innées semblent particulièrement coûteuses en énergie et en nutriments, de part l’état d’inflammation systémique qu’elles peuvent induire (Klasing & Leshchinsky, 1999). C’est également le cas de la réponse immunitaire acquise à médiation cellulaire, qui libère de nombreuses cytokines pro-inflammatoires (voie Th1) et requiert des nutriments pour la diversification des types de lymphocytes. En revanche, la réponse immunitaire acquise à médiation humorale est vue comme moins demandeuse en énergie, du fait de la production de cytokines anti-inflammatoires (voie Th2), et des bénéfices cumulées que l’acquisition d’une mémoire immunitaire apporte à long terme (Lee, 2006). Ces données sont résumées dans la Figure 17. Néanmoins, les coûts réels de l’immunité pour l’organisme sont très difficiles à mesurer, d’autant plus que la réponse immunitaire est très polymorphe, de par ses différentes voies d’action (ce qui pose la question de quel paramètre optimal mesurer dans une situation donnée), et que de nombreux facteurs l’influencent (Lochmiller & Deerenberg, 2000). Parmi ces facteurs, on peut citer ceux liés à l’agent pathogène (magnitude, type et durée de l’infection), et ceux spécifiques à l’espèce ou à l’individu (âge, sexe, fonds génétique, statut nutritionnel). De plus, les données mesurées sont issues d’espèces domestiques ou captives, et pourraient varier considérablement en environnement naturel. 92 Figure 23 : Relations entre traits d’histoire de vie et voies de la réponse immunitaire Adapté d’après Lee, 2006. Données sur les traits d’histoire de vie de Loxodonta africana et Mus musculus d’après Encyclopedia of Life. 93 2.3. Disparités de persistance des anticorps maternels entre espèces 2.3.1. Etudes réalisées chez une espèce aviaire à la fois Les données classiques de persistance chez la Poule indiquent que la demi-vie plasmatique des anticorps maternels chez le jeune est d’environ 6 jours, et que tous les anticorps transférés par la mère ont disparu au bout de 2 à 3 semaines (Kaleta et al., 1977 ; Davison et al., 2008). Cependant, on peut s’attendre à ce que les espèces longévives aient une persistance plus longue des anticorps maternels, étant donné leur période d’élevage rallongée (Lee, 2006). Cela pourrait également être un avantage chez des espèces sociales ou coloniales, qui partagent le même environnement parasitaire au nid (Garnier et al., 2012b). Quelques études ont montré l’existence d’une variabilité au niveau de la persistance des anticorps maternels entre différentes espèces. Chez le Manchot du Cap, les anticorps maternels dirigés contre Plasmodium spp. persistent jusqu’à 10 semaines d’âge (Graczyk et al., 1994). Chez le Pigeon biset, la persistance des anticorps maternels anti-WNV (virus West-Nile) a été mesurée à en moyenne 27 jours (Gibbs et al., 2005). Dans le cas du Petit-duc maculé, des anticorps anti-WNV ont été détectés au moins jusqu’au 27e jour post-éclosion (Hahn et al., 2006). Enfin, chez le Moineau domestique, les anticorps maternels totaux ont une demi-vie sérique d’environ 2 jours et ne sont plus détectables après 9 jours environ (King et al., 2010). Il semble donc que des valeurs de persistance élevées soient davantage retrouvées dans des espèces à rythme de vie lent. Néanmoins, pour pouvoir établir une comparaison rigoureuse entre ces données, il serait judicieux de travailler sur le même type d’anticorps spécifique transféré, et de contrôler l’exposition des mères par une vaccination simultanée de tous les individus testés. 2.3.2. Etude comparative entre trois espèces Une étude réalisée par Garnier et al. (2012b) a mis en évidence que la demi-vie des anticorps maternels spécifiques NDV est bien plus élevée chez le Puffin cendré (Calonectris diomedea), une espèce longévive, comparé à deux espèces, l’une à rythme de vie intermédiaire, la Mouette tridactyle (Rissa tridactyla) et l’autre à rythme de vie rapide, la Caille du Japon (Coturnix japonica). Les données de persistance des anticorps anti-NDV, ainsi que les traits d’histoire de vie majeurs de ces espèces, sont indiqués sur le Tableau 2 ; les courbes de décroissance des anticorps maternels sont présentées sur la Figure 24. L’intérêt de cette étude est que les mesures de demi-vie des anticorps maternels ont été effectuées en contrôlant l’exposition des mères par vaccination, permettant de limiter la variabilité de l’établissement d’une réponse immunitaire liée à l’agent pathogène. 94 Tableau 2 : Comparaison des modes de vie et des persistances en anticorps anti-NDV chez trois espèces aviaires Source : Encyclopedia of Life ; Garnier et al., 2012b Puffin cendré Mouette tridactyle Caille du Japon > 30 ans 18 ans 3 ans (sauvage) ; 6 ans (captivité) Durée d’incubation 54 jours moyenne 25 jours 17 jours Taille de ponte 1-3 œufs 5-9 œufs Durée d’élevage 90 jours moyenne du jeune 42 jours 28 jours Demi-vie moyenne 25 jours des anticorps maternels anti-NDV* 5 jours 5 jours Durée de persistance > 40 jours des anticorps maternels anti-NDV* < 15 jours < 15 jours Longévité moyenne 1 * Femelles vaccinées contre le NDV selon un protocole similaire entre espèces (Garnier et al., 2012b). 95 Figure 24 : Courbes de décroissance des taux d’anticorps maternels anti-NDV en fonction du nombre de jours écoulés depuis l’éclosion D’après Garnier et al., 2012b. En orange : Puffin cendré. En bleu : Mouette tridactyle. En vert : Caille du Japon. En abscisses : nombre de jours depuis l’éclosion. En ordonnées : quantité standardisée d’anticorps spécifiques anti-NDV circulante chez le jeune (en PI). Pour chaque espèce, la ligne médiane correspond à la moyenne estimée par un modèle additif mixte généralisé, et la zone colorée autour de la moyenne représente l’intervalle de confiance à 95% de la courbe. 96 Cette variation interspécifique de la persistance des anticorps maternels chez le jeune peut se comprendre par l'existence de compromis relatifs à l'interaction entre différents traits d'histoire de vie. Le Puffin cendré, dont une illustration est présentée à la Figure 25, fait partie de l’ordre des Procellariiformes et de la famille des Procellariidae, regroupant des espèces d’oiseaux retrouvés en haute mer, et partageant un rythme de vie particulièrement lent (puffins, fulmars, pétrels, prions). Le mode de vie de cette espèce est caractérisé par une longévité relativement élevée (plus de 30 ans à l’état sauvage), une ponte annuelle unique, une longue période d’incubation (54 jours en moyenne) et d’élevage du jeune (environ 90 jours) (Giudici et al., 2010). Ainsi, chez cette espèce, une décroissance ralentie du taux d’anticorps circulants chez le jeune va dans le sens des traits d’histoire de vie de l’espèce, permettant ainsi d’allonger la durée de protection du jeune pendant le temps nécessaire à sa croissance et de limiter les dépenses énergétiques liées à l’immunité au bénéfice de sa croissance. L'investissement maternel post-natal dans l'immunité du jeune peut être particulièrement intéressant pour des espèces qui se reproduisent peu et ont un nombre limité de descendants (Ramos et al., 2014) ; ainsi, des histoires de vie différentes peuvent mener à l'émergence de diverses stratégies immunologiques (Ricklefs & Wikelski, 2002). 97 Figure 25 : Puffin cendré (Calonectris diomedea) Image adaptée d’après Marchant & Higgins, 1990 (© Jeff Davies). À gauche : adulte, face ventrale. À droite : adulte, face dorsale. 98 2.4. Lien entre la persistance des anticorps maternels et les voies de catabolisme Il est possible que la persistance particulièrement longue des anticorps maternels observée chez des espèces longévives d'Oiseaux soit une conséquence de l'évolution vers une diminution du catabolisme protéique chez les stades juvéniles de ces espèces (Garnier et al., 2013). Or la régulation du catabolisme des anticorps maternels est réalisée au niveau du récepteur FcRY, et particulièrement à l’extrémité N-terminale où s'effectue la liaison avec les domaines CH3 et CH4 des IgY. Ces derniers sont ainsi le siège des mécanismes de transport qui expliquent la demi-vie des anticorps dans le sérum. Des expériences de mutagenèse dirigée (dont quelques exemples figurent dans le Tableau 3) ont montré que des mutations ponctuelles touchant un à trois acides aminés situés dans la portion terminale de la chaîne lourde des IgG peuvent fortement modifier leur liaison au FcRn, et par ce biais augmenter leur demi-vie sérique par rapport à des anticorps non mutés (Zalevsky et al., 2010 ; Ko et al., 2014 ; Monnet et al., 2015). Par ailleurs, il est possible d’imaginer que des mutations au niveau du FcRn impactent également l’affinité de la liaison anticorps-récepteur, même si aucune étude n’en fait mention. Bien que ce genre d’analyse n’ait pas été réalisé dans le cas de la liaison entre le FcRY et les IgY, il est fort possible que, de la même façon, certaines mutations ponctuelles, au niveau soit du Fc des immunoglobulines, soit du récepteur, induisent une persistance prolongée des anticorps maternels. Le mécanisme à l’origine de cette persistance repose sans doute dans l’augmentation de l’affinité entre le récepteur et son ligand, qui opère alors d’autant mieux ses fonctions de recyclage des anticorps circulants. Dans le cadre de l’évolution des stratégies d’histoires de vie, de telles mutations pourraient avoir émergé chez des espèces tirant un avantage d’une protection rallongée du jeune, notamment du fait d’une durée de développement importante, comme c’est le cas pour les espèces à rythme de vie lent. Afin d’identifier des facteurs génétiques impliqués dans la variabilité des taux de persistance, une approche de génomique basée sur la comparaison interspécifique des séquences génomiques des IgY et du FcRY a été envisagée. Cette étude pourrait mettre en évidence l’existence de patrons évolutifs dans certains taxons. 99 Tableau 3 : Comparaison de la persistance sérique de plusieurs anticorps anti-VEGF chez la Souris Adapté d’après Zalevsky et al., 2010. Mutants : variants d’anticorps anti-VEGF obtenus par mutagenèse dirigée. VEGF : facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (« vascular endothelium growth factor »). 100 2.5. Identification des motifs génétiques impliqués dans l’interaction FcRYIgY Le FcRY est composé de 10 domaines extracellulaires: un domaine N-terminal riche en cystéines (CysR), un domaine fibronectine de type II (FNII), et huit domaines de type C riches en lectines (CTL). La liaison avec le FcRY se fait au niveau des chaînes CH3 et CH4 de l’IgY. Les domaines du FcRY directement en contact avec l’anticorps sont FNII et CTL6 (éventuellement CTL5), bien que les autres CTL semblent également avoir un rôle important dans la stabilisation tridimensionnelle du complexe FcRY-IgY (He & Bjorkman, 2011). La structure moléculaire du complexe FcRY-IgY est illustrée à la Figure 26. Ainsi, la structure des anticorps, notamment certains acides aminés clés situés sur les domaines constants des chaînes lourdes, pourrait avoir d'importantes conséquences fonctionnelles, déterminant l'affinité de liaison au récepteur FcRY et par ce biais le temps de persistance des anticorps dans le plasma. Il serait alors intéressant de mettre ces résultats en parallèle avec les différences de persistance sérique des anticorps maternels chez plusieurs espèces ayant des histoires de vie contrastées. En ce sens, l'analyse de la divergence entre séquences des domaines constants des IgY se liant au FcRY pourrait mettre en lumière des processus évolutifs liés aux contraintes de l'histoire de vie des espèces, et aux compromis entre l'investissement dans l'immunité et dans d'autres traits d'histoire de vie demandeurs en énergie. L'utilisation de méthodes comparatives peut permettre de mettre en évidence l'existence de tels compromis dans les traits d'histoire de vie le long d'un continuum entre histoires de vie longues et brèves (Addison et al., 2009 ; Garnier et al., 2013). Notre démarche expérimentale s’est appuyée sur ces éléments théoriques, et peut être résumée de la façon suivante. Nous avons cherché à mettre en évidence des différences dans les séquences génomiques de certains motifs des IgY et du FcRY chez plusieurs espèces d’oiseaux à rythmes de vie contrastés. Pour ce faire, nous avons décidé de séquencer ces motifs à partir d’ADN issu d’échantillons sanguins, et d’amorces de PCR (Polymerase Chain Reaction) que nous avons construites à partir des séquences disponibles dans les bases de données. 101 Figure 26 : Structure du complexe FcRY-IgY Adapté d’après He & Bjorkman, 2011. A gauche : Structure du complexe à partir d’une reconstruction à 25 Å (angström) de résolution. A droite : Détail des portions du récepteur impliquées dans l’interaction. FcRY : récepteur des IgY. FcY : portion Fc des IgY. CH3 : domaine CH3 des IgY ; 102 3. Matériel et méthodes 3.1. Espèces étudiées Nous avons cherché à mettre en évidence l'existence d'une variation génétique adaptative au niveau des portions terminales des chaînes lourdes d'IgY, et/ou du récepteur FcRY, pour différentes espèces d’oiseaux aux rythmes de vie contrastés. Au laboratoire, la persistance des anticorps maternels anti-NDV a été mesurée pour plusieurs espèces d’Oiseaux de mer (Ramos et al., in prep.) : le Puffin cendré (Calonectris diomedea), le Pétrel tempête (Hydrobates pelagicus), le Guillemot de Troïl (Uria aalge), la Mouette tridactyle (Rissa tridactyla), le Cormoran huppé (Phalacrocorax aristotelis), l’Albatros à bec jaune (Thalassarche chlororynchos) et le Gorfou sauteur (Eudyptes chrysocome). Des échantillons sanguins de ces espèces étaient également disponibles. 3.2. Extraction de l’ADN génomique Le sang des oiseaux contenant des hématies nucléées, il est possible d’extraire l’ADN génomique à partir d’échantillons sanguins chez ces animaux. Cinq individus ont été utilisés pour chaque espèce précédemment citée. Un kit d’extraction d’ADN commercial (DNEasy Blood and Tissue Kit, Qiagen, Pays-Bas) a été utilisé. 10 µL de sang ont été mélangés avec 20 µL de protéinase K. Après ajout de 220 µL de solvant PBS et de 200 µL d’une solution tampon fournie dans le kit, le mélange a été vortexé, puis mis en incubation pendant 10 minutes à 56°C. Après ajout de 200 µL d’éthanol, le mélange est à nouveau vortexé, puis transféré dans une colonne de centrifugation fournie par le kit. Le mélange a été centrifugé trois fois à 8000 tr/min pendant une minute, avec ajout à chaque étape d’une solution tampon permettant d’éliminer l’éthanol présent. Après une incubation à température ambiante d’une minute et une dernière étape de centrifugation, le microtube contient l’ADN purifié. La qualité de l’ADN extrait a été vérifiée en réalisant une migration sur un gel d’agarose au bromure d’éthidium. 3.3. Recherche d’amorces de PCR Le génome de deux espèces de Procellariiformes, le Fulmar boréal (Fulmarus glacialis) et le Pétrel cul-blanc (Oceanodroma leucorhoa), ont été utilisés pour déterminer des amorces de PCR pour les espèces d’oiseaux de mer sélectionnées. D’autres espèces aviaires séquencées récemment (Zhang et al., 2014) ont été rajoutées pour optimiser le consensus des séquences. Le critère de choix des séquences incluses dans l’élaboration des amorces est la evalue (seuil de e-value < 10-10 permettant d’exclure le fait que deux séquences aient été appariées sous l’effet du hasard). Les séquences ont été extraites de la base de données GenBank publiée par le NCBI (National Center for Biotechnology Information, U.S.A.). Les 103 alignements de ces séquences ont été réalisés avec le logiciel Multalin (Multiple Sequence Alignment ; Corpet, 1998). Le Tableau 4 présente les couples d’amorces de PCR utilisés pour amplifier des fragments d’ADN correspondant aux domaines CH3 et CH4 des IgY, ainsi qu’aux domaines FNII, CTL5 et CTL6 du récepteur FcRY. 3.4. Réalisation de la PCR 15 couples d’amorces (6 pour CH3, 6 pour CH4, et un pour chaque domaine recherché du FcRY) ont été formés ; ils sont indiqués sur la Figure 27. Les amorces ont été diluées au 1/100e avant utilisation. Dans chaque tube, 2 µL d’ADN, 2 µL de solution tampon, 1,5 µL de MgCl2, 1 µL de dNTP (mélange des quatre désoxyribonucléotides), 0,2 µL de Taq polymérase, 2 µL de l’amorce sens, 2 µL de l’amorce antisens et 9,5 µL d’eau ont été mélangés. Ces mélanges sont ensuite disposés sur une plaque de PCR contenant 96 puits. Les cycles de PCR ont été réalisés selon les étapes suivantes : 5 min à 95°C, 30 sec (secondes) à 94°C, 30 sec à la température de fusion choisie (Tm), 30 sec à 72°C et 5 min à 72°C. Les trois étapes centrales de ce cycle ont été répétées 35 fois. Nous avons réalisé trois plaques de PCR : une plaque contenant les amorces CH3 et CH4 avec un Tm de 50°C, une plaque contenant les amorces CH3 et CH4 avec un Tm de 55°C, une plaque contenant les amorces des portions du FcRY à 43°C et une plaque contenant les amorces des portions du FcRY à 45°C. Etant donné qu’il s’agit d’une expérience préliminaire qui vise à tester l’efficacité des amorces de PCR pour amplifier les séquences recherchées, nous avons décidé de n’utiliser qu’un individu par espèce pour chaque couple d’amorce pour CH3 et CH4, et 3 individus par espèce pour les domaines du FcRY. 104 Tableau 4 : Amorces de PCR utilisées Espèces utilisées : Fulmar boréal (Fulmar), Pétrel cul-blanc (Pétrel). CH3 : domaine CH3 des IgY. CH4 : domaine CH4 des IgY. FcRY : récepteur des IgY. CTL5 : domaine CTL5 du FcRY. CTL6 : domaine CTL6 du FcRY. FNII : domaine FNII du FcRY. Sens : amorce gauche (dans le sens de lecture). Antisens : amorce droite (dans le sens inverse de lecture). f59 : début de l’amorce fixé manuellement au 59e nucléotide de la séquence. 105 Figure 27 : Couples d’amorces PCR CH3 : domaine CH3 des IgY. CH4 : domaine CH4 des IgY. FcRY : récepteur des IgY. Tm : température de fusion. 106 4. Résultats et discussion 4.1. Alignements de séquences Les alignements de séquences correspondant aux domaines CH3-CH4 de l’IgY, et aux domaines FNII et CTL5-6 du FcRY sont représentés respectivement aux Figures 28, 29 et 30. Entre la Poule et le Canard, qui sont deux espèces phylogénétiquement assez proches, un taux de 54% d’identité a été retrouvé pour les acides aminés de la chaîne lourde des IgY, avec une conservation complète des régions comportant des résidus cystéine et tryptophane (Magor et al., 1992). En revanche, la recherche de séquences similaires aux domaines CH3 et CH4 de la Poule dans les génomes du Pétrel fulmar et du Pétrel cul-blanc donne des scores médiocres, par faible taux d’homologie. Il a donc été décidé de baser le choix des amorces sur les séquences du Pétrel fulmar et du Pétrel cul-blanc – et non sur celles de la Poule - pour les domaines CH3 et CH4. Pour le FcRY, la recherche d’amorces de PCR a été réalisée sur la séquence consensus des différentes espèces. Tandis que les domaines du FcRY sont très conservés entre espèces, ceux de l’IgY varient considérablement. Cette variabilité est peut-être même répandue au sein d’une même espèce. Bien que le Fc soit supposé très conservé entre individus d’une même espèce, des différences ont été notées. Sept allotypes, c’est-à-dire sous-types de chaînes lourdes caractéristiques d’une population d’une espèce, ont par exemple été mis en évidence chez la Poule (Zhao et al., 2000). 107 Figure 28 : Alignement de séquences des domaines terminaux du Fc de l’IgY Gallus : Poulet / Anas : Canard / Anser : Oie domestique / Fulmaris : Pétrel fulmar / Struthio : Autruche d’Afrique / Leach : Pétrel cul-blanc A. : domaine CH3. B. : domaine CH4. Noir : absence de consensus. Bleu : consensus partiel. Rouge : consensus total. A. B. 108 Figure 29 : Alignement de séquences du domaine FNII du FcRY Gallus : Poulet / Anas : Canard / Anser : Oie domestique / Columba : Pigeon biset / Pygoscelis : Manchot Adélie / Aptenodytes : Manchot royal / Opisthocomus : Hoatzin huppé / Egretta : Aigrette garzette / Nipponia : Ibis nippon / Cuculus : Coucou gris / Struthio : Autruche d’Afrique / Tinamus : Tinamou noir / Pelecanus : Pélican d’Amérique / Phalacrocorax : Grand Cormoran / Fulmarus : Pétrel fulmar. Noir : absence de consensus. Bleu : consensus partiel. Rouge : consensus total. 109 Figure 30 : Alignement de séquences des domaines CTL5-6 du FcRY Légende similaire à la Figure 22. 110 4.2. PCR Les gels de PCR sont présentés à la Figure 31. Plusieurs couples d’amorces ont amplifié des fragments de taille adéquate pour CH3 et CH4. Pour le FcRY, le seul couple d’amorces ayant donné des fragments d’amplification de taille recherchée est celui correspondant au domaine FNII. 111 Figure 31 : Gels de PCR Premier gel : amorces CH3 et CH4, Tm = 50°C. Deuxième gel : amorces FNII, CTL5 et CTL6, Tm = 45°C. La première marque de chaque ligne donne l’échelle (marqueur de taille 100 pb). 112 5. Perspectives L’objectif est de séquencer les portions des gènes correspondant aux domaines terminaux des IgY, et aux domaines du FcRY impliqués dans la liaison anticorps-récepteur (domaines FNII et CTL 5-6 en priorité). A partir des alignements établis, 6 couples d’amorces de PCRont été construits pour le domaine CH3 des IgY, 6 autres couples pour le domaine CH4 des IgY, un couple pour le domaine FNII du FcRY, un couple pour le domaine CTL5 et un dernier couple pour le domaine CTL6. Plusieurs couples ont amplifié des fractions de gènes dont la taille correspondait aux séquences recherchées à l’issue d’une PCR. Il reste à poursuivre et affiner ces travaux en vue de séquencer ces portions de gènes. Il sera ensuite possible de comparer les séquences entre les différentes espèces étudiées, en vue de calculer des taux d’homologie et de repérer des mutations particulières de ces portions de gènes. Ainsi, l’identification de mutations spécifiques d’une espèce au niveau de la liaison IgY-FcRY pourrait être reliée à des caractères immunologiques particuliers, telle une persistance prolongée des anticorps maternels en vue de la protection du jeune. Pour la mère, le développement d'une réponse immunitaire est considéré comme coûteux, et se fait au détriment d'autres fonctions comme la croissance et la reproduction (Sheldon & Verhulst, 1996 ; Lochmiller & Deerenberg, 2000). Cependant, pour le jeune qui reçoit ces anticorps, il s'agit un avantage qui lui permet de limiter l'investissement immunitaire au bénéfice de son développement (Grindstaff, 2007), ce qui procure un bénéfice en termes de valeur sélective pour la mère. Notre étude permettrait d’élucider les mécanismes moléculaires à l’origine de ce compromis énergétique forgé par l’évolution des modes de vie des espèces, notamment dans une famille d’oiseaux de mer à rythme de vie particulièrement lent, les Procellariidés. Néanmoins, d’autres paramètres physiologiques peuvent influer sur la persistance des anticorps maternels : densité de récepteurs produits, repliement tridimensionnel du FcRY et de l’IgY, présence d’inhibiteurs moléculaires du FcRY (Ward et al., 2015). Dans le cas où les mutations recherchées ne seraient pas retrouvées, ces axes d’étude gagneraient à être explorés, notamment par le biais d’études transcriptomiques. Il serait également intéressant de réaliser cette approche comparative dans d’autres taxons, car des données sur les gènes des IgG (ou des IgY) sont disponibles dans plusieurs espèces de Mammifères (Zhao et al., 2012 ; Eguchi-Ogawa et al., 2012), de Poissons (Ghaffari & Lobb, 1989 ; Harding et al., 1990) ou de Reptiles (Fellah et al., 1993 ; MagadanMompo et al., 2013). En particulier, chez les Mammifères, les persistances des anticorps maternels ont été mesurées pour des espèces domestiques, ce qui en ferait aussi un bon taxon d’étude pour cette théorie. 113 114 CONCLUSION Dans un article paru en 2012, Sutherland et collègues établissent la liste des questions fondamentales à élucider dans le domaine de l’écologie. Parmi celles-ci, trois d’entre elles entrent dans notre cadre d’étude, et soulèvent l’importance de la prise en compte de la transmission de facteurs maternels non-génétiques dans des processus variés : - Quelles sont les bases physiologiques des compromis entre traits d’histoire de vie ? - Quelles sont les causes et les conséquences écologiques de la variation épigénétique ? - Comment les effets transgénérationnels portant sur les traits d’histoire de vie, tels les effets maternels, impactent les dynamiques de populations ? (Sutherland et al., 2012) Il est de plus en plus reconnu que les effets épigénétiques sont des vecteurs d’évolution à l’origine d’innovations plastiques, altérant les mécanismes directs de transmission classiquement étudiés (Wolf et al., 1998 ; Day & Bonduriansky, 2011). Le transfert d'anticorps de la mère au jeune est une illustration de la transmission d’informations non génétiques à la descendance. Il a été peu étudié en populations naturelles, alors que ses implications en évolution et en écologie sont larges, par exemple dans la compréhension des relations hôte-parasite ou dans la modulation de la valeur sélective des descendants (Boulinier & Staszewski, 2008). De plus, l'investissement dans l'immunité du jeune dépend d'un compromis avec d'autres fonctions coûteuses en énergie, et l'étude de la variabilité interspécifique de la persistance des anticorps maternels s'insère également dans le cadre de la théorie des traits d'histoire de vie, et dans la compréhension de l'adaptation d'une espèce à son milieu. Le travail présenté dans cette thèse a permis de montrer, d’une part, qu’il n’y avait pas de répétabilité du taux d’anticorps transférés dans l’œuf chez une femelle, et qu’il n’était pas possible d’établir une sélection sur ce caractère. D’autre part, il a proposé un cadre théorique à l’apparition d’événements évolutifs qui ont pu avoir une répercussion directe sur la persistance des anticorps maternels chez le jeune, à l’origine de l’émergence d’histoires de vie 115 contrastées. L’étude combinée des deux paramètres de ce transfert – taux et persistance des anticorps transférés – offre différents angles d’abord de l’immunité maternelle. De nombreuses zones d'ombres restent à éclaircir quant aux bases génétiques de la transmission des anticorps maternels, autant sur la capacité de la mère à transférer des anticorps, que leur persistance chez le jeune, qui repose sur les interactions entre anticorps et récepteur néonatal. Par ailleurs, des travaux de génétique quantitative seront utiles pour mieux comprendre le rôle de cet effet maternel dans la réponse à la sélection, notamment en l'incluant dans le calcul de la variance génétique (Räsänen & Kruuk, 2007). L’existence d’une variabilité phénotypique et génétique sur un caratère, à la fois intraet inter-espèces, permet d’envisager des mécanismes d’évolution ayant agi sur ce caractère. Ce travail ouvre également des perspectives d'application en populations naturelles, où la prise en compte des effets maternels s'avère essentielle pour comprendre des phénomènes évolutifs variés tels les dynamiques de populations ou les interactions hôtes-parasites. 116 117 118 BIBLIOGRAPHIE ABBAS AK, LICHTMAN AH, PILLAI S, MASSON PL. (2013). Les bases de l’immunologie fondamentale et clinique. France, Elsevier-Masson, 4, 304 p. ABDEL-MONEIM AS, ABDEL-GAWAD MMA. (2006). Genetic variations in maternal transfer and immune responsiveness to infectious bursal disease virus. Vet. Microbiol., 114, 16-24. ADDISON B, KLASING KC, ROBINSON WD, AUSTIN SH, RICKLEFS RE. (2009). Ecological and life-history factors influencing the evolution of maternal antibody allocation : a phylogenetic comparison. Proc. Biol. 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Immunol., 31, 1034-1049. 128 129 130 131 ÉCOLOGIE ÉVOLUTIVE DU TRANSFERT MATERNEL D’ANTICORPS CHEZ LES OISEAUX POLLET Salomé Résumé Le transfert de l'immunité de la mère au jeune est un mécanisme essentiel pour la protection contre les agents pathogènes lors des premiers jours de vie. Chez les Oiseaux, ce transfert est réalisé par le passage d'anticorps maternels dans le jaune d'œuf. Bien que les processus physiologiques sous-tendant le transfert d'anticorps maternels aient été abondamment étudiés, de nombreux points restent encore à éclaircir. En particulier, peu de données existent quant à la variabilité du taux de transfert d'anticorps maternels, et sur le fait que ce caractère phénotypique d'une importance prépondérante pour le jeune pourrait être soumis à sélection. L'analyse d'une expérience de sélection menée chez la Poule sur le taux de transfert d'anticorps dans le jaune d'œuf permet d'apporter des pistes quant à l'existence d'une base génétique de ce transfert. Une quantification du taux de transfert d'anticorps spécifiques a pu être réalisée par titrage ELISA, chez des animaux dont l'immunisation a été contrôlée par vaccination. Sur notre population d’étude, nous n’avons pas retrouvé d’effet de la sélection sur le taux de transfert d’anticorps, modélisé par les résidus de la régression des taux dans l’œuf et dans le plasma. En parallèle de ce travail, un autre caractère lié à l’immunité maternelle, la persistance des anticorps transférés chez le jeune, a été étudié, cette fois-ci sous l’angle d’une comparaison interespèces. La multiplicité des stratégies d’histoire de vie au sein du règne aviaire pose des questions quant à l’allocation de ressources à différents traits. Nous avons cherché à élaborer une théorie permettant d’expliquer la variabilité des persistances d’anticorps maternels retrouvées chez différents Oiseaux à rythmes de vie contrastés. En conclusion, l’étude des deux axes de la réponse immunitaire juvénile – taux de transfert et persistance des anticorps maternels – illustre des mécanismes évolutifs intimement reliés à la survie et aux capacités de reproduction des individus. Mots clés : IMMUNOGLOBULINE / ANTICORPS / ADN / TRANSFERT PASSIF D'IMMUNITE / RÉPONSE IMMUNITAIRE / IMMUNISATION / SÉLECTION / ÉCOLOGIE ÉVOLUTIVE / OISEAU Jury : Président : Pr. Directeur : Dr. LE ROUX Delphine Assesseur : Dr. ABITBOL Marie EVOLUTIONARY ECOLOGY OF THE MATERNAL TRANSFER OF ANTIBODIES IN BIRDS POLLET Salomé Summary The maternal transfer of immunity is a fundamental mechanism ensuring the protection of the youngster against pathogens during its first days of life. In birds, this transfer is mediated by the uptake of antibodies from the egg yolk. Even if the physiological processes underlying maternal antibody transfer have been widely studied, there are many points still unravelled. Very few data exist on the variability of the rate of transfer of maternal antibodies, and on the fact that this phenotypic trait of paramount importance for offspring fitness could be open to selection. We analyzed an experiment of selection in poultry on the rate of transfer of maternal antibodies into the egg yolk, which opens new paths of understanding a possible genetic basis on this transfer. With an ELISA-based technique, we quantified the rate of transfer of specific antibodies, on animals immunized through vaccination. We did not find, on the population under study, any effect of selection on antibody transfer rate, which was modelled using the residuals of female-egg antibody quantities regression. In parallel, we studied another trait linked with maternal immunity, the persistence of transferred antibodies, under the scope of a comparison between species. The multiplicity in life history strategies among birds raises issues, especially on the allocation of resources to different traits. We have sought to build a theory that could explain the variability of persistence in maternal antibodies found in different bird species showing contrasted paces of life. As a conclusion, the study of the two axes of the juvenile immune response – the rate of transfer, and the persistence of maternal antibodies – portrays evolutionary mechanisms closely tied to survival and reproductive capacities of individuals. Keywords : IMMUNOGLOBULIN / ANTIBODY / DNA / PASSIVE TRANSFER OF IMMUNITY / IMMUNE RESPONSE / IMMUNIZATION / SELECTION / EVOLUTIONARY ECOLOGY / BIRD Jury : President : Pr. Director : Dr. LE ROUX Delphine Assessor : Dr. ABITBOL Marie