ECBU - OneDrive
publicité
Institut Pasteur d’Algérie Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines (E.C.B.U) F. Djennane D. Mohammedi D. Tiouit D. Touati K. Rahal Edition 2009 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Déja parus dans la collection : Institut Pasteur d’Algérie Techniques Microbiologiques: - M.N Ouar-Korichi-H.Senouci-K.Rahal Diagnostic bactériologique et sérologique de la brucellose. ANDS 1998, 1ere édition, 33pages - R.Bellouni-H.tali-Maamar-K.Rahal Etude cytobactériologique et céphalorachidien. ANDS 2000. 52pages biochimique du liquide - A.Benslimani-K.Rahal. Prélèvements génitaux. ANDS 2001. 128 pages. - A.S Merad-H.Tali-Maamar-K.Rahal Diagnostic bactériologique et antibiothérapie des infections oculaires . ANDS 2003 . 40 pages. - M.N Ouar-Korichi-H.Senouci-K.Rahal Diagnostic bactériologique et sérologique de la brucellose humaine. ANDS 2005 2eme édition. 58 pages - N.Ramdani-Bouguessa-K.Rahal Diagnostic bactériologique des infections respiratoires ANDS 2006 . 48 pages. - M.Azouaou.M.Lazri.S.Mahrane.H.Senouci Diagnostic de la diphtérie ANDS 2007 . 94 Pages 2 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 SOMMAIRE CHAPITRE I................................................................................................................ 4 INTRODUCTION .......................................................................................................... 5 GENERALITES............................................................................................................. 6 RAPPEL ANATOMOPHYSIOLOGIQUE .................................................................................. 7 Rappel anatomique ............................................................................................... 7 Portes d'entrées..................................................................................................10 Facteurs favorisants l’infection urinaires ....................................................................11 Moyens de défense de l’hôte ..................................................................................12 RAPPEL CLINIQUE ..................................................................................................... 14 Cystite .............................................................................................................14 Pyélonéphrite ....................................................................................................14 Prostatite .........................................................................................................14 LE PRELEVEMENT...................................................................................................... 16 Indications de l’E.C.B.U ........................................................................................16 Les conditions du prélèvement ................................................................................17 Le matériel....................................................................................................17 Moment du prélèvement ....................................................................................18 Toilette ........................................................................................................18 Recueil des urines ...........................................................................................18 Prélèvement d’urine pour des recherches spécifiques.................................................23 Transport ......................................................................................................24 Conservation ..................................................................................................24 CHAPITRE II ............................................................................................................. 25 Examen cytobactériologique des urines...........................................................................26 Examen macroscopique...............................................................................................26 Détermination du PH urinaire ...................................................................................... 26 Examen microscopique .............................................................................................. 27 Examen à l’état frais ............................................................................................27 Examen direct après coloration ...............................................................................33 Culture .................................................................................................................. 35 Techniques d’ensemencement ................................................................................35 1- Méthode de référence : Méthode de KASS Modifiée.................................................35 2- Méthode à l’anse calibrée ...............................................................................36 3- Lames immergées .........................................................................................37 4- Tests rapides ..............................................................................................38 5- Techniques à base de milieux chromogéniques ......................................................40 Choix des milieux de culture...................................................................................44 1- Milieux pour numération bactérienne .................................................................44 2- Milieux d’isolement ......................................................................................44 Incubation.........................................................................................................45 Aspect des colonies..............................................................................................45 Identification biochimique des colonies......................................................................48 1- Caractéres biochimiques d’orientation rapide .......................................................48 2- Identification classique ..................................................................................49 3- Identification rapide (API system)......................................................................50 4- Identification des colonies sur milieux chromogènes ...............................................51 5- Identification antigénique ...............................................................................52 6- Antibiogramme ...........................................................................................52 Chapitre III.............................................................................................................. 53 Interprétation de l’ECBU ............................................................................................ 54 Interprétation selon la bactériurie et la leucocyturie......................................................... 55 Interprétation selon les germes ................................................................................... 60 Interprétation chez le transplanté rénal......................................................................... 62 Chapitre VI ............................................................................................................. 63 Epidémiologie .......................................................................................................... 64 Annexe .................................................................................................................. 70 Références bibliographiques....................................................................................... 74 3 CHAPITRE I IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 INTRODUCTION L’infection urinaire est une pathologie fréquente, c’est ainsi qu’elle constitue le principal motif d’exploration microbiologique (l’examen cytobactériologique des urines représente plus de la moitié des examens bactériologiques), de même qu’elle est la 2ème pathologie infectieuse rencontrée en pratique extra hospitalière et nécessite un traitement antibiotique, d’où des conséquences sur le coût des soins et le développement des résistances. Si l’ECBU permet un diagnostic formel de toute infection, sa qualité est conditionnée par un bon prélèvement, une technique rigoureuse au laboratoire et l’utilisation de critères d’interprétation reconnus. La prise en charge correcte d’une infection urinaire nécessite la prise en compte de 4 éléments décisionnels : • Clinique : - Sexe du patient - L’infection : sièges, symptômes, étiologie, évolution, complexité • Bactériologique : Bactérie : - Espèce - Sensibilité aux antibiotiques • Epidémiologique : Connaître les résistances régionales ou nationales. bactériennes locales, • Pharmacologique : Antibiotiques - Diffusion - Demi–vie… Le diagnostic de la tuberculose sera seulement évoqué suivantes : pour les raisons - Symptomatologie et circonstances de découverte souvent différents - Méthodes de diagnostic bactériologique différentes - Germe particulier (mycobactéries) - Atteinte souvent mixte (appareil génital et urinaire) - Traitements différents. Chapitre I : Généralités 5 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 GENERALITES Les infections des voies urinaires sont définies par la présence d’un nombre significatif de bactéries qui se développent au niveau des voies excrétrices urinaires hautes ou basses. Il existe trois types d’infections urinaires selon l’organe de l’appareil urinaire qu’elle touchent : • La cystite ou l’infection de la paroi vésicale avec pullulation bactérienne dans les urines. • La pyélonéphrite ou infection du parenchyme rénal • La prostatite ou infection de la prostate Une autre situation infectieuse urinaire est constituée par la bactériurie asymptomatique ou la colonisation, ainsi dénommée en l’absence de signes cliniques urinaires d’orientation, elle correspond à l’une des 3 infections précédentes. L’infection est dite « simple » en l’absence d’anomalies urologiques décelables ou jouant à l’évidence un rôle dans sa survenue et / ou sa présentation. Elle est dite « compliquée » (à ne pas confondre avec une infection urinaire grave ou sévère) lorsqu’une anomalie urologique haute ou basse entraîne une stase urinaire ou lorsqu’un corps étranger tel un calcul même minime constitue un gîte bactérien. Les infections urinaires peuvent être compliquées également par une maladie générale : insuffisance rénale, maladie de système notamment diabète ou maladie immunosuppressive (cancer, SIDA), ou traitement immunosuppressif au long cours. Sont aussi considérées comme compliquées la pyélonéphrite aiguë survenant chez la femme enceinte et d’une façon plus générale les pyélonéphrites aiguës de l’homme. Chapitre I : Généralités 6 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 RAPPEL ANATOMOPHYSIOLOGIQUE Rappel anatomique - L’appareil urinaire s’étend des reins au méat urétral - Au niveau du rein, des papilles calicielles s’opposent au reflux intra rénal - Des mouvements péristaltiques urétéraux favorisent l’écoulement de l’urine du rein vers la vessie - Un système anti reflux au niveau de la jonction urétéro-vésicale évite le reflux des urines vers le rein lors de la miction - La vessie s’évacue par l’urètre. - Un double sphincter existe au niveau de la jonction urétro-vésicale et assure la continence : • sphincter lisse : à commande réflexe • sphincter strié : à commande volontaire Schema de l’arbre urinaire SCHÉMA DE L’APPAREIL URINAIRE (coupe frontale) Chapitre I : Généralités 7 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Schéma de l’appareil uro-génital féminin (Coupe sagittale) Chapitre I : Généralités 8 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Schéma de l’appareil uro-génital masculin ( coupe sagittale ) Chapitre I : Généralités 9 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Portes d’entrées Tout l’arbre urinaire est physiologiquement stérile, à l’exception des derniers milimètres de l’urètre et ceci, bien que l’urine soit pour de nombreux germes un bon milieu de culture, l’infection peut se faire par plusieurs voies. 1- Colonisation par voie ascendante : Elle est la plus fréquente, les germes d’origine intestinale ou périnéale cheminent le long de l’urètre jusqu’à la vessie. La contamination est spontanée ou provoquée. • • Spontanée : - Normalement, l’urine et l’arbre urinaire sont stériles sauf les derniers millimètres de l’urètre - La bactérie migre au niveau du périnée puis le méat urinaire, remonte le long de l’urètre et colonise la vessie : signes de cystite - L’infection peut se propager vers (pyélonéphrite), la prostate (prostatite). l’uretère, le rein Provoquée (infection iatrogène) - Le germe est apporté de l’urètre vers la vessie par des manœuvres instrumentales :cystoscopie, cathétérisme vésical et sonde vésicale. 2- Colonisation par voie hématogène - Plus rare que la voie ascendante - Contexte de sepsis généralisé - Contamination du rein donnant une pyelonéphrite ou plus rarement un abcés du rein - Est plus fréquente chez le nouveau né 3– Autre voie (Exceptionnellement) : - Urines infectées par effraction de l’arbre urinaire : traumatisme, tumeurs, fistules …. Chapitre I : Généralités 10 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Facteurs favorisants l’infection urinaire 1- Facteurs liés à la bactérie elle même : a. facteurs d’adhésion (fimbriae) et autres facteurs non spécifiques, non liés aux fimbriae : Pour échapper aux mécanismes de défense de l’hôte, les bactéries uropathogènes développent de nombreux mécanismes pour adhérer et envahir les tissus. • Escherichia coli - Produit des facteurs modulant sa virulence dans le tractus urinaire (résistance à la phagocytose et à l’action du complément) : ** Adhésine - Sont des sites de glycoreconnaissance essentiellement fimbriale mais aussi à la surface de la bactérie - On distingue : - Adhésine type 1 mannose sensible. - Adhésine type 2 mannose résistante. ** Toxines - Toxine cytotoxique nécrosante - Hémolysine alpha : Cytotoxique pour les cellules rénales épithéliales Permet aux bactéries de s’encapsuler et d’échapper à la réaction inflammatoire Libère le fer héminique et favorise sa biodisponibilité ** Antigène de surface - AgO : portion externe du Lipopolysacharide de la membrane externe de paroi. - Agk : polysaccharide capsulaire. • Proteus mirabilis - Le pouvoir d’adhérence par son adhésine la Proteus mirabilis fimbriae (PMF) est médiocre ce qui exliquerait sa rareté dans les infections urinaires habituelles. Cependant, il possède une uréase qui entraîne la production d’urine alcaline favorisant la production de calculs. - Flagelles : progression dans l’arbre urinaire - Hémolysine et protéase - Uréase : production d’ammoniac qui entraîne une alcalinisation de l’urine. Chapitre I : Généralités 11 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 • Staphylococcus saprophyticus : - Il adhère fortement à l’urothélium par des lésions relatives à un résidu lactosamine. Son pouvoir pathogène est amplifié par la production du slime. • Pseudomonas aeruginosa possède une capsule polysaccharidique épaisse qui le protége de la phagocytose et de la fixation par les anticorps. b. l’inoculum bactérien : quantité des bactéries qui arrivent au niveau du tractus urinaire 2- Facteurs liés à l’environnement : • Le principal facteur c’est le pH Le pH urinaire est acide, donc inhibe la croissance bactérienne. Une variation du pH urinaire vers l’alcanisation entraîne une multiplication bactérienne. 3- Facteurs liés à l’hôte a- Anomalies morphologiques de l’arbre urinaire b- L’immunité humorale : (rôle des IgA sécrétoires dans la défense vis-àvis des agressions bactériennes : leur diminution peut entrainer une augmentation du taux d’infection du tractus urinaire). c- Faible réponse immunitaire de l’hôte : grossesse, diabète, manœuvre instrumentale (sondage), jeune enfant d- Hygiène de vie : boissons en quantité insuffisante. Moyens de défense de l’hôte • Diurèse importante (1,5l/j) : le flux d’urine délivré par les reins dilue la concentration d’urine • pH acide des urines (< 5,5) • Osmolarité faible (< 200 milliosmoles) • Concentration élevée d’urée urinaire et autres acides organiques. Une modification entraîne soit une augmentation du PH et donc augmentation des risques d’infections, soit à l’inverse une diminution du PH (acidification des urines) et donc diminution du risque d’infection. Chapitre I : Généralités 12 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 • Chez l’homme : - Sécrétions prostatiques acides - Longueur de l’urètre • Intégrité de la muqueuse vésicale avec une couche de mucopolysaccharides acides. La proteine de Tamm-Horsfall (secrétée par le rein) inhibe les fimbriae et améliore la cléarance bactérienne lors de la miction. • Rôle bactéricide du mucus vésical • La présence d’IgA sécrétoires empêche l’adhérence des bactéries sur les cellules épithéliales. Chapitre I : Généralités 13 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 RAPPEL CLINIQUE Cystite C’est l’infection de la vessie, elle se manifeste par un ou plusieurs des signes suivants : - Dysurie habituellement associée à une pollakiurie - Un besoin impérieux de miction - Des brûlures mictionnelles - Une douleur supra-pubienne La cystite isolée ne s’associe ni à de la fièvre ni à des douleurs lombaires Pyélonéphrite Le syndrome infectieux signe l’atteinte parenchymateuse. La fièvre peut s’accompagner de frissons évocateurs d’une bactériémie. Les douleurs lombaires et/ ou abdominales orientent vers une pyélonéphrite aiguë. Ces lombalgies sont en règle générale unilatérales à irradiation descendante vers le pubis et les organes génitaux externes, elles peuvent s’accompagner de signes digestifs tels que nausées et vomissements. A l’examen les fosses lombaires sont souvent empâtées. Prostatite Prostatite aiguë Comme pour la pyélonéphrite aigue l’atteinte du parenchyme prostatique s’accompagne de fièvre et de frissons. La prostate est très douloureuse, tendue associant un ou plusieurs signes cliniques : - Pollakiurie - Rétention aiguë d’urines - Parfois tableau de septicémie Chapitre I : Généralités 14 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 La prostatite chronique : Elle est souvent pauci symptomatique, on peut trouver : - Une douleur périnéale - Une dysurie - Des brûlures mictionnelles - Des douleurs pelviennes - Des douleurs scrotales - Une éjaculation douloureuse - Une hémospermie Elle est souvent à l’origine d’infection asymptomatique récidivante chez l’homme. urinaire ou bactérienne Abcés du rein C’est une maladie rare et de pronostic grave sans traitement. Son diagnostic est soupçonné sur la clinique, (état général altéré, fiévre prolongée, frisson, douleur lombaire unilatérale par la palpation) et la biologie (hyperleucocytose, VS accélerée, ECBU négatif). Il est confirmé par l’imagerie (Echographie, UIV, angiographie du rein). L’abcés du rein est consécutif à une bactérièmie ou à une pyélonéphrite non ou mal traitée. Chapitre I : Généralités 15 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 LE PRELEVEMENT Le Prélèvement d’urine est une étape essentielle dans le diagnostic d’une infection urinaire, sa bonne exécution conditionne la qualité de l’examen cytobactériologique des urines, son but est de récupérer les urines vésicales et d’éviter leur contamination par la flore de la région périnéale. Indications de l’E.C.B.U Situations cliniques qui conduisent à demander un ECBU. 1- Syndrome douloureux Douleurs lombaires, douleurs pelviennes, brûlures mictionnelles (per, pré ou post miction) sensibilité au toucher rectal de la prostate (prostatite). 2- Troubles fonctionnels de la miction Pollakiurie, incontinence urinaire, rétention urinaire, énurésie secondaire chez l’enfant. 3- Fièvre inexpliquée : Elle représente dans ce cas un signe en faveur de la pyélonéphrite et de la prostatite. Chez le nourrisson et l’enfant la température peut atteindre 39° - 40°. 4- Aspect anormal des urines : Hématurie et/ou trouble. 5- Cas particuliers du nouveau né et du nourrisson Il n’existe aucun signe spécifique. Il faut savoir évoquer le diagnostic et faire un ECBU devant des signes parfois trompeurs : - Fièvre variable (parfois très élevée, pouvant entraîner une convulsion inaugurale, mais souvent modérée ou totalement absente) - Septicémie surtout avant l’âge de 02 mois - Mauvaise prise de poids ou cassure de la courbe pondérale - Ictère persistant. 6- Infection urinaire asymptomatique : En cas de déficience immunitaire : - Diabète - Grossesse - Transplantation rénale. 7- L’ECB des urines peut également être réalisé avant tout geste invasif sur l’appareil urogénitale, qu’il soit à but diagnostic (U.C.R, Cystoscopie, résection per endoscopique) ou thérapeutique (intervention chirurgicale). Chapitre I : Généralités 16 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Les conditions du prélèvement : Le prélèvement doit être effectué en respectant certaines conditions indispensables pour assurer une bonne interprétation de l’E.C.B.U Le matériel Le matériel pour la réalisation du prélèvement doit être stérile : pour ceci on utilise : - Des pots stériles à usage unique ou des tubes à col large stériles. On peut avoir recours à d’autres matériels en fonction de l’âge, de l’état du malade ou de la technique utilisée : - Sachet collecteur pédiatrique - Sonde, cathéter ou étui pénien - Aiguille montée sur une seringue - Antiseptiques non irritants (dakin ou chlorhexidine) ou savon neutre (savon de Marseille) - Compresses stériles ou une serviette propre - Gants stériles (sondage, ponction sus pubienne…) Chapitre I : Généralités 17 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Moment du prélèvement Antiobiothérapie : Le prélèvement doit être effectué sur les urines du matin. En cas d’urgence on peut réaliser le prélèvement à n’importe quel moment de la journée à condition que les urines aient séjourné au moins trois heures dans la vessie à savoir trois heures entre la dernière miction et le prélèvement pour l’analyse. La miction est un moyen de défense mécanique de la vessie et permet d’éliminer les bactéries. Quand les mictions sont fréquentes elles peuvent aboutir à un résultat faussement négatif. Toilette Après un lavage hygiénique des mains, la toilette locale doit être effectuée en réalisant une toilette de la région uro-génitale avec un antiseptique doux (dakin, chlorhexidine) ou un savon neutre (savon de Marseille) : Chez la femme : La toilette est réalisée au niveau de la région vulvaire d’avant en arrière pour éliminer les germes vulvovaginaux et digestifs. Chez l’homme : La toilette concerne le méat urinaire (verge, gland) et après rétraction du prépuce (décalotter le prépuce) pour le garçon non circoncis. Aussi bien chez la femme que chez l’homme, on rince abondamment à l’eau claire, pour éliminer l’antiseptique qui peut entraver la culture des bactéries, et essuyer avec une compresse stérile ou une serviette propre. Le prélèvement des urines doit être effectué avant toute antibiothérapie. Une fenêtre thérapeutique de 48h à 72h est réalisée si le malade est sous traitement antibiotique. Chez un enfant présentant une malformation de l’arbre urinaire avec une antibioprophylaxie, le prélèvement est réalisé malgré la présence de l’antibiotique. Pour un contrôle, d’une infection urinaire traitée, le prélèvement doit être réalise 48 h après l’arrêt du traitement antibiotique. Recueil des urines Il existe plusieurs techniques de prélèvement adaptées à l’âge et à l’état du malade, mais toutes doivent être soumises aux conditions d’asepsie rigoureuse. - La technique du milieu du jet : Cette technique est simple et réalisée chez des malades autonomes et coopérants adultes et enfants de plus de deux ans. Elle est réalisée chez l’enfant de plus de 02 ans et chez l’adulte (homme et femme). Chapitre I : Généralités 18 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Elle consiste à éliminer le premier jet urinaire (20 ml) qui peut contenir jusqu’à 104 UFC/ml de bactéries provenant de la flore urétrale, le milieu du jet qui correspond à l’urine vésicale est récupéré dans un pot stérile qui n’est ouvert qu’à la fin de la toilette sans toucher le bord supérieur du récipient, et après élimination du dernier jet, le tube est fermé hermétiquement. Chez la femme il faut écarter les grandes lèvres, et en cas de leucorrhées importantes il faut placer une compresse au niveau de la région vulvaire, afin d’éviter toute contamination par la fore vaginale. - Sachet collecteur : Le collecteur ou la poche à urine est une technique simple et non invasive. Elle est réservée aux nouveaux nés et nourrissons qui ne font pas de miction à la demande. Le collecteur d’urine présente une partie adhésive qu’on colle sur la région périnéale préalablement désinfectée et essuyée afin d’assurer son adhérence et éviter le contact avec la partie anale. Le collecteur est laissé en place vingt à trente minutes. Si le nourrisson n’a pas uriné au bout de 30 mn, il faut placer un nouveau collecteur après une nouvelle toilette ; la miction peut être stimulée en donnant à boire au nourrisson. À la fin de la miction on retire le collecteur et on le ferme en collant les parties adhésives entre elles. Chaque laboratoire doit disposer de fiches techniques pour expliquer la toilette, la technique du milieu du jet ainsi que celle du sachet collecteur, car ces deux techniques sont réalisées souvent à la maison par le malade ou son parent. - La ponction sus pubienne La ponction sus pubienne permet de récuperer les urines intra vésicale, mais c’est un acte invasif de pratique peu courante. La ponction de vessie est un acte médical invasif, réalisée chez les nourrissons fébriles nécessitant une antibiothérapie en urgence, ainsi que devant des résultats douteux sur plusieurs prélèvements réalisés par voie basse. Chapitre I : Généralités 19 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Elle est réalisée au moins 4 heures aprés la dernière miction (vessie pleine) afin de visualiser le globe vésical. Le nourrisson est allongé, les régions sous ombilicale et sus pubienne sont nettoyées puis badigeonnées d’alcool iodée, le médecin porte des gants stériles et ponctionne avec une seringue stérile verticalement sur la ligne médiane en plein matité à un centimètre au dessus de la symphyse pubienne. L’urine est aspirée, l’aiguille est capuchonnée et le point de ponction est comprimé. - Sondage vésical ou Cathétérisme vésical : C’est une technique invasive indiquée dans des cas particuliers tel que : Rétention vésicale, Problème d’incontinence chez les personnes âgées et chez la femme Cette technique est à éviter car elle présente des risques d’infections iatrogènes lors de la pose de la sonde et doit être réalisée dans les conditions d’asepsie rigoureuse. Chapitre I : Généralités 20 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 On distingue différents systèmes de sondage vésical : - Le sondage à demeure avec un système ouvert : Le prélèvement est réalisé par ponction au moment de la miction des urines avec une seringue stérile au niveau de la paroi de la sonde après désinfection et clampage en aval, le point du prélèvement est obturé par du sparadrap. Ce prélèvement n’est pas représentatif de l’urine vésicale car les bactéries adhèrent à la paroi de la sonde et un biofilm se forme autour d’elle. Il est donc préférable de réaliser le prélèvement au moment du changement de la sonde, si possible. - Le sondage à demeure avec système clos : Cette technique est plus representative, car elle s’oppose à la colonisation par les bactéries grâce aux valves anti retour. Il existe un site de prélèvement et un site de drainage du collecteur . L’urine doit être prélevée au niveau du site de prélèvement sur la tubulure de la poche après sa désinfection avec un antiseptique. L’urine est recueillie à l’aide d’une seringue stérile. Pour les deux types de sondage, le prélèvement au niveau de la poche de collection des urines est proscrit car il y a une pullulation microbienne importante. - Le sondage urinaire intermittant : Il est réalisé uniquement au moment du prélèvement en introduisant une sonde urinaire dans la vessie. Le recueil de l’urine se fait directement dans un tube stérile. - Cathétérisme urétéral : Il permet d’avoir les urines du rein gauche ou droit, après désinfection de l’extrémité de la sonde, on recueille les urines en demandant au malade en décubitus latéral de tousser à plusieurs reprises. - Cathétérisme sus pubien : Il constitue le seul moyen pour réaliser un prélèvement quand l’urètre n’est pas accessible ou trop abîmé, c’est un mode de drainage assez confortable mais il nécessite un spécialiste pour la technique. En cas d’urétérostomie et sans sondage, le prélèvement est réalisé avec un collecteur d’urine après un nettoyage de la stomie urinaire Chapitre I : Généralités 21 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 - Etui pénien : Le prélèvement par l’intermédiaire d’un étui pénien est réalisé en cas d’incontinence sans rétention urinaire, ce système est non traumatisant et reste confortable pour le malade,il est préféré au sondage pour le sexe masculin. Si le malade porte déjà un étui pénien il faut l’enlever, réaliser une toilette et placer un nouvel étui pénien avec un sac vidangeable. L’étui pénien, comme le sac collecteur, ne doit pas être gardé plus de vingt à 30 minutes. Les urines sont recueillies directement de l’étui penien, a travers son orifice, vers le pot stérile. - Cas particulier de la prostatite : dans ce cas le prélèvement est réalisé selon la technique de MEARS-STAMEY. Après une abstinence sexuelle d’au moins 03 jours et après une toilette soigneuse, on récupère les premières urines et 10ml du milieu du jet. Après arrêt de la miction, le médecin pratique un massage prostatique et les gouttes du liquide prostatique tombent directement dans le pot stérile, les trois pots sont étiquetés avant d’être envoyés au laboratoire Chapitre I : Généralités 22 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Prélèvement d’urine pour des recherches spécifiques Recherche de mycobactéries : Après une restriction hydrique, on récupère la totalité des urines du matin, trois jours de suite dans des conditions d’asepsie rigoureuse Recherche des leptospires : A partir de la deuxième semaine de l’infection, les leptospires sont excrétées dans les urines de façon intermittente mais prolongée. Il faut donc répéter le prélèvement et le réaliser de préférence au laboratoire car il faut des urines fraîchement émises encore tièdes afin de réaliser un examen direct avec un microscope à fond noir ou une culture sur milieux spéciaux. Recherche de gonocoque : Dans le cas d’urétrite gonococcique sans écoulement purulent, la recherche du gonocoque peut être effectuée sur le premier jet urinaire. Recherche de mycoplasmes : Réaliser un prélèvement urétral sans miction depuis trois heures, avec un écouvillon ou une anse calibrée. Ce prélèvement est associé au premier jet urinaire et aux secrétions prostatiques. Recherche de chlamydia : Réaliser un prélèvement urétral avec un écouvillon extra fin ou une curette ophtalmologique par grattage afin de ramener un maximum de cellules. Les urines sont à proscrire car elles sont souvent toxiques pour la culture cellulaire. Recherche d’anaérobies : Réalisée sur des urines prélevées par ponction vésicale. Chapitre I : Généralités 23 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Transport Le tube est fermé hermétiquement et étiqueté correctement portant nom, prénom et heure du prélèvement. Le tube doit contenir 10 à 20ml d’urine accompagné d’une fiche de renseignements qui doit comporter : • L’identité du malade. • L’origine du malade hospitalisé ou externe. • Pathologie existante. • Notion d’intervention chirurgicale sur l’appareil urinaire. • Les signes cliniques. • La prise ou non d’antibiotiques, avec le nom de (ou des)antibiotique(s) et la posologie ainsi que la durée de prise. • La technique de prélèvement pratiquée. Ces renseignements jouent un rôle très important et permettent une interprétation adéquate selon les différents cas qui peuvent se présenter. Le transport doit être rapide et ne doit pas dépasser trente minutes après la miction. Si le transport nécessite une à deux heures, l’urine est placée dans de la glace afin d’éviter les faux positifs car à température ambiante on a une pullulation bactérienne. Conservation L’urine peut être conservée douze à vingt quatre heures à +4°C sans effet sur la bactériurie, néanmoins la leucocyturie en sera altérée. La conservation est donc à éviter sauf en cas de nécessité. Chapitre I : Généralités 24 CHAPITRE II Examen cytobactériologique des urines IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Examen cytobactériologique des urines Examen macroscopique Aspect des urines : l’urine normale est claire. Un aspect trouble peut être dû à une infection urinaire mais aussi à la présence de cristaux ou de sels amorphes. Technique : Homogénéiser l’urine par retournement ou par agitation mécanique et noter l’aspect limpide ou trouble et la présence d’une éventuelle hématurie Détermination du PH urinaire Le but étant d’évaluer l’état d’acidité ou d’alcalinité des urines. Principe : Mesure de la concentration en ions H+. Technique : Recueil des urines fraîches à l’abri de l’air et mesure du pH grâce à l’électrode d’un pH-mètre. Celui çi doit etre calibré avec des solutions tampon pH = 4 ou 10 et pH = 7. Les valeurs doivent être à peu près les mêmes. Une seconde méthode, plus simple, fait appel à des bandelettes revêtues de deux indicateurs colorés et dont le changement des couleurs allant de l’orange au bleu couvre une gamme de pH de 5,0 à 8,5. La réalisation de ce test s’effectue également sur urines fraîches. Résultats : Le pH normal des urines varie de 4,5 à 7,8 en fonction de l’alimentation et des modifications du pH sanguin. En cas d’infection urinaire, en particulier à germes uréasiques, il existe une alcalinisation intempestive. Physiologiquement, on observe une acidose de jeûne (la nuit) et une alcalose post-prandiale. Interprétation et intérêts C’est un examen fiable permettant l’interprétation des désordres acidobasiques et l’aide au diagnostic ou à la surveillance d’un certain nombre d’affections dans : - Le diagnostic des acidoses tubulaires ; - L’exploration des lithiases uriques ou cystiniques (on sait que la solubilité de ces cristaux est beaucoup plus grande en milieu alcalin) ; - La surveillance des infections urinaires récidivantes ou à uréolytiques (il est alors important d’assurer un pH urinaire acide). Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines germes 26 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Examen microscopique Cet examen doit être effectué dans les deux heures qui suivent le prélèvement afin de limiter l’altération des éléments cellulaires. Examen à l’état frais C’est un examen qui se fait entre lame et lamelle sur cellule hématimétrique ou sur cellule normale ; il présente de ce fait un double intérêt : Quantitatif : Numération des éléments cellulaires Qualitatif : Description des différents éléments cellulaires. a- Numération de l’urine entière sur cellule à numération : - Cellule de Malassez Elle permet la numération des leucocytes par mm3 La cellule de Malassez (de profondeur 0.2 mm) est constituée de 10 bandes verticales de 0.25 mm de large et de 10 bandes horizontales de 0.20 mm de large formant 100 rectangles. Le volume de la cellule est de 1 mm3. Chaque rectangle quadrillé représente 1/100 mm3. Selon que la leucocyturie est plus ou moins importante, les leucocytes sont comptés dans un volume différent : de un rectangle pour les fortes leucocyturie à la cellule entière pour les leucocyturies voisines des valeurs normales. - Cellule de Nageotte La cellule de Nageotte est de 10mm de largeur sur 10mm de longueur avec une profondeur de 0.5mm et un volume total correspondant a 50mm3 ; le dénombrement des élements se fait sur 04 bandes ; le chiffre total obtenu est divisé par 5 pour ramener le dénombrement au millimètre cube. Valeurs normales : le nombre de leucocyte est habituellement inférieur à 5000 par ml d’urine. Une leucocyturie supérieure à 3 10 000 par ml (> 10/ mm ) est en faveur d’une infection urinaire. b- Entre lame et lamelle (Culot de centrifugation): Le culot peut être obtenu par centrifugation de l’urine à une vitesse moyenne de 1000 tours min ou en laissant l’urine décanter. L’expression quantitative de la leucocyturie s’opère par examen du culot urinaire entre lame et lamelle, à l’objectif 40 x (nombre de champs à parcourir dizaine / cinquantaine). Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 27 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Nombre de leucocytes par champs microscopiques Expression du résultat 0-5 Rares leucocytes (= valeur normale) 5-10 Quelques leucocytes 10-20 Leucocytes en quantité un peu supérieure à la normale Plus de 20 leucocytes isolés et intacts Nombreux leucocytes intacts Paquets de plus de 20 leucocytes agglutinés et altérés Nombreux leucocytes altérés et présence de pus Paquets de plus de 50 leucocytes agglutinés et altérés Pus abondant Chez l’enfant : Garçon : 0-10 Fille : 0-50 Rares leucocytes (=valeurs normales) L’expression quantitative des hématies se fait par le même procédé : Nombre d’hématies observées par champ microscopique Expression du résultat sur la fiche d’examen 0-5 Rares hématies (= valeur normale) 5-10 Hématies en quantité un peu supérieur à la normale 10-20 Hématies assez nombreuses Supérieur à 20 Nombreuses hématies c- Description des éléments de l’urine sur une préparation à l’état frais L’examen de l’urine totale entre lame et lamelle (à x 40) permet de distinguer les éléments suivants : 1- Les leucocytes Lorsqu’ils sont intacts, ils se présentent comme des disques granuleux à l’intérieur desquels le noyau apparaît plus réfringent ; lorsqu’ils sont altérés, les leucocytes ont des contours irréguliers, fripés. La présence de leucocytes dans les urines signe l’existence d’une réaction inflammatoire. Cependant de véritables réactions inflammatoires peuvent ne pas s’accompagner d’une leucocyturie élevée (foyer inflammatoire bien circonscrit, dilution des urines, lyses des leucocytes dans l’échantillon) La présence de leucocytes en amas témoigne de l’ouverture d’un foyer inflammatoire (micro-abcés). L’altération des leucocytes peut être liée à de mauvaises conditions de conservation du prélèvement avant son examen. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 28 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 2- Les hématies : Intactes , elles se présentent comme de petits disques de sept mm de diamètre aux bords plus réfringents ; altérées, elles ont un aspect en oursin : petits disques de cinq à six mm de diamètre, hérissées de spicules périphériques. La présence d’hématies témoigne d’une lésion des muqueuses de l’appareil urinaire. Au-delà de 5 hématies par champs, le passage des globules rouges dans les urines peut être considéré comme pathologique ; les hématies intactes ont une forte probabilité de provenir de la vessie ou de l’urètre. Les hématies altérées viennent du rein. L’hématurie s’observe : - dans les formes hémorragiques des néphrites : on pourra alors découvrir des cylindres hématiques à l’examen du sédiment. - dans le cas d’une atteinte glomérulaire. - dans les cystites hémorragiques tuberculeuses, gonococciques, à germes banaux. - dans la tuberculose rénale. - l’hématurie peut être associée à d’autre affections d’étiologie non infectieuse : cancer, lithiase rénale, tumeurs de la vessie. 3- Les cellules épithéliales : Peuvent être observées dans les urines : des cellules rénales, urétérales vésicales et urétrales. 4- Les cylindres Cylindres granuleux Cylindres hyalins Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 29 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Les cylindres sont des éléments de grande taille épousant la forme d’une partie du tubule rénal. Ils sont repérés à partir d’un examen entre lame et lamelle de l’urine totale à l’objectif x 10. Ils peuvent être exclusivement protéiques : Les cylindres hyalins. Ou alors plus rarement, ils peuvent provenir de la dégénérescence de cellules épithéliale : les cylindres granuleux. Une cylindrurie n’a pas une grande signification. On peut l’observer chez des individus normaux lorsque l’urine est très concentrée ou très acide, ou encore après un effort musculaire très intense. L’excrétion de cylindres hyalins peut accompagner d’autre part n’importe quelle protéinurie quelle qu’en soit l’origine. En règle générale la présence de cylindres signe une atteinte tubulaire. L’observation de cylindres hyalins en nombre important indique, par contre, une affection sévère du parenchyme rénal. La présence de cylindres granuleux est presque toujours pathologique et signe alors une néphrite grave. 5- Les cristaux urinaires L’urine contient des substances peu solubles qui s’y trouvent pratiquement à l’état de solution saturée. Dans le cas d’une excrétion accrue de ces substances, celles-ci peuvent précipiter sous forme cristalline et on les retrouve dans l’urine. Les cristaux observés peuvent correspondre à un constituant normal de l’urine ou bien à un métabolite anormal dont elle est physiologiquement dépourvue. Certains cristaux sont retrouvés exclusivement dans une urine acide et d’autres dans une urine alcaline. Les cristaux amorphes sont souvent identifiés par le pH. Ainsi, si l’urine est alcaline, on identifie des phosphates amorphes, tandis que si elle est acide, on identifie des urates amorphes. Cette pratique est un peu risquée, car les phosphates amorphes et les triples phosphates sont possibles à un pH légèrement acide (6,5). Certaines situations cliniques, qui peuvent expliquer la formation de calculs, sont aussi susceptibles de favoriser la formation de cristaux. PH alcalin Phosphates amorphes Triple phosphates Biurate d’ammonium Phosphate de calcium Carbonate de calcium Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines pH acide Urates amorphes Acide urique Oxalates de calcium Cystine 30 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 - Cristaux de substances présents dans l’urine normale : Des cristaux assez fréquents : - Oxalate de calcium : en forme d’enveloppe de lettre ou en cacahuète. - Acide urique : en losange, en carré, en fleur, en fins filaments rassemblés de couleur jaune ou brun rougeâtre. - Urates ammoniacaux magnésiens : en glomérules hérissés de pointe ou en paquets d’aiguille, jaune. - Phosphate triple : en couvercle de cercueil, en feuille de fougère, incolore réfringents. Des cristaux moins fréquents : - Carbonate de calcium : très petits cristaux groupés par deux, ovoïdes, solubles dans l’acide acétique, incolores. - Sulfate de calcium : lames plates et longues isolées ou en paquets (urine acide). - Phosphate bi calcique : amas de lames en étoiles, incolores (urine alcaline ou neutre). Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 31 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 L’observation en quantité importante de cristaux correspondant à une de ces substances doit être signalée. Elle peut être liée à une lithiase. Leur élimination en petite quantité n’a pas grande signification. Cristaux de substances anormalement présentes dans l’urine. - Leucine : cristaux jaunâtres, de forme ronde avec nombreuses situations radiales (affection hépatique grave). - Tyrosine : cristaux longs et fins, aiguilles en bottes de foin (affection hépatique grave). - Cystine : lames hexagonales incolores et très réfringentes (maladie héréditaire cystinurie). - Sulfamides : retrouvés chez des malades traités aux sulfamides, leurs présences peuvent endommager le rein. - Cholestérol : plaque carrée avec coté en escalier, soluble dans l’éther. - Elément minéraux amorphes Sont de deux types : • Phosphates amorphes : petites granulations blanchâtres (Culot blanchâtre, urine alcaline ou neutre) • Urates amorphes : petits grains jaunâtres rassemblés en amas plus denses et plus larges que les phosphates (Culot rosé, urine acide) Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 32 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 6- Les bactéries : A l’état frais on peut apprécier la présence éventuelle de bactéries, leurs formes (cocci ou bacilles) et leurs mobilités. 7- Les parasites : - Trichomonas vaginalis : parasite protozoaire globuleux, d’un diamètre de 15 µm en moyenne, mobile dans les urines fraîches ou il se déplace en tourbillonnant grâce à une membrane ondulante et 4 flagelles. - Œufs de Schistosoma haematobium. 8- Autres éléments : - Levures : Elles présentent à l’état frais une forme sphérique ou ovalaire, de taille variable (5 à 12 mm). Certaines montrent un bourgeonnement à l’un de leur pôle. - Spermatozoïdes : Peuvent être observés dans les urines fraîches. Mobiles, ils sont constitués d’une très petite tête (5 mm) prolongée d’un long flagelle souple de 50 mm. Examen direct après coloration Le Bleu de méthylèn(BM) Permet la différenciation des leucocytes (aspect morphologique), permet de visualiser la disposition des bactéries dans les cellules (intra ou extra cellulaire) et aussi d’apprécier le mode de groupement des bactéries. C’est une technique semi quantitative des éléments cellulaires. Les levures sont bien appréciées au BM. Un frottis confectionné a partir de l’urine totale bien mélangée, est séché et fixé puis coloré au BM ; ce frottis permet l’examen des éléments cellulaires dans des conditions moins traumatisantes que le Gram. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 33 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Le GRAM Permet d’apprécier l’importance de la population bactérienne, son caractère monomorphe ou polymorphe et la morphologie des bactéries : cocci ou bacille à Gram positif ou à Gram négatif (aspect morpho-tinctorial) et le mode de groupement des cocci. (Orientation pour la culture). Une goutte (10 ou 50 ul) d’urine non centrifugée est déposée sur une lame et séchée à l’air sans étalement, fixée puis colorée au Gram. (Une grande concentration de bactéries va migrer vers le sommet de la goutte). Une bactériurie significative : N ≥ 2 bactéries / champ Une pyurie significative : N > 10 leucocytes / champ correspondant à 104/ml Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 34 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 CULTURE Techniques d’ensemencement 1- Méthode de référence : Méthode de KASS Modifiée - Déscription de la technique 0.1 ml d’urine bien mélangée est diluée dans 9.9 ml d’eau distillée stérile à l’aide d’une pipette calibrée à 0.1 ml ; puis 0.1 ml de cette dilution est ensuite aussitot étalée sur une gélose nutritive avec un râteau préalablement stérilisé. Une double dilution de l’urine est effectuée dans certaines situations : sondés et paraplégiques. (Voir annexe pour schéma des dilutions). On ensemence parallèlement l’urine non diluée sur un milieu sélectif (hektoene ou BCP ou Mac Conkey qui permet d’inhiber l’envahissement du proteus) ou enrichie (Gélose au sang) dans le cas ou on suspecte à l’examen direct ou au Gram des germes exigeants ou déficients. - Lecture : La numération se fait selon la formule de Kass : Ou : N=n.102 .10 bactérie / ml n : Nombre de colonie sur la boîte. 2 10 : Inverse de la dilution. 10 : Inverse de l’inoculum. Nombre de colonie : - 1-9 10-99 + 100 : 103 Bact/ml Numération négative : 104 Bact/ml Numération douteuse : 105 Bact/ml Numération positive Interprétation : UFC=Unités formant colonie Chaque colonie qui pousse à partir de l’urine diluée correspond à 1000 UFC dans 01 ml d’échantillon. Une bactériurie significative est considérée devant une numération > 100 colonies sur gélose nutritive ce qui correspond à > 10 5 UFC / ml. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 35 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 2- Méthode à l’anse calibrée - Déscription de la technique Une anse calibrée à 10 µl est utilisée pour ensemencer les géloses nutritives et sélectives. On prélève verticalement avec l’anse calibrée et par capillarité une goutte d’urine que l’on ensemence par stries sur la boîte de gélose : une strie centrale est ensemencée puis perpendiculairement réaliser un isolement de haut en bas de la boite en desserant légèrement les dernières stires. (Voir annexe pour schéma). - Avantages Simplifie la technique de Kass en évitant les dilutions de l’urine. Cette technique permet de bien séparer les colonies pour ensuite bien les compter. Diminution du coût. - Inconvénients Dans le cas de l’utilisation d’une anse calibrée en fil de platine, le volume délivré par celle ci doit être régulièrement contrôlé (courbe d’étalonnage au Bleu d’Evans). En effet après un grand nombre d’utilisation la calibration de l’anse peut être modifiée (corrosion, stérilisation du matériel). - Interprétation Chaque colonie isolée correspond à une concentration de 103 Unités viables / ml urine. La numération bactérienne est comparée à l’abaque de lécture correspondant aux différentes concentrations de bactéries/ml d’urines. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 36 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 3- Lames immergées - Description de la technique Une lame porte objet munie d’un quadrillage en relief est recouverte de gélose CLED(Cystine – Lactose – Electrolyte – Déficient) sur une face et de gélose Mac Conkey sur l’autre. L’intérêt de la gélose de Mac Conkey est d’inhiber les bactéries à Gram+ et le développement en nappe des Proteus. La lame est conservée dans un flacon cylindrique stérile en matière plastique. Elle est fixée au couvercle du même flacon. - Utilisation Saisir la lame par l’intermédiaire du couvercle auquelle elle est fixée, immerger complètement les deux faces, retirer immédiatement, laisser égoutter l’excès. Incubation 18 à 24 heures à 35°C. - Lecture et Interprétation La lecture est faite sur la gélose CLED (face verte) en comparant la densité des colonies présentes sur chaque face avec une série de reproductions étalons correspondant à : 103, 104, 105, 106, 107 bactéries/ml d’urine. - Avantages et inconvénients La gélose CLED (Cystine – Lactose – Electrolyte – Déficient) : - Milieu peu sélectif. - Indicateur coloré (Bleu de bromothymol) variation de pH après consommation du milieu (Lactose) par les bactéries. - Aspect des colonies oriente l’identification des germes mais le diagnostic est présomptif et devra toujours être confirmé par une identification complète biochimique. - Inhibition de l’envahissement de Proteus par la faible teneur en électrolytes. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 37 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 4- Tests rapides Ces techniques de détection rapide de la bactériurie consistent soit à mettre en évidence la présence d’enzymes bactériennes, soit à détecter précocement la croissance bactérienne : - Détection précoce de la croissance bactérienne : Se fait grâce à des automates qui enregistrent en continue l’augmentation de la masse bactérienne dans un milieu standard incubé à 35°C avec parfois une agitation pour accélérer la croissance. La détection des bactéries se fait le plus souvent par turbidimétrie mais peut également faire appel à la bioluminescence (mesure de l’ATP bactérien) ou à la radiométrie (détection du C14 du CO2). Le rapport qualité / coût de ces méthodes est médiocre et elles sont peu utilisées. - Méthode de criblage rapide : Consiste à rechercher simultanément une bactériurie et une leucocyturie par détection dans les urines d’enzymes bactériennes (nitrate réductase) et leucocytaire (leucocytes estérases). Ces méthodes qui donnent un résultat en quelques minutes par immersion dans l’urine de bandelette réactives, sont simples et peu coûteuses. Cependant, elles ne doivent être utilisées qu’à deux conditions : - Elles doivent détecter simultanément une bactériurie et une leucocyturie - Elles ne doivent être utilisées que pour dépister les urines négatives (bactériurie et leucocyturie négatives). Ces échantillons pourront ne pas être examinés sauf exception et dans ce cas, un ECBU classique devra être effectué. Exemple : MULTISTIX®, URITEST 2®, NEPHUR TEST®. - Principes : Permettent de rechercher simultanément : • Nitrate-réductase (Test de Griess), enzyme produite par les entérobactéries. • Leucocyte-estérase (Test de la LE) produite par les polynucléaires endommagés présents dans les urines infectées. • Lorsque la bandelette se positive, elle démontre une hématurie et une leucocyturie. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 38 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 - Avantages des Bandelettes urinaires Les méthodes de criblages rapides ont un bon pouvoir prédictif négatif et permettent de réduire de 30% environ le nombre d’ECBU réalisés au laboratoire. - Inconvénients : Les bactéries â Gram positif et les Pseudomonas ne possèdent pas de nitrate-réductase, On ne peut pas révéler (<104 bactéries/ml). La spécificité varie de 82 à 98% (insuffisant pour de réelles infections urinaires). les Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines infections à faible inoculum 39 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 5- Techniques à base de milieux chromogéniques Ces techniques permettent l’ensemencement par technique à l’anse calibrée de l’urine sur des milieux gélosés contenant des chromogènes mettant en évidence certains genres et espèces bactériennes grâce à l’aspect des colonies, ce qui permet une identification et une orientation diagnostic avec un gain de temps non négligeable - Principe du substrat chromogène * Analogue structural d’une molécule naturellement clivée par une enzyme bactérienne ou fongique. * Initialement le substrat ne possède aucune propriété. Après clivage l’aglycone libéré acquiert des propriétés chromogéniques, il précipite sans diffuser dans la gélose afin de permettre une bonne différenciation des colonies dans une culture plurimicrobienne. Sur les premiers milieux chromogènes fabriqués, le substrat diffusait dans la gélose ce qui ne permettait pas une bonne distinction des colonies - Activités enzymatiques utilisées dans les milieux de culture chromogèniques - D-glucuronidase ou -D-galactosidase : spécifiques d’Escherichia coli. - D-glucosidases : spécifiques d’Enterococcus spp. , et groupe KES-C (Klebsiell spp. - Enterobacter spp. - Serratia spp. - Citrobacter spp.). - Tryptophane déaminase : spécifique du groupe Proteus / Morganella Providencia. - D-galactosaminidase : spécifique de Candida albicans. - Parmis ces produits nous avons : Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 40 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Chromagar Orientation (Becton Dickinson) - Milieu non sélectif. - Enzymes utilisées : D-glucosidase, D-galactosidase Tryptophane desaminase (test complémentaire) - Substances nutritives fournies par des peptones sélectionnées, sources d’électrolytes limités (réduction du nombre d’espèces de Proteus). - Conservation : + 2 à 8 °C à l’abri de la lumière. - Ensemencement par öse calibrée pour permettre la numération bactérienne (comparaison avec brochure). - Incubation 35 +/- 2°C en aérobie 20 à 24 heures. - Identification : Directe sur boîte de : E.coli, entérocoques et la plupart des souches de S. saprophyticus. Par décoloration du milieu de : KES (Klebsiella-EnterobacterSerratia) et PMP (Proteus-Morganella-Providencia). Les autres pathogènes urinaires ne pourront être identifiés qu’avec des tests biochimiques. - Tests de confirmation Indispensable pour différencier Enterococcus sp et Streptococcus agalactiae (test pyroglutamate) et le groupe PMP (test à indole par DMCA : diméthylaminocinnamaldéhyde) ; conseillé pour E.coli - Limites : - Ne permet pas la croissance d’organismes exigeants (Neisseria, Haemophilus, Mycoplasma). - Pas d’identification directe des autres bactéries à Gram négatif. - Aeromonas hydrophila peut produire des colonies roses similaires à E.coli (nécessité du test indole). Uriselect 4 (BIO RAD) - Principe identique avec utilisation des enzymes D-glucosidase, D-galactosidase et tryptophane désaminase (test complémentaire). - Milieu gris opaque (lecture plus difficile pour certains techniciens). - Limites : - Quelques souches de staphylocoques peuvent être inhibées. - Quelques souches de levures ne se développent pas. - Queleques souches de Citrobacter spp indologènes dépourvues de D-galactosidase peuvent pousser comme une E.coli (colonies roses). Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 41 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 - UTI 4 (OXOID) - Principe identique avec utilisation des enzymes D-glucosidase, D-galactosidase et tryptophane désaminase (test complémentaire). - CPS ID 2 (bioMérieux) - Principe identique avec utilisation des enzymes D-glucuronidase, D-glucuronosidase et tryptophane désaminase. Comparaison des milieux chromogènes aux milieux non chromogènes (Etude comparative au laboratoire de microbiologie du Centre Pierre et Marie Curie d’Alger CPMC 2004) Une étude réalisée au laboratoire de microbiologie du CPMC sur une période de 2 mois (Nombre d’échantillons = 100) comparant le milieu chromogène : Uriselect 4 aux milieux classiques : gélose nutritive(numération bactérienne) et hektoene(isolement) a démontré des sensibilités équivalentes concernant le taux de détection et le compte bactérien. Ces milieux peuvent donc être utilisés pour l’ensemencement primaire des urines. Ils ont surtout démontré leur supériorité pour la détection des urines pluri microbiennes par rapport aux milieux classiques. - Limites : - Vu la couleur du milieu : gris ce qui rend l’appréciation des couleurs produites par les colonies différente selon les techniciens - Les IU à levure ne sont pas détectées - Préparation du milieu nécessite une rigueur quand à l’utilisation de la verrerie stérile, autoclavage et du stockage. En résumé, les milieux chromogènes présentent les caractères suivants : Même capacité à détecter les germes urinaires communs du tractus urinaire que l’association de deux milieux non chromogènes. Les milieux chromogènes peuvent donc être utilisés comme milieu primaire d’isolement pour les cultures d’urines. Ces milieux permettent une meilleure discrimination des colonies donc une meilleure sensibilité de détection des urines poly-microbiennes, ceci les rend plus faciles à utiliser pour les personnes ayant peu d’expérience. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 42 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Ils permettent une identification directe de E. coli, Enterrococcus spp et Proteus mirabilis. L’ensemble de ces germes est retrouvé à environ 60 % en milieu hospitalier. Cette identification rapide de E. coli, Enterrococcus spp et Proteus mirabilis, présente des avantages cliniques puisque le résultat est rendu plus rapidement au clinicien. Tous ces milieux inhibent l’envahissement par Proteus. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 43 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Choix des milieux de culture 1- Milieux pour numération bactérienne Les milieux utilisés doivent permettre une numération des bactéries les plus fréquemment rencontrées, c’est à dire les entérobactéries, les Pseudomonas , les Staphylocoques et les entérocoques qui sont toutes des bactéries peu exigeantes et à cultures rapides En routine on utilise une gélose nutritive (GN), Un milieu Cysteine Lactose Electrolytes Déficient (CLED). 2- Milieux d’isolement On utilise pour l’isolement des bactéries peu exigeantes, des milieux sélectifs tels que : gélose lactosée au bromocrésol pourpre (BCP), milieu de Mac Conkey qui permet d’inhiber les bactéries à Gram+ et le développement en nappe du Proteus et le milieu Hektoène (milieu lactosé). Si on suspecte des bactéries à croissance difficile, d’autres milieux de culture devront être utilisés. Une gélose au sang frais ou cuit peut permettre d’isoler des Streptocoques ou des Haemophilus. Un milieu Loweinstein Jensen pour les Mycobactéries, Une gélose Columbia au sang pour une recherche exceptionnelle d’anaérobies strictes. BCP : Gélose lactosée au bromocrésol pourpre. Milieux non inhibiteur. Les germes fermentant le lactose sont reconnus par une coloration jaune témoin de l’acidification du milieu. Gélose Mac Conkey : Milieu sélectif. Gélose lactosée au rouge neutre (indicateur de pH coloré mettant en évidence la fermentation du lactose par les bactéries). Présence de sels biliaires évitant l’envahissement par Proteus et de cristal violet inhibant la croissance des germes à Gram positif en Europe ; attention aux Etats Unis, les géloses Mac Conkey ne contiennent pas de cristal violet. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 44 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Gélose au sang : - Milieu non sélectif, sans indicateur coloré. - Convient pour la culture des germes exigeants et hémolytiques. - Si on veut inhiber l’envahissement des Proteus, on peut, lors de l’ensemencement, mettre un peu d’alcool dans le couvercle de la boîte. - L’association acide nalidixique + colistine (ANC) inhibe les bactéries â Gram négatif et les Bacillus. - Milieu adapté à la culture des bactéries à Gram positif notamment les streptocoques. Incubation L’incubation des milieux se fait à 35°C pendant 18-24 h à l’étuve. L’atmosphère d’incubation pour les milieux enrichis se fait sous CO2 et en anaérobiose pour la recherche de germes anaérobies strictes. La durée d’incubation peut être prolongée pour la recherche de germes à croissance difficile : anaérobies jusqu’à 72 h voir une semaine et Mycobactéries une semaine jusqu’à 1 mois. Aspect des colonies 1- Milieux usuels - Entérobactéries : Colonies de 1 à 3 mm de diamètre généralement bombées , lisses et brillantes , opaques et blanchâtres. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 45 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Les aspects particuliers - Proteus vulgaris et mirabilis : envahissement de la gélose en voile montrant des vagues successives - Salmonella donne des colonies petites et transparentes, à centre noir sur milieu hektoene - Serratia donne des colonies pigmentées en rouge sur gélose nutritive - P.aeruginosa donne de petites colonies plates et pigmentées en vert sur gélose nutritive. - Les Staphylocoques : Colonies volumineuses éventuellement pigmentées en jaune pour S.aureus sur gélose nutritive. - Les Streptocoques : nutritive. Fines colonies Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines transparentes sur gélose 46 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 2- Milieux spécifiques - Gélose au sang frais :(GSF) - Les Staphylocoques et les Streptocoques : peuvent faire apparaître sur GSF une hémolyse bêta = halo clair autour de la colonie. - Gélose chromogène : Les colonies apparaissent colorées (la couleur dépend du type de milieux chromogène utilisé). Exp colonies sur Uriselect 4 (Bio rad) E.coli + E.faecalis - K.pneumoniae Gélose Loweinstein Jensen Dans le cas d’une tuberculose urinaire, les colonies de Mycobactérium tuberculosis apparaissent sur ce milieu de couleur beige clair, chamois avec un aspect de chou fleur. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 47 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Identification biochimique des colonies 1- Caractères biochimiques d’orientation rapide Oxydase Principe : L’oxydase cytochrome assure la moléculaire sur le cytochrome réduit. fixation de l’oxygène On met une colonie en présence de la NN-dimethylparaphénylène-diamine réduite et incolore soit en solution, soit en imprégnant un disque de papier buvard et en le desséchant. Cette enzyme possède la capacité d’oxyder la NN-dimethylparaphénylène-diamine réduit et incolore en dérivé semi quinonique rose violacé. Technique : - Sur une lame propre et dégraissée (se trouvant à l’intérieur d’une boîte de Petri vide), déposer dans un angle une goutte d’eau distillée à l’aide d’une pipette Pasteur. - A l’aide d’une pince en plastique, saisir un disque pour la recherche d’oxydase, réhydrater avec de l’eau distillée et le déposer au milieu de la lame, veiller à ce que le liquide ne déborde pas du disque. - Avec une pipette Pasteur boutonnée, prélever un peu de culture pure de 18h sur milieu d’isolement et déposer la colonie sur le disque, attendre quelques secondes. Lecture : Oxydase + : le disque devient rose foncé puis violet au niveau du dépôt. Oxydase - : pas de changement de couleur. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 48 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Catalase Principe : Cette enzyme catalyse la dégradation du peroxyde d’hydrogène H2O2 produit toxique du métabolisme aérobie de nombreuses bactéries, en H2O et ½ O2. C’est l’action directe de cette enzyme qui est mise en évidence dans la masse microbienne, cette action est caractérisée par un dégagement gazeux résultant de la décomposition de l’eau oxygénée. Technique : - A l’aide d’une pipette Pasteur déposer au milieu d’une lame propre et dégraissée se trouvant à l’intérieur d’une boîte de Petri vide une goutte d’eau oxygénée. - Avec une pipette boutonnée, prélever un peu de culture pure de 18h sur milieu d’isolement et déposer les bactéries dans l’eau oxygénée. Lecture : Catalase + : Bulles de gaz dans l’eau oxygénée. Catalase - : Pas de dégagement gazeux. 2- Identification classique A l’aide d’une suspension bactérienne, on ensemence des milieux de culture de compositions différentes en tubes permettant de mettre en évidence les principaux caractères biochimiques identifiant les entérobactéries. L’incubation se fait à 35°C pendant 18-24h ; la lecture des caractères se fait selon le tableau 1 (annexe 1). Suivant l’algorythme des principaux caractères biochimiques révélés les bactéries seront identifiées (voir annexe). Chaque milieu utilisé doit au préalable être contrôlé pour éviter les diagnostics éronés. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 49 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 3- Identification rapide (API system) L’API est un système standardisé pour l’identification des bactéries selon les caractères biochimiques. Principe : La galerie API comporte 20 micro tubes contenant des substrats déshydratés. Les micro tubes sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les milieux déshydratés, les réactions produites pendant la période d’incubation se traduisent par des virages colorés spontanés lors de l’addition des réactifs . La lecture de ces réactions se fait à l’aide du tableau de lecture et l’identification est obtenue à l’aide du catalogue analytique ou d’un logiciel d’identification. Technique : A l’aide d’une pipette, prélever 1 à 4 colonies morphologiquement identiques et réaliser une suspension avec le médium (2ml) "solution saline" ou avec l’eau physiologique. Remplir les tubes (et non les cupules) des tests avec la suspension précédente pour éviter la formation de bulles d’air au fond des tubes. Poser la pointe de la pipette sur le coté de la cupule en inclinant légèrement la boîte d’incubation vers l’avant. Remplir les tubes et cupules des tests qui portent un cadre. EX : GLU Remplir d’huile de paraffine les cupules des tests soulignés EX : ADH, urée Remplir d’un peu d’eau la boîte d’incubation pour éviter la dessication lors de l’incubation à 35°C pendant 24h. La lecture : - Apres incubation, la galerie sera lue et les résultats comparés au tableau de lecture. Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées ou révélées par l’addition des réactifs. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 50 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 La lecture automatisée : Il existe un automate pour la lecture des Api System (Biomérieux) en fonction des caractères révélés par la galerie biochimique, ceci constitue un gain de temps pour l’interprétation des galeries Api . Cependant la lecture par cet automate peut poser quelques problèmes lors de la révélation tardive de quelques caractères biochimiques. Interprétation : L’identification est obtenue à partir du profil numérique. Sur la fiche de résultats, les tests sont séparés par groupes de trois et les valeurs 1, 2 ou 4 sont indiquées pour chacun. En additionnant à l’intérieur de chaque groupe les valeurs correspondant à des réactions positives, on obtient 7 chiffres, la réaction de l’oxydase est affectée de la valeur 4 lorsque elle est positive. L’identification est réalisée à l’aide du catalogue analytique (recherche le profil numérique dans la liste des profils). EX : 4144532 => E.Coli 4- Identification des colonies sur milieux chromogènes Arbre décisionnel adapté aux milieux chromogènes utilisant les enzymes ß-glucosidase et ß-D galactosidase (exemple Uriselect 4). Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 51 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 5- Identification antigénique - Sérogroupage des streptocoques Le groupage concerne les streptocoques béta-hémolytiques du groupe A,B,C,Fet G et les streptocoques du groupe D. Le groupage rapide se fait facilement par des techniques d’agglutination au moyen de particules de latex sensibilisées après extraction enzymatique (Slidex strepto kit de Biomérieux). - Sérotypage des Pseudomonas aeruginosa Il s’agit d’un d’un sérotypage de l’antigene O, qui est réalisé grace aux antisérums commercialisés (Diagnostic Pasteur), 16 sérogroupes sont individualisés. La technique est celle de l’agglutination sur lame qui demande quelques minutes pour apparaître. L’intéret du sérotypage des P.aeruginosa est beaucoup plus épidémiologique. 6- Antibiogramme Un antibiogramme est réalisé par méthode de diffusion en disque selon les recommandations du CLSI pour chaque germe isolé (cf. Fasicule de standardisation de l’antibiogramme en médecine humaine à l’echelle nationale 5ème Edition 2008. Chapite II : Examen Cytobactériologique des Urines 52 CHAPITRE III Interprétation de l’ECBU IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Interprétation de l’ECBU L’interprétation de l’examen cytobactériologique des urines doit se faire avec un sens critique et une collaboration étroite entre le clinicien et le microbiologiste et dépend de plusieurs facteurs tels que : • La qualité du prélèvement : respect des conditions d’hygiène, du temps de transport et de la température de conservation de l’échantillon • La technique de prélèvement utilisée (milieu du jet, sonde ….etc.) • le germe ou les germes identifiés (espèce bactérienne et son pouvoir pathogène reconnu) • Etat du malade et de ses antécédents • Renseignements cliniques d’antibiotiques, sonde). • Age du malade (nouveau né, personne âgée, enfant….etc.) (fièvres, brûlures mictionnelles, prise En plus de ces éléments importants l’interprétation dépend également des résultats des différents examens cytologiques et bactériologiques réalisés à partir de l’urine à savoir : - Numération des éléments cellulaires (leucocytes) - Les résultats des examens microscopiques (bleu de méthylène et Gram) - La numération bactérienne, quelque soit la technique choisie L’interprétation des cultures est basée sur les critères de KASS : 1- Bactériurie ≥ 105UFC/ml avec un seul type de bactérie : infection urinaire 2- Bactériurie ≤ 103 UFC/ml : absence d’infection urinaire 3- Bactériurie entre 103 UFC /ml et 105 UFC/ml : zone d’incertitude, elle est fonction de l’espèce bactérienne et du contexte clinique à contrôler si nécessaire. KASS définit un seuil ≥ 105 UFC/ml comme étant significatif, alors que dans plusieurs situations ce taux est revu à la baisse. Chapitre III : Interprétation de l’ECBU 54 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Interprétation selon la bactériurie et la leucocyturie a) Urines du milieu du jet : • Leucocyturie ≤ 104/ml et d’infection urinaire. la bactériurie ≤ 103 UFC/ml : absence • Leucocyturie ≥ 104/ml et la bactériurie ≥ 105UFC/ml, avec un seul type de bactérie, il s’agit d’une infection urinaire certaine. • Leucocyturie ≥ 104/ml et la bactériurie ≥ 105 UFC/ml avec deux types de bactéries chez la femme et un examen direct qui retrouve de nombreuses cellules épithéliales, il s’agit de deux probables possibilités : - Infection génitale. - Infection urinaire mais contaminée Un second prélèvement d’urine est demandé tout en expliquant les modalités de prélèvement. Les prélèvements gynécologie. génitaux sont effectués dans un service de • Leucocyturie ≤ 104/ml et la bactériurie ≥ 105 UFC/ml, avec un seul type de bactérie, c’est une infection urinaire dans les cas suivants : - Femme enceinte : confirmer par un deuxième ECBU. - Immunodéprimé - diabétique - Nourrisson - Personne âgée Ce cas est retrouvé chez 20% de la population, ainsi qu’en début d’infection urinaire, dans ces cas un deuxième prélèvement s’impose dans lequel on doit identifier la même bactérie (genre, espèce et profil antibiotique). Une bactériurie sans leucocyturie peut être également observée lorsque le prélèvement est gardé trop longtemps à +4°C ou lorsque les urines sont hypertonique ou trop alcalines. Ces conditions contribuent à détruire les leucocytes. En cas de non respect des conditions d’hygiène, du temps de transport et de la température de conservation, il peut s’agir d’une contamination bactérienne d’une urine stérile (faux positifs). Dans certains cas il peut s’agir d’une bactériurie asymptomatique (colonisation sans infection). Chapitre III : Interprétation de l’ECBU 55 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 • Leucocyturie ≤ 104/ml ou ≥ 104/ml (présence ou absence de leucocytes) et la bactériurie ≥ 105UFC/ml, avec deux types de bactéries, l’infection urinaire poly microbienne est admise dans les cas suivants : - Uropathie : Reflux vésiculo-urétéral, Maladie de la jonction pyélo-urétérale - Sondé - Paraplégique En dehors des cas cités il peut s’agir d’une souillure, un deuxième prélèvement est demandé au malade en rappelant les modalités de recueil des urines. • Leucocyturie ≤ 104/ml ou ≥ 104/ml (présence ou absence de leucocytes) et la bactériurie ≥ 105UFC/ml, avec plus de deux types de bactéries, la souillure est certaine, un deuxième prélèvement est demandé au malade en rappelant les modalités de recueil des urines. • Leucocyturie ≥ 104/ml et une bactériurie comprise entre 103 105UFC/ml : et - Diurèse abondante à l’origine d’une dilution des bactéries. - Présence dans les urines de substances antibactériennes utilisées pour la toilette - Un PH urinaire bas entrave la multiplication des bactéries - Micro organisme à croissance lente (cocci) - Obstruction urétérale complète - Infection à Pseudomonas sp - Traitement antibiotique en cours • Leucocyturie ≥ 104/ml et une bactériurie ≤ 103 UFC/ml : - Prise d’antibiotique dans les cinq jours qui précèdent le prélèvement on parle d’infection décapitée, refaire le prélèvement 48 h après l’arrêt du traitement si nécessaire, car une seule prise d’antibiotique suffit à décapiter l’infection en 06h à 12h avec conservation des leucocytes. - La coloration de Gram montre une présence de bactéries extracellulaire avec une numération bactérienne inférieure à 103 UFC/ml : infection à anaérobies probable, utiliser les milieux de culture et les techniques de diagnostic adéquates et rechercher le foyer de l’infection (fistule rénale ou digestive). Chapitre III : Interprétation de l’ECBU 56 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 - La coloration au Bleu de méthylène montre une présence de cocci intra et extra leucocytaire : infection à Neisseria gonorrhoeae probable, demander un prélèvement urétral. - Clinique en faveur de bactéries qu’on ne peut mettre en évidence par les techniques classiques : Chlamydia, Mycoplasme, et Mycobactéries. Rechercher ces bactéries par les techniques spécifiques. • La présence de Leucocyturie sans bactériurie peut être observée dans d’autres situations : - Maladie fébrile systémique. - La fièvre chez le nourrisson. - Le rein polykystique, ou les kystes ne communiquent pas avec un système collecteur. - Lithiase rénale ou calculs rénaux. - Néphropathie interstitielle. - Inflammation de l’urothélium par l’action mécanique d’un dispositif (cathéter). - Infection mycosique. - Infection parasitaire : la bilharziose uro-génitale. - Personnes âgées (tumeur vésicale). - Transplanté rénal : les leucocytes type lymphocytes orientent vers une réaction de rejet de greffe. • Depuis les critères de Kass le diagnostic bactériologique de l’infection urinaire est resté basé sur l’association d’une leucocyturie ≥ 104 /ml et surtout d’une bactériurie ≥ 105UFC/ml. Le seuil significatif de la leucocyturie est resté remarquablement consensuel fixé dans tous les écrits à un nombre ≥ 104/ml (10/mm3), par contre le seuil de la bactériurie qui est certes très spécifique manque de sensibilité et doit être aujourd’hui révisé à la baisse dans beaucoup de situations cliniques : - Les infections urinaires récidivantes Bactériurie ≥ 104 UFC/ml - Cystite simple chez la femme de 15-65 ans Bactériurie > 103 UFC/ml pour les coliformes Bactériurie > 104 UFC/ml pour les autres espèces bactériennes - Pyélonéphrite non compliquée Bactériurie ≥ 104 UFC/ml Chapitre III : Interprétation de l’ECBU 57 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 - Prostatites aigues Bactériurie ≥ 104 UFC/ml Pour le diagnostic d’une prostatite aigue l’ECBU est nécessaire mais reste insuffisant, car s’il est négatif il faut réaliser l’analyse fractionnée des urines ainsi que l’analyse des sécertions prostatiques recueillies au méat urétral, après massage de la glande (à éviter en cas de prostatite fèbrile risque de bactériemie). - Prostatites chroniques infectieuses : Le diagnostic est basé sur au moins un des critères suivants selon l’épreuve de Mears et Stamey : ¾ les secrétions prostatiques et les 10 ml d’urine permettant d’obtenir une bactériurie ≥ 103 UFC/ml avec un seul type de bactérie. ¾ les secrétions prostatiques et les 10 ml d’urine éliminés, contiennent la même bactérie que les urines vésicales à savoir du milieu du jet mais à une concentration 10 fois plus importante. Il faut savoir que la technique de Mears et Stamey a ses limites, cette technique ne peut être appliquée lors de poussée infectieuse, car le massage est douleureux et il y a risque de bactériémie. On ne peut prouver la prostatite par cette méthode que si l’urine vésicale est stérile, de plus elle exige un personnel entraîné et un patient coopérant. b) La ponction sus-pubienne : L’interprétation est basée sur la présence de culture bactérienne. La présence d’une seule colonie sans dilution de l’urine signe l’infection urinaire, les bactéries proviennent directement de l’urine vésicale. c) Le sondage vésical La leucocyturie ne constitue pas un facteur prédictif d’infection urinaire chez le malade sondé, elle n’est corrélée à la bactériurie qu’à des concentrations microbiennes supérieures à 107 UFC/ml. La symptomatologie est un critère important pour l’interprétation de l’ECBU chez le porteur de sonde et permet de faire la différence entre la colonisation et l’infection urinaire proprement dite. Selon la conférence de consensus sur les infections urinaires nosocomiales de l’adulte entre la sociéte francaise des pathologies infectieuses et la sociéte francaise d’urologie qui a eu lieu à l’Institut Pasteur de Paris en 2002 : 4 situations peuvent être observées : Chapitre III : Interprétation de l’ECBU 58 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Bactériurie UFC/ml Sonde Symptômes Leucocyturie ≥104 /ml + ou - + + ≥103 Infection certaine - ≥105 1 ou 2 espèces isolées quelque soit l’espèce bactérienne Infection débutante ou sujet neutropénique Infection débutante ou sujet neutropénique colonisation + ou - + + ou - + - ≥103 1 ou 2 espèces isolées uropathogène reconnues (E.coli) + - + ou - Seuil de détection ≥103 Interprétation Cette interprétation n’est valable que si les conditions de prélèvement sur sonde sont respectées. Si la bactériurie est découverte au moment de l’ablation de la sonde, il est conseillé de réaliser un deuxième prélèvement d’urine 48h plus tard. Rappelons que les urines du sachet collecteur de la sonde ne sont analysées que si le sachet est changé (un sachet neuf) et ne reste en place que 20 à 30 minutes, de même la culture de la sonde est proscrite (colonisation de la sonde ne veut pas dire que ces bactéries sont dans l’urine vésicale). Chapitre III : Interprétation de l’ECBU 59 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Interprétation selon les germes L’identification de la bactérie mérite aussi une interprétation lorsque le germe n’appartient pas à une espèce courante de l’infection urinaire, en sachant que toute bactérie peut être responsable d’une infection et à l’inverse peut être un contaminant. ¾ Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, et Staphylococcus saprophyticus (chez la femme) sont des germes dont le rôle est bien établi dans l’infection urinaire Les autres germes ne peuvent être incriminés qu’après discussion, à savoir : ¾ Stapylococcus epidermidis n’est incriminé en tant que pathogène qu’en présence de matériel étranger ou après instrumentation au niveau de l’appareil urinaire, car c’est une bactérie de la flore cutanée. Les Staphylocoques coagulase négative sont en nette augmentation dans les infections urinaires, mais ils ne peuvent être incriminés que s’ils sont retrouvés dans un deuxième prélèvement surtout en l’absence de leucocyturie, car ce sont des bactéries de la flore cutanée. ¾ Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus meticillino-résistant sont incriminés avec une numération ≥ 104 UFC/ml dans les cas suivants : - Malade hospitalisé - Prise d’antibiotiques à large spectre - Intervention sur l’arbre urinaire ¾ Staphylococcus aureus peut être isolé lors d’une prostatite. sp, Stenotrophomonas maltophilia, autres ¾ Acinetobacter pseudomondaceae, leur implication en pathologie exige un niveau de bactériurie élevé ≥105 UFC/mL, ainsi qu’une répétition de la positivité des urines à la même bactérie, et cela doit être associé à d’autres critères, cliniques ou inflammatoires. ¾ Streptococcus agalactiae, retrouvé chez la femme enceinte. ¾ Enterobacter sp, Serratia sp., Citrobacter sp et Proteus indole positif sont des bactéries responsables surtout d’infections urinaires nosocomiales, leur isolement en dehors de l’hôpital est à discuter. Ils sont incriminés en ambulatoire suite à une hospitalisation récente ou à Chapitre III : Interprétation de l’ECBU 60 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 une prise d’antibiotiques à large spectre, il ne faut pas hésiter à demander un deuxième prélèvement d’urine au moindre doute surtout en l’absence de leucocyturie. Chez le garçon non circoncis les Proteus retrouvés dans les urines peuvent être une simple souillure liée à l’adhérence préputiale de la bactérie ou de phimosis. ¾ Les entérocoques peuvent être de simples contaminants, seule la présence de signes cliniques de cystite et d’une leucocyturie élevée témoignent d’une infection vraie. ¾ Les lactobacilles, streptocoques α hémolytiques, Gardnerella vaginalis, Bifidobactérium sp, bacilles diphtérimorphes sauf Corynébactérium uréalyticum sont des contaminants qui appartiennent à la flore urétrale ou génitale de proximité. Leur isolement associé à la présence de cellules épithéliales urinaires à l’examen direct des urines signe de façon quasi certaine une contamination à l’occasion du prélèvement. Seul leur isolement à partir d’une ponction d’urine utilisant un cathéter sus pubien pourrait permettre d’évoquer leur rôle pathogène. ¾ Corynébactérium uréalyticum nécessite une incubation de 48 heures. Il est retrouvé dans les infections suite à une greffe du rein ou une intervention urologique. Chapitre III : Interprétation de l’ECBU 61 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Interprétation chez le transplanté rénal Avant la transplantation : Leucocyturie ≤ 104/ml et la bactériurie ≥ 105UFC/ml, avec un seul type de bactérie, est une simple colonisation ne traiter que si le malade est admis à l’hôpital pour intervention. Après la transplantation : L’infection urinaire peut être précoce, en présence d’une sonde urinaire, ou tardive six mois après la greffe d’où la nécessité de réaliser des tests rapides (Multistix) afin de dépister une éventuelle infection urinaire. La présence de nitrites, de leucocytes ou hématies est une indication pour la réalisation d’un ECBU afin de confirmer l’infection urinaire et la traiter. Ce suivi doit être fait durant la première année après la transplantation. Une étude réalisée au CHU de Montpellier a répertorié les principaux agents pathogènes responsables d’infections urinaires chez le transplanté rénal. Micro-organismes Nbre (%) Micro-organismes Nbre (%) Bacilles à Gram négatif 52 (90%) Cocci Gram positif 4 (7%) E. coli 41 (71%) Staphylocoque coagulase-negative 2 (3.5%) E. coli (BLSE) 10 (17.2%) Pseudomonas aeruginosa 6 (10%) Enterococcus faecalis 2 (3.5%) Klebsiella pneumoniae 3 (5%) Morganella morganii 2 (4%) Champignons Candida krusei Virus 1 (1.5%) BK Virus 1 (1.5%) BLSE : Betalactamase à spectre élargi. Chapitre III : Interprétation de l’ECBU 62 CHAPITRE VI Epidémiologie IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Principales étiologies des infections urinaires dans les différents hôpitaux d’Alger CHUBM 2001-2005 N % HCA 2001-2005 N % CHUM 2005 N % EHS KETTAR 2001-2005 N % E. coli 878 62.7 2349 63.69 538 52.03 1411 62.8 Klebsiella spp 166 11.8 439 11.90 182 17.60 258 11.5 Proteus spp 159 11.3 196 5.31 55 5.31 210 9.3 Autres enterobactéries 21 1.5 165 4.47 _ _ 12 0.5 Pseudomonas spp 46 3.3 77 2.09 64 6.18 110 5 Staphylocoque spp 68 5 199 5.40 66 6.38 131 6 Streptocoque spp 31 2.2 192 5.21 37 3.57 46 2 Enterocoque spp 5 0.4 3 0.08 16 1.54 22 1 CHU BM : HCA : CHU M : EHS Kettar : N: Centre hospitalo-universitaire de Beni Messous Hopital central de l’armée Centre hospitalo-universitaire Mustapha Bacha Etablissement hospitalier spécialisé d’EL Kettar Nombre Chapitre VI : Epidémiologie 64 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Répartition des principales étiologies des infections urinaires en fonction des tranches d’âges de sexe et de l’origine du malade dans les hôpitaux d’Alger 0- 2 ANS CHUM HCA CHUBM H(N) 3-6 ANS Ext(N) H(N) 7-15 ANS Ext(N) H(N) ≥ 16 ANS Ext(N) H(N) Ext(N) F M F M F M F M F M F M F M F M E.coli 42 14 21 30 37 17 88 8 112 21 128 8 108 5 138 10 Klebsiella spp 3 19 / 7 6 4 / 2 6 2 14 5 13 / 41 2 Proteus spp 2 8 5 12 2 3 6 6 11 4 8 7 10 / 15 4 Pseudomonas spp 6 2 / 4 1 1 / 3 6 / 2 1 / / / / Staphylocoque spp / / / 2 / / 4 1 / 5 3 9 7 1 27 / Streptocoque spp / 1 / / / / / / 4 3 2 1 1 / / / E.coli 10 19 39 21 24 17 88 14 32 11 99 16 517 235 669 318 Klebsiella spp 5 18 12 9 6 1 6 8 3 10 13 2 117 105 109 76 Proteus spp 3 10 1 9 1 5 6 11 3 10 1 4 40 44 20 56 Pseudomonas spp 1 11 0 4 7 6 5 1 3 1 0 0 50 104 14 21 Staphylocoque spp 0 1 0 1 0 0 1 2 0 2 3 2 33 28 63 24 Streptocoque spp 1 0 2 4 2 1 1 1 2 4 3 0 48 30 49 34 E.coli 10 5 11 14 14 8 22 6 11 3 22 4 26 15 204 45 Klebsiella spp 4 10 1 6 5 5 4 1 0 11 2 2 8 16 37 17 Proteus spp 0 3 1 3 2 4 1 4 0 2 1 0 7 4 4 2 Pseudomonas spp 0 6 0 2 / / 1 0 0 4 1 0 2 13 2 8 Staphylocoque spp 0 1 0 1 1 1 / / / / 1 1 1 2 32 3 Streptocoque spp / / 1 0 / / / / / / / / 0 1 18 5 H : Hospitalisé , ext : externe , F : feminin , M : Masculin, N : nombre Chapitre VI : Epidémiologie 65 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Résistances aux antibiotiques des principaux germes isolés des Urines des différents hopitaux d‘Alger E.coli (CHU-Mustapha) 70 N= 534 66,6 60 50 45,6 40 30 24,4 20 16,9 3,4 10 1,9 5 6,8 0 Taux de résistance % Ampicilline Cefotaxime Ofloxacine Amoxicilline+Ac Clavulanique Gentamicine Cotrimoxazole Cefazoline Amikacine Klebsiella spp (CHU-Mustapha) N= 180 70 63,8 60 50 55,4 40 30 40,9 36,6 35,8 25,5 20 3,9 10 0 Taux de résistance % Amoxicilline+Ac Clavulanique Cotrimoxazole Ofloxacine Chapitre VI : Epidémiologie Cefazoline Gentamicine Cefotaxime Amikacine 66 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 P.mirabilis (EHS EL Kettar) N= 47 Amikacine Amoxicilline+Ac Clavulanique 100 90 91,3 80 86,6 Ampicilline 70 Cefotaxime Cefoxitime 78,5 60 50 54,1 Gentamicine 44,4 40 30 Ticarcilline 20 Cefazoline 4,4 0 10 2,3 8,5 Cotrimoxazole 0 Taux de résistance % Streptocoque spp (EHS EL Kettar) N= 37 30 29,7 25 20 15 11,1 10 0 0 0 5 0 Taux de résistance % Penicilline G Ampicilline Gentamicine HN Erthromycine Vancomycine *HN :Haut niveau Chapitre VI : Epidémiologie 67 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 S.aureus (HCA) N= 14 14 13 12 10 8 7 6 6 6 4 6 4 2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 Amikacine Chloramphenicol Erythromycine Gentamicine Oxacilline Penicilline G Pristinamycine Rifamycine Tetracycline Cotrimoxazole Vancomycine Ac Fusidique Fosfomycine Lincomycine Kanamycine 0 Taux de résistance en Nombre Staphylocoque spp (CHU-Mustapha) N=65 Urine (N=65) 45 40 43,1 35 30 27,3 25 23,8 20 15 14,1 12,1 10 5 3,2 4,6 0 0 Taux de résistance % Penicilline G Oxacilline Gentamicine Kanamycine Erythromycine Lincomycine Tetracycline Vancomycine Chapitre VI : Epidémiologie 68 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 P.aeruginosa (CHU Beni Messous) N= 20 5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 2 1,5 1 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 Taux de résistance en Nombre Ticarcilline Piperacilline Ceftazidime Imipenem Tobramycine Ofloxacine Ciproloxacine Amikacine Chapitre VI : Epidémiologie Gentamicine 69 ANNEXE IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Méthode de KASS modifiée: Anse 0 .1 m l 0 .1 m l E nsem ensem ent a v e c u n ra te a u H K ,B C P ,M c C o n k e y GSF U rin e Is o le m e n t s u r m ilie u x s e le c tifs 9 .9 m l E a u p h y s io lo g iq u e GN N u m é ra tio n b a c té rie n n e Méthode à l’anse calibrée : Anse calibrée à 10 ul Urine Annexe Milieux utilisés selon technique : GN , BCP, Milieux chromogènes 71 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Algorithme pour identification des Cocci Gram + : CGP Catalase r Staphylocoques Coagulase r s S.aureus SCN s Streptocoques Culture sur GN r Esculine(+) BGT+NaCl 6% (+) Enterococcus sp Annexe s Hémolyse béta sur GSF Sérogroupage 72 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 Tableau de lecture des réactions biochimiques sur Api system Tests Urée Indole TDA Négatif Orange Pas d’anneau Marron Résultats Positif Rose Kovacs / immédiat Anneau rouge / rose TDA / immédiat Brun rouge Vp1+vp2 / 10minute VP Incolore RM Incolore TSI (glucose, saccharose, Rouge lactose) Citrate de simmons Vert Disque OPNG Incolore Témoin d’acide amine Violet LDC ODS ADH Annexe Violet Violet Violet Rose / rouge RM / IMMEDIAT Rouge Jaune Bleu Jaune Jaune Zone intermédiaire Jaune Jaune Jaune Violet Violet Violet 73 Références Bibliographiques IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 1- BENSMAN A. Les infections urinaires de l’enfant. La revue du praticien, 2004 ; 54 ; N°3 : 237-242. 2- BOTTO H. Prostatites. La revue du Praticien, 2003 ; 53 ; N°16 : 1785-1789. 3- CARON F. Diagnostic bactériologique et antibiotherapie des infections urinaires. La revue du Praticien,2003 ;53 ;N°16 :1760-1769. 4- CAVALLO JD. Bonne pratique de l’examen cytobactériologique des urines au laboratoire. feuillets de biologie , 1997 ;vol XXXVIII ;N° 215 ; 7-13. 5- CAVALLO JD et Coll. Outils du diagnostic biologique des infections urinaires nosocomiales, analyse critique .Médecine et maladie ifectieuse 2003 ; 33 ; 447-456. 6- COCHAT et Coll. Analyse Pédiatriques, 1998 ; 5 :65-70. 7- COCHAT L. et MARQUET L. Infections urinaires de l’enfant, leucocyturie, Revue du praticien, 2003, 53 : 571-575 8- COURCOL R et Coll. Les difficultés d’interprétation de l’examen cytobactériologique des urines. Revue francaise des laboratoires, Février 2005 : 21-25. 9- FOURCADE R-O, MANSI A.Cystites. La revue du Praticien, 2003 ; 53 ; N°16 :1772-1776. d’urine par bandelette réactive ; Archives 10- GERARD M et Coll. L’infection urinaire du nouveau né. Archives de pédiatrie, 1998 ; 5 ; Suppl 3 : 254-259. 11- GOLDSTEIN FW. Place actuelle des tests rapides de détection de l’infection urinaire. Médecine Maladie infectieuse, 1991 ; 21 : 83-88. 12- GRAF J-D et Coll. Infections urinaires de l’adulte : Quels examens préscrire et comment les interpréter. Médecine et hygiène,1999 ; 57 : 423-425. 13- GUIBERT J. Partenariat clinicien-biologiste devant une infection urinaire. Feuillets de biologie, 1999 ; XXXVI ; N°202 : 9-16. 14- HERVE J et Coll. Infections urinaires du sujet âgé. La presse médicale, 2000 ; 29 ; N°39 : 2137-2141. 15- LECOMTE F. Infections urinaires. La revue du praticien, 1998 ; 12 ; N°416 : 25-43. 16- LUCET J-C. A propos des infections urinaires nosocomiales. Lettre de l’infectiologue : 2003 ; Tome XVIII ; n°4 ; 155-161. 17- LEROY V et Coll. Epidémiologie et diagnostic des infections urinaires. Medecine Thérapeutique -Pédiatrie, 2004 ; vol. 7, n°3 : p 173 – 186. Références Bibliographiques 75 IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009 18- MARIANI-KURKDJAN P. Physiopathologie des infections MédecineThérapeutique-pédiatrie, 2004 ; vol. 7, n° 3 : p 167 – 172. urinaires. 19- MEYRIER A. Infections du haut et du bas appareil urinaire. Revue du praticien,1995 ; 45 : 951-961. 20- MEYRIER A. Pyélonéphrites aigues. La revue du Praticien, 2003 ; 53 ; N°16 : 1777-1784. 21- MOURAD M. et Coll. Complications infectieuses et néoplasiques après transplantation rénale. EMC- Nephrologie 2 , 2005 ; 158-181. 22- MOULIN F et Coll. Infections urinaires nosocomiales : Etude rétrospective dans un hôpital pédiatrique. Archives de pédiatrie, 1998 ; 5 suppl 3 :274-278. 23- RAYMOND J et Coll. Diagnostic microbiologique des infections urinaires chez l’enfant .intérêt des tests rapides. Archives de pédiatrie, 1998 ; 5 ; Suppl 3 : 260-265. 24- REMY G. Prostatites, Revue du Praticien 1990 ; 40 ; 1285-1288 25- TAKAI K et Coll. Urinarytract infection following renal transplantation. Transplantation proceedings,1998;30:3140-3141. 26- VILLEFRANQUE V, COLAU J-C. Infections urinaires au cours de la grossesse. La revue du praticien,2000 ;50 :1379-1382. 27- REMIC 2004. Examen cytobactériologique des urines (E.C.B.U) :13-17. 28- Conférence de consensus co-organisée par la société de pathologie infectieuse de langue francaise(SPILF) et l’association francaise d’urologie (AFU). Infections urinaires nosocomiale,Nov 2002,Institut Pasteur, Paris. 29- CRETEIL JP et Coll. Evaluation d’une technique d’identification et de numération rapide des germes rencontrés dans les infections urinaires. Feuillets de biologie ,1993 ;vol XXXIV;N° 191 30- Utilisation de bandelettes urinaires : File: http://www.bioltrop.fr/13-techbioche/bandelettes-urinaires.htm 31- Les cellules rénales et les cristaux urinaires: http://www.agora.crosemont.qc.ca/urinesediments/docfr/doc_003.htm http://www.agora.crosemont.qc.ca/urinesediments/docfr/doc_004.htm http://www.agora.crosemont.qc.ca/urinesediments/docfr/doc_005.htm Références Bibliographiques 76
