LA SOURIS B7.2 TRANSGÉNIQUE: UN MODÈLE POUR L`ÉTUDE

LA SOURIS B7.2 TRANSGÉNIQUE:
UN MODÈLE POUR L'ÉTUDE DE L'HOMÉOSTASIE DES
LYMPHOCYTES B
JOSÉE PARADIS
DÉPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE ET D'IMMUNOLOGIE
UNIVERSITÉ MCGILL, MONTRÉAL
SEPTEMBRE 2004
MÉMOIRE PRÉSENTÉ EN VUE DE L'OBTENTION
DU DIPLÔME DE MAÎTRISE ÈS SCIENCES
(IMMUNOLOGIE)
© Josée Paradis, 2004.
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•••
Canada
iii
llillJ~~ J)~~ ~illlIIt~~ ............................................ . Page iii
Résumé ................................................................... . Page vi
ilbstract .................................................................. . Page viii
~iste
des tableaux ...................................................... . Page x
~iste
des figures ........................................................ . Page xi
~iste
des abréviations, sigles et symboles ......................... . Page xii
1. Introduction ......................................................... . Page 1
1.1 Le système de costimulation B7/CD28/CTLA-4 .......... . Page 1
1.2 Les effets d'une expression constitutive de la molécule
B7.2 par les lymphocytes B .................................. . Page 5
1.3 Le développement et la maturation des lymphocytes B. ..
Page 9
1.4 But et objectifs de ce projet de maîtrise .................... . Page 12
2.
~atériels
et méthodes ............................................. . Page 14
2.1 Souris ........................................................... , Page 14
2.2 Détermination du génotype des souris ...................... . Page 14
2.3 Préparation des suspensions cellulaires .................... . Page 16
2.4 Marquage des cellules et cytométrie de flux ............... . Page 17
3. Résultats .............................................................. . Page 19
3.1 La déplétion des lymphocytes B chez les souris B7.2
transgéniques est indépendante de la voie apoptotique
TNF/TNFR-l ................................................... Page 19
3.2 Population des lymphocytes B chez les souris B7.2
transgéniques déficientes en CMH de classe 1 ou en
CMH de classe II... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. Page 23
3.3 La déplétion des lymphocytes B dans les souris B7.2
transgéniques ne semble pas être un évènement prénatal. Page 30
3.4 Cinétique de l'ontogénie et analyse phénotypique des
lymphocytes B de la moelle osseuse des souris B7.2
transgéniques de la lignée 27................................. Page 34
iv
3.5 Cinétique de l'ontogénie et analyse phénotypique des
lymphocytes B de la rate des souris B7.2 transgéniques
de la lignée 27................................................ ... Page 37
3.6 Cinétique de l'ontogénie et analyse phénotypique des
lymphocytes B des ganglions lymphatiques des souris
B7.2 transgéniques de la lignée 27........................ ... Page 44
3.7 Retard de la maturation des lymphocytes B chez les
souris B7.2 Tg de la lignée 7 âgées de vingt
Jours.............................................................. Page 51
3.8 La déplétion des lymphocytes B chez les souris B7.2
transgéniques est dépendante de la spécificité
antigénique ...................................................... Page 54
3.9 Immaturité des lymphocytes B chez les souris OT-11
B7.2 double transgéniques âgées de vingt
Jours............... .............................. ................. Page 58
4. Discussion et conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. Page 62
4.1 La contrepartie physiologique de l'étude des souris B7.2
transgéniques................................................... Page 62
4.2 L'implication d'un mécanisme apoptotique dans la
déplétion des lymphocytes B B7.2 transgéniques.........
Page 63
4.3 La participation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ dans
la déplétion des lymphocytes B chez les souris B7.2
transgéniques......... ... ... ... ... ... ... ......... ............... Page 66
4.4 La cinétique de l'ontogénie des lymphocytes B chez les
souris B7.2 transgéniques..................................... Page 67
4.5 L'importance de la spécificité antigénique dans la
déplétion des lymphocytes B B7.2 transgéniques.........
Page 74
4.6 Conclusion...................................................... Page 76
5. Remerciements
Page 78
6. Bibliographie
Page 79
v
7. Annexe 1: Compliance of certification for mouse
methodology workshop............................................................ Page 87
vi
Résumé
La souris B7.2 transgénique:
Un modèle pour l'étude de l'homéostasie des lymphocytes B.
La protéine B7.2, exprimée par les cellules présentatrices de l'antigène,
serait la principale molécule de la famille B7 impliquée dans l'initiation de la
réponse immunitaire dépendante des lymphocytes T par son interaction avec
le récepteur CD28 exprimé à la surface des cellules T. La molécule B7.2 peut
aussi se lier avec le récepteur CTLA-4 qui, contrairement à la molécule
CD28, agit à titre de régulateur négatif de l'activation des lymphocytes T.
Normalement, l'expression de la protéine B7.2 est fortement régulée afin
d'assurer la disponibilité transitoire de ce signal de costimulation menant à
l'activation des lymphocytes T.
Il a été démontré à l'aide de plusieurs
modèles expérimentaux que le blocage du système B7/CD28 prévient
l'initiation de réponses immunitaires contre des molécules exprimées par le
Soi. Il a donc été postulé que l'expression dérégulée de la molécule B7.2 à la
surface des cellules présentatrices de l'antigène pourrait briser la tolérance
vis-à-vis du Soi et induire des désordres auto-immuns systémiques.
C'est en se basant sur cette hypothèse que des souris transgéniques
(Tg), dans lesquelles la molécule B7.2 est exprimée de façon constitutive à la
surface des lymphocytes B, ont été générées. Les souris B7.2 Tg ont révélé
un rôle tout à fait inattendu du système B7.2/CD28 dans le maintien de
l'homéostasie des cellules B. En effet, ces souris présentent une réduction
drastique du nombre de lymphocytes B au niveau de la moelle osseuse et des
organes lymphoïdes périphériques.
Cette déplétion des cellules B est
dépendante de la présence des lymphocytes T et de l'expression du récepteur
CD28.
vii
Le but principal de ce projet de maîtrise était d'étudier plus en
profondeur les processus impliqués dans la déplétion des lymphocytes B chez
les souris B7.2 Tg. Nous avons démontré que la déplétion des lymphocytes B
qui expriment de façon constitutive la molécule B7.2 n'implique pas la voie
apoptotique activée par le TNFR-I et peut être induite par les lymphocytes T
CD8+.
L'étude du développement des lymphocytes B au cours de l'ontogénie a
révélé qu'un défaut de maturation des lymphocytes B se produit très tôt lors
du développement des souris B7.2 Tg. Ce phénotype est observé même chez
les souris B7.2 Tg qui possèdent un répertoire de récepteurs des cellules T
(TcRs) restreint.
Par contre, à l'âge adulte ces souris montrent un
compartiment lymphocytaire B tout à fait normal, contrairement aux souris
B7.2 Tg qui possèdent un répertoire de TcRs polyclonal.
Ces études suggèrent que deux mécanismes immunologiques distincts
sont impliqués dans la déplétion des lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg.
Un premier mécanisme induirait un arrêt de la maturation des lymphocytes B
dans la rate très tôt au cours de l'ontogénie et se produirait même en présence
d'une population de lymphocytes T dont le répertoire de TcRs est restreint.
Le second mécanisme se produirait uniquement en présence d'un répertoire
de TcRs polyclonal, indiquant la nécessité d'une reconnaissance de peptides
du Soi présentés par les molécules du CMH exprimées à la surface des
lymphocytes B par certains TcRs.
viii
Abstract
The B7.2 transgenic mouse:
A model for studing B cell homeostasis.
The B7.2 molecule, which is mainly expressed on antigen-presenting
cells, is well known to provide a costimulatory signal for the initiation of
antigen-specific T cell responses through its interaction with CD28 expressed
on T cells. B7.2 also binds to CTLA-4 which, in contrast to CD28, is a
negative regulator of T cell activation. Normally, tightly regulated expression
of B7.2 ensures the transient availability of this costimulatory signal.
Because blockade of the CD28 pathway was able to inhibit the activation of
self-reactive T cells in several experimental models, it has been postulated
that deregulated expression of B7.2 on antigen-presenting cells may break
self-tolerance and induce systemic auto immune diseases.
To test this hypothesis, transgenic (Tg) mice that constitutively express
the costimulatory ligand B7.2 on B lymphocytes have been generated. These
mice revealed an unforeseen role for the B7.2/CD28 costimulatory pathway
in the maintenance of lymphocyte homeostasis. Adult transgenic mice
expressing constitutively B7.2 on B lymphocytes have very low number of B
cells in bone marrow and peripheral lymphoid organs.
This mechanism
requires the expression of CD28 on syngeneic T lymphocytes.
This master degree project helped us to understand sorne aspects by
which the B7.2/CD28 interaction leads to the B cell elimination in B7.2 Tg
mlce.
First, we show that the TNF/TNFR-I apoptotic pathway is not
involved in the depletion of B7.2 Tg B cells. We report also that the two T
cell subsets, CD4+ and CD8+, are able to mediate the elimination ofB7.2 Tg
B cells. Then, the kinetic of B cell ontogeny in B7.2 Tg mice and their wildtype littermates reveals that, early in life, B7.2 Tg mi ce exhibit a delay in B
ix
cell maturation. This delay in B cell maturation early in ontogeny is also
observed in B7.2 Tg mice that express a monoclonal specificity of the T cell
antigen receptor (TcR) (B7.2/0T-I double Tg mice).
However, adult
B7.2/0T-I double Tg mice have a normal B cell compartment in lymphoid
organs.
From our study, we conclude that there are two mechanisms by which
B7.2/CD28 interaction leads to the depletion of B cells. One involves the
induction of a developmental arrest that can occur even in the presence of a
restricted TcR repertoire. The other involves an active process, which occurs
only in the presence of a polyclonal TcR repertoire. Thus, B7.2/CD28
interaction, in addition to its critical role as a mediator of T cell proliferation
in response to foreign antigens, has a functional role in the regulation of B
cell homeostasis.
x
Liste des tableaux
Tableau 1 Nombres absolus des lymphocytes B de la moelle
osseuse chez différentes souris âgées de vingt jours... Page 59
xi
Liste des figures
Figure 1 Population des lymphocytes B chez les souris B7.2
transgéniques déficientes pour la molécule TNFR-l.... Page 22
Figure 2 Population des lymphocytes B chez les souris B7.2
transgéniques déficientes en CMH de classe II....... .... Page 27
Figure 3 Population des lymphocytes B chez les souris B7.2
transgéniques déficientes en CMH de classe 1.. . . . . . . .... Page 29
Figure 4 Population des lymphocytes B du foie chez les souris
néonatales B7.2 transgéniques.............................. Page 33
Figure 5 Population des lymphocytes B de la moelle osseuse
chez les souris B7.2 transgéniques à différents
âges..................................... ......... ............... Page 36
Figure 6 Population des lymphocytes B de la rate chez les
souris B7.2 transgéniques à différents âges ............... Page 41
Figure 7 Caractérisation phénotypique des lymphocytes B de la
rate des souris B7.2 transgéniques à différents âges.. ... Page 43
Figure 8 Population des lymphocytes B des ganglions
lymphatiques périphériques chez les souris B7.2
transgéniques à différents âges.......................... .... Page 48
Figure 9 Caractérisation phénotypique des lymphocytes B des
ganglions lymphatiques périphériques chez les souris
B7.2 transgéniques à différents âges...................... Page 50
Figure 10 Caractérisation phénotypique des lymphocytes B
chez les souris B7.2 Tg de la lignée 7 âgées de vingt
jours............................................................ Page 53
Figure 11 Population des lymphocytes B chez les souris adultes
OT-IIB7.2 double transgéniques ........................... Page 57
Figure 12 Caractérisation phénotypique des lymphocytes B
chez les souris OT-IIB7.2 db Tg âgées de vingt jours Page 61
XlI
Liste des abréviations, sigles et symboles
ACK: Solution "Ammonium-Chloride Killing"
ADN: Acide désoxyribonucléique
ADNc: Acide désoxyribonucléique complémentaire
ARNm: Acide ribonucléique messager
B7.2 mod: Expression constitutive modérée (moderate) de B7.2
B7.2 hi: Expression constitutive élevée (high) de B7.2
BcR: Récepteur de cellule B (B Cell Receptor)
CD: Groupe de différentiation (Cluster Differentiation)
CLIP: Peptide de la chaîne invariante associée au CHM de classe II (Class
II-Associated Invariant-Chain Peptide)
CMH: Complexe majeur d'histocompatibilité
CPA: Cellule présentatrice de l'antigène
CTLA-4: Antigène 4 associé au lymphocyte cytotoxique (Cytotoxic T
Lymphocyte- Associated Antigen 4)
Ctrl: Contrôle
dbTg: Double transgénique
D.O.: Densité optique
dNTPs: Desoxynucléotides tri-phosphate
FACS: Solution "Fluorescence Activated Cell Sorting"
FSC: Taille cellulaire (Forward scatter)
FasL: Fas ligand
Fc: Région constante de la chaîne lourde d'immunoglobuline
FITC: Fluorescéine isothiocyanate
HBSS : Milieu Hank's Balanced Salts Solution
HSA: Heat-Stable Antigen
Ig: Immunoglobuline
Igll: Chaîne lourde d'immunoglobuline
INF -y: Interféron gamma
IL: Interleukine
L: Ligand
n: Nombre
NK: Cellule Natural Killer
PBS: Tampon phosphate salin
PCR: Réaction de polymérase en chaîne (Polymerase Chain Reaction)
PE: Phycoerythrine
R: Récepteur
SSC: Granulosité cellulaire (Side scatter)
TcR: Récepteur de cellule T (T Cell Receptor)
TE: Tampon Tris-EDTA
Tg: Transgénique
TNF: Facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor)
Va: Chaîne variable alpha du TcR
Vp: Chaîne variable beta du TcR
1. Introduction
1.1 Le système de costimulation B7/CD28/CTLA-4.
Le développement d'une réponse immunitaire acqUIse dépend de
l'activation des lymphocytes T.
L'activation des cellules T requiert un
premier signal, ou signal 1, qui est fourni par le récepteur des cellules T
(TcR) suite à la liaison d'un peptide antigénique présenté par les molécules du
complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe 1 ou de classe II. Un
deuxième signal, ou signal 2, est également nécessaire. Celui-ci est assuré
par des récepteurs dits de costimulation. L'existence du signal 2 permet une
meilleure supervision de la réponse des lymphocytes T, puisque l'absence du
signal de costimulation entraîne l'anergie, un état dans lequel les cellules T ne
sont plus réceptives à une stimulation antigénique (Jenkins et Schwartz,
1987).
La molécule CD28, exprimée constitutivement par la majorité des cellules
T CD4+ et CD8+ naïves, est le récepteur de co stimulation le mieux caractérisé
(Slavik et al., 1999).
La costimulation via la molécule CD28 permet
l'augmentation et le soutien de la réponse des lymphocytes T initiée lors de
l'engagement du TcR par le complexe CMH/peptide.
Le signal via le
récepteur CD28 assure la survie des lymphocytes T par l'induction de gènes
anti-apoptotiques tels que bel-XL (Boise et al., 1995). De plus, il favorise la
prolifération des cellules T par la production d'IL-2, cette dernière résultant
de l'induction de la transcription du gène codant pour cette cytokine et de la
stabilisation de son ARNm (Greenfield et al., 1998). La prolifération des
lymphocytes T est également facilitée par la progression à travers le cycle
cellulaire grâce à l'expression de certaines kinases de la phase G1 (Nagasawa
et al., 1997) et à la dégradation de l'inhibiteur du cycle cellulaire p27Kip
(Firpo et al., 1994). De plus, l'engagement du récepteur CD28 diminue le
seuil d'activation des lymphocytes T en réduisant le nombre de molécules
2
TcR qui doivent être engagées pour induire l'expansion clonale des cellules T
(Viola et Lanzavecchia,
1996).
Ceci
serait le résultat de signaux
intracellulaires induits via le récepteur CD28 qui conduisent à la
réorganisation des microtubules d'actine du cytosquelette et au recrutement de
radeaux lipidiques lors de la formation de la synapse immunologique (Viola
et al., 1999; Wulfing et Davis, 1998). L'importance de la costimulation via le
récepteur CD28 a été démontrée in vivo. En effet, si on empêche l'interaction
de la molécule CD28 avec ses ligands, on prolonge la durée des greffes et on
réduit la sévérité de certaines maladies auto-immunes chez plusieurs modèles
expérimentaux (Salomon et Bluestone, 2001). De plus, on constate, chez les
souris possédant une délétion du gène codant pour le récepteur CD28, une
absence de centres germinatifs lors d'une immunisation avec un antigène
protéique étranger, ce qui indique que le récepteur CD28 est important dans
la collaboration entre les lymphocytes B et les lymphocytes T lors de la
réponse immune (Shahinian et al., 1993; Ferguson et al., 1996).
Paradoxalement,
le
récepteur
CD28,
qm
transmet
des
signaux
intracellulaires lors de l'activation des lymphocytes T qui répondent aux
antigènes du Soi, serait aussi important pour maintenir la tolérance des
lymphocytes T. En effet, on a montré que le récepteur CD28 est nécessaire
pour la génération et/ou la maintenance des cellules T régulatrices, qui sont
d'une importance capitale dans le maintien de la tolérance périphérique (Tang
et al., 2003). Finalement, l'engagement du récepteur CD28 en absence d'un
signal au niveau du TcR pourrait aussi avoir un effet physiologique. Il a en
effet été démontré qu'une stimulation de la molécule CD28 augmente la
transcription des gènes codant pour l'IL-2 et l'IL-4 indépendamment de
l'engagement du TcR (Raab et al., 2001).
Le récepteur CD28 est structurellement homologue à la molécule CTLA-4,
un récepteur exprimé à la surface des cellules T activées par la stimulation de
leurs TcRs (Brunet et al., 1987; Harper et al., 1991).
Contrairement au
3
récepteur CD28, la molécule CTLA-4 agit à titre de régulateur négatif de
l'activation des lymphocytes T. Un des effets de l'engagement du récepteur
CTLA-4 est d'empêcher la transcription du gène codant pour l'IL-2 en
inhibant la translocation du facteur de transcription NF-AT au niveau du
noyau cellulaire (Brunner et al., 1999).
De plus, la costimulation via la
molécule CTLA-4 freine la progression à travers le cycle cellulaire en
inhibant la production de la cycline 03 et des kinases cdk4 et cdk6, ainsi
qu'en empêchant la dégradation de l'inhibiteur p27Kip (Brunner et al., 1999).
Malgré le fait que les récepteurs CD28 et CTLA-4 possèdent des fonctions
opposées, ceux-ci partagent deux ligands communs, soit les molécules B7.l
(CD80) et B7.2 (CD86), qui font partie de la grande famille des molécules B7
(Sharpe et Freeman, 2002).
Les molécules B7.l et B7.2 présentent une
grande homologie structurale et sont exprimées principalement par des
cellules spécialisées dans la présentation de l'antigène (CPA), soit les cellules
dentritiques, les monocytes, les macrophages et les lymphocytes B activés
(Chambers, 2001). La molécule B7.2 est exprimée faiblement à la surface
des CPAs au repos, alors que la protéine B7.1 est absente. Suite à l'activation
des CPAs, l'expression de la molécule B7.2 est rapidement augmentée à leur
surface, alors que la protéine B7.1 est induite plus lentement et est exprimée
sur une plus longue période de temps (expression maximale après 48h versus
4-5 jours, respectivement) (Lenschow et al., 1994). Dans cet ordre d'idées, il
a été démontré que l'expression de la molécule B7.2, contrairement à celle de
la molécule B7.l, est rapidement augmentée à la surface des lymphocytes B
matures suite à l'engagement de leurs récepteurs des cellules B (BcRs) par un
antigène (Lenschow et al., 1994). Il a donc été proposé que B7.2 serait la
principale molécule costimulatrice impliquée dans l'initiation de la réponse
immune dépendante des cellules T via l'interaction avec le récepteur CD28,
alors que l'interaction B7.lICD28 servirait plutôt à soutenir l'activation des
lymphocytes T.
4
Il a récemment été démontré que les molécules B7.1 et B7.2 ne sont pas
seulement exprimées par les lymphocytes B au stade mature. En effet, B7.1
est détectable à la surface des cellules pro-B et pré-B de la moelle osseuse
fraîchement isolées, et l'expression de B7.2 est observée lorsque ces cellules
sont mises en présence d'IL-7 (Gray et al., 2002). De plus, l'expression du
récepteur CD28 a été décelée à la surface des cellules stromales (Gray et al.,
2002). Ces résultats suggèrent que ces molécules co stimulatrices pourraient
jouer un rôle fonctionnel dans le développement des lymphocytes B au
niveau de la moelle osseuse.
Des études récentes indiquent que les protéines B7.1 et B7.2 ne semblent
pas agir uniquement comme ligands pour les récepteurs CD28 et CTLA-4,
mais peuvent aussi générer eux-mêmes des signaux intracellulaires. Il a été
démontré que l'engagement des molécules B7.1 et B7.2 par des anticorps
monoclonaux chez les lymphocytes B purifiés modifie la prolifération des
cellules B induite par différents stimuli, la production d'IgG, l'expression de
molécules anti- et pro-apoptotiques ainsi que la phosphorylation protéique
(Hirokawa et al., 1996; Suvas et al., 2002). D'ailleurs, la molécule B7.2
possède une longue queue cytoplasmique comprenant jusqu'à trois sites
potentiels de phosphorylation par la protéine kinase C ainsi qu'un résidu
tyrosine (Lenschow et al., 1996). De plus, il a été rapporté que B7.2 devient
phosphorylée suite à l'activation des cellules B (Lenschow et al., 1996). Il a
aussi été montré que les molécules B7.1 et B7.2 exprimées à la surface des
cellules dentritiques peuvent délivrer des signaux intracellulaires, qui
conduisent à l'augmentation de la production d'INF-y et de TNF-a
(Grohmann et al., 2002).
5
1.2 Les effets d'une expression constitutive de la molécule B7.2 par les
lymphocytes B.
Il a été mentionné à la section 1.1 que la molécule B7.2 serait la principale
molécule de la famille B7 impliquée dans l'initiation de la réponse
immunitaire dépendante des lymphocytes T. Normalement, l'expression de
la protéine B7.2 est fortement régulée afin d'assurer la disponibilité
transitoire de ce signal de costimulation menant à l'activation des
lymphocytes T. En effet, il a été démontré qu'en absence de lymphocytes T
présentant la spécificité appropriée, l'expression de la molécule B7.2 est
rapidement diminuée à la surface des cellules B matures stimulées in vivo
avec un antigène (Constant, 1999). De plus, l'expression de la protéine B7.2
est réprimée sur les lymphocytes B anergiques spécifiques pour des
molécules du Soi (Hodgkin et Basten, 1995). Il a aussi été publié que la
restauration sélective de l'expression de la molécule B7.2 sur des
lymphocytes B auto-réactifs anergiques amène une prolifération massive et
une production d'anticorps dirigés contre des molécules du Soi durant
l'interaction avec des cellules T CD4+ spécifiques (Rathrnell et al., 1998).
Il a été démontré à de multiples repnses que le blocage du système
B7/CD28 prévient l'initiation de réponses immunitaires contre des molécules
exprimées par le Soi (Salomon et Bluestone, 2001). Une expression accrue
de la molécule B7.2 a en effet été détectée à la surface des lymphocytes B
sanguins chez des patients souffrant du lupus érythémateux disséminé,
maladie qui consiste en une production chronique d'IgG dirigées contre
l'ADN et plusieurs autres molécules exprimées dans le noyau cellulaire
(Folzenlogen et al., 1997; Roth et al., 1997).
De plus, la production
d'anticorps dirigés contre l'ADN chez les souris atteintes du lupus est
dépendante de l'expression de la protéine B7.2 (Nakajima et al., 1995).
6
Par ces observations, il a donc été postulé que l'expression dérégulée de
B7.2 à la surface des cellules présentatrices de l'antigène pourrait briser la
tolérance vis-à-vis du Soi et induire des désordres auto-immuns systémiques.
C'est en se basant sur cette hypothèse que deux groupes de recherche
indépendants ont généré des souris transgéniques dans lesquelles la molécule
B7.2 est exprimée de façon constitutive à la surface des lymphocytes B, et ce
dès les premiers stades de leur développement dans la moelle osseuse
(Fournier et al., 1997; Van Parijs et al., 1997).
Le transgène utilisé par
Fournier et al. contient la région codante de l'ADNc de B7.2 sous le contrôle
transcriptionnel d'un promoteur de la molécule CMH de classe· 1 et d'un
élément "enhancer" de la chaîne lourde Il des immunoglobulines. Ce
transgène permet l'expression constitutive de B7.2 chez les lymphocytes B et
T ainsi que chez les cellules NK (Fournier et al., 1997). Le groupe de Van
Parijs et al. utilise un transgène contenant la région codante de l'ADNc de
B7.2 ou de B7.1 dont la transcription est contrôlée par un promoteur et un
élément "enhancer" de la chaîne lourde Il des immunoglobulines.
L'expression constitutive des molécules B7.2 et B7.l est observée à la
surface des lymphocytes B de la moelle osseuse et des cellules T (Van Parijs
et al., 1997).
Les souris B7.2 Tg générées par Fournier et al. ainsi que par Van Parijs et
al. ont révélé un phénomène tout à fait inattendu.
En effet, les lignées
transgéniques qui expriment de façon constitutive les molécules B7.1 et B7.2
sur les lymphocytes B présentent toutes une réduction drastique de ces
cellules au niveau de la moelle osseuse (Fournier et al., 1997; Van Parijs et
al., 1997). Dans les deux lignées B7.2 trangéniques générées par Fournier et
al., soit les lignées 27 et 7 (expression à la surface des lymphocytes B
matures de la molécule B7.2 à un niveau modéré ou élevé respectivement),
cette déplétion des lymphocytes B de la moelle osseuse conduit à une
diminution marquée des lymphocytes B dans les organes lymphoïdes
périphériques tels que la rate et les ganglions lymphatiques (Fournier et al.,
7
1997). Par contre, les souris transgéniques générées par Van Parij s et al. et
qui expriment de façon constitutive B7.l ou B7.2 dans la moelle osseuse ne
montrent pas de réduction du nombre de lymphocytes B au niveau des
organes lymphoïdes périphériques (Van Parijs et al., 1997). Cette différence
entre les deux systèmes transgéniques n'est pas claire mais pourrait
s'expliquer par le fait que chez les souris générées par Van Parijs et al., une
fraction des précurseurs de cellules B n'expriment pas le transgène et peuvent
migrer vers la périphérie pour compléter leur programme de différentiation.
Selon un mécanisme homéostatique inconnu, ces lymphocytes B pourraient
remplir la niche allouée aux lymphocytes B.
Le mécanisme qui conduit à la déplétion drastique des lymphocytes B dans
les souris B7.2 Tg n'est pas encore complètement connu. Fournier et al. ont
montré que ce processus dépend de la présence des lymphocytes T et de
l'expression du récepteur CD28.
En effet, les souris B7.2 Tg qui sont
déficientes en lymphocytes T (souris B7.2 Tg TcRP -/-) ou dans l'expression
de la molécule CD28 (souris B7.2 Tg CD28 -/-) ont un nombre normal de
lymphocytes B dans la moelle osseuse, la rate et les ganglions lymphatiques
(Fournier et al., 1997). Le transfert de lymphocytes T de type sauvage dans
les souris B7.2 Tg TcRP -/- a conduit à l'élimination des lymphocytes B de la
moelle osseuse, ce qui a permis de montrer que l'expression du transgène
B7.2 par les lymphocytes T n'est pas requise pour l'élimination des
lymphocytes B dans les souris B7.2 Tg (Fournier et al., 1997).
Cette
observation est d'ailleurs supportée par les résultats de Van Parijs et al. qui
montrent que la lignée transgénique exprimant la molécule B7.l uniquement
sur les lymphocytes B et non sur les lymphocytes T présente aussi une perte
importante des lymphocytes B au niveau de la moelle osseuse (Van Parijs et
al., 1997). Le processus d'élimination des lymphocytes B dans les souris
B7.2 Tg implique donc l'interaction entre la molécule B7.2 exprimée par les
lymphocytes B et la molécule CD28 exprimée par les lymphocytes T.
8
Le mécanisme par lequel l'interaction B7.2/CD28 conduit à la perte des
lymphocytes B n'implique pas les molécules Fas et FasL (Fournier et al.,
1997).
Par contre, il est clair qu'il s'agit d'un mécanisme apoptotique
puisque l'expression constitutive de la molécule anti-apoptotique Bcl-2 dans
les lymphocytes B des souris B7.2 Tg permet de restaurer la population de
cellules B dans la moelle osseuse, la rate et les ganglions lymphatiques
périphériques (Blanchette, 2001). Cependant, il est important de préciser que
les lymphocytes B qui se retrouvent dans les organes lymphoïdes
périphériques des souris B7.2 Tg et qui expriment le transgène bcl-2
démontrent en grande majorité un phénotype immature (Blanchette, 2001).
Même si les lymphocytes B sont à peme détectables dans la moelle
osseuse des souris B7.2 Tg, ces animaux ne sont pas tout à fait dépourvus de
lymphocytes B matures dans la rate. L'examen des différents sous-types de
lymphocytes B au niveau splénique a révélé que les populations de cellules B
transitionnelles de type 2 (T2) et folliculaires sont fortement diminuées chez
les souris B7.2 Tg, alors que le nombre de lymphocytes B de la zone
marginale est augmenté chez ces animaux comparativement aux souris de
type sauvage (Blanchette, 2001). De plus, la génération des lymphocytes de
type B-l qui peuplent la cavité péritonéale n'est pas affectée chez les souris
B7.2 Tg (S. Fournier, résultats non-publiés). Ces analyses démontrent que
l'interaction B7.2/CD28
affecte particulièrement la génération d'une
population spécifique de lymphocytes B, soit les lymphocytes B folliculaires.
Ces études révèlent donc que le système B7/CD28, bien connu pour jouer
un rôle important dans l'activation des lymphocytes T, est aussi impliqué
dans la régulation de l'homéostasie des lymphocytes B.
La contrepartie
physiologique du phénomène observé chez les souris B7.2 Tg n'est pas claire.
Il est possible que l'expression des molécules B7.l et/ou B7.2 par les cellules
immatures de la moelle osseuse serve à identifier les cellules répondant aux
antigènes du Soi et à les éliminer.
9
1.3 Le développement et la maturation des lymphocytes B.
Les travaux qui ont conduit à la rédaction de ce mémoire de maîtrise ont
impliqué l'analyse de différentes sous-populations de lymphocytes B. Afin
de faciliter la présentation des résultats expérimentaux, il est opportun de
rappeler les étapes du développement des lymphocytes B. Chacun des stades
du développement des cellules B est caractérisé par le réarrangement
séquentiel et l'expression des gènes codant pour les chaînes lourdes et légères
des immunoglobulines ainsi que par l'expression de différentes molécules de
surface (Hardy et Hayakawa, 2001). La génération des lymphocytes B a lieu
dans le foie foetal et se poursuit par la suite dans la moelle osseuse à la
naissance. Le premier sous-type de lymphocyte B à être généré est la cellule
pro-B,
celle-ci
étant dérivée d'une
cellule
souche hématopoiétique
pluripotente. C'est à ce stade que le réarrangement des différents segments
des gènes codant pour la chaîne lourde des immunoglobulines débute, où les
portions DH et J H se joignent lorsque la cellule pro-B est au stade précoce, et
où les segments VH et DJ H se réarrangent quand la cellule pro-B a atteint le
stade tardif. On assiste alors à l'expression de la chaîne
~,
caractérisant le
second sous-type de lymphocyte B à survenir dans le développement, soit la
cellule pré-B. La cellule pré-B passe par un premier stade dit "cellule pré-B
large", où la chaîne
~
est exprimée à la surface cellulaire en combinaison
avec une chaîne légère substitutive, ce qui forme le pré-BcR. Ensuite, la
cellule pré-B large se divise et devient la cellule "pré-B petite", où le
réarrangement des segments V L et
a lieu.
h de la chaîne légère d'immunoglobuline
Les lymphocytes pro-B et pré-B peuvent se différencier par
l'expression du marqueur CD43, où les cellules pro-B sont CD43+ et les
cellules pré-B CD43-. Dès que l'assemblage d'une chaîne légère est terminé
et qu'une molécule complète d'IgM tenant lieu de récepteur des cellules B
(BcR) est exprimée à la surface cellulaire, la cellule est alors définie en tant
que cellule B immature. Les cellules B immatures sont sujettes à la sélection
négative si leur BcR a la capacité de se lier à des antigènes du Soi.
La
10
délétion des cellules B immatures réagissant contre le Soi peut être évitée par
un mécanisme appelé le traitement du récepteur, qui consiste en un second
réarrangement des gènes codant pour la chaîne légère des immunoglobulines
afin de produire un nouveau BcR. Si, à la suite du traitement du récepteur, la
cellule B immature exprime à nouveau un BcR qui se lie à des antigènes du
Soi, cette cellule B sera exclue du répertoire.
Dans le cas de la
reconnaissance d'un antigène du Soi multivalent (par exemple les molécules
du CMH présentes en grand nombre à la surface cellulaire), la cellule B
immature mourra par apoptose; si l'antigène du Soi est soluble, la cellule
pourra migrer en périphérie mais sera anergique (Janeway et al., 2001). Les
cellules B immatures ne réagissant pas contre le Soi quittent la moelle
osseuse et poursuivent leur maturation en périphérie au niveau de la rate.
Il existe quatre sous-types de lymphocytes B au niveau splénique:
les
cellules B transitionnelles de type 1 (Tl), les cellules B transitionnelles de
type 2 (T2), les cellules B folliculaires et les cellules B de la zone marginale
(Loder et al., 1999).
Ces différentes sous-populations de lymphocytes B
peuvent se différencier par l'expression différentielle des molécules IgM,
CD21 et CD23. Les lymphocytes B Tl (IgMéleVé CD21" CD23-) représentent
les cellules B nouvellement émigrées de la moelle osseuse. Si elles reçoivent
les signaux appropriés, ces cellules B Tl se développent alors en cellules B
T2 (IgMéleVé CD21 élevé CD23élevé).
Ces signaux sont jusqu'à présent
indéterminés, mais la différentiation des cellules B Tl en cellules B T2 serait
dépendante d'un signal au BcR (Loder et al., 1999).
Les cellules B T2
migrent dans les follicules et se différencient en cellules B folliculaires (IgM+
CD21 + CD23élevé).
Les lymphocytes B folliculaires pourraient également
avoir comme précurseurs les cellules B Tl (Loder et al., 1999). Finalement,
l'origine des cellules B de la zone marginale (IgMéleVé CD21 élevé CD23 bas)
reste obscure: elles pourraient dériver des cellules B T2 (Roark et al., 1998;
Amano et al., 1998), des lymphocytes B folliculaires (Dammers et al., 1999)
ou avoir pour origine le foie fœtal (Carvalho et al., 2001).
Il
Les lymphocytes B folliculaires et les cellules B de la zone marginale
représentent les deux populations de lymphocytes B matures au niveau
splénique.
Ces
deux
populations
de
lymphocytes
B correspondent
respectivement à 80-90 % et 5-10 % des cellules B comprises dans la rate
d'une souris adulte (Oliver et al., 1997). Les lymphocytes B folliculaires sont
juxtaposés aux gaines lymphoïdes périartériolaires de la pulpe blanche, celleci composée en majorité de cellules T. Les cellules B folliculaires peuvent
donc facilement participer à la réponse immunitaire dépendante des cellules T
(Liu et Arpin, 1997). Les lymphocytes B de la zone marginale, comme leur
nom l'indique, sont situés dans la zone marginale à proximité du sinus
marginal et d'une panoplie de macrophages bordant les follicules (Martin et
Keamey, 2000).
Par leur situation anatomique, les cellules B de la zone
marginale sont exposées aux antigènes véhiculés par la circulation sanguine
et font partie de la première ligne de défense dans les réponses immunes
indépendantes des lymphocytes T contre les antigènes bactériens (Martin et
al., 2001; Balâzs et al., 2002).
Les lymphocytes B folliculaires ne sont pas sessiles, mais font partie du
pool de lymphocytes matures recirculants, passant du sang dans les follicules
lymphoïdes primaires des ganglions lymphatiques, de la rate, de même que
vers d'autres tissus lymphoïdes périphériques (plaques de Peyer de l'intestin
grêle, amygdales, appendice) et de là retournent dans le sang via le système
lymphatique (Janeway et al., 2001). Si les cellules B rencontrent un antigène
et des lymphocytes T auxiliaires appropriés lors de leur passage dans un tissu
lymphoïde, elles deviennent activées et migrent au centre des follicules
lymphoïdes pour y établir des centres germinatifs, qui sont des sites d'intense
prolifération des lymphocytes B où a lieu l 'hypermutation somatique des
gènes réarrangés des régions variables des anticorps (Janeway et al., 2001).
Ces cellules B se transforment alors en plasmocytes sécréteurs d'anticorps,
qui sont surtout retrouvés dans les cordons médullaires des ganglions
12
lymphatiques, dans la pulpe rouge de la rate, dans la moelle osseuse et dans la
lamina propria des muqueuses (Janeway et al., 2001).
Un autre sous-type de lymphocytes B, les cellules B-l, sont aussi des
lymphocytes B matures résidant majoritairement dans les cavités pleurale et
péritonéale (Hayakawa et Hardy, 2000). Ces lymphocytes B sont classés en
deux sous-types, soit les cellules B-l a (CD5+) et B-l b (CDS-) (Berland et
Wortis, 2002). Au même titre que les lymphocytes B de la zone marginale,
les cellules B-l semblent contribuer significativement aux réponses immunes
indépendantes des cellules T contre les antigènes multivalents (Martin et al.,
2001). Les précurseurs de ces cellules sont un sujet controversé. La plupart
des cellules B-l dériveraient de cellules souches résidant dans le foie fœtal,
alors que certaines cellules B B-l seraient générées à partir des cellules B
folliculaires (aussi appelées cellules B-2) en réponse à une activation
indépendante des cellules T de type 2 (Wortis et al., 1995; Clarke et Arnold,
1998).
1.4 But et objectifs de ce projet de maîtrise.
Le but principal de ce projet de maîtrise était d'étudier plus en profondeur
les processus impliqués dans la déplétion des lymphocytes B chez les souris
B7.2 Tg. Un des objectifs de ce projet était de déterminer si l'interaction
entre les molécules TNF-a et TNFR-I est impliquée dans la déplétion des
cellules B B7.2 Tg, le système TNF/TNFR-l étant une des voies apoptotiques
bien connue chez les lymphocytes (Smith et al., 1994; Sedger et al., 2002).
Nous avons donc croisé les souris B7.2 Tg avec des souris déficientes pour la
molécule TNFR-l. Nous avons aussi voulu déterminer si la déplétion des
lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg est dépendante des lymphocytes T
CD4+ et/ou CD8+. Pour répondre à cette question, nous avons généré des
souris B7.2 Tg qui sont déficientes dans la génération de l'une ou l'autre de
ces sous-populations de lymphocytes T.
Ensuite, nous avons dressé la
13
cinétique de l'ontogénie des cellules B chez les souris B7.2 Tg à partir de la
naissance afin de mieux comprendre le processus de déplétion des
lymphocytes B chez ces animaux.
Finalement, nous avons voulu étudier
l'importance de l'interaction entre le TcR et le complexe CMH/peptide dans
l'élimination des lymphocytes B B7.2 Tg engendrée par l'interaction entre la
molécule B7.2 et son récepteur CD28 exprimé par les lymphocytes T. Nous
avons donc généré des souris B7.2 Tg dont la spécificité des TcRs exprimés
par les lymphocytes T est restreinte en croisant celles-ci avec les souris OT-1
Tg, qui expriment un TcR transgénique spécifique pour un peptide de
l'ovalbumine. Toutes ces analyses ont été effectuées dans le cadre des souris
B7.2 Tg de la lignée 27, où la molécule B7.2 est exprimée à un niveau
modéré à la surface des lymphocytes B matures. Certains résultats ont aussi
été corroborés par l'utilisation des souris B7.2 Tg de la lignée 7, où la
molécule B7.2 est exprimée de façon élevée à la surface des lymphocytes B
matures.
14
2- Matériels et méthodes
2.1 Souris
La génération des souris C57Bl/6- B7.2 Tg a été décrite par Fournier et al.
(Fournier et al., 1997). Les souris C57BI/6-p2-m -/-, C57B1/6- I-Ap -/- et
C57BI/6-0T-1 Tg ont été obtenues de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME,
États-Unis). Les souris C57BI/6-TNFR-1 -/- ont été fournies par le Dr Trevor
Owens (Université McGiIl, Montréal, Canada).
Les souris OT-l Tg et
TNFR-l -/- ont été croisées avec des souris B7.2 Tg de la lignée 27. Les
souris p2-m -/- et I-Ap -/- ont été croisées avec des souris B7.2 Tg de la
lignée 7 et de la lignée 27. Les souris négatives pour le transgène B7.2 ont
été employées à titre de contrôles dans les expériences.
2.2 Détermination du génotype des souris
Afin de vérifier la présence ou l'absence du transgène B7.2, du transgène
OT-l, des cellules T CD8+ dans les souris potentiellement p2-m-/- ou des
cellules T CD4+ dans les souris potentiellement I-Ap -/-, environ 0.3 mL de
sang a été prélevé de la veine de la queue dans 1 mL de solution Alsevier
(144 mM dextrose/ 71 mM NaCl/ 27 mM citrate de sodium).
Les
échantillons sanguins ont été lavés dans 3 mL de solution FACS (154 mM
NaCI/ 8,1 mM Na2HP04/ 2,68 mM KCI/ 1,47 mM KH2P04/ 1 % sérum de
boeuf (Sigma) inactivé par la chaleur, 0.1 % NaN3), et les érythrocytes ont été
lysés dans 3 mL de tampon de lyse ACK (150 mM NH4Cl/ 1 mM KHC0 3
/
0.1 mM Na2EDTA). Après un lavage dans la solution FACS, les cellules ont
été resuspendues dans 50 ).tL de solution FACS et ensuite incubées avec les
anticorps fluorescents pendant 25 min dans la glace et à la noirceur. Un antiCD8-FITC (10 ).tg/mL, clone Ly2, Pharmingen) a été utilisé afin de détecter
la présence de cellules T CD8+ chez les souris potentiellement p2-m -/-, un
anti-CD4-FITC (10 ).tg/mL, clone L3T4, Pharmingen) a été employé afin de
15
. vérifier la présence de cellules T CD4+ chez les souris potentiellement I-Ap
-/-, un anti-Va2-FITC (10 Ilg/mL, clone B20.1, Pharmingen) a été utilisé afin
de détecter le transgène OT-I et/ou un anti-B7.2-PE (4 Ilg/mL, clone RMMP2, Cederlane) a été employé afin de détecter la présence du transgène B7.2.
Les cellules ont été lavées une première fois dans la solution FACS et une
seconde fois dans la solution PBS
IX (154 mM NaCl/ 8,1 mM
Na2HP04e12H20/ 2,68 mM KCI/ 1,47 mM KH2P04/ 0.1 % NaN3) avant
l'analyse en cytométrie de flux sur un FACScan (Becton Dickinson). 5 XI03
évènements cellulaires ont été collectés, en excluant les cellules mortes par
leurs caractéristiques FSC/SSC. L'analyse des données a été effectuée à l'aide
du programme Cell Quest (Becton Dickinson).
Afin de vérifier la présence ou l'absence de la délétion du gène codant
pour TNFR-I, environ 1 cm de queue de souris a été digéré avec 0.4 mg de
protéinase K (ICN Biomedicals) dans 700 ilL de solution de digestion (50
mM Tris pH 8.0/ 100 mM EDTA/ 0.5 % SDS) toute la nuit à 55 oc. 700 ilL
de phénol (pH 7.9, Sigma) a été ajouté au matériel digéré, et le mélange a été
soumis au vortex pendant 2 min et centrifugé à 13 000 rpm pendant 20 min à
la température ambiante. La phase aqueuse a ensuite été transférée dans 700
ilL de phénol-chloroforme 1: 1 (pH 7.9, Sigma! Fisher Scientific), soumise au
vortex pendant 2 min, et centrifugée de nouveau à 13 000 rpm pendant 20
min à la température ambiante. La nouvelle phase aqueuse a été transférée
dans 700 ilL d'éthanol 95 %, et 70 ilL de 3M sodium-acétate (pH 5.2) a été
ajouté afin de faire précipiter l'ADN génomique. L'ADN a ensuite été lavé
dans 1 mL d'éthanol 70 %, asséché pendant 30 min à l'air ambiant,
resuspendu dans 100 ilL de tampon TE (10 mM Tris-HCl pH 7.4/ 1 mM
Na2EDTA pH 8.0) et chauffé à 60 oC pendant 10 min afin de favoriser la
solubilisation de l'ADN. La concentration en Ilg/mL a été déterminée par
analyse spectrophotométrique (où une D.O. de 1 à 260 nm= 50 Ilg/mL d'ADN
double-brin).
400 ng d'ADN génomique a été utilisé afin d'effectuer une
16
analyse par PCR à l'aide des amorces spécifiques pour la séquence codante de
TNFR-l (Dr Trevor Owens, Université McGill, Montréal, Canada): TNFR-I5' GGC TGC AGT CCA CGC ACT GG (amorce commune spécifique aux
gènes de type sauvage et mutant), TNFR-I-3' TGT GAA AAG GGC ACC
TTT ACG GC (amorce spécifique au gène de type sauvage) et TNFR-I-3'
ATT CGC CAA TGA CAA GAC GCT GG (amorce spécifique au gène de
type mutant). Les concentrations finales des réactifs utilisés lors du PCR
étaient les suivantes: 0,8 /lM des amorces énumérées ci-dessus, 50 U/mL Taq
polymérase (Amersham Pharmacia Biotech), 0,2 mM dNTPs (Amersham
Pharmacia Biotech), tampon PCR IX sans MgCh (Perkin Elmer) et 2 mM
MgCh (Perkin Elmer). Les conditions de PCR étaient les suivantes: 94 oC 5
min; pour 29 cycles: 94 oC 1 min, 63 oC 30 sec et 72 oC 1,5 min; 72 oC 10
min; 4 oc. Les résultats du PCR ont été visualisés par électrophorèse sur gel
d'agarose 0.8 % (Sigma) contenant 0.5 /lg/mL de bromure d'éthidium
(Sigma).
2.3 Préparation des suspensions cellulaires
Les cellules de la moelle osseuse ont été libérées des fémurs et des tibias
par l'injection dans les cavités osseuses de milieu HBSS complet (milieu
"Hank's Balanced Salts Solution" (Sigma) enrichi de 5 % de sérum de boeuf
(Sigma) inactivé par la chaleur, 0.2 mM de 2-mercaptoéthanol (BioShop),
400 U/mL de pénicilline G (Sigma) et 0.4 mg/mL de streptomycine
(GibcoBRL» à l'aide d'une seringue comprenant une aiguille de jauge 21
dans le cas d'os provenant de souris adultes et de jauge 26 dans le cas d'os
provenant de jeunes souris (âgées de 2 à 20 jours). Les cellules de la rate, des
ganglions lymphatiques (axillaires, brachiaux et inguinaux) et du foie ont été
préparées dans du milieu HBSS complet en écrasant doucement les tissus
entre les extrémités givrées de deux lames de microscope en verre.
Les
cellules des ganglions lymphatiques ont été lavées dans du HBSS complet.
Les cellules hépatiques ont été resuspendues dans une solution de 44 %
17
Percoll (Amersham Biosciences) préparée dans du HBSS complet, et
centrifugées sur un gradient de 67.5 % Percoll préparé dans l'eau à 600 rcf
pendant 20 min à la température ambiante. Afin de lyser les érythrocytes, les
cellules de la moelle osseuse, de la rate et du foie ont été traitées avec le
tampon ACK- dans le cas de cellules provenant de souris adultes- ou avec la
solution de Oey (resuspension de maximum 108 cellules dans 1 mL de
solution FACS, et traitement avec 5 mL de solution de Oey: 131 mM NH4Cl/
13,4 mM NaHC03 / 5,55 mM dextrose/ 4,96 mM KCl/ 2, Il mM
Na2HP04e12 H20/ l,53 mM CaCh/ 1,03 mM MgCh e6 H20/ 0,283 mM
MgS0 4e7 H20/ 0,2 mM KH2P04)- dans le cas des cellules provenant de
jeunes souris. Ces cellules ont ensuite été lavées dans du HBSS complet.
Les suspensions cellulaires ont finalement été filtrées à travers une membrane
de nylon afin de retirer les agrégats tissulaires. Le compte cellulaire a été
effectué à l'aide d'un hémacymètre en excluant les cellules mortes par
coloration au Trypan bleu (Sigma- solution 0,4 % préparée dans du PBS IX).
2.4 Marquage des cellules et cytométrie de flux
Après un lavage dans la solution FACS, les cellules (l0 6) ont été incubées
pendant 15 min sur la glace en présence de 20 ,...g/mL d'un anti-CD32/CD16
afin de bloquer les récepteurs Fc, lavées dans la solution FACS, resuspendues dans cette solution aux concentrations appropriées à chacun des
anticorps utilisés et marquées avec les anticorps couplés à la biotine pendant
25 min sur la glace.
Les cellules ont ensuite été lavées dans la solution
FACS, resuspendues dans cette solution aux concentrations appropriées à
chacun des anticorps utilisés et marquées avec les anticorps fluorescents
pendant 25 min sur la glace et à la noirceur. Les cellules ont ensuite été
lavées une première fois dans la solution FACS et une seconde fois dans la
solution PBS IX avant d'être analysées en cytométrie de flux sur un
FACScan (Becton Dickinson). 104 évènements cellulaires ont été collectés,
en excluant les cellules mortes d'après leurs caractéristiques FSC/SSC.
18
L'analyse des données a été effectuée à l'aide du programme Cell Quest
(Becton Dickinson). Les anticorps qui ont été utilisés dans cette étude sont
les suivants: anti-B220-FITC et PE (6 Ilg/mL, clone Ly5; Cederlane), antiIgM-biotine (10 llg/mL, clone 11/41; Pharmingen), anti-B7.2-PE (4 llg/mL,
clone RMMP-2; Cederlane), anti-CD21/CD35-FITC (10 Ilg/mL, clone 706;
Pharmingen), anti-CD23-PE (6 Ilg/mL, clone B3B4; Pharmingen), anti-IgDFITC (10 Ilg/mL, clone 11-26c.2a; Pharmingen), anti-CD62L-biotine (10
Ilg/mL, clone MEL-14; Pharmingen), anti-CD l-biotine (10 Ilg/mL, clone
1B1; Pharmingen), anti-CD4-FITC (10 Ilg/mL, clone L3T4; Pharmingen),
anti-CD8-PE (10 Ilg/mL, clone Ly2; Pharmingen), anti-CD43-FITC (10
Ilg/mL, clone Ly-48, leukosialin; Pharmingen) et anti-Va2-FITC (10 Ilg/mL,
clone B20.1; Pharmingen). Le Cy-Chrome conjugué à la streptavidine (2
Ilg/mL, Pharmingen) a été employé afin de révéler les anticorps couplés à la
biotine.
19
3. Résultats
3.1 La déplétion des lymphocytes B chez les souris B7.2 transgéniques
est indépendante de la voie apoptotique TNFITNFR-l.
Il a été démontré auparavant que la déplétion des cellules B chez les souris
B7.2 Tg est dépendante de la présence des lymphocytes T (Fournier et al.,
1997).
De plus, la population de cellules B chez les souris B7.2 Tg est
restaurée lorsque la molécule anti-apoptotique Bc1-2 est exprimée de façon
transgénique par les lymphocytes B (Blanchette, 2001). Ces observations
nous ont donc amené à poser l'hypothèse que la déplétion des lymphocytes B
chez les souris B7.2 Tg pourrait être causée par l'induction d'un mécanisme
apoptotique chez les cellules B B7.2 Tg, celui-ci étant directement engendré
par l'interaction avec les lymphocytes T.
Plusieurs mécanismes peuvent être utilisés par les cellules T afin d'induire
l'apoptose chez d'autres lymphocytes. Le principal mécanisme utilisé par les
cellules T CD8
+
cytotoxiques qui conduit à la mort par apoptose de leurs
cellules cibles est le relâchement de granules lytiques contenant les protéines
perforine et granzymes (Shresta et al., 1998). Un autre mécanisme bien connu
menant à l'apoptose des lymphocytes activés implique l'interaction entre
FasL, récepteur exprimé par les lymphocytes T, et la molécule Fas exprimée
par la cellule cible (Krammer, 2000). Finalement, la production de cytokines
par les cellules T, telles que l'INF-y, le TNF-a et le TNF-p, peuvent
engendrer l' apoptose d'autres lymphocytes par leur liaison au récepteur
d'INF-y (Garvy et Riley, 1994) ainsi qu'aux récepteurs du TNF-a, soit
TNFR-l et TNFR-2 (Sedger et al., 2002).
Il a été observé précédemment chez les souris B7.2 Tg lprllpr (souris ayant
une mutation dans le gène codant pour la molécule Fas qui empêche celle-ci
de générer un signal intracellulaire) que le nombre de lymphocytes B est égal
20
au nombre de cellules B chez les souris B7.2 Tg, ce qui a permis de conclure
que la déplétion des cellules B B7.2 Tg est indépendante de la voie
apoptotique Fas/FasL (Fournier et al., 1997). En se basant sur le fait que le
TNF-a est une cytokine induite chez les lymphocytes T suite à l'interaction
B7/CD28 (Thompson et al., 1989) et que le TNFR-l peut être exprimé par les
cellules B de la moelle osseuse (Sedger et al., 2002), nous avons croisé des
souris déficientes pour le TNFR-l avec les souris B7.2 Tg de la lignée 27 afin
de vérifier si l'interaction TNF/TNFR-1 est impliquée dans la déplétion des
lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg.
Les cellules provenant de la moelle osseuse, de la rate et des ganglions
lymphatiques périphériques ont été marquées avec un anticorps anti-B220,
B220 étant une molécule exprimée par les lymphocytes B à chaque stade de
leur développement dans la moelle osseuse ainsi que lors de leur maturation
en périphérie. On observe que le nombre absolu des lymphocytes B dans la
moelle osseuse, la rate et les ganglions lymphatiques des souris TNFR-l -/B7.2 Tg est grandement diminué comparativement aux souris de type
sauvage et aux souris TNFR-l -/- (figure 1). De plus, le nombre absolu des
cellules B dans les organes lymphoïdes des souris TNFR-l -/- B7.2 Tg est
comparable au nombre absolu des lymphocytes B dans les tissus lymphoïdes
des souris B7.2 Tg (figure 1).
Ces résultats démontrent que le mécanisme apoptotique conduisant à la
déplétion des cellules B B7.2 Tg n'implique pas la voie TNF/TNFR-l.
21
Figure 1- Population des lymphocytes B chez les souris B7.2
transgéniques déficientes pour la molécule TNFR-l. Les cellules de la
moelle osseuse (provenant d'un fémur et d'un tibia) (A), de la rate (B) et des
ganglions lymphatiques périphériques (C) ont été marquées avec un anticorps
anti-B220 et analysées en cytométrie de flux.
La fréquence des cellules
B220+ (panneaux de gauche) est indiquée sur les profils B220 versus FSC
pour les souris Ctrl, TNFR-I -/-, B7.2 Tg de la lignée 27 et TNFR-I -/- B7.2
Tg de la lignée 27. Le nombre absolu de cellules B (panneaux de droite) est
représenté pour chaque type de souris. Le nombre de souris analysées dans le
cadre de ces expériences est: Ctrl n=2, TNFR-I -/- n=l, B7.2 Tg n=2 et
TNFR-I -/- B7.2 Tg n=3. Les souris étaient âgées de huit semaines.
22
Figure 1
A) Moelle osseuse
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23
3.2 Population des lymphocytes B chez les souris B7.2 transgéniques
déficientes en CMH de classe 1 ou en CMH de classe II.
Il a été démontré précédemment que la déplétion des lymphocytes B B7.2
Tg est dépendante de l'interaction avec les cellules T (Fournier et al., 1997).
Afin de déterminer la sous-population de lymphocytes T, CD4+ et/ou CDS+,
qui est impliquée dans la déplétion des cellules B B7.2 Tg, nous avons croisé
les souris B7.2 Tg de la lignée 7 et 27 avec des souris p2-m -/- (souris
déficientes pour les protéines du CMH de classe I) ou I-Ap -/- (souris
déficientes pour les protéines du CMH de classe II).
Lors de la sélection positive dans le thymus, les thymocytes doublepositifs (CD4+ CDS+) se différencient en thymocytes simple-positifs et
perdent soit le co-récepteur CD4 si leurs TcRs sont sélectionnés par des
molécules du CMH de classe l, soit le co-récepteur CDS si leurs TcRs sont
sélectionnés par des molécules du CMH de classe II.
Ces thymocytes
deviennent alors des lymphocytes T CDS+ et T CD4+ respectivement. Les
souris p2-m -/- sont déficientes pour la molécule p2-microglobuline, protéine
liée de façon non-covalente à la chaîne a du CMH de classe 1. Les cellules
de ces animaux n'expriment pas de molécules du CMH de classe 1 à leur
surface puisque la chaîne p des protéines du CMH 1 doit s'associer à la
molécule p2-microglobuline pour être exprimée à la surface cellulaire. Les
souris p2-m -/- ne possèdent donc pratiquement pas de cellules T CDS+,
puisque ces lymphocytes ne peuvent être sélectionnés positivement par
l'interaction de leurs TcRs avec les molécules du CMH de classe 1 lors de
leur développement dans le thymus. Chez les souris I-Ap -/-, la chaîne p des
molécules du CMH de classe II de type H2-A n'est pas exprimée.
Les
molécules du CMH de classe II de type H2-E n'existant pas chez la lignée de
souris C57BL/6, l'expression de la molécule du CMH de classe II est presque
totalement éliminée chez ces animaux. Ces souris ne possèdent donc que très
peu de lymphocytes T CD4+, ces cellules ne pouvant subir la sélection
24
positive thymique par la restriction de leurs TcRs aux molécules du CMH II.
Les croisements avec ces souris mutantes nous ont permis de générer des
souris B7.2 Tg qui ne contiennent pratiquement qu'une seule des deux souspopulations de lymphocytes T, soit les lymphocytes T CD4+ dans le cas des
souris p2-m -/- B7.2 Tg et les lymphocytes T CD8+ chez les souris I-Ap -/B7.2 Tg.
Les cellules provenant de la moelle osseuse, de la rate et des ganglions
lymphatiques périphériques ont été marquées avec des anticorps anti-B220 et
anti-IgM. En premier lieu, on observe que le nombre absolu des lymphocytes
B provenant de la moelle osseuse des souris I-Ap -/- B7.2 Tg est de quatre
fois inférieur au nombre absolu des cellules B compris dans la moelle osseuse
des souris I-Ap -/- (figure 2A). Le nombre absolu des cellules B au niveau
splénique est de sept à dix fois plus bas chez les souris I-Ab -/- B7.2 Tg que
chez les souris I-Ab -/- (figure 2B).
Par contre, de façon surprenante, le
nombre absolu des lymphocytes B compris dans les ganglions lymphatiques
des souris I-Ap -/- B7.2 Tg est égal ou supérieur au nombre absolu des
cellules B dans les ganglions lymphatiques des souris I-Ab -/- (figure 2C).
La déplétion des lymphocytes B en présence de cellules T CD4+ semble
beaucoup plus drastique qu'en présence de cellules T CD8+.
En effet, le
nombre absolu de lymphocytes B compris dans la moelle osseuse des souris
p2-m -/- B7.2 Tg est d'environ dix fois plus bas que le nombre absolu des
lymphocytes B des souris p2-m -/- provenant de ce même tissu (figure 3A).
Cette déplétion marquée des cellules B B7.2 Tg est aussi observée en
périphérie, où le nombre absolu des lymphocytes B provenant de la rate et
des ganglions lymphatiques des souris p2-m -/- B7.2 Tg est de vingt à quatrevingt fois inférieur au nombre absolu des cellules B comprises dans ces
organes lymphoïdes chez les souris p2-m -/- (figures 3B et 3C).
25
Ces résultats démontrent qu'une déplétion des cellules B B7.2 Tg a lieu
lorsque celles-ci interagissent soit avec des lymphocytes T CD4+ ou avec des
cellules T CD8+. De plus, la diminution de la population de lymphocytes B
B7.2 Tg semble beaucoup plus drastique chez les souris p2-m -/- B7.2 Tg que
chez les souris I-Ap -/- B7.2 Tg.
26
Figure 2- Population
des
lymphocytes
B
chez les souris B7.2
transgéniques déficientes en CMU de classe II. Les cellules de la moelle
osseuse (provenant d'un fémur et d'un tibia) (A), de la rate (B) et des
ganglions lymphatiques périphériques (C) ont été marquées avec des
anticorps anti-B220 et anti-IgM et analysées en cytométrie de flux.
La
fréquence des cellules B220+ chez les souris I-Ab -/- (panneaux de gauche) et
I-Ab -/- B7.2 Tg de la lignée 27 (panneaux médians) est indiquée sur les
profils B220 versus IgM. Les nombres absolus (panneaux de droite) des
cellules B220+ sont illustrés pour les souris I-Ab -/-, I-Ab -/- B7.2 Tg de la
lignée 7 et I-Ab -/- B7.2 Tg de la lignée 27. La moyenne (-) des nombres
absolus est indiquée. Le nombre de souris utilisées est: I-Ab -/- B7.2 Tg de la
lignée 7 n=ll et I-Ab -/- n=7; I-Ab -/- B7.2 Tg de la lignée 27 n=lO et I-Ab
-/- n=9. Les souris utilisées dans le cadre de ces expériences étaient âgées de
cinq à neuf semaines.
27
Figure 2
A) Moelle osseuse
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87.2 Tg
lignée 7
lignée 27
28
Figure 3- Population des lymphocytes B chez les souris B7.2
transgéniques déficientes en CMH de classe I. Les cellules de la moelle
osseuse (provenant d'un fémur et d'un tibia) (A), de la rate (B) et des
ganglions lymphatiques périphériques (C) ont été marquées avec des
anticorps anti-B220 et anti-IgM et analysées en cytométrie de flux.
La
fréquence des cellules B chez les souris p2-m -/- (panneaux de gauche) et
p2-m -/- B7.2 Tg de la lignée 27 (panneaux médians) est indiquée sur les
profils B220 versus IgM. Les nombres absolus des cellules B220+ (panneaux
de droite) sont illustrés pour les souris p2-m -/-, p2-m -/- B7.2 Tg de la lignée
7 et p2-m -/- B7.2 Tg de la lignée 27. La moyenne (-) des nombres absolus
est indiquée. Le nombre de souris utilisées est: p2-m -/- B7.2 Tg de la lignée
7 n=8 et p2-m -/- n=5; p2-m -/- B7.2 Tg de la lignée 27 n=8 et p2-m -/- n=5.
Les souris utilisées dans le cadre de ces expériences étaient âgées de cinq à
neuf semaines.
29
Figure 3
A) Moelle osseuse
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B7.2 Tg
lignée 27
30
3.3 La déplétion des lymphocytes B dans les souris B7.2 transgéniques
ne semble pas être un évènement prénatal.
Nous avions auparavant observé dans notre laboratoire que l'expression
constitutive de la molécule anti-apoptotique Bcl-2 dans les lymphocytes B
des souris B7.2 Tg inhibait leur délétion mais conduisait à l'accumulation de
lymphocytes B ayant un phénotype immature dans les organes lymphoïdes
périphériques (Blanchette, 2001). Ce phénotype est identique à celui observé
chez les souris dans lesquelles on a bloqué, par l'expression transgénique de
la molécule Bcl-2, la délétion des lymphocytes B qui expriment un récepteur
de lymphocyte B (BcR) reconnaissant un antigène du Soi membranaire
(Young et al., 1997). Dans ce cas, l'accumulation de lymphocytes B avec un
phénotype immature avait été expliquée par le fait que bien que la molécule
Bcl-2 peut empêcher la mort des lymphocytes B qui reconnaissent des
antigènes du Soi multivalents, elle ne peut pas prévenir l'arrêt de
développement induit dans ces lymphocytes B auto-réactifs.
Nous avons
donc posé l'hypothèse que les lymphocytes B exprimant le transgène B7.2
pouvaient de façon similaire subir un arrêt de développement, ce qui causerait
leur mort par apoptose.
Afin d'évaluer si le développement des cellules B est perturbé dans les
souris B7.2 Tg, nous avons déterminé la cinétique de l'ontogénie des
lymphocytes B et le portrait phénotypique de ceux-ci de la naissance jusqu'à
l'âge adulte. Il est bien connu que la lymphopoïèse des lymphocytes B a lieu
dans le foie avant la naissance (Janeway et al., 2001). Nous avons donc voulu
déterminé si la proportion des cellules B B7.2 Tg est normale dans le foie des
souris âgées de deux jours à l'aide d'un marquage avec des anticorps antÎB220, anti-IgM et anti-CD43. Cette analyse nous permet de différencier les
lymphocytes B immatures/matures (IgM+ B220+) des lymphocytes pré-B
(B220+ IgM- CD43-) et des lymphocytes pro-B (B220+ IgM- CD43+)
(Janeway et al., 2001).
31
En premier lieu, le nombre absolu des lymphocytes B chez les souris B7.2
Tg et Ctrl est similaire (figure 4A). De plus, la fréquence des lymphocytes B
immatures/matures (IgM+ B220+) n'est pas différente chez les souris Ctrl et
B7.2 Tg (figure 4A). Finalement, les cellules pro-B (B220+ IgM- CD43+) et
pré-B (B220+ IgM- CD43-) sont en proportions similaires chez les souris B7.2
Tg et Ctrl (figure 4B).
Ces résultats indiquent que la génération des lymphocytes B au cours de la
vie fœtale n'est pas perturbée chez les souris B7.2 Tg.
32
Figure 4- Population des lymphocytes B du foie chez les souris néonatales
B7.2 transgéniques. Les cellules du foie des souris Ctrl et B7.2 Tg de la
lignée 27 âgées de deux jours ont été marquées avec des anticorps anti-B220,
anti-IgM et anti-CD43 et analysées en cytométrie de flux. A) Expression des
molécules B220 et IgM sur les cellules du foie. Les nombres situés au coin
supérieur indiquent la fréquence des cellules retrouvées dans chaque
quadrant, et le nombre situé au coin inférieur indique le nombre absolu des
cellules B220+ Ctrl et B7.2 Tg B) Expression des molécules IgM et CD43
sur les cellules exprimant le marqueur B220.
Les nombres indiquent la
fréquence des cellules retrouvées dans chaque quadrant. Ces résultats sont
représentatifs des analyses effectuées sur 4 souris Ctrl et 6 souris B7.2 Tg.
33
Figure 4
A)
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Ctrl
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*
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34
3.4 Cinétique de l'ontogénie et analyse phénotypique des lymphocytes B
de la moelle osseuse des souris B7.2 transgéniques de la lignée 27.
Nous avons analysé les populations de lymphocytes B dans la moelle
osseuse puisque c'est dans ce tissu que le développement des cellules B
survient après la naissance.
La cinétique de l'ontogénie ainsi que le
phénotype des lymphocytes B provenant de la moelle osseuse ont été
déterminés chez les souris Ctrl et B7.2 Tg de la lignée 27 âgées de dix jours
et plus, les fémurs et tibias étant de taille minime avant cet âge. Les cellules
ont été marquées avec des anticorps anti-B220 et anti-IgM aux jours 10, 20,
30,60 et 90.
On observe une déplétion des cellules B B7.2 Tg dès le jour 10, où leur
nombre absolu est de seulement 3 X10 6 cellules, alors que l'on atteint un
nombre absolu de 6 X10 6 chez les souris Ctrl (figure SB). De plus, le nombre
absolu de cellules B n'augmente pas malgré la croissance de la souris B7.2
Tg en demeurant à une valeur fixe d'environ 3 X10 6 cellules (figure SB).
Finalement, on constate que la déplétion des lymphocytes B B7.2 Tg touche
autant les pro-B/pré-B (B220+ IgM-) que les cellules B immatures/matures
(B220+ IgM+) dans cet organe lymphoïde central, car la fréquence de ces
sous-populations de lymphocytes B est plus basse dans la moelle osseuse des
souris B7.2 Tg que dans celle des souris Ctrl, et ce à toutes les périodes
analysées (figure SA).
On peut donc conclure que la déplétion des lymphocytes B B7.2 Tg dans
la moelle osseuse s'avère drastique tôt dans leur ontogénie.
35
Figure 5- Population des lymphocytes B de la moelle osseuse chez les
souris B7.2 transgéniques à différents âges.
Les cellules de la moelle
osseuse (provenant de deux fémurs et deux tibias) ont été marquées avec des
anticorps anti-B220 et anti-IgM, et analysées en cytométrie de flux.
A)
Expression des molécules IgM et B220 sur les cellules de la moelle osseuse.
La fréquence des cellules B220+ IgM- et B220+ IgM+ chez les souris Ctrl et
B7.2 Tg de la lignée 27 est indiquée sur les profils B220 versus IgM. B)
Cinétique de la moyenne des nombres absolus des cellules B220+ en fonction
de l'âge des souris Ctrl (0) et B7.2 Tg de la lignée 27 (-). Les valeurs
représentées sur ce graphique ont été obtenues par analyse en cytométrie de
flux en sélectionnant les cellules B220+ comprises dans la population des
cellules vivantes. Les moyennes ont été obtenues à partir de l'analyse de:
jour 10 (Ctrl n=5 et B7.2 Tg n=7), jour 20 (Ctrl n=8 et B7.2 Tg n=IO), jour
30 (Ctrl n=6 et B7.2 Tg n=ll), jour 60 (Ctrl n=2 et B7.2 Tg n=2) et jour 90
(Ctrl n=9 et B7.2 Tg n=8).
36
Figure 5
A)
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20 jours
30 jours
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37
3.5 Cinétique de l'ontogénie et analyse phénotypique des lymphocytes B
de la rate des souris B7.2 transgéniques de la lignée 27.
Afin d'étudier les lymphocytes B dans les tissus lymphoïdes périphériques
des souris Ctrl et B7.2 Tg de la lignée 27, nous avons marqué les cellules de
la rate et des ganglions lymphatiques périphériques avec des anticorps antiB220, anti-IgM et anti-B7.2. De plus, nous avons caractérisé le niveau de
maturité des cellules B dans ces tissus à l'aide des anticorps anti-IgM, antiCD21 et anti-CD23. Ces analyses permettent de caractériser les différentes
sous-populations de lymphocytes B qui y sont présentes: les cellules B Tl
(IgMélevé CD2 r CD23-), les cellules B T2 (lgMé\evé CD21 élevé CD23élevé), les
cellules B folliculaires (IgM+ CD21 + CD23élevé) et les cellules B de la zone
marginale (IgMélevé CD21 élevé CD23 bas) (Loder et al., 1999).
Lorsque les souris sont âgées de deux jours, on observe que le nombre
absolu des lymphocytes B n'est pas différent entre les souris B7.2 Tg et Ctrl
(figure 6B).
De plus, la proportion des cellules B220+ qui expriment le
marqueur IgM est identique entre les deux types de souris (figure 6A).
Cependant, parmi les cellules B220+ IgM+, on observe une différence dans la
fréquence des lymphocytes B qui expriment le marqueur CD23. En effet, la
fréquence des cellules B220+ IgM+ CD23+ est diminuée de façon significative
dans les souris B7.2 Tg par rapport aux souris Ctrl (figure 7A).
Au jour 10, on constate que le nombre absolu des cellules B220+ n'est pas
différent dans la rate des souris B7.2 Tg et Ctrl (figure 6B). Par contre, le
phénotype des cellules B est drastiquement différent. Alors que la majorité
(environ 75 %) des cellules B220+ dans les souris de type sauvage expriment
le marqueur IgM à leur surface, la plupart des lymphocytes B dans la rate des
souris B7.2 Tg sont IgM- (figure 6A). De plus, on voit que la fréquence des
lymphocytes B IgM+ exprimant les marqueurs CD21 et CD23 chez les souris
B7.2 Tg est très faible comparativement aux souris Ctrl (figure 7A).
38
On observe ensuite au jour 20 que le nombre absolu des cellules B220+ est
plus bas dans la rate des souris B7.2 Tg par rapport aux souris de type
sauvage (figure 6B). Cependant, les lymphocytes B B7.2 Tg expriment le
marqueur IgM à un niveau semblable que celui observé chez les souris Ctrl
(figure 6A).
De plus, on constate qu'une plus grande proportion de
lymphocytes B IgM+ expriment la molécule CD23 dans la rate des souris
B7.2 Tg par rapport au jour 10, mais la grande majorité de ces cellules
n'expriment toujours pas le marqueur CD21 comparativement aux souris Ctrl
(Figure 7A).
Au jour 30, on observe que le nombre absolu des lymphocytes B est
toujours plus bas dans la rate des souris B7.2 Tg que dans celle des souris
Ctrl (figure 6B). Ensuite, le profil B220 versus IgM est toujours comparable
entre les deux types de souris (figure 6A).
De plus, on constate qu'une
population de cellules IgM+ CD21élevé CD23 bas est maintenant apparente dans
la rate des souris Ctrl et B7.2 Tg (figure 7A).
Ce profil correspond au
phénotype des lymphocytes B de la zone marginale de la rate (Loder et al.,
1999). On observe que la fréquence des cellules B de la zone marginale est
beaucoup plus élevée dans la rate des souris B7.2 Tg que chez les souris Ctrl
âgées de trente jours (figure 7A). Des marquages additionnels à l'aide des
anticorps anti-CD21 et anti-CD23 en combinaison avec un anticorps antiIgD, anti-CD62L ou anti-CDl ont permis de confirmer que le profil de cette
population cellulaire correspond bel et bien à celui des lymphocytes B
résidant dans la zone marginale de la rate. En effet, les cellules CD21 élevé
démontrant une expression faible du marqueur CD23 à leur surface ont un
profil typique des cellules B de la zone marginale, soit IgD bas , CD62Lbas et
CD1élevé, et la proportion de ces cellules est toujours plus importante dans la
rate des souris B7.2 Tg que chez les souris Ctrl (figure 7B; Loder et al.,
1999).
39
Finalement, on observe aux JOurs 60 et 90 que le nombre absolu des
lymphocytes B B7.2 Tg est toujours grandement diminué comparativement
aux souris Ctrl (figure 6B). La proportion des cellules B220+ qui expriment
la molécule IgM est encore identique entre les deux types de souris au jour 60
(figure 6A). De plus, la fréquence des lymphocytes B de la zone marginale
(IgM+ CD21 élevé CD23 bas) est toujours grandement augmentée chez les souris
B7.2 Tg par rapport aux souris de type sauvage à cette période (figure 7A).
Un autre point intéressant est le profil d'expression de B7.2 à la surface des
lymphocytes B chez les jeunes souris B7.2 Tg. On observe que plusieurs
cellules B B7.2 élevé , autant IgMéleVé que IgM+ /bas se retrouvent dans la rate de
ces souris au jour 2 (figure 7C). De plus, la population de cellules B observée
au jour 10 chez les souris B7.2 Tg semble y être composée en grande partie
de cellules IgM- B7.2élevé (figure 7C). Ensuite, on voit que les cellules B
présentes dans la rate des souris B7.2 Tg au jour 20 sont presque
exclusivement IgM+ et qu'une très grande proportion de ces cellules B
exprime constitutivement B7.2 à un niveau allant de faible à modéré (figure
7C). Finalement, la majorité des lymphocytes B IgM+ spléniques démontrent
un niveau faible de B7.2 à leur surface au jour 30 (figure 7C).
On peut donc conclure que la déplétion des lymphocytes B B7.2 Tg dans
la rate a lieu tôt dans leur ontogénie, comme il a été aussi observé dans la
moelle osseuse (section 3.4, figure 5). De plus, cette déplétion s'accompagne
d'un défaut de la maturation des cellules B au niveau splénique. Finalement,
le profil d'expression de la molécule B7.2 chez les souris B7.2 Tg amène
l'idée que le système de déplétion des lymphocytes B B7.2 Tg semble de plus
en plus efficace à mesure que ces souris deviennent plus âgées. En effet, on
observe que plus la croissance de la souris B7.2 Tg augmente, moins on
retrouve de cellules B exprimant la protéine B7.2 de façon élevée à leur
surface dans la rate de ces animaux.
40
Figure 6- Population des lymphocytes B de la rate chez les souris B7.2
transgéniques à différents âges. Les cellules de la rate ont été marquées
avec des anticorps anti-B220 et anti-IgM et analysées en cytométrie de flux.
A) Expression des molécules IgM et B220 sur les cellules de la rate. La
fréquence des cellules B220+ IgM- et B220+ IgM+ chez les souris Ctrl et B7.2
Tg de la lignée 27 est indiquée sur les profils B220 versus IgM. B) Cinétique
de la moyenne des nombres absolus des cellules B220+ en fonction de l'âge
des souris Ctrl (0) et B7.2 Tg de la lignée 27 (-). Les valeurs représentées
sur ce graphique ont été obtenues par analyse en cytométrie de flux en
sélectionnant les cellules B220+ comprises dans la population des cellules
vivantes. Les moyennes ont été obtenues à partir de l'analyse de: jour 2 (Ctrl
n=7 et B7.2 Tg n=6), jour 10 (Ctrl n=5 et B7.2 Tg n=7), jour 20 (Ctrl n=8 et
B7.2 Tg n=lO), jour 30 (Ctrl n=6 et B7.2 Tg n=ll), jour 60 (Ctrl n=2 et B7.2
Tg n=2) et jour 90 (Ctrl n=9 et B7.2 Tg n=8).
41
Figure 6
A)
2 jours
v
10 jours
0
(')
0
~
NO
Ctrl
cn..:-
0
0
0
v
0
(')
0
B7.2 Tg
B)
,-.
>e
=
80
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'-'
~
M
M
=
60
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G.I
-=
=
40
G.I
\J
G.I
"d
G.I
~
.Q
20
e
~
0
0
Âge des souris (jours)
20 jours
30 jours
60 jours
42
Figure 7- Caractérisation phénotypique des lymphocytes B de la rate des
souris B7.2 transgéniques à différents âges. A) Expression des molécules
CD21 et CD23 sur les cellules exprimant le marqueur IgM. Les cellules de la
rate ont été marquées avec des anticorps anti-IgM, anti-CD21 et anti-CD23
aux jours 2, 10, 20, 30 et 60 et analysées en cytométrie de flux. Les profils
CD21 versus CD23 chez les souris Ctrl (panneaux de gauche) et les souris
B7.2 Tg de la lignée 27 (panneaux de droite) ont été obtenus en sélectionnant
les cellules IgM+. Les nombres indiquent la fréquence des cellules retrouvées
dans chaque quadrant. Le nombre de souris utilisées pour chaque période
analysée est: jour 2 (Ctrl n=7 et B7.2 Tg n=6), jour 10 (Ctrl n=5 et B7.2 Tg
n=7), jour 20 (Ctrl n=8 et B7.2 Tg n=lO), jour 30 (Ctrl n=6 et B7.2 Tg n=ll)
et jour 60 (Ctrl n=2 et B7.2 Tg n=2). B) Expression des molécules CD23,
IgD, CD62L et CDl sur les cellules exprimant le marqueur CD21.
Les
cellules de la rate ont été marquées au jour 30 avec des anticorps anti-CD21
et anti-CD23 en combinaison avec un anticorps anti-IgD, anti-CD62L ou
anti-CDl et analysées en cytométrie de flux. Les profils CD23 versus IgD
(panneaux de gauche), CD23 versus CD62L (panneaux médians) et CD23
versus CDl (panneaux de droite) chez les souris Ctrl et les souris B7.2 Tg de
la lignée 27 ont été obtenus en sélectionnant les cellules CD21 élevé.
Ces
résultats sont représentatifs des analyses effectuées sur une souris Ctrl et une
souris B7.2 Tg. C) Expression des molécules IgM et B7.2 sur les cellules
exprimant le marqueur B220. Les cellules de la rate ont été marquées avec
des anticorps anti-B220, anti-IgM et anti-B7.2 aux jours 2, 10, 20 et 30 et
analysées en cytométrie de flux. Les profils IgM versus B7.2 chez les souris
Ctrl (panneaux de gauche) et les souris B7.2 Tg de la lignée 27 (panneaux de
droite) ont été obtenus en sélectionnant les cellules B220+. Le nombre de
souris utilisées pour chaque période analysée est: jour 2 (Ctrl n=7 et B7.2 Tg
n=6), jour 10 (Ctrl n=2 et B7.2 Tg n=3), jour 20 (Ctrl n=2 et B7.2 Tg n=3),
jour 30 (Ctrl n=4 et B7.2 Tg n=5).
43
Figure 7
A)
2joun
10 jours
v_
;.'
.
o~
......
'. -
~ {
:
".,
.
10 jours
~IC·'... ··
,. 1.·.f.~.fi... :
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20 jours
.
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M
v!'! -r--.--..........., ......--..---~~
o
M
o
N<'!
0 0
30jours ~!'!
30 jours v':-o
e~~~~ b-~~~
B)
Ctrl
CD62L
B7.2 Tg
2 jours
...... ,',!' .
JI~~~I Ui2.i
Ctrl
C)
~~~~~.J ~.
~!M]
!'! ' ............'.
20 jours
B7.2 Tg
Ctrl
CDl
44
3.6 Cinétique de l'ontogénie et analyse phénotypique des lymphocytes B
des ganglions lymphatiques des souris B7.2 transgéniques de la
lignée 27.
Afin de compléter la cinétique de l'ontogénie des lymphocytes B chez les
souris B7.2 Tg de la lignée 27, nous avons finalement étudié les cellules B
des ganglions lymphatiques périphériques.
Ces cellules ont été marquées
avec des anticorps anti-B220, anti-IgM et anti-B7.2, et leur niveau de
maturité a ensuite été caractérisé par un marquage avec des anticorps antiIgM, anti-CD21 et anti-CD23. Nous avons dû effectuer les analyses chez des
souris âgées d'au moins dix jours, les ganglions lymphatiques étant de taille
minime avant cette période.
De façon surprenante, on constate au jour lOque le nombre absolu des
cellules B220+ est semblable dans les ganglions lymphatiques des souris B7.2
Tg et Ctrl (figure 8B).
De plus, la proportion des cellules B220+ qui
n'expriment pas la molécule IgM à leur surface est beaucoup plus élevée dans
les ganglions lymphatiques des souris B7.2 Tg comparativement aux souris
de type sauvage (figure 8A).
Ensuite, on observe que la fréquence des
lymphocytes B IgM+ CD23+ qui expriment le marqueur CD21 est
drastiquement différente. En effet, alors qu'environ 60 % de ces cellules
expriment la molécule CD21 dans les souris de type sauvage, la plupart des
cellules B IgM+ dans les ganglions lymphatiques des souris B7.2 Tg sont
CD21" (figure 9A).
On observe ensuite au jour 20 que le nombre absolu des cellules B220+ est
toujours équivalent dans les ganglions lymphatiques des souris B7.2 Tg et
Ctrl (figure 8B). De plus, la proportion des cellules B220+ n'exprimant pas le
marqueur IgM est maintenant identique entre les deux types de souris (figure
8A).
On constate aussi à cette période qu'une grande proportion des
lymphocytes B IgM+ CD23+ n'expriment toujours pas le marqueur CD21
45
dans les souris 87.2 Tg par rapport aux souris Ctrl, quoique la fréquence des
cellules 8 IgM+ CD23+ CD21 + augmente dans les ganglions lymphatiques
des souris 87.2 Tg comparativement au jour 10 (figure 9A). On voit aussi
qu'une plus grande proportion des cellules 8 IgM+ CD2r expriment la
molécule CD23 chez les souris 87.2 Tg par rapport au jour 10 (figure 9A).
Lorsque les souris sont âgées de trente jours, on observe que le nombre
absolu des cellules 8 dans les ganglions lymphatiques est encore semblable
chez les souris 87.2 Tg et Ctrl (figure 88). De plus, le profil 8220 versus
IgM est similaire chez ces deux types de souris (figure 8A). Cependant, on
constate que la plupart des lymphocytes 8 IgM+ CD23+ expriment maintenant
le marqueur CD21 dans les souris 87.2 Tg et Ctrl (figure 9A).
Finalement, le nombre absolu des cellules 8220+ diminue de façon
significative dans les ganglions lymphatiques des souris 87.2 Tg âgées de
soixante jours comparativement aux souris Ctrl à la même période (figure
88).
Par le suite, le nombre absolu des lymphocytes 8 reste toujours
grandement diminué au jour 90 dans les souris 87.2 Tg par rapport aux souris
Ctrl (figure 88). De plus, le profil 8220/IgM reste similaire chez ces deux
types de souris au jour 60 (figure 8A). En outre, la proportion des cellules 8
IgM+ CD23+ CD21 + est identique dans les deux types de souris à cette
période (figure 9A).
Pour ce qui est du profil IgM/87.2 des cellules 8220+ dans les ganglions
lymphatiques des souris 87.2 Tg, on n'observe pratiquement pas de cellules
IgM- au jour 10 et une grande proportion des cellules 8 IgM+ qui s'y trouvent
expriment déjà à leur surface un niveau allant de faible à modéré de la
molécule 87.2 (figure 98).
Finalement, les lymphocytes 8 87.2 Tg
expriment presque tous un niveau faible de 87.2 à leur surface au jours 20 et
30 (figure 98).
46
On constate donc qu'il n'y a pas de déplétion des lymphocytes B B7.2 Tg
dans les ganglions périphériques aux jours 10, 20 et 30 et ce malgré le fait
que la déplétion des cellules B est visible dans la moelle osseuse et la rate des
souris B7.2 Tg tôt dans leur ontogénie. Par contre, on observe un retard de la
maturation des lymphocytes B compris dans les ganglions lymphatiques des
souris B7.2 Tg aux jours 10 et 20, ce qui a aussi été dénoté au niveau
splénique chez ces animaux.
47
Figure 8- Population des lymphocytes B des ganglions lymphatiques
périphériques chez les souris B7.2 transgéniques à différents âges. Les
cellules des ganglions lymphatiques périphériques ont été marquées avec des
anticorps anti-B220 et anti-IgM et analysées en cytométrie de flux.
A)
Expression des molécules B220 et IgM sur les cellules des ganglions
lymphatiques. La fréquence des cellules B220+ IgM- et B220+ IgM+ chez les
souris Ctrl et B7.2 Tg de la lignée 27 est indiquée sur les profils B220 versus
IgM. B) Cinétique de la moyenne des nombres absolus des cellules B220+ en
fonction de l'âge des souris Ctrl (0) et B7.2 Tg de la lignée 27 (-). Les
valeurs représentées sur ce graphique ont été obtenues par analyse en
cytométrie de flux en sélectionnant les cellules B220+ comprises dans la
population des cellules vivantes. Les moyennes ont été obtenues à partir de
l'analyse de: jour 10 (Ctrl n=5 et B7.2 Tg n=7), jour 20 (Ctrl n=8 et B7.2 Tg
n=lO), jour 30 (Ctrl n=6 et B7.2 Tg n=ll),jour 60 (Ctrl n=2 et B7.2 Tg n=2)
et jour 90 (Ctrl n=9 et B7.2 Tg n=8).
48
Figure 8
A)
10
jours
vo _ _
~_~~~
M
20 jours
30 jours
60 jours
IgM
IgM
IgM
o
o
o
o
~--~----,
M
o
~
B7.2Tg
00...:o
IgM
B)
-:>'
4
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~
~
~
M
M
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~~ 2
u
~
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...
e
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~
,.Ci
1
0
0
V'l
N
0
V'l
V'l
t"'-
Âge des souris (jours)
0
0
49
Figure 9- Caractérisation phénotypique des lymphocytes B des ganglions
lymphatiques périphériques chez les souris B7.2 transgéniques à
différents âges. A) Expression des molécules CD21 et CD23 sur les cellules
exprimant le marqueur IgM.
Les cellules des ganglions lymphatiques
périphériques ont été marquées avec des anticorps anti-IgM, anti-CD21 et
anti-CD23 aux jours 10, 20, 30 et 60 et analysées en cytométrie de flux. Les
profils CD21 versus CD23 chez les souris Ctrl (panneaux de gauche) et les
souris B7.2 Tg de la lignée 27 (panneaux de droite) ont été obtenus en
sélectionnant les cellules IgM+.
Les nombres indiquent la fréquence des
cellules retrouvées dans chaque quadrant. Le nombre de souris utilisées pour
chaque période analysée est: jour 10 (Ctrl n=5 et B7.2 Tg n=7), jour 20 (Ctrl
n=8 et B7.2 Tg n=10), jour 30 (Ctrl n=6 et B7.2 Tg n=ll) et jour 60 (Ctrl n=2
et B7.2 Tg n=2). B) Expression des molécules IgM et B7.2 sur les cellules
exprimant le marqueur B220.
Les cellules des ganglions lymphatiques
périphériques ont été marquées avec des anticorps anti-B220, anti-IgM et
anti-B7.2 aux jours 10, 20 et 30 et analysées en cytométrie de flux.
Les
profils IgM versus B7.2 chez les souris Ctrl (panneaux de gauche) et les
souris B7.2 Tg de la lignée 27 (panneaux de droite) ont été obtenus en
sélectionnant les cellules B220+. Le nombre de souris utilisées pour chaque
période analysée est: jour 10 (Ctrl n=2 et B7.2 Tg n=3), jour 20 (Ctrl n=2 et
B7.2 Tg n=3) et jour 30 (Ctrl n=4 et B7.2 Tg n=5).
50
Figure 9
A)
B)
Ctrl
10 jours
~0
u..:-
0
B7.2 Tg
10 jours
0
0
~
V
V
;:!
~
-
M
M
~
0
20 jours
~0
20 jours
0
U..:~
0
~o
-
!P-
~
0
0
~
V
~
-
M
0
30 jours
N
30 jours
~o
!P-
O
U
M
o
60 jours
~0
u..:-0..;-~~~--1
0
CD23
B7.2
t8
.:;~.
).::;;,:~:.:
~
.
.
.
..
')'\',
":: ..
..
'
51
3.7 Retard de la maturation des lymphocytes B chez les souris B7.2
transgéniques de la lignée 7 âgées de vingt jours.
Afin de vérifier si le retard de la maturation des lymphocytes B chez les
jeunes souris B7.2 Tg de la lignée 27 n'est pas causé par un défaut de
développement relié à une insertion aberrante du transgène B7.2 dans le
génome des animaux de cette lignée, nous avons analysé la population de
cellules B chez des souris B7.2 Tg de la lignée 7 âgées de vingt jours.
Rappelons que la molécule B7.2 est exprimée à des niveaux modéré et élevé à
la surface des lymphocytes B matures chez les souris B7.2 Tg des lignées 27
et 7 respectivement.
En premIer lieu, il est important de mentionner qu'une déplétion des
lymphocytes B est observée dans la moelle osseuse et la rate des souris B7.2
Tg de la lignée 7 au jour 20, mais pas dans les ganglions lymphatiques de ces
même animaux (résultats non-montrés). Ces résultats concordent avec ceux
obtenus chez les souris B7.2 Tg de la lignée 27 à cette période (sections 3.4 à
3.6). Nous avons caractérisé le niveau de maturité des cellules B comprises
dans les organes lymphoïdes secondaires des jeunes souris Ctrl et B7.2 Tg de
la lignée 7 à l'aide d'un marquage avec des anticorps anti-IgM, anti-CD21 et
anti-CD23. On constate qu'un retard de maturation des cellules B est dénoté
chez les jeunes souris de la lignée 7 âgées de vingt jours.
En effet, on
observe beaucoup plus de cellules B immatures (IgM+ CD21- CD23- et IgM+
CD21- CD23+) dans la rate et dans les ganglions lymphatiques des souris B7.2
Tg de la lignée 7 que dans les organes lymphoïdes périphériques des souris
Ctrl (figure 10).
Le délai au niveau de la maturation des lymphocytes B chez les souris
B7.2 Tg de la lignée 27 ne découle donc pas d'une insertion aberrante du
transgène B7.2 dans le génome de ces animaux.
52
Figure 10- Caractérisation phénotypique des lymphocytes B chez les
souris B7.2 Tg de la lignée 7 âgées de vingt jours.
Les cellules de la rate (A) et des ganglions lymphatiques périphériques (B)
ont été marquées avec des anticorps anti-IgM, anti-CD21 et anti-CD23 au
jour 20 et analysées en cytométrie de flux. Les profils CD21 versus CD23
chez les souris Ctrl et B7.2 Tg de la lignée 7 ont été obtenus en sélectionnant
les cellules IgM+. Les nombres indiquent la fréquence des cellules retrouvées
dans chaque quadrant.
Ces résultats sont représentatifs des analyses
effectuées sur 1 souris Ctrl et 2 souris B7.2 Tg.
53
Figure 10
A) Rate
Ctrl
B7.2
9 60
19 12
11 17
54 18
B) Ganglions lymphatiques
51
32
CD23
54
3.8 La déplétion des lymphocytes B chez les souris B7.2 transgéniques
est dépendante de la spécificité antigénique.
Il a été démontré auparavant que la déplétion des cellules B chez les souris
B7.2 Tg est dépendante de l'interaction entre la molécule B7.2 et le récepteur
CD28 exprimé par les lymphocytes T (Fournier et al., 1997). Afin d'évaluer
1'importance de l'interaction entre le TcR et le complexe CMH/peptide dans
l'élimination des lymphocytes B B7.2 Tg engendrée par le système
B7.2/CD28, nous avons croisé les souris B7.2 Tg de la lignée 27 avec des
souris OT-1 Tg. Les souris OT-1 Tg sont originellement générées en
introduisant par transgénèse des inserts codant pour des éléments Va2 et Vp5
du TcR, ce qui facilite par la suite la visualisation en cytométrie de flux des
cellules ayant acquis le transgène OT-1 par 1'utilisation d'anticorps anti-Va2
ou anti-Vp5. Ces souris possèdent des TcRs transgéniques spécifiques aux
résidus 257 à 264 de la molécule d'ovalbumine présentés dans le contexte H2Kb . Ce système permet donc de vérifier si la spécificité de l'antigène présenté
par les lymphocytes B aux cellules T CD8+ est importante dans le mécanisme
de déplétion des lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg.
On peut voir en figure lIA que la quasi-totalité des lymphocytes T CD8+
dans les ganglions lymphatiques des souris OT-1 Tg et OT-I1B7.2 db Tg
expriment le marqueur Va2, ce qui signifie que ces cellules ont acquis le
transgène OT-1. De plus, il est important de mentionner que la génération
des lymphocytes T CD8+ est favorisée lors du développement des cellules T
dans les souris ayant acquis le transgène OT-l, où les cellules T CD8+ y sont
d'environ 8 à 13 fois plus nombreux que les cellules T CD4+ (résultats nonmontrés). La contribution des cellules T CD4+ à un éventuel signal 1 est
donc minime chez les souris OT-1 Tg et les souris OT-I1B7.2 db Tg.
On constate que contrairement aux souris B7.2 Tg adultes où la déplétion
des lymphocytes B est apparente autant dans la moelle osseuse, la rate et les
55
ganglions lymphatiques périphériques, le nombre absolu des lymphocytes B
dans ces trois organes lymphoïdes est normal chez les souris adultes OT-I Tg
et OT-lIB7.2 db Tg, (figure lIB).
De plus, on constate que les profils
IgM/CD211CD23 sont assez semblables dans la rate et les ganglions
lymphatiques des souris adultes OT-I Tg et OT-lIB7.2 db Tg (figure IIC).
On peut donc conclure que la déplétion des lymphocytes B B7.2 Tg
semble se produire seulement lorsque le répertoire de cellules Test
polyclonal.
De plus, une plus grande proportion de lymphocytes B
folliculaires est observée dans la rate des souris adultes OT-lIB7.2 db Tg
comparativement aux souris adultes B7.2 Tg.
56
Figure 11- Population des lymphocytes B chez les souris adultes OT-ll
B7.2 double transgéniques. A) Expression des molécules CD8 et Va2 sur
les cellules des ganglions lymphatiques. Les cellules ont été marquées avec
des anticorps anti-CD8 et anti-Va2 et analysées en cytométrie de flux. Les
nombres indiquent la fréquence des cellules retrouvées dans chaque quadrant
pour les souris OT-l Tg, OT-1IB7.2 db Tg et B7.2 Tg de la lignée 27. B)
Expression des molécules B220 et IgM sur les cellules de la moelle osseuse
(provenant d'un fémur et d'un tibia), de la rate et des ganglions lymphatiques
périphériques. Les cellules ont été marquées avec des anticorps anti-B220 et
anti-IgM et analysées en cytométrie de flux.
Les nombres situés au coin
supérieur indiquent la fréquence des cellules retrouvées dans chaque quadrant
et le nombre situé au coin inférieur indique le nombre absolu des cellules
B220+ pour les souris OT-l Tg, OT-l Tg!B7.2 db Tg et B7.2 Tg de la lignée
27. C) Expression des molécules CD21 et CD23 sur les cellules exprimant le
marqueur IgM.
Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques
périphériques ont été marquées avec des anticorps anti-IgM, anti-CD21 et
anti-CD23 et analysées en cytométrie de flux. Les nombres indiquent la
fréquence des cellules retrouvées dans chaque quadrant pour les souris OT-l
Tg, OT-1IB7.2 db Tg et B7.2 Tg de la lignée 27.
Ces résultats sont
représentatifs des analyses effectuées sur 1 souris OT-l Tg, 1 souris OT-l Tg!
B7.2 db Tg et 1 souris B7.2 Tg de la lignée 27. Les souris étaient âgées de
.
SIX
.
semames.
57
Figure 11
A)
OT·I Tg
B)
_--.----1--,
"'0
M
OT·II B7.2 db Tg
B7.2Tg
OT.l/B7.2 db Tg
B7.2 Tg
o
Ne_~
Moelle osseuse
o
Rate
....o -.......--~-.
M
e
"'o~~
Ganglions
lymphatiques
OT·l Tg
C)
'V"o
_---.--+---.
M
o
N
Rate
o
'V"O
_ - _ - - - I I - -....
(')
Ganglions
lymphatiques
e
N
o
.-4
ë
CD23
58
3.9 Immaturité des lymphocytes B chez les souris OT-IIB7.2 double
transgéniques âgées de vingt jours.
Il a été démontré précédemment chez les souris adultes OT-IIB7.2 db Tg
que le nombre absolu des lymphocytes B est normal et que leur phénotype est
mature. Afin de vérifier si les lymphocytes B B7.2 Tg présentaient un retard
de maturation chez les souris OT-IIB7.2 db Tg âgées de vingt jours, nous
avons analysé les cellules B de la moelle osseuse, la rate et les ganglions
lymphatiques de ces animaux par un premier marquage avec des anticorps
anti-B220 et anti-IgM ainsi que par un second marquage à l'aide des
anticorps anti-IgM, anti-CD21 et anti-CD23. En premier lieu, on peut voir au
tableau 1 que le nombre absolu des cellules B n'est pas réduit de façon
significative dans la moelle osseuse des souris OT-l/B7.2 db Tg âgées de
vingt jours, où celui-ci est de 22 Xl 06 cellules B chez ces souris
comparativement à 28 XIQ6 cellules B chez les souris OT-l Tg du même âge.
De plus, aucune déplétion significative n'est dénotée au niveau splénique et
dans les ganglions lymphatiques des souris OT-IIB7.2 db Tg au jour 20
(résultats non-montrés). Par contre, l'analyse de l'expression des marqueurs
CD21 et CD23 montre que les cellules IgM+ présentent toujours un retard de
maturation dans la rate et les ganglions lymphatiques des souris OT-IIB7.2
db Tg âgées de vingt jours (figure 12).
On peut donc conclure que la déplétion des lymphocytes B B7.2 Tg
semble se produire en présence d'un réceptoire polyclonal de cellules T mais
que le délai de la maturation des cellules B peut être observé lorsque le
répertoire des cellules T est restreint chez les souris OT-IIB7.2 db Tg âgées
de vingt jours.
59
Tableau 1 Nombres absolus des lymphocytes B de la moelle osseuse chez
différentes souris âgées de vingt jours.
Moelle osseuse
Souris
Ctrl
n
8
!
15 ± 3
1
B7.2Tg
10
1
3±2
-------------------------------------------------- --------------------------1------------------------------------------------------------------------OT-I Tg
2
1
28 ± 1
_________g_!:lL~.z:~_~~_I_~__________ ____________~__________J________________________________ ~_~_i__~____________________________
Les résultats ont été obtenus par l'analyse en cytométrie de flux des cellules de la
moelle osseuse marquées avec un anticorps anti-B220-FITC. Le nombre absolu
de cellules B a été obtenu en sélectionnant les cellules B220+. n représente le
nombre de souris analysées pour chaque génotype.
60
Figure 12- Caractérisation phénotypique des lymphocytes B chez les
souris OT -11B7.2 db Tg âgées de vingt jours.
Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques périphériques ont été
marquées avec des anticorps anti-IgM, anti-CD21 et anti-CD23 au jour 20 et
analysées en cytométrie de flux.
Les nombres indiquent la fréquence des
cellules retrouvées dans chaque quadrant pour les souris Ctrl et B7.2 Tg de la
lignée 27 des génotypes normal et OT-1 Tg. Les profils CD21 versus CD23
ont été obtenus en sélectionnant les cellules IgM+.
Ces résultats sont
représentatifs des analyses effectuées sur 8 souris Ctrl, 10 souris B7.2 Tg, 2
souris OT-1 Tg et 3 souris OT-1 Tg/B7.2 db.
61
Figure 12
Rate
Normale
OT-l Tg
CD23
Ganglions lymphatiques
62
4- Discussion et conclusion
4.1 La contrepartie physiologique de l'étude des souris B7.2
transgéniques.
Les recherches effectuées par deux groupes de recherche indépendants
(Fournier et al., 1997; Van Parijs et al., 1997) sur les souris B7.2 Tg ont
révélé une nouvelle fonction attribuée au système B7.2/CD28, soit la
régulation de l 'homéostasie des cellules B.
En effet, l'expression
transgénique et constitutive de la molécule B7.2 par les lymphocytes B chez
ces souris cause une déplétion marquée de ceux-ci dans la moelle osseuse
(Fournier et al., 1997; Van Parijs et al., 1997) et en périphérie (Fournier et
al., 1997). Physiologiquement, la déplétion des cellules B B7.2 Tg reflèterait
un moyen utilisé par le système immunitaire afin d'éliminer les lymphocytes
B exprimant un niveau trop élevé de la molécule B7.2, ces derniers pouvant
occasionner d'éventuels désordres auto-immuns en périphérie (Van Parijs et
al., 1997). Il a été démontré récemment que CD80 est détectable à la surface
des cellules pro-B et pré-B fraîchement isolées et que l'expression de CD86
est induite chez ces mêmes populations cellulaires suite à une stimulation à
l'IL-7 (Gray et al., 2002). L'étude des souris B7.2 Tg, où la molécule B7.2
est exprimée à un degré élevé à la surface des lymphocytes B de la moelle
osseuse, est donc un modèle ayant une pertinence physiologique.
Le système de déplétion des lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg,
rapporté originellement par Fournier et al., n'est pas la seule molécule de
costimulation à être impliquée dans la régulation de l 'homéostasie des
cellules B. En effet, Van Parijs et ses collègues ont relaté un phénomène
similaire chez les souris B7.l Tg, et ce en plus de corroborer les résultats de
Fournier et al. en ce qui a trait aux souris B7.2 Tg (Van Parijs et al., 1997).
De plus, Gray et al. rapportent que les cellules stromales ont la capacité
d'exprimer CD28, et que l'engagement de ce récepteur aurait un effet négatif
63
sur l'habileté des cellules stromales à supporter l'expansion in vitro des
cellules pro-B (Gray et al., 2002). Un autre groupe, Arens et al., observe
quant à lui que l'interaction entre CD27 et son ligand CD70 cause une
expansion des cellules T effectrices, ces dernières éliminant les lymphocytes
B CD70 Tg dans les organes lymphoïdes primaires et secondaires par leur
production d'INFy (Arens et al., 2001). De plus, Zhu et al. démontrent aussi
une déplétion des cellules B dans la rate et les ganglions lymphatiques chez
les souris 4-1 BBL Tg (Zhu et al., 2001). En outre, la protéine CD24, ou
HSA, peut agir à titre de régulateur négatif dans le développement des
cellules B en causant l'apoptose de celles-ci (Taguchi et al., 2003).
Finalement, Martinez-Barnetche et al. proposent l'implication du système
CD40/CD40L dans le processus de sélection négative des lymphocytes B,
ayant observé l'absence de cellules pro-B dans la moelle osseuse des souris
adultes CD40L Tg ainsi que le manque de cellules B dans les organes
lymphoïdes périphériques de ces souris (Martinez-Barnetche et al., 2002).
L'implication
des
molécules
costimulatrices
dans
la
régulation de
l'homéostasie des lymphocytes B s'observe donc dans plusieurs systèmes, ce
qui renforce la pertinence de l'étude du modèle de souris B7.2 Tg de Fournier
et al.
4.2 L'implication d'un mécanisme apoptotique dans la déplétion des
lymphocytes B B7.2 transgéniques.
La section 3 de ce mémoire de maîtrise s'intéresse en premier lieu à
l'implication d'un mécanisme apoptotique dans la déplétion des lymphocytes
B B7.2 Tg. Il a été démontré préalablement que la population de cellules B
dans les souris B7.2 Tg est restaurée lorsque la molécule Bcl-2 est exprimée
de façon constitutive chez les lymphocytes B (Blanchette, 2001). En effet, la
protéine Bcl-2 est une molécule anti-apoptotique régulant l'activation des
caspases dans le processus d'apoptose, établissant ainsi une balance entre la
64
survie et la mort cellulaire programmée chez les lymphocytes (Cory et
Adams, 2002). Nous avons donc voulu connaître la voie apoptotique jouant
le rôle de médiatrice dans la déplétion des cellules B chez les souris B7.2 Tg.
Un mécanisme bien connu conduisant à l'apoptose des lymphocytes
implique l'interaction entre Fas et FasL (Krammer, 2000). Il a en effet été
rapporté que les cellules T CD4+ peuvent induire la mort cellulaire
programmée des lymphocytes B activés par cette voie (Rathmell et al., 1995;
Nagata et Golstein, 1995). Cependant, il a été démontré par Fournier et ses
collègues que le nombre de lymphocytes B est le même chez les souris B7.2
Tg que chez les souris B7.2 Tg lpr/lpr, ces dernières ayant une mutation dans
le gène codant pour la molécule Fas qui empêche celle-ci de générer un signal
intracellulaire.
Ceci a permis de conclure que la déplétion des cellules B
B7.2 Tg est indépendante de la voie apoptotique Fas/FasL (Fournier et al.,
1997). Un autre système pouvant engendrer la mort cellulaire programmée
des lymphocytes B est celui impliquant les molécules TNF-a et TNFR-l
(Sedger et al., 2002).
Tel que décrit à la section 3.1, une déplétion des
cellules B est toujours observée chez les souris TNFR-l -/- B7.2 Tg (figure
1), ce qui nous amène donc à rejeter l'hypothèse voulant que la voie
apoptotique TNF/TNFR-l soit la médiatrice de la déplétion des lymphocytes
B B7.2 Tg. En outre, nous avons écarté la possibilité que le second récepteur
pour la molécule TNF-a, soit TNFR-2, soit impliqué dans la déplétion des
cellules B chez les souris B7.2 Tg, car ce récepteur n'est pas exprimé par les
lymphocytes B de la moelle osseuse (Smith et al., 1994).
Plusieurs possibilités peuvent être explorées en ce qui concerne l'apoptose
des cellules B enclenchée par des réactions récepteurs-ligands produites entre
les lymphocytes B et les cellules T chez les souris B7.2 Tg. Le principal
mécanisme dont se servent les cellules T cytotoxiques pour induire l' apoptose
chez leurs cellules cibles est le relâchement de granules lytiques contenant les
protéines perforine et granzymes (Shresta et al., 1998). Ensuite, il a été
démontré que la sécrétion d'INFy par les cellules T dans la moelle osseuse
65
peut empêcher la production d'IL-7 par les cellules stromales, stopper la
prolifération des cellules pré-B et causer la mort de ces dernières par apoptose
(Garvy et Riley, 1994). De plus, un nouveau mécanisme menant au suicide
cellulaire des lymphocytes B a été découvert récemment, soit la liaison de la
cytokine IL-2l produite par les cellules T au récepteur IL-2IR exprimé par
les cellules B.
En effet, il a été publié que la stimulation in vitro de
lymphocytes B au repos ou activées à l'aide d'IL-2l peut amener la mort
cellulaire programmée de ceux-ci (Mehta et al., 2003). En outre, la protéine
CD24, ou HSA, peut réguler de façon négative le développement des cellules
B en causant leur apoptose (Taguchi et al., 2003). Finalement, il ne faut pas
omettre la possibilité que l'apoptose des cellules B B7.2 Tg soit causée par
une molécule encore inconnue.
Afin de tester si les molécules énumérées dans le paragraphe précédent
sont à l'origine de la mort par apoptose des lymphocytes B chez les souris
B7.2 Tg, il aurait été pertinent de mettre au point un système in vitro qui
simulerait la déplétion des cellules B observée chez ces animaux. Ce système
aurait permis de bloquer directement les récepteurs de ces molécules à la
surface de cellules B de la moelle osseuse de souris B7.2 Tg et de voir si cette
action peut contrer leur déplétion. Nous avons tenté à de multiples reprises
de reproduire in vitro ce mécanisme en mettant en culture des cellules
stromales de la lignée S 17 (Collins et Dorshkind, 1987), des cellules T de
type sauvage et des lymphocytes B de la moelle osseuse provenant de souris
TcR~
-/- B7.2 Tg. Ce système in vitro incluait aussi du surnageant contenant
de l'IL-7 préalablement sécrété par un hybridome J558L-IL-7 mis en culture
(Winkler et al., 1995).
Nous avons testé plusieurs concentrations de ce
surnageant IL-7 ainsi que diverses conditions prenant en ligne de compte la
quantité de cellules à mettre en culture et différentes périodes d'incubation.
Malheureusement, nous n'avons pas observé la déplétion des lymphocytes B
B7.2 Tg par cette méthode in vitro.
66
4.3 La participation des lymphocytes T CD4+ et CDS+ dans la déplétion
des lymphocytes B chez les souris B7.2 transgéniques.
Une variable indispensable dans l'accomplissement de la déplétion des
cellules B B7.2 Tg est la présence des lymphocytes T (Fournier et al., 1997).
Nous avons donc voulu connaître la contribution des sous-populations de
cellules T CD4+ et CD8+ dans ce mécanisme. Il est décrit à la section 3.2 de
ce manuscrit que les deux sous-populations de lymphocytes T semblent
participer à la déplétion des cellules B B7.2 Tg. Par contre, les cellules T
CD4+ sembleraient plus efficaces que les cellules T CD8+ dans l'élimination
des lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg.
En effet, on observe une
déplétion beaucoup plus marquée des cellules B chez les souris p2-m -/- B7.2
Tg que chez les souris I-Ap -/- B7.2 Tg (figures 2 et 3).
Nous avons réalisé par la suite que les souris p2-m -/- B7.2 Tg n'étaient
peut-être pas le meilleur modèle pour analyser la déplétion des cellules B
B7.2 Tg en présence exclusive de cellules T CD4+. En effet, la théorie du
"missing self' propose que l'interaction entre une cellule NK et sa cellule
cible mène à la lyse de la cellule cible sauf si cette dernière exprime les
molécules du CMH de classe l, ces dernières ayant pour effet d'engager des
récepteurs inhibiteurs spécifiques à la surface de la cellule NK (Natarajan et
al., 2002). Chez les souris p2-m -/-, les molécules du CMH de classe 1 ne
sont pas exprimées à la surface des cellules B, ce qui pourrait causer leur lyse
cellulaire par les cellules NK. De plus, le récepteur CD28 est présent à la
surface des cellules NK et a donc la possibilité d'interagir avec la molécule
B7.2 exprimée sur les lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg. Ces éléments
pourraient peut-être expliquer la déplétion si sévère des lymphocytes B
observée chez les souris p2-m -/- B7.2 Tg. Dans le but de mesurer l'effet réel
causé par la présence exclusive de lymphocytes T CD4+ sur la déplétion des
cellules B B7.2 Tg, il serait approprié d'utiliser un modèle de souris
déficientes pour la molécule CD8.
67
Une critique peut être apportée en ce qui a trait aux résultats observés lors
de l'analyse des cellules B comprises dans les ganglions lymphatiques
périphériques des souris I-Ap -/- B7.2 Tg.
En effet, une déplétion des
lymphocytes B B7.2 Tg est visible en terme de fréquence dans les ganglions
lymphatiques de ces souris, alors que le pourcentage des cellules B y est de
18 % comparativement à 44 % chez les souris I-Ap -/- (section 3.2, figure
3C). Par contre, cette déplétion n'est pas claire en terme de nombre absolu,
où les valeurs fluctuent dans un intervalle très large. Ces résultats confus
pourraient être expliqués en partie par le fait qu'une expansion des cellules T
CD8+ a lieu dans les souris I-Ap -/- B7.2 Tg, ce qui peut fausser les données
en nombre absolu des lymphocytes B dans ces souris (Nicol, 2001).
On peut donc conclure sur ce volet du projet que les lymphocytes T CD8+
semblent avoir la capacité de participer à la déplétion des cellules B dans la
moelle osseuse et la rate des souris I-Ap -/- B7.2 Tg. Par contre, on ne peut
pas tirer de conclusion définitive en ce qui a trait au rôle joué par les
lymphocytes T CD4+ dans le mécanisme de déplétion des cellules B B7.2 Tg.
4.4 La cinétique de l'ontogénie des lymphocytes B chez les souris B7.2
transgéniques.
Une grande partie de ce mémoire de maîtrise est consacrée à l'hypothèse
voulant que la déplétion des lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg soit due à
un arrêt du développement des cellules B exprimant de façon constitutive
B7.2. En effet, nous avions observé que la population de lymphocytes B
restaurée chez les souris Bcl-2/B7.2 db Tg est en majorité composée de
cellules immatures (Blanchette, 2001). Nous avons donc effectué la cinétique
de l'ontogénie des lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg de la lignée 27 de
la naissance à l'âge adulte afin de mieux comprendre la déplétion des cellules
B chez ces souris.
68
En premier lieu, on ne voit pas de déplétion des cellules B dans le foie des
souris B7.2 Tg néonatales, ce qui suggère que ce processus n'est pas un
événement prénatal (section 3.3, figure 4).
Ensuite, on observe que les
cellules B provenant de la rate des souris B7.2 Tg montrent déjà un retard de
maturation au jour 2, et ce alors qu'aucune déplétion des lymphocytes B B7.2
Tg ne soit observée à cette période (section 3.5, figure 7A). Puis on constate
qu'une déplétion des lymphocytes B se produit dans la moelle osseuse des
souris B7.2 Tg âgées de dix jours ainsi que dans la rate au jour 20 (section
3.4, figure 5; section 3.5, figure 6), mais seulement au jour 60 dans les
ganglions lymphatiques périphériques (section 3.6, figure 8).
De plus,
l'immaturité des cellules B est flagrante dans la rate et les ganglions
lymphatiques des souris B7.2 Tg âgées de dix et vingt jours (section 3.5,
figure 7A; section 3.6, figure 9A). Le nombre absolu de cellules B dans la
rate et la moelle osseuse des souris B7.2 Tg demeure par la suite toujours plus
bas que le nombre absolu des cellules B dans la moelle osseuse et la rate des
souris Ctrl suivant le jour 10 et 20 (section 3.5, figure 6; section 3.4, figure
5), alors qu'une réduction du nombre des cellules B B7.2 Tg n'est observée
qu'à partir du jour 60 dans les ganglions lymphatiques (section 3.6, figure 8).
Finalement, les lymphocytes B présentent un phénotype mature dans la rate et
les ganglions lymphatiques des souris B7.2 Tg aux jours 30 et 60 (section 3.5,
figure 7A; section 3.6, figure 9A). À la lumière de ces observations, il est
clair que les cellules B chez les jeunes souris B7.2 Tg de la lignée 27
présentent un retard de maturation comparativement aux lymphocytes B chez
les jeunes souris de type sauvage.
Notre première hypothèse était que la déplétion des lymphocytes B en
périphérie chez les souris B7.2 Tg découlerait d'un arrêt du développement
de ceux-ci dans la moelle osseuse. À la suite de l'élaboration de la cinétique
de l'ontogénie des lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg, on constate
qu'effectivement un système visant à éliminer les lymphocytes B exprimant
69
un niveau trop élevé de la molécule B7.2 semble se produire au niveau de la
moelle osseuse.
Une première observation suggérant qu'un arrêt du
développement des lymphocytes B B7.2 Tg se produit dans cet organe
lymphoïde central est le fait qu'au jour 10, on observe très peu de cellules B
IgM+ au niveau splénique (section 3.5, figure 6A). L'expression des chaînes
lourdes et légères du BCR étant des évènements se produisant initialement au
niveau du développement des lymphocytes B dans la moelle osseuse
(Janeway, 2001), cette pénurie de cellules B220+ IgM+ dans la rate des souris
B7.2 Tg au jour 10 est probablement due à une déplétion préalable des
lymphocytes B dans la moelle osseuse. Il est important ici de mentionner une
fois de plus qu'aucune déplétion des cellules B n'est observée dans la rate des
souris B7.2 Tg âgées de deux et dix jours, alors que la déplétion des
lymphocytes B B7.2 Tg est constatée au jour 10 dans la moelle osseuse
(section 3.4, figure 5; section 3.5, figure 6).
Il est regrettable que nous
n'ayons pu étudier les cellules B comprises dans la moelle osseuse avant le
jour 10, car nous y aurions peut-être observé une déplétion des lymphocytes
B B7.2 Tg.
Dans ce même ordre d'idées, il est surprenant d'observer autant de cellules
B IgM- au jour 10 dans la rate des souris B7.2 Tg (section 3.5, figures 6A et
7C).
En effet, il a été démontré que l'expression de la chaîne lourde
d'immunoglobuline du pré-BcR ainsi que des chaînes lourdes et légères du
BcR sont des étapes primordiales dans le développement des lymphocytes B
afin d'assurer leur survie et leur passage en périphérie (Torres et a!., 1996;
Lam et al., 1997). Une question émerge alors: quel sera le destin de ces
cellules B IgM - ayant atteint la rate des souris B7.2 Tg au jour 10? D'un
point de vue spéculatif, ces lymphocytes B pourraient être éliminés, car il est
difficile d'imaginer qu'ils puissent atteindre le pool de cellules matures s'ils
n'expriment pas de récepteurs de cellules B (BcR). Les lymphocytes B IgM+
observés aux périodes analysées suivant le jour 10 dans la rate et les
ganglions lymphatiques périphériques des souris B7.2 Tg (section 3.5, figures
70
6A et 7C; section 3.6, figures 8A et 9B) pourraient dériver de deux
précurseurs: soit elles proviennent de la maturation des quelques cellules B
IgM+ observées au jour 10 dans la rate (section 3.5, figures 6A et 7C), soit
elles découlent de nouvelles cellules B B7.2 Tg exprimant la molécule IgM
qui ont été générées dans la moelle osseuse entre les jours 10 et 20.
Finalement, il est possible que ces cellules B IgM+ observées après le jour 10
dans la rate et les ganglions lymphatiques des souris B7.2 Tg proviennent des
deux précurseurs mentionnés ci-haut.
Le fait qu'aucune déplétion des cellules B de la zone marginale de la rate
ne soit observée chez les souris B7.2 Tg est une seconde observation qui
suggère qu'un arrêt du développement des lymphocytes B se produit au
niveau de la moelle osseuse de ces animaux. En effet, on constate que la
fréquence des cellules IgM+ CD21 élevé CD23 bas , phénotype correspondant ici
aux lymphocytes B de la zone marginale de la rate, est beaucoup plus élevée
chez les souris B7.2 Tg que chez les souris Ctrl (section 3.5, figure 7A).
D'autres modèles murins, présentant des perturbations au niveau du
développement central des lymphocytes B et rapportés dans la littérature, ont
aussi démontré que les cellules B de la zone marginale de la rate peuvent
survivre malgré un problème de développement des lymphocytes B dans la
moelle osseuse de ces animaux. En premier lieu, on peut citer le modèle de
souris déficientes pour la molécule IL-7, où une déplétion des cellules B est
observée dans la moelle osseuse et la rate de ces souris dès la naissance, et où
les lymphocytes B persistant à l'âge adulte sont des cellules B activées
correspondant au phénotype des cellules B de la zone marginale (Carvalho et
al., 2001). Ensuite, on peut mentionner le système de souris transgéniques
RAG-2
tl/dei,
où le gène codant pour la molécule Rag-2 peut être inactivé de
façon permanente au moment voulu, ce qui résulte en l'absence de production
de lymphocytes B par la moelle osseuse (Hao et Rajewsky, 2001).
On
constate que la déplétion des cellules B folliculaires mais la maintenance des
cellules B de la zone marginale dans la rate se produisent chez ces souris
71
adultes (Hao et Rajewsky, 2001). En outre, il est important de mentionner
que l'observation des cellules de la zone marginale dans la rate au jour 30
chez les souris B7.2 Tg et de type sauvage est un phénomène
physiologiquement valable, car il a été démontré que ce type de lymphocytes
B est initialement visible chez la souris lorsque celle-ci est âgée d'un mois
(Loder et al., 1999).
La maintenance des cellules B de la zone marginale de la rate chez les
souris B7.2 Tg, le modèle murin déficient pour la molécule IL-7 (Carvalho et
al., 2001) et les souris RAG-2 tl/dei (Hao et Rajewsky, 2001) semble refléter
une riposte défensive de la part du système immunitaire dans ces modèles
expérimentaux. En effet, un manque de lymphocytes B folliculaires, causé
par un défaut dans le développement central des lymphocytes B, amènerait le
système à compenser cette perte d'effectifs en se dotant d'un arsenal de
lymphocytes B pouvant répondre vivement à d'éventuelles attaques.
Les
cellules B de la zone marginale de la rate représentent des candidates idéales
dans l'accomplissement de cette tâche, celles-ci étant situées dans un site
anatomique idéal (Martin et al., 2001) et ayant la capacité de se convertir
rapidement en cellules effectrices (Oliver et al., 1999).
Les résultats obtenus lors de l'élaboration de la cinétique de l'ontogénie
des lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg nous suggèrent donc qu'un arrêt
du développement des cellules B semble se produire au niveau de la moelle
osseuse de ces animaux. Cependant, ces observations proposent aussi qu'un
autre système, visant à éliminer les lymphocytes B IgM+ exprimant un niveau
trop élevé de la molécule B7.2 et ayant échappées à la déplétion dans la
moelle osseuse, se produise au niveau de leur maturation dans la rate. En
premier lieu, on observe qu'effectivement une large proportion de cellules B
exprimant un niveau élevé de la molécule B7.2 se retrouvent dans la rate des
souris B7.2 Tg âgées de deux, dix et vingt jours (section 3.5, figure 7C). En
parallèle, on voit aussi que plusieurs lymphocytes B B7.2élevé sont observés
72
dans les ganglions lymphatiques des souris B7.2 Tg aux jours 10 et 20
(section 3.6, figure 9B). De plus, on constate que les cellules B IgM+ CD21CD23-, qui présentent le phénotype des lymphocytes B transitionnels de type
1 ou Tl de la rate (Loder et al., 1999), semblent avoir de la difficulté à
atteindre un degré de maturation plus avancé car leur fréquence est beaucoup
plus élevée dans la rate des souris B7.2 Tg aux jours 2,10 et 20 qu'au niveau
splénique des souris Ctrl à ces mêmes périodes (section 3.5, figure 7A). De
plus, on observe que les cellules IgM+ se retrouvant dans les ganglions
lymphatiques des souris B7.2 Tg âgées de dix et vingt jours ne représentent
pas pour la plupart des lymphocytes B matures ou folliculaires ayant un
phénotype IgM+ CD21+ CD23+, mais sont soit des lymphocytes B Tl (IgM+
CD2r CD23-) ou des cellules immatures IgM+ CD21- CD23+ (section 3.6,
figure 9A). Ces derniers résultats nous incitent donc à considérer l'hypothèse
que deux systèmes pourraient agir chez les souris B7.2 Tg afin d'éliminer les
lymphocytes B exprimant un niveau trop élevé de la molécule B7.2, soit un
premier système se déroulant dans la moelle osseuse et un second processus
agissant au niveau de la maturation des cellules B dans la rate.
Un autre point intéressant observé dans la cinétique de l'ontogénie des
lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg est le niveau d'expression variable de
la molécule B7.2 par les cellules B en périphérie aux différentes périodes
analysées. En effet, la proportion observée de lymphocytes B B7.2élevé dans
la rate et les ganglions lymphatiques est inversement proportionnelle au
vieillissement de la souris B7.2 Tg (section 3.5, figure 7C; section 3.6, figure
9B). On constate donc que plus la souris B7.2 Tg prend de l'âge, plus la
déplétion des cellules B exprimant la molécule B7.2 à un niveau élevé
devient efficace. Ce phénomène pourrait être expliqué par le fait que très peu
de cellules T ont quitté le thymus et atteint la circulation chez les souris B7.2
Tg néonatales (résultats non-montrés). Fournier et al. ayant démontré que les
lymphocytes T sont essentiels à l'accomplissement de la déplétion des
cellules B chez les souris B7.2 Tg adultes (Fournier et al., 1997), on peut
73
donc supposer que les cellules T ne seraient pas en nombre suffisant dans la
circulation des souris B7.2 Tg âgées de deux et dix jours, ce qui expliquerait
l'absence de déplétion observée dans la rate de ces animaux à cette période.
Dans cet ordre d'idées, on constate que plus l'influx de cellules T dans la
circulation augmente avec la croissance de la souris, plus on observe une
amélioration de l'efficacité du mécanisme de déplétion des lymphocytes B
B7.2 Tg. En outre, il a été démontré que les cellules T ont atteint un état
fonctionnel leur permettant d'interagir avec les lymphocytes B chez les souris
néonatales (Astori et al., 1999). Il est donc peu probable que la capacité des
cellules T à interagir avec les lymphocytes B B7.2 Tg serait la cause de
l'absence de déplétion des lymphocytes B dans la rate des souris B7.2 Tg
âgées de deux et dix jours.
Un dernier aspect important à considérer dans cette section de la
discussion est le fait que la déplétion des lymphocytes B B7.2 Tg ne soit
visible dans les ganglions lymphatiques périphériques qu'au jour 60 (section
3.6, figure 8).
En effet, il est surprenant d'observer que la déplétion des
cellules B B7.2 Tg dans cet organe lymphoïde secondaire soit constatée à une
période aussi tardive, alors qu'elle est apparente dans la moelle osseuse au
jour 10 et dans la rate au jour 20 (section 3.4, figure 5; section 3.5, figure 6).
Il a été démontré dans un autre modèle murin que la déplétion des
lymphocytes B en périphérie, causée par l'absence d'un influx de cellules B
provenant de la moelle osseuse, a un effet beaucoup plus lent sur la baisse du
nombre de lymphocytes B dans les ganglions lymphatiques que dans la rate
(Hao et Rajewsky, 2001). Ceci pourrait peut-être expliquer que l'on observe
une déplétion aussi tardive des cellules B dans les ganglions lymphatiques
des souris B7.2 Tg.
74
4.5 L'importance de la spécificité antigénique dans la déplétion des
lymphocytes 8 87.2 transgéniques.
La dernière partie de ce manuscrit se consacre à l'importance de la
spécificité antigénique dans la déplétion des cellules B chez les souris B7.2
Tg de la lignée 27. Notre présomption initiale était que ce processus ne
nécessitait pas l'engagement du TcR par le complexe CMH Ipeptide.
Cependant, nous n'observons pas de déplétion des lymphocytes B dans les
souris adultes OT-ll B7.2 db Tg (section 3.8, figure liB). Ayant démontré
au préalable, par le biais des souris I-Ap -1- B7.2 Tg, que les lymphocytes T
CD8+ sont impliqués dans la déplétion des cellules B B7.2 Tg, nous sommes
en mesure d'affirmer que la spécificité de l'antigène présenté par le CMH de
classe 1 au TcR est importante dans l'accomplissement de ce mécanisme. Il
peut sembler étrange qu'aucune déplétion des lymphocytes B
ne soit
observée chez les souris OT-l/B7.2 db Tg, car il a été démontré auparavant
que des antigènes du Soi existent chez les souris OT-I Tg (Hogquist et al.,
1997; Santori et al., 2002). Cette observation est d'ailleurs logique, car la
présence d'antigènes du Soi est nécessaire à la sélection positive des cellules
T dans le thymus, et des lymphocytes T sont générés chez les souris OT-I Tg.
Certaines raisons peuvent expliquer l'absence de déplétion des cellules B
chez les souris OT-l/B7.2 db Tg malgré l'existence d'antigènes du Soi chez
ces souris, soit la rareté de ces molécules exprimées par le Soi dans ce
système, l'incapacité éventuelle des lymphocytes B à présenter ces peptides
ou la présentation à un degré insuffisant de ces antigènes du Soi par les
cellules B.
Certaines expériences pourraient faire suite aux études effectuées sur les
souris OT-l/B7.2 db Tg adultes. Par exemple, des souris OT-2/B7.2 db Tg,
qui possèderaient des TcRs transgéniques spécifiques aux résidus 323-339 de
la molécule d'ovalbumine dans un contexte I-Ab, nous permettraient
d'évaluer si une déplétion des cellules B B7.2 Tg a lieu en présence de
75
lymphocytes T CD4+ exprimant un TcR transgénique, et donc si la spécificité
antigénique est importante dans ce cas-ci. De plus, il serait intéressant de
croiser les souris B7.2 Tg de la lignée 27 avec des souris déficientes pour la
molécule H-2M afin d'étudier la déplétion des lymphocytes B B7.2 Tg
lorsqu'un seul type de molécule du Soi est présenté par les cellules Baux
lymphocytes T CD4+. En effet, le rôle de la protéine H-2M est de catalyser la
dissociation du fragment protéique CLIP de la chaîne invariante associée au
CMH de classe II, cette dernière étant impliquée dans le transport des
molécules du CMH II du réticulum endoplasmique aux endosomes (Janeway
et al., 2001). La molécule H-2M étant absente chez ces souris, il n'y a pas de
clivage entre le peptide CLIP et la chaîne invariante associée au CMH de
classe II. Les autres peptides ne peuvent donc pas s'associer avec la chaîne
invariante et être présentés par le CMH II à la surface cellulaire, et il en
résulte donc que les APCs de ces souris présentent aux cellules T CD4+
uniquement le complexe peptide CMH II/CLIP.
Toutefois, avant
d'entreprendre des expériences avec des souris OT-2/B7.2 db Tg et des souris
B7.2 Tg déficientes pour la molécule H-2M, il serait important de déterminer
si les lymphocytes T CD4+ ont bel et bien un rôle à jouer dans la déplétion
des cellules B chez les souris B7.2 Tg.
Les expériences chez les souris OT-IIB7.2 db Tg âgées de vingt jours nous
ont fourni des éléments très intéressants. En effet, on observe que malgré le
fait qu'aucune déplétion des lymphocytes B ne soit constatée au jour 20 dans
la moelle osseuse des souris OT-l/B7.2 db Tg (section 3.9, tableau 1), on
dénote quand même un retard de maturation des lymphocytes B dans la rate
et les ganglions lymphatiques de ces animaux (section 3.9, figure 12). Il
semblerait donc que 1'hypothèse voulant que deux mécanismes distincts
soient impliqués dans la déplétion des lymphocytes B B7.2 Tg soit
pertinente. Un premier système impliquerait les lymphocytes T, représentés
dans un répertoire de TcRs polyclonal, dans un processus actif d'élimination
des cellules B B7.2 Tg à la suite des signaux 1 (CMH:peptide/TcR) et 2
76
(B7.2/CD28) véhiculés entre les lymphocytes B et les cellules T. L'autre
système aurait pour effet de retarder la maturation des lymphocytes B B7.2
Tg et ne nécessiterait pas l'engagement du TcR par le complexe
CMH/peptide.
4.6 Conclusion
En résumé, ces travaux de maîtrise ont permis de préciser certains aspects
du phénomène de déplétion des lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg. En
premier lieu, le mécanisme apoptotique conduisant à la déplétion des cellules
B B7.2 Tg n'implique pas la voie TNF/TNFR-l. Ensuite, les lymphocytes T
CD8+ sont impliqués dans l'élimination des cellules B chez les souris B7.2
Tg. De plus, on observe un retard de la maturation des lymphocytes B au
niveau de la rate et des ganglions lymphatiques chez les jeunes souris B7.2
Tg. Ce délai de maturation des cellules B chez ces jeunes souris se produit
autant en présence d'un répertoire de TcRs restreint que polyclonal.
Finalement, un déficit de lymphocytes B matures folliculaires est observé
chez les souris adultes B7.2 Tg, alors que les cellules B de la zone marginale
de la rate ne sont pas affectées. Cette déplétion de lymphocytes B chez les
souris adultes B7.2 Tg se produit seulement en présence d'un répertoire de
TcRs polyclonal.
Deux processus immunologiques pourraient donc être à l'origine de la
déplétion des lymphocytes B chez les souris B7.2 Tg. Un premier processus
causerait un arrêt de maturation des cellules B au niveau de la rate et pourrait
s'avérer indépendant de l'interaction entre le TcR et le complexe
CMH/peptide. Un second processus, quand à lui, impliquerait l'engagement
des TcRs par les complexes CMH/peptide et le signal de costimulation
véhiculé entre la molécule B7.2 et son récepteur CD28.
77
En conclusion, les expériences effectuées sur le modèle de souris B7.2 Tg
mettent en évidence le rôle du système B7.2/CD28 dans le contrôle de
l 'homéostasie des lymphocytes B.
78
5. Remerciements
En premier lieu, j'aimerais remercier chaleureusement ma directrice de
recherche, Mme Sylvie Fournier, pour m'avoir permis d'évoluer au sein de
son laboratoire, pour m'avoir fait bénéficier de sa grande expertise durant
mes études graduées à l'Université McGill ainsi que durant mes stages
effectués lors de mon baccalauréat dans son laboratoire de l'Université de
Sherbrooke, et pour les nombreux conseils prodigués lors de la rédaction et
de la correction de ce mémoire ainsi que lors de la préparation de séminaires.
Ensuite, je tiens à remercier M. Marcel Brisebois, étudiant au doctorat que
j'ai eu le plaisir de côtoyer durant ces années passées au laboratoire, pour ses
multiples conseils dans le cadre de mes expérimentations.
Je tiens aussi à remercier Mlle Lei Zhu, étudiante à la maîtrise, qui m'a
offert son aide à de multiples reprises lors de mes expériences. l'aimerais
aussi remercier Mlle Cindy Chan ainsi que M. Dominic Martel, étudiants au
baccalauréat honorifique, qui m'ont également beaucoup aidé dans le cadre
de mon projet.
De plus, je tiens à remercier M. Jonathan Nicol ainsi que M. Alexandre
Blanchette, anciens étudiants gradués du laboratoire de Mme Fournier à
l'Université de Sherbrooke, pour m'avoir consacré de leur temps lors de mes
stages coopératifs.
Je voudrais aussi remercier le Dr Martin Olivier d'avoir participé à la
correction de ce mémoire de maîtrise.
Finalement, j'aimerais remercier les professeurs ainsi que les étudiants du
département de microbiologie et d'immunologie de l'Université McGill pour
leur aide et leur soutien durant mes études graduées.
79
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Annexe 1
Compliance of certification for mouse methodology workshop