Puce à ADN - Nguyen Hoai Tuong

Puce à ADN
Nguyen Hoai Tuong
[email protected]
Etudiant du Master 2 ECD 2007 - 2008
de l’Ecole Polytechnique
de l’Université de Nantes, France
Résumé: L’objectif de ce document est de décrire brièvement les concepts de base
utilisés dans la technologie de puce à ADN et de présenter les éléments essentiels
qui constituent cette technique ainsi que les différents domaines d’application de la
technologie des puces à ADN.
Mots-clés: Bioinformatique, puce à ADN
Abstract: This document describes in brief the basis concepts in the DNA
microarray technology and presents the essential elements that constitute this
technique and also his different application fields.
Keywords: Bioinformatic, DNA microarray

Table de Matière
1. INTRODUCTION ...........................................................................................................................................................3
2. DE LA CELLULE AU TRANSCRIPTOME................................................................................................................3
2.1. De la cellule à l’ADN.............................................................................................................................................3
2.2. De l’ADN au génome.............................................................................................................................................3
2.3. Du génome au transcriptome..................................................................................................................................4
3. PUCE A ADN...................................................................................................................................................................5
3.1. Définition................................................................................................................................................................5
3.2. Principe de la puce à ADN .....................................................................................................................................5
3.3. Types de Puce à ADN ............................................................................................................................................5
3.3.1. Les macroarrays ou filtres à haute densité........................................................................................................6
3.3.2. Les microarrays.................................................................................................................................................6
3.3.3. Les puces à oligonucléotides .............................................................................................................................7
3.3.4. Les puces à ADN pour étudier l’expression des gènes ......................................................................................7
3.3.5. Les puces à ADN pour étudier l’expression des gènes ......................................................................................7
3.4. La fabrication des puces à ADN.............................................................................................................................8
3.4.1. La fabrication de la puce...................................................................................................................................8
3.4.2. La fixation des sondes........................................................................................................................................9
3.4.2.1. Transfert de brins d’ADN..............................................................................................................................9
3.4.2.2. La synthèse in situ.......................................................................................................................................10
3.4.3. L'hybridation....................................................................................................................................................10
3.5. L’exploitation des données fabriquées .................................................................................................................10
3.5.1. La lecture.........................................................................................................................................................10
3.5.2. L’analyse des données .....................................................................................................................................10
3.5.3. Le regroupement en fonction du profil d’expression.......................................................................................11
3.6. Domaine d’application de Puce à ADN................................................................................................................11
3.6.1. La cancérologie...............................................................................................................................................11
3.6.2. La génomique...................................................................................................................................................12
3.6.3. Le criblage médicamenteux .............................................................................................................................12
3.6.4. La pharmaco-génomique.................................................................................................................................12
3.6.5. Le diagnostic clinique......................................................................................................................................12
3.6.6. L’identification et l’expertise médico-légale ...................................................................................................13
3.6.7. L’environnement..............................................................................................................................................13
3.6.8. Les applications dans le domaine de la guerre bactériologique ou chimique.................................................13
3.6.9. L’identification d’espèces animales dans l’alimentation humaine et animale.................................................13
3.7. Revers de Puce à ADN.........................................................................................................................................13
REFERENCES ......................................................................................................................................................................14

1. Introduction
Les puces à ADN offrent plusieurs avantages dans le diagnostique des maladies
génétiques avec une efficacité trés remarquable. Elles présentent une technique de
choix en biologie moléculaire et dans le séquençage des génes. Plusieurs
laboratoires ont développés des modèles d'assemblages pour rendre ces puces plus
pratiques. Dans le carde de stage du Master ECD 2007 – 2008, je travaille sur le
sujet « Méta-analyse de données de puces à ADN » sous la direction de M.Gérard
Ramstien, Professeur de l’Université de Nantes. La suite de ce document
présentera différentes étapes de la fabrication des puces à ADN, les éléments
essentiels qui constituent cette technique ainsi que les différents domaines
d’application de la technologie des biopuces.
2. De la cellule au transcriptome
2.1. De la cellule à l’ADN
La cellule est l’unité de base biologique Chez les organismes les plus simples,
l'information génétique n'est pas compartimenté dans un noyau vrai mais est
libre dans le cytoplasme. Pour les organismes les plus simples, l'information
génétique est compartimentée dans un noyau (présence d’un nucléaire). L'ADN
présent dans ce noyau est une molécule qui peut être gigantesque avec in
enchainement linéaire de millions de nucléotides (l'adénine - A, la cytosine - C, la
guanine - G et la thymine - T)
Figure 1
L'appariement des paires de nucléotides de type Watson et Crick (A et T d'une part,
C et G d'autre part) concourt à l'organisation de l'ADN en double hélice, dont
chaque brin a alors une séquence parfaitement complémentaire à l'autre. Cette
compartimenté est à la base de la plupart des techniques d'analyse en biologie
moléculaire.
2.2. De l’ADN au génome
L'unité de base du stockage de l'information génétique est le gène, petite séquence
d'ADN utilisée par la cellule pour synthétiser les protéines de structure, des
enzymes nécessaires à son fonctionnement (respiration, division cellule, croissance,
échanges, métabolisme...) ou des ARNs (ARNt, ARNr et divers petits ARN)

Les gènes sont des tailles de variable et sont disséminés le long de double brin
d'ADN de chacune des cellules. L'inventaire génique est alors défini comme
l'ensemble de ces gènes, dont le nombre peut varier suivant l'individu, de 6200
chez la levure à une trentaine de milliers chez la souris ou l'homme.
Le génome est donc de façon très simple, l'ensemble de la séquence des
chromosomes comprenant des gènes, des séquences répétées et des séquences
fonctionnelles telles que les télomères (extrémités des chromosomes eucavotes) ou
les origines de réplications des chromosomes par exemple.
2.3. Du génome au transcriptome
L'ARN obtenu dans le noyau est appelé ARN pré-messager ou précurseur car il
subira des maturations avant son transfert vers le cytoplasme (passage de
membrane nucléaire) ou il sera traduit en protéines par les ribosomes. La
traduction interprète chaque triplet de nucléotides (codon) de l'ARN pré-messager
en un acide aminé selon le code génétique universel: un codon donné correspond à
un acide aminé donné, et plusieurs codons peuvent coder pour le même acide
aminé (dégénérescence du code génétique).
Figure 2
Sachant qu'à partir d'un même gène, plusieurs copies d'ARN pré-messager
peuvent être produits à des niveaux différents en fonction de l'activité de la cellule,
le transcriptome reflétera donc le niveau d'expression de tous les gènes à un temps
t pour une condition physiologique donnée.
Si Jansen [JENSEN01] ont montré que l'analyse du transcriptome donnait une
assez bonne vision du jeu de protéines présent dans la cellule, il est cependant
important de noter qu'il n'existe pas nécessairement de corrélation directe entre le
niveau d'expression d'un gène (quantité d'ARNm) et la quantité de protéines
produite. D'une manière plus générale, pouvoir comparer le transcriptome de
différents types cellulaires, dans différentes conditions, ou pouvoir analyser
l'ensemble du transcriptome d'une cellule à divers stades de son cycle cellulaire ou
dans des conditions pathologiques, doit permettre d'une part de mieux comprendre
de fonctionnement cellulaire sur le plan fondamental, et offre d'autre part
beaucoup d'intérêt en termes d'application potentielles.

3. Puce à ADN
3.1. Définition
La technologie des puces à ADN ou biopuces, connaît à l’heure actuelle un essor
exceptionnel et suscite un formidable intérêt dans la communauté scientifique. Le
concept puce à ADN repose sur une technologie multidisciplinaire intégrant la
biologie, la biotechnologie, la chimie des acides nucléiques, l’analyse d’images et la
bioinformatique. Les premières puces à ADN ont été décrites il y a un peu plus de
dix ans [LANDER99]. Une puce à ADN, aujourd’hui communément appelée « DNA
microarray » en anglais (de « array » = rang ordonné), est constituée de fragments
d’ADN immobilisés sur un support solide selon une disposition ordonnée.
3.2. Principe de la puce à ADN
Le but de puce à ADN était de mesurer chez l’homme l’expression simultanée d’un
grand nombre de gènes, voire de l’ensemble des gènes contenus dans le génome. Il
s’agit d’analyser des profils d’expression génique et à les corréler à des processus
biologiques afin de définir des signatures d’expression. La confection des puces à
ADN a permis d’étendre ce principe à la détection simultanée de milliers de
séquences en parallèle.
Une puce comporte quelques centaines à plusieurs dizaines de milliers d’unités
d’hybridation appelées « spots » (de l’anglais « spot » = tache), chacune étant
constituée d’un dépôt (sondes) de fragments d’ADN ou d’oligonucléotides
correspondant à des sondes de séquences données. L’hybridation de la puce avec
un échantillon biologique, marqué par un radioélément ou par une molécule
fluorescente, permet de détecter et de quantifier l’ensemble des cibles qu’il
contient en une seule expérience.
3.3. Types de Puce à ADN
D’abord conçues sur des membranes poreuses de nylon (appelées parfois
« macroarrays » par opposition aux « microarrays »), les puces à ADN ont été
progressivement mises au point sur lames de verre à la fin des années 90. La
miniaturisation, rendue possible par l’utilisation d’un support solide, de
marqueurs fluorescents et par les progrès de la robotique, permet aujourd’hui de
fabriquer des puces comportant une très haute densité de spots, susceptibles de
recouvrir l’intégralité du génome d’un organisme sur une simple lame de
microscope. On distingue plusieurs types de puces selon la densité des spots, le
mode de fabrication, la nature des fragments fixés à la surface, les méthodes
d’hybridation et l’objectif du projet:
• les macroarrays et microarrays avec un dépôt direct de molécules d’ADN sur
leur support.
• les puces à oligonucléotides avec la synthèse in situ des sondes
oligonucléotidiques sur une surface solide.