Question 1 : La protéine OXA1 Schéma d`après la séquence de son

Question 1 : La protéine OXA1
Schéma d'après la séquence de son ARNm et après analyse bio informatique
Transfection de cellules Hela avec un plasmide comportant la séquence nucléotidique de
OXA1 suivie de celle codant pour le tag (marqueur) HA (hémagglutinine) +/- insertion d'un
deuxième tag (T7).
Homogénéisation des cellules Hela, western blot (anticorps anti-HA).
Biosynthèse de OXA1 in vitro : lysat de réticulocytes (cytosol d'hématies immatures, lapin)
+ ARNm de OXA1.
Western blot (électrophorèse, transfert sur nitrocellulose, détection avec anticorps antiHA).
A. Le lysat de réticulocytes contient tout ce qui est nécessaire à la protéosynthèse
B. La protéine synthétisée par le lysat a un PM de 48 kDa
C. Les cellules Hela produisent OXA1 après transfection
D. Les cellules Hela synthétisent une protéine tronquée
E. OXA1 synthétisée par les cellules Hela a perdu son extrémité C-term
F. OXA1 synthétisée par les cellules Hela a perdu son extrémité N-term
G. OXA1 pourrait être une protéine membranaire
H. OXA1 pourrait être une protéine peroxysomale
I. OXA1 pourrait être une protéine mitochondriale
Réponses :
A. Vrai : ribosomes, ARNt, source d'énergie...
B. Faux : 49 kDa (OXA1 + tag HA)
C. Vrai : synthèse de OXA1 avec le tag HA, détectée par l'anticorps anti-HA
D. Vrai : PM < 49 kDa
E. Faux
F. Vrai : perte des 64 premiers aa : PM = 48 + 1 (tag) – 7 = 42 kDa
G. Vrai : 5 domaines hydrophobes
H. Faux : pas de clivage pour les protéines peroxysomales (même pour signal
d'adressage)
I. Vrai
Question 2 : Localisation subcellulaire de OXA1 (1)
Transfection de cellules Hela avec un plasmide comportant la séquence nucléotidique
codant pour :
– OXA1 entière [1 – 435]
– ou OXA1 délétée des 64 premiers aa [65 – 435]
suivie de la séquence nucléotidique codant pour le tag HA.
Détection de OXA1 par immunofluorescence (anticorps anti-HA).
Marquage des mitochondries (mitotracker) ou du réticulum endoplasmique (anticorps anti
calréticuline).
Marquage de l'ADN nucléaire (DAPI).
calciréticuline
A. [1 – 435] est adressée à la mitochondrie
B. [1 – 435] a été clivée
C. [1 – 435] a perdu ses 64 premiers aa
D. Ces 64 premiers aa représentent le signal d'adressage à la mitochondries
E. [65 – 435] est adressée à la mitochondrie
F. [65 – 435] est adressée au réticulum endoplasmique
G. Les domaines transmembranaires représentent le signal d'adressage au RE
Réponses :
A. Vrai
B. Vrai
C. Vrai
D. Vrai
E. Faux
F. Vrai
G. Vrai : puisque OXA1 ne possède pas de peptide signal
Question 3 : Localisation subcellulaire de OXA1 (2)
Transfection de cellules hela avec un plasmide comportant la séquence nucléotidique
codant pour OXA1, dans laquelle a été insérée la séquence nucléotidique codant pour le
tag T7 et suivie de la séquence nucléotidique codant pour le tag HA
Isolement de la fraction mitochondriale
+/- traitement ménagé par un détergent
+/- digestion ménagée par la protéinase K
Extraction des protéines
Western blot de :
– OXA1 (anticorps anti HA et anti T7)
– d'une sous unité de TIM
– et de Hsp 60 mitochondriale
OXA1 est localisée
A. Dans la membrane mitochondriale externe
B. Dans la membrane mitochondriale interne
C. Dans la matrice mitochondriale
D. En présence de détergent, la protéinase K n'a pas accès à la matrice
E. L'extrémité N-term de OXA1 est dans la matrice
F. L'extrémité N-term de OXA1 est dans l'espace intermembranaire
L'épitope de l'anticorps anti TIM se fixe sur un domaine situé....
G. Dans la matrice mitochondriale
H. Dans l'espace intermembranaire
Rq : dans la mitochondrie elle peut être localisée dans :
– la membrane externe
– l'espace intermembranaire
– la membrane interne
– la matrice
Comment choisir le bon modèle ?
Piste 1 : il ne se passe rien
Piste 2 : décape mitochondrie, protéine du versant extérieur (cytosolique) ==> pas dans
membrane externe
Piste 3 : perméabilise la membrane ==> pas dans espace intermembranaire
Piste 4 : digestion membrane externe et protéine
==> pas dans espace
intermembranaire
==> dans membrane interne
==> pas dans lumière
Bon modèle :
Réponses :
A. Faux : protéinase K ==> pas de modification en l'absence de détergent
B. Vrai
C. Faux : pas de digestion de Hsp 60
D. Vrai
E. Faux
F. Vrai
G. Faux
H. Vrai
Question 4 : Rôle(s) de QXA1 (1)
Cotransfection de cellule HEK 293 (rein d'embryon humain) avec :
– un plasmide comportant la séquence nucléotidique codant pour OXA1 suivie de la
séquence nucléotidique codant pour le tag HA
– un plasmide comportant la séquence nucléotidique codant pour :
• un petit ARN interférant (siRNA : small interferant RNA) complémentaire de
la séquence nucléotidique codante de l'ARNm de l'OXA1 et d'orientation opposée
• ou un siRNA ciblant un ARNm non exprimé par les cellule HEK 293
48 heures après transfection :
– mesure (RT-PCR) de la quantité des ARNm codant pour 7 protéines
– isolement de la fraction mitochondriale
– western blot : détection de :
• OXA1 (anticorps anti HA)
• tubuline
• 6 protéines mitochondriales, codées par le génome nucléaire (Nuc) ou
mitochondrial (Mito)
– mesure de la quantité de protéines (en % / expérience avec siRNA témoin)
A. Le plamside « OXA1-HA » a conduit à la synthèse de OXA-HA
B. Ce plasmide a été transcrit en ARNm
C. Les ARNm codant pour OXA1-HA ont été détruits après transfection avec le plasmide
siRNA OXA1
D. Le plasmide « siRNA OXA1 » a été transcrit
E. Rôle des siRNA ?
F. Les ARNm endogènes de OXA1 ont été détruits
H. Le plasmide « siRNA témoin » a ciblé les ARNm des protéines étudiées
Réponses :
A. Vrai : western blot : détection de OXA1-HA
B. Vrai : protéine présente
C. Vrai : quantité des ARNm : 2% (et pas de protéines)
D. Vrai
E. Détruire leurs ARNm cibles (régulation par la cellule)
F. Vrai : les si RNA ciblent la région codante des ARNm de OXA1, commune aux ARNm
« endogènes » et aux ARNm de OXA1-HA produits après transfection
H. Faux : aucune modification de la quantité de ces protéines
Question 5 : Les ARNm et les protéines
A. Le plasmide « siRNA témoin » a induit la destruction des ARNm codant pour les
protéines étudiées
B; Le plasmide « siRNA OXA1 » a induit la destruction des ARNm de OXA1
C. La quantité de certaines des protéines mitochondriales est diminuée après transfection
avec le plasmide « siRNA OXA1 »
D. Le plasmide « siRNA OXA1 » a induit la destruction des ARNm de ces protéines
E. La quantité de OXA1 baisse plus que celle des autres protéines mitochondriales
Réponses :
A. Faux : western blot : protéines détectées
B. Vrai : quantité des ARNm OXA1-HA = 2 % et diminution de OXA1 (- 90 %)
C. Vrai : OXA1, NDUFA9, COX … diminuées
D. Faux : il y a les messagers (100 % ARNm) il n'y a plus les protéines
E. Vrai : - 90 % / - 40 %
Question 6 : OXA1 contrôle la traduction des ARNm de …
A. la tubuline
B. NDUFA9
C. COX1
D. de sous unités de l'ATP synthase
E. OXA1 détruit les protéines mitochondriales
F. Les protéines mitochondriales étudiées contrôlent la traduction de OXA1
G. OXA1 est localisé dans la membrane interne
H. Les protéines dont la quantité baisse sont localisées dans la membrane interne
OXA1 intervient dans l'insertion dans la membrane interne de protéines codées
par :
I. Le génome mitochondrial
J. le génome nucléaire
Réponses :
A. Faux
B. Faux
C. Faux
D. Faux : ARNm à 100 %
E. Faux : pas d'activité protéase
F. Faux : comment une protéine de la mitochondrie jouerait sur la synthèse dans le cytosol
G. Vrai
H. Vrai
I. Vrai : ex : COX1
J. Vrai : ex : 2 sous unités de l'ATP synthase