Utilisation de la protéine Tat-Foxp3 pour induire la formation des
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Utilisation de la protéine Tat-Foxp3 pour induire la formation des lymphocytes T régulateurs, dans le contexte de la thérapie cellulaire de la dystrophie musculaire de Duchenne Mémoire Laetitia Mavinga Maîtrise en Biologie cellulaire et moléculaire Maître ès sciences (M.Sc.) Québec, Canada © Laetitia Mavinga, 2013 Résumé La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie héréditaire récessive liée au chromosome X. Elle est causée par l’absence de la dystrophine dans les fibres musculaires. La thérapie cellulaire est l’une des approches thérapeutiques possibles, mais son succès dépend du contrôle du rejet des myoblastes greffés et des fibres musculaires hybrides. À présent, le contrôle du rejet est obtenu par l’administration d’immunosuppresseurs puissants. Notre objectif à long terme est de développer un protocole de tolérance immunologique qui permettrait de prévenir le rejet, sans recours à une immunosuppression soutenue. La première étape du protocole de tolérance immunologique que nous souhaitons développer est d’induire la formation de lymphocytes T régulateurs en utilisant le facteur de transcription Foxp3. Nos travaux nous ont permis de produire, dans des bactéries E. coli, la protéine de fusion Tat-Foxp3. Par des essais in vitro nous avons démontré l’augmentation de l’expression du récepteur CD25 sur les lymphocytes T CD4+ naïfs après transduction de la protéine Tat-Foxp3. Cela suggère que la protéine Tat-Foxp3 pourrait convertir les lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs. D’autres travaux seront nécessaires pour confirmer que ces cellules exprimant le CD25 sont vraiment des T régulateurs. iii Abstract The Duchenne muscular dystrophy is the most common hereditary muscular disease. This disease is inherited as an X-linked recessive trait. It is caused by the absence of dystrophin in muscle fibers. Cell therapy is the potential treatment but, its success depends on the control of the rejection of the transplanted myoblasts and of the hybrid fibers that they formed. At present, the control of the graft rejection is achieved by administration of powerful immunosuppressive drug. Our long-term aim is to develop a protocol for immune tolerance that would prevent the graft rejection without sustained immunosuppression. The first step of this tolerance protocol that we want to develop is to induce the formation of regulatory T cells using the transcription factor Foxp3. In this study we generated, in bacteria E. coli, a fusion protein Tat-Foxp3. By in vitro assays, we demonstrated that Tat-Foxp3 protein upregulated the expression of CD25 in naïve CD4+ T cells. Additional experiments will be required to confirm that these CD25 expressing cells are Treg. v Table des matières Résumé ........................................................................................................................................................ iii Abstract .........................................................................................................................................................v Table des matières ...................................................................................................................................... vii Liste des figures ........................................................................................................................................... ix Liste des abréviations................................................................................................................................... xi Remerciements ........................................................................................................................................... xv Introduction .................................................................................................................................................. 1 Chapitre 1 : La dystrophie musculaire de Duchenne.................................................................................... 3 1.1 Historique........................................................................................................................................... 3 1.2 Caractéristiques de la dystrophie musculaire de Duchenne .............................................................. 4 1.3 Étiologie ............................................................................................................................................. 6 1.3.1 Le gène responsable .................................................................................................................. 6 1.3.2 La dystrophine ............................................................................................................................ 6 1.4 Le muscle strié squelettique ............................................................................................................. 8 1.4.1 Origine embryonnaire du muscle strié squelettique .................................................................... 9 1.4.2 Organisation générale du muscle strié squelettique ................................................................... 9 1.4.3 Les fibres musculaires .............................................................................................................. 10 1.4.4 La contraction musculaire ......................................................................................................... 11 1.4.5 La régénération musculaire ...................................................................................................... 12 1.5 Modèles animaux ............................................................................................................................. 12 1.5.1 La souris mdx ........................................................................................................................... 12 1.5.2 Le chien GRMD ........................................................................................................................ 13 1.6 Différentes pistes thérapeutiques .................................................................................................... 13 1.6.1 Thérapie pharmacologique ....................................................................................................... 13 1.6.2 Thérapie génique...................................................................................................................... 13 1.6.3 Thérapie cellulaire .................................................................................................................... 16 Chapitre 2 : L’immunité adaptative et les lymphocytes T régulateurs ...................................................... 19 2.1 Origine des cellules du système immunitaire ................................................................................... 19 2.2 Le système immunitaire adaptatif .................................................................................................... 20 2.2.1 Différenciation et maturation des lymphocytes ......................................................................... 20 2.2.2 Les lymphocytes T.................................................................................................................... 21 2.3 Les cellules présentatrices d’antigènes ........................................................................................... 23 2.4 Les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité ................................................................. 24 2.5 Les lymphocytes T effecteurs .......................................................................................................... 25 2.6 Les lymphocytes T régulateurs ........................................................................................................ 26 2.6.1 Types des lymphocytes T régulateurs ...................................................................................... 27 2.6.2 Mécanismes d’action des lymphocytes T régulateurs Foxp3+ .................................................. 28 2.6.3 Usages thérapeutiques des lymphocytes T régulateurs ........................................................... 29 2.7 Forkhead box protein 3 .................................................................................................................... 31 Chapitre 3: La greffe et la tolérance immunologique .................................................................................. 33 3.1 Types des greffes ............................................................................................................................ 33 3.2 Risques des greffes ......................................................................................................................... 33 3.2.1 Rejet des greffes ...................................................................................................................... 33 3.2.2 La maladie du greffon contre l’hôte .......................................................................................... 35 vii 3.3 Modes d’action des immunosuppresseurs ....................................................................................... 35 3.4 La tolérance immunitaire .................................................................................................................. 37 3.4.1 La tolérance centrale ................................................................................................................ 38 3.4.2 La tolérance périphérique ......................................................................................................... 38 Chapitre 4 : Hypothèse et Objectifs ............................................................................................................ 41 4.1 Hypothèse de travail ........................................................................................................................ 41 4.2 Objectifs de ce mémoire .................................................................................................................. 41 Chapitre 5 : Méthodologies, résultats et discussions.................................................................................. 43 5.1 Matériel et méthodes........................................................................................................................ 43 5.1.1 Construction du vecteur d’expression ....................................................................................... 43 5.1.2 Production de la protéine recombinante 6xHis-Tat-Foxp3 ........................................................ 46 5.1.3 Purification de la protéine recombinante 6xHis-Tat-Foxp3 ....................................................... 47 5.1.4 Purification des lymphocytes T CD4+........................................................................................ 48 5.1.5 Culture des lymphocytes T CD4+ .............................................................................................. 48 5.1.6 Transduction de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 dans des lymphocytes T CD4+ ......................... 49 5.1.7 Détection de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 par Western Blot ..................................................... 49 5.1.8 Analyse par cytométrie en flux .................................................................................................. 50 5.2 Résultats .......................................................................................................................................... 50 5.2.1 Construction du vecteur d’expression pET16b-6xHis-Tat-Foxp3.............................................. 50 5.2.2 Production et purification de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 ........................................................ 51 5.2.3 Localisation intracellulaire de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3...................................................... 53 5.2.4 Caractéristiques des lymphocytes T CD4+ transduits ............................................................... 54 5.3 Discussion ........................................................................................................................................ 56 Conclusion.................................................................................................................................................. 59 Bibliographie............................................................................................................................................... 61 viii Liste des figures Figure 1 : Photographie du premier malade dystrophique (Joseph Sarazinen) observé par Duchenne ...... 4 Figure 2 : Représentation de la manœuvre de Gowers .............................................................................. 5 Figure 3 : Structure primaire de la dystrophine. ........................................................................................... 8 Figure 4 : Complexe glycoprotéique associé à la dystrophine. .................................................................... 8 Figure 5 : Anatomie du muscle squelettique. ............................................................................................. 11 Figure 6 : Récepteurs d’un lymphocyte T et ses sous-unités membranaires. ........................................... 22 Figure 7 : Différenciation des lymphocytes T CD4+. ................................................................................... 23 Figure 8 : Activation des lymphocytes T en lymphocytes T effecteurs. ...................................................... 26 Figure 9 : Production et fonction des lymphocytes T régulateurs naturels. ................................................ 30 Figure 10 : Organisation et fonction de la protéine Foxp3.......................................................................... 32 Figure 11 : Représentation schématique du plasmide pET16b .................................................................. 45 Figure 12 : Électrophorèse sur gel d’agarose 1% après amplification du gène Foxp3. MW ..................... 51 Figure 13 : Électrophorèse sur gel d’agarose 1% après amplification du plasmide pET16b. MW. ........... 51 Figure 14 : Induction des bactéries compétentes E.coli BL21................................................................... 52 Figure 15 : Purification de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 (en conditions natives) ........................................ 52 Figure 16: Purification de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 (en conditions dénaturantes). ............................... 53 Figure 17 : Détection par Western Blot de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 aux différentes étapes de purification ......................................................................................................................................... 53 Figure 18 : Détection par Western Blot de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 après transduction dans les lymphocytes T CD4+. ......................................................................................................................... 54 Figure 19: Marquage des lymphocytes T CD4+CD25+ ............................................................................... 55 Figure 20: Analyse cytométrique des lymphocytes marqués avec les anticorps anti-CD4-PE-Cy5 et antiCD25-PE ........................................................................................................................................... 56 ix Liste des abréviations AAV : adeno- associated virus ADN : acide désoxyribonucléique AP-1 : activator protein-1 ARN : acide ribonucléique ATP : adénosine triphosphate BCR : B-cell receptor BMD : Becker muscular dystrophy BMP4 : bone morphogenic factor- 4 BMT : bone marrow transplantation CAD : complexe associé à la dystrophine CD : cluster of differenciation CMH : complexe majeur d’histocompatibilité CPA : cellule présentatrice d’antigènes CSH : cellule souche hématopoïétique CTLA-4 : cytotoxic T- lymphocyte antigen 4 DMD : Duchenne muscular dystrophy eGFP : enhanced green fluorescent protein FACS : fluorescence activated cell sorting FDA : US Food and Drug Administration FKH : winged- helix/forkhead domain Foxp3 : forkhead box protein 3 GITR : glucocorticoid-induced TNF receptor family-related gene GRMD : Golden Retriever Muscular Dystrophy GVHD : graft-versus-host disease HBSS : Hank’s balanced salt solution HLA : human leucocyte antigen IDO : indoleamine 2, 3- dioxygenase IGF-1 : insulin-like growth factor 1 Ikzf2 : Helios IL-2 : interleukine de type 2 INF-γ : interféron γ IPEX : Immuno- dysregulation Polyendocrinopathy auto- immune Enteropathy X-linked IPTG : isopropyl-β -D-thiogalactoside LFA-1 : Lymphocyte Function-associated Antigen-1 MACS : magnetic affinity cell sorting xi mdx : muscular dystrophy X-linked MLR : mixed lymphocyte reaction MRF4 : myogenic regulatory factor 4 mTOR : mammalian target of rapamycin MyoD : myoblast determination Myf-5 : myogenic factor 5 NFAT : nuclear factor of activated T-cell NFκB : nuclear factor kappa B NK : natural killer NLS : nuclear localization signal nrp1 : Neuropilin 1 Pax 7 : Paired box gene 7 PCR : Polymerase chain reaction PRD : proline rich domain Pcd1 : programmed cell death-1 QRT-PCR : quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction SNC : système nerveux central TCR : T cell receptor TGF-β : transforming growth factor- β TH : helper CD4+ T cell TLRs : toll- like receptors TNF-α : tumor necrosis factor α Tr1 : Type 1 regulatory T cells Treg : regulatory T cells TSDR : Treg-specific demethylated region TTCB : Transfusion, Tréosulfan, Cyclophosphamide et Bone marrow transplantation VIH-1 : virus de l’immunodéficience humaine de type 1 ZIP : leucine zipper ZnF : zinc finger xii Je dédie ce mémoire à mes parents, mes sœurs et frères, mon mari, mes enfants, et à tous mes amis. xiii Remerciements Je voudrais remercier en premier lieu mon directeur de recherche, le Dr Jacques-P. Tremblay, pour m’avoir accueillie dans son laboratoire, pour toutes les connaissances scientifiques qu’il m’a transmises et aussi pour sa grande disponibilité durant toute la période de ma formation. J’aimerais remercier ensuite mon codirecteur, le Dr Daniel Skuk, pour ses précieux conseils et aussi pour tout ce qu’il m’a apporté directement, mais aussi indirectement par son exemple. Je ne peux oublier tous les professionnels de recherche, particulièrement Joël Rousseau, pour m’avoir appris les premiers pas dans le laboratoire de biologie moléculaire avec tant de patience et de rigueur. Un grand merci également à mes collègues Jean-Paul Iyombe, Amina Chikh, Chantale Maltais et Sylvestre Ahou avec qui j’ai eu à passer des moments de joie et de peines au laboratoire. Du fond de mon cœur, je voudrais remercier mes parents, mes sœurs et frères ainsi que mes enfants qui ont su m’apporter beaucoup d’amour. Finalement, je tiens à remercier spécialement mon mari, je n’en serais pas arrivée à ce point sans son soutien et son énorme patience. L’Agence canadienne de développement international (ACDI) et le Programme canadien de bourses de la Francophonie (PCBF) ont généreusement contribué à ce travail par l’entremise de la bourse d’études. Un merci spécial à Jeanne Gallagher, gestionnaire principale du PCBF, pour sa rigueur et son soutien moral durant toute la période de ma formation à l’Université Laval. xv Introduction La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie héréditaire récessive liée au chromosome X, affectant 1 garçon sur 3600 à la naissance (Robert M. Kliegman 2011). Elle est l’une de plus sévères et fréquentes des myopathies; elle est causée par des mutations du gène de la dystrophine (Blake, Weir et al. 2002). La DMD se caractérise par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques des membres et du tronc et aussi par une atteinte cardiaque. Les manifestations cliniques débutent très tôt dans l’enfance, avant l’âge de 5 ans, par une faiblesse musculaire d’aggravation graduelle conduisant à un handicap majeur à la préadolescence. L’insuffisance respiratoire en premier lieu et l’insuffisance cardiaque en deuxième sont responsables du décès à la fin de l’adolescence ou au début de l’âge adulte (Manzur and Muntoni 2009). Le gène de la dystrophine est le plus grand gène dans le génome humain, sa taille est de 2,3 millions de paires de bases. Son locus est situé sur le chromosome X. La dystrophine est une protéine structurale du cytosquelette de la fibre musculaire, constituée de 3685 acides aminés. La dystrophine joue un rôle important dans la stabilité de la membrane plasmique des fibres musculaires pendant les cycles de contraction et relaxation musculaire (Draviam, Billington et al. 2001). L’absence de la dystrophine entraine une fragilité des fibres musculaires pendant la contraction et la relaxation musculaire, ce qui conduit à leur dommage et à une nécrose segmentaire. Les fibres musculaires peuvent régénérer grâce à la prolifération des cellules souches spécifiques du muscle squelettique, les cellules satellites. Les cellules satellites vont être activées pour se transformer en myoblastes, lesquels vont proliférer et fusionner pour réparer les fibres endommagées. Toutefois, en l’absence de la dystrophine, ces nouvelles fibres restent encore vulnérables à la nécrose lors de la contraction et relaxation musculaire. La répétition des cycles de dégénération et régénération conduit à l’épuisement des cellules satellites, par laquelle la régénération est de moins en moins efficace, conduisant à l’atrophie et à la disparition progressive des fibres musculaires. Parallèlement, il y’ a l’installation d’une fibrose et d’une adipose conduisant à la perte progressive de la fonctionnalité du muscle. Actuellement, il n’existe aucun traitement curatif pour la DMD. Plusieurs équipes de chercheurs travaillent pour trouver un traitement efficace. Deux grandes catégories de thérapies sont en cours d’étude : la thérapie génique et la thérapie cellulaire. La thérapie génique vise à corriger le défaut génétique en transférant des copies fonctionnelles du gène de la dystrophine dans les fibres musculaires par différents moyens (Lin et al, 2001). La thérapie cellulaire, quant à elle, consiste à transplanter des cellules normales précurseurs des fibres musculaires dans le muscle dystrophique. En effet, le laboratoire du Dr Tremblay a récemment effectué des essais cliniques de greffe de myoblastes qui ont permis de démontrer le 1 rétablissement de la dystrophine dans différents pourcentages de fibres musculaires dans les muscles dystrophiques (Skuk et al, 2004; Skuk et al, 2006). Comme dans ces essais cliniques où il s’agit de greffes allogéniques, le succès de cette thérapie nécessite une immunosuppression soutenue pour contrôler le rejet immunologique des cellules greffées et des fibres musculaires auxquelles elles fusionnent. Il y’ a cependant des risques associés à l’immunosuppression, comme l’hypertension artérielle, les maladies cardio-vasculaires, les infections opportunistes, le risque élevé de développer des cancers, la néphrotoxicité ainsi que le diabète. Une ligne de recherche majeure dans le domaine de la transplantation consiste à trouver un moyen d’éviter l’immunosuppression par le développement d’une tolérance immunologique du receveur vis-à-vis de la greffe. La tolérance immunologique est un état de non-réponse du système immunitaire adaptatif à un antigène; c’est la capacité de l’organisme à accepter un ou plusieurs antigènes étrangers de manière spécifique tout en restant fonctionnel à 100 %. L’objectif à long terme de mon projet de recherche est donc de développer un protocole de tolérance immunologique qui pourrait prévenir le rejet des myoblastes normaux greffés chez les patients DMD, et des fibres musculaires exprimant la dystrophine du donneur, sans avoir recours à une immunosuppression soutenue. La première étape de ce protocole de tolérance est d’induire la formation des lymphocytes T régulateurs en introduisant la protéine Foxp3 dans les lymphocytes T CD4+ naïfs. Les lymphocytes T régulateurs ainsi formés permettraient par la suite une greffe de cellules souches hématopoïétiques du donneur et ainsi le développement d’une tolérance immunologique permanente envers la greffe de myoblastes. L’objectif spécifique des travaux décrits dans ce mémoire est de développer la première étape de ce protocole soit la production de la protéine Tat-Foxp3. 2 Chapitre 1 : La dystrophie musculaire de Duchenne 1.1 Historique La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) a été décrite depuis plusieurs siècles (Emery and Emery 1995). Les anciens Égyptiens l’ont peint sur les murs de leurs tombes sous forme d’anomalies physiques semblables à la poliomyélite paralytique et au nanisme congénital. Mais la première description clinique de la dystrophie musculaire de Duchenne pourrait être attribuée à Sir Charles Bell (1774- 1842) qui, dans sa publication intitulée « The nervous system of the human body », a décrit le cas d’un homme de 18 ans présentant une faiblesse musculaire généralisée. En 1836, le Professeur Gaetano Conte et le Dr L. Gioja ont décrit 2 frères d’une même famille qui présentaient une faiblesse musculaire progressive des membres inférieurs. En 1847 Mr Partridge a présenté le cas d’un garçon de 9 ans qui a développé une faiblesse musculaire progressive, avec une hypertrophie et des contractures musculaires. L’autopsie effectuée sur le tissu musculaire a révélé une dégénérescence graisseuse diffuse. Au cours de la même année, le Dr William John Little (1810- 1894) a effectué des études sur 2 frères âgés de 12 et 14 ans qui présentaient le même tableau. En 1851, Edward Meyron (1807- 1880), après avoir décrit quelques cas, a constaté que la maladie était familiale avec une prédilection pour les garçons; il a également constaté que l’atteinte nerveuse n’existait pas, mais qu’il y avait plutôt une destruction microscopique des fibres musculaires (Meryon 1852, Emery and Muntoni 2003). En 1861, Guillaume Benjamin Amand Duchenne, Duchenne de Boulogne (1806-1875) a mieux caractérisé cette maladie, en la décrivant au départ comme une hypertrophie musculaire provoquée par des problèmes cérébraux (O'Brien and Kunkel 2001). Il a pu prouver que certaines paralysies motrices étaient liées à une atteinte primitive de la fibre musculaire et non à celle du cerveau ou de ses annexes et a permis ainsi de tracer les grandes lignes de la maladie : l’affection débute par une faiblesse dans les muscles inférieurs pour s’étendre dans les muscles posturaux, on observe une pseudohypertrophie des mollets (Figure 1). C’est donc Duchenne qui a décrit cette maladie entièrement d’où lui vient son nom. En 1886, William Richard Gowers (1845-1915) a mieux identifié le caractère héréditaire de cette dystrophie, par sa transmission récessive liée à l’X (O'Brien and Kunkel 2001). Il décrivit aussi la méthode particulière par laquelle les enfants malades se relevaient du sol: ils se servaient des membres supérieurs pour compenser la faiblesse musculaire des jambes et du tronc, d’où l’attribution du nom de la manœuvre à son nom (Figure 2). La manœuvre de Gowers aide encore aujourd’hui au diagnostic clinique de la DMD. 3 En 1982 l’anomalie a été localisée sur le bras court du chromosome X, plus précisément à la bande p21 (Davies, Pearson et al. 1983, Bertelson, Bartley et al. 1986). En 1986, grâce à une approche moléculaire, par la méthode de génétique inverse, le gène responsable de la DMD a été isolé par le groupe du Professeur Kunkel à Boston aux États-Unis (Monaco, Neve et al. 1986). En 1987 la protéine codée par ce gène a ainsi été identifiée à l’aide d’anticorps polyclonaux: c’est la dystrophine (Hoffman, Brown et al. 1987). Figure 1 : Photographie du premier malade dystrophique (Joseph Sarazinen) observé par Duchenne. Il présente une hypertrophie des mollets et une lordose lombaire (Tyler 2003) 1.2 Caractéristiques de la dystrophie musculaire de Duchenne La DMD est l’une de plus sévères et fréquentes des myopathies. C’est une myopathie héréditaire récessive liée au chromosome X (Zatz, Vianna-Morgante et al. 1981, Davies, Pearson et al. 1983, Dubowitz 1995, Liu, Lissens et al. 1996). Son incidence mondiale est d’un garçon sur 3600 nouveau-nés mâles (Emery 1993, Emery 2001, Robert M. Kliegman 2011). Seuls les garçons sont atteints, les femmes sont porteuses de l’anomalie, mais ne développent pas la maladie, à l’exception de quelques rares cas. Les hommes DMD, étant fortement handicapés par la maladie, ne parviennent pas à se reproduire. La symptomatologie débute très tôt dans l’enfance, avant l’âge de 5 ans de façon insidieuse par des troubles de la marche marqués par une démarche dandinante sur la pointe des pieds accompagnés des chutes fréquentes; les enfants présentent des difficultés à courir (Brooke, Griggs et al. 1981). Au début de la maladie, la faiblesse musculaire est plus importante aux membres inférieurs qu’aux membres supérieurs, ce qui fait que les enfants ont des difficultés à utiliser leurs jambes pour se lever, et ils utilisent donc leurs bras : c’est la manœuvre de Gowers (Figure 2). Le taux de créatine kinase est très augmenté dans le sérum, souvent dans les stades pré- symptomatiques (Dreyfus, Schapira et al. 1960). Il 4 atteint des concentrations de 15000 à 35000 UI/L, la concentration normale étant <160 UI/L. D’autres enzymes lysosomales présentes dans le muscle, comme l’aldolase et l’aspartate aminotransférase, sont aussi augmentées, mais sont peu spécifiques dans la DMD (Robert M. Kliegman 2011). Au cours du développement de l’enfant, on assiste à l’accentuation progressive de la faiblesse musculaire et on observe une pseudohypertrophie des mollets due à une fibrose excessive (Eiholzer, Boltshauser et al. 1988). Vers l’âge de 9-10 ans, l’enfant perd la capacité de marcher et doit recourir au fauteuil roulant pour se déplacer. Il présente un handicap moteur majeur (Brooke, Griggs et al. 1981). L’atteinte des muscles respiratoires conduit à une insuffisance respiratoire restrictive nécessitant une ventilation assistée, avec des risques d’infections respiratoires qui peuvent être la cause du décès (Eagle, Baudouin et al. 2002, Manzur and Muntoni 2009). Les troubles cardiaques sont fréquents; les cardiomyopathies sont la deuxième cause de la mortalité après les problèmes respiratoires (Liu, Lissens et al. 1996). Quelques malades présentent un retard mental léger. D’autres complications sont aussi présentes telles que: les troubles nutritionnels marqués par une difficulté à avaler avec risque de fausses routes, et une réduction de l’alimentation pouvant aboutir à une dénutrition et des carences nutritionnelles. Les troubles orthopédiques sont marqués par des déformations des membres et du tronc, telle la scoliose dans 75 à 90 % des cas (Kinali, Arechavala-Gomeza et al. 2009). Figure 2 : Représentation de la manœuvre de Gowers. Elle représente un enfant atteint de DMD se levant du sol (Tyler 2003) 5 1.3 Étiologie La DMD est causée par l’absence de la dystrophine dans les fibres musculaires. Cette protéine fait depuis l’objet de nombreuses recherches. 1.3.1 Le gène responsable Le gène de la dystrophine est localisé sur le bras court du chromosome X, au locus p21.2 (Monaco, Neve et al. 1986, Hoffman, Brown et al. 1987). C’est le plus grand gène dans le génome humain, sa taille est de 2,3 millions de paires de bases (Den Dunnen, Grootscholten et al. 1989, Nobile, Marchi et al. 1997); il contient 79 exons séparés par des introns inhabituellement longs et est transcrit en un ARN messager de 14 Kb (Monaco, Neve et al. 1986, Koenig, Hoffman et al. 1987). Il y’ a un épissage alternatif de l’ARN prémessager du gène de la dystrophine produisant 7 isoformes différentes de la dystrophine (Bies, Phelps et al. 1992). Trois de ces 7 isoformes sont exprimées dans les muscles ou dans différentes régions du cerveau (Klamut, Gangopadhyay et al. 1990). 70 % des patients ont une délétion de un ou plusieurs exons ce qui modifie le cadre de lecture (décalage du cadre de lecture), il y’ a aussi des mutations nonsens. Le reste des patients ont de petites mutations (des mutations ponctuelles ou des microdélétions) (Bulman, Gangopadhyay et al. 1991, Battaloglu, Telatar et al. 1992, Emery and Muntoni 2003) ou des duplications (Hu, Ray et al. 1990). Dans tous les cas il en résulte une absence de dystrophine dans les fibres musculaires (Beggs, Koenig et al. 1990, Mendell, Buzin et al. 2001, Blake, Weir et al. 2002). 1.3.2 La dystrophine La dystrophine est une grande protéine, son poids moléculaire est de 427 kDa (Koenig, Monaco et al. 1988); elle est composée de 3685 acides aminés. Elle est membre de la superfamille des spectrines qui comprend, outre les spectrines, les α-actinines ainsi que d’autres protéines associées (Koenig, Monaco et al. 1988, Cohn and Campbell 2000). Elle est donc considérée comme l’une des plus grosses protéines de l’organisme, en seconde position après la titine (Davison and Critchley 1988). C’est une protéine qui joue un rôle important dans la stabilité mécanique de la membrane plasmique lors des contractions musculaires (Draviam, Billington et al. 2001). La dystrophine est normalement présente depuis le stade fœtal dans tous les muscles squelettiques, dans le cœur, les muscles lisses et dans certains types des cellules nerveuses où elle est exprimée sous différentes isoformes (Luna and Hitt 1992, Ahn and Kunkel 1993, Wang, Pansky et al. 1998). Dans les fibres musculaires squelettiques, elle est localisée à la face cytoplasmique de la membrane plasmique, en dessous du sarcolemme où elle représente 5 % des protéines du sarcolemme et 0.002 % des protéines du muscle strié (Zubrzycka-Gaarn, Bulman et al. 1988). Sa structure primaire permet d’identifier 4 domaines distincts (Koenig, Monaco et al. 1988) (Figure 3): 6 Le domaine N- terminal (250 acides aminés) : très conservé, il constitue le domaine de liaison à l’actine (Hammonds 1987, Way, Pope et al. 1992). Le grand domaine central de type triple hélice (2800 acides aminés) contient 25 répétitions en tandem semblables à celles retrouvées dans la β-spectrine, une autre protéine du cytosquelette (Davison and Critchley 1988, Cross, Stewart et al. 1990). Le domaine riche en cystéines (CR) se lie à la β-dystroglycane (Koenig, Monaco et al. 1988). Il se compose des acides aminés 3056 à 3354. Le domaine C- terminal (400 acides aminés) contient des sites de liaison pour les protéines intracellulaires (Jung, Yang et al. 1995). Il comprend les résidus 3355 à 3685. Grâce à ces domaines, la dystrophine permet de lier le réseau des microfilaments intracellulaires associés à l’actine à un ensemble complexe de protéines de la membrane et indirectement à la matrice extracellulaire (Ervasti and Campbell 1993). Au niveau du sarcolemme, la dystrophine fait partie d’une structure macromoléculaire de protéines appelée complexe associé à la dystrophine (CAD) (Figure 4). Ce complexe comprend : les sarcoglycanes (α, β, δ, Ɛ, γ), les dystroglycanes (α, β), les dystrobrévines, les syntrophines (α1, β1, β2) (Matsumura and Campbell 1994, Ehmsen, Poon et al. 2002). La dystrophine est liée au cytosquelette intracellulaire via son domaine N- terminal qui lie l’actine tandis que son domaine riche en cystéines se lie à la β-dystroglycane en plus de la syntrophine et de la dystrobrevine à sa partie C- terminale (Sadoulet-Puccio, Rajala et al. 1997). Du côté extracellulaire de la membrane, l’ α-dystroglycane lié à la β-dystroglycane sert de récepteurs pour la matrice extracellulaire. C’est la β-dystroglycane qui fait le pont transmembranaire entre les protéines intracellulaires et les protéines extracellulaires. Le CAD apporte une stabilité au sarcolemme et assure l’intégrité de la fibre musculaire en la protégeant contre des dommages induits par les contractions (O'Brien and Kunkel 2001). La présence de la dystrophine et du CAD est importante pour la stabilité mécanique de la fibre musculaire lors des contractions musculaires et la résistance des fibres musculaires à l’étirement. L’absence de la dystrophine, et par conséquent du CAD, provoque une instabilité membranaire de la fibre musculaire fragilisant ainsi la membrane de la fibre musculaire. La membrane musculaire fragilisée ne résiste plus aux contraintes imposées lors de la contraction musculaire. Chez les patients DMD, le stress occasionné par la contraction ou l’étirement musculaire est responsable des ruptures musculaires qui vont entrainer une dégénérescence musculaire progressive avec libération des enzymes musculaires dans le sang. 7 Figure 3 : Structure primaire de la dystrophine. La dystrophine se divise en 4 domaines, elle est très conservée entre différentes espèces mais le nombre de spectrines peut subir des variations. Figure 4 : Complexe glycoprotéique associé à la dystrophine. La dystrophine est une grande protéine qui fait le lien entre le cytosquelette d’actine dans la fibre musculaire et la matrice extracellulaire, via la liaison de plusieurs complexes protéiques (Bonneman, 1996). 1.4 Le muscle strié squelettique Le muscle strié squelettique forme l’essentiel du tissu musculaire du corps, lequel comprend environ 639 muscles striés squelettiques. Il est constitué de faisceaux parallèles de fibres longues multinucléées et est capable de contractions puissantes. Il est innervé par des nerfs moteurs somatiques et branchiaux. Le muscle strié squelettique mobilise les os et d’autres structures, assure le soutien et forme les reliefs du corps (Rickard L. Drake 2006). Il joue aussi un rôle important dans la thermogénèse. 8 1.4.1 Origine embryonnaire du muscle strié squelettique Le tissu musculaire dérive du 3e feuillet embryonnaire, le mésoblaste, qui se forme durant la 3e semaine du développement embryonnaire. Ce feuillet se divise en 3 bandes tissulaires longitudinales : le mésoblaste para- axial, le mésoblaste intermédiaire et le mésoblaste latéral. Le muscle squelettique dérive du mésoblaste para-axial qui se divise à son tour en plusieurs paires de somites dont chacune se différencie en différents types cellulaires, dont les myoblastes (Christ and Ordahl 1995). La différenciation des somites en myoblastes est sous le contrôle de facteurs de régulation sécrétés par le tube neural : les facteurs Wnts (Wingless), Wnt1 et Wnt3a ainsi que le Shh (Sonic hedgehog) sécrétés respectivement par la partie dorsale et par le plateau du tube neural et qui sont capables d’activer la myogenèse tandis que BMP4 et Notch, un antagoniste de Wnts, sont des inhibiteurs de la myogenèse (Buckingham 2001). Les myoblastes sont donc les précurseurs de cellules musculaires squelettiques. Les gènes régulateurs responsables de la détermination des myoblastes sont le gène MyoD ainsi que le gène Myf-5 (Buckingham 2001). Après leur détermination dans le myotome, les myoblastes vont subir une migration dans les bourgeons puis vont se mettre à proliférer par mitoses successives pour ensuite fusionner entre eux et former des myotubes multinucléées. Les cellules multinucléées vont se différencier en fibres musculaires. Tous les progéniteurs myogéniques ne se différencient pas; certains restent indifférenciés et quiescents à l’intérieur du tissu musculaire formé, ce sont les cellules satellites qui peuvent être activées en cas de lésion afin de régénérer le muscle (Hughes 1992, Dreus 1993). Les fibres musculaires accumulent les protéines contractiles (actine et myosine) qui sont arrangées en faisceaux. L’arrangement de ces protéines contractiles en filaments fins d’actine et en filaments épais de myosine sera à l’origine des unités contractiles répétées visibles le long des myofibrilles, les sarcomères. 1.4.2 Organisation générale du muscle strié squelettique Chaque muscle est entouré d’une épaisse couche de tissu conjonctif dense, l’épimysium. Celui-ci donne naissance à des cloisons du tissu conjonctif, le périmysium, qui divise le muscle en plusieurs faisceaux. Le périmysium à son tour se subdivise en fines cloisons conjonctives lâches qui entourent individuellement chaque fibre musculaire, c’est l’endomysium. L’unité de base du muscle squelettique est la fibre musculaire. Elle est entourée d’un réseau de tissu conjonctif qui constitue une armature de soutien et sert aussi de lieu de passage pour les vaisseaux sanguins et les nerfs qui desservent le muscle. À certains endroits le tissu musculaire et le tissu conjonctif se mélangent pour s’ancrer à l’os formant ainsi des tendons (Wheater, Young et al. 2001) (Figure 5). 9 1.4.3 Les fibres musculaires Les fibres musculaires sont des cellules multinucléées provenant de la fusion de plusieurs centaines de cellules mononuclées, les myoblastes (Wakelam 1985). En microscopie optique, les fibres musculaires apparaissent comme des éléments allongés de forme cylindrique, plurinucléés avec une alternance régulière de bandes transversales claires et sombres (en coupe longitudinale). Elles mesurent 10 à 100 µm de diamètre avec une longueur variable de quelques mm à plusieurs cm. Leur cytoplasme, nommé sarcoplasme, est occupé principalement par des myofibrilles qui se groupent en amas et est limité en périphérie par une membrane plasmique doublée d’une lame basale, le sarcolemme. Le sarcoplasme contient tous les organites intracellulaires incluant le réticulum sarcoplasmique, l’appareil de Golgi, les mitochondries, le glycogène, l’eau, les sels minéraux ainsi qu’un pigment respiratoire caractéristique, la myoglobine. Les noyaux cellulaires sont majoritairement situés en périphérie, sous le sarcolemme. Les myofibrilles sont des cylindres d’environ 1 à 2 µm de diamètre qui occupent toute la longueur de la fibre. En microscopie électronique, on observe la structure filamentaire des myofibrilles; elles sont constituées de petites sous-unités parallèles à leur axe et qui se répètent régulièrement, les myofilaments de myosine et d’actine, donnant ainsi l’apparence striée au muscle. Ces myofilaments sont superposés les uns aux autres et forment le sarcomère. Le sarcomère est l’unité contractile, fonctionnelle, du muscle strié. Une contraction du muscle correspond à un raccourcissement du sarcomère. Chaque sarcomère contient 2 types de myofilaments, épais et minces. Les myofilaments épais sont constitués de plusieurs molécules de myosine. Ils ont 12 à 14 nm d’épaisseur et 1.6 µm de long. Ils sont situés au milieu du sarcomère où ils forment les bandes sombres des muscles striés appelées stries A. Les myofilaments fins sont constitués de plusieurs molécules d’actine et d’autres molécules régulatrices (la tropomyosine et la troponine) impliquées dans la régulation de la contraction musculaire. Ils mesurent 5 à 7 nm d’épaisseur et 0.98 µm de long. Ils sont fixés aux 2 extrémités du sarcomère sur la ligne Z. La bande I occupe la région située entre les bandes A des 2 sarcomères contigus, elle est constituée par la partie des filaments fins qui ne sont pas engagés entre les filaments épais. La bande I est traversée en son milieu par la bande Z. La zone H est une bande étroite à mi-longueur de la bande A, plus claire que le reste de celle-ci et correspondant à l’espace qui sépare l’extrémité des filaments fins. Ces 2 systèmes filamentaires sont unis par des ponts de myosine ou complexes d’actomyosine à la base de la contraction musculaire. Différentes protéines jouent un rôle important dans les relations entre le cytosquelette des fibres musculaires et la matrice extracellulaire : nous citons la dystrophine ainsi qu’un complexe glycoprotéique membranaire (Figure 4). 10 Figure 5 : Anatomie du muscle squelettique. Le muscle squelettique est souvent attaché à l’os par un tendon; il est formé de plusieurs faisceaux de fibres. A l’intérieur de chaque fibre musculaire on retrouve des myofibrilles et, près des fibres on retrouve des cellules mononuclées, ce sont les cellules satellites, nécessaires pour la régénération musculaire. 1.4.4 La contraction musculaire La contraction du muscle strié squelettique est sous le contrôle de la volonté. C’est un phénomène qui est géré par le système nerveux central et déclenché par la libération du calcium stocké dans le réticulum sarcoplasmique. En réponse à une vague de dépolarisation du sarcolemme, l’actine et la myosine glissent l’une sur l’autre et se dépolymérisent en actomyosine, produisant un raccourcissement qui est à la base de la contraction musculaire. La contraction est caractérisée au niveau du muscle par un raccourcissement, un épaississement et un durcissement. Ce processus dépend de l’ATP et du calcium. En fonction des propriétés métaboliques et contractiles concernant la vitesse maximale de raccourcissement, il existe 2 types des fibres musculaires, les fibres de type I et les fibres de type II. Les fibres de type I sont plus aptes à un travail aérobie; elles contiennent un nombre important de mitochondries, de la myoglobine et sont entourées par plus des capillaires sanguins. Leur contraction est lente et elles sont très résistantes à la fatigue, d’où elles peuvent soutenir un exercice modéré de longue durée. Ces fibres se localisent surtout dans les muscles posturaux. Les fibres de type II sont plus aptes à un travail anaérobie; elles se divisent en 2 types : les fibres de type IIA et IIB. Les fibres de type IIA contiennent un nombre important de mitochondries, de la myoglobine et sont entourées par des capillaires sanguins, mais elles résistent peu à la fatigue comparativement aux fibres de type I. Elles se retrouvent majoritairement dans les muscles des jambes. Les fibres de type IIB contiennent peu de mitochondries, de myoglobine et de capillaires sanguins, mais possèdent une teneur élevée en glycogène et provoquent des contractions rapides et puissantes. Ces dernières sont retrouvées 11 en grand nombre surtout dans les muscles du bras (Wheater, Young et al. 2001, Campbell and Reece 2005). 1.4.5 La régénération musculaire La régénération musculaire est une réponse rapide et complète du muscle survenant lors des dommages qui lui sont infligés (traumatisme mécanique, agent chimique ou pathologie). Elle comprend 2 phases : la phase dégénérative suivie de la phase régénérative. La dégénérescence musculaire se caractérise par une nécrose de la fibre musculaire. Le secteur nécrotique de la fibre musculaire est infiltré par de cellules inflammatoires (neutrophiles et macrophages) qui vont assurer la phagocytose des débris cellulaires et supporter l’action des cellules myogéniques. Le processus de régénérescence musculaire fait suite à la nécrose et est semblable à la myogenèse; il est dû à l’activation et la prolifération des cellules satellites (Cornelison and Wold 1997). L’expression de MyoD et Myf5 est prédominante dans les cellules myogéniques tandis que l’expression de Pax7 diminue. L’expression de myogénine et de MRF4 permet la différenciation et la fusion des myoblastes avec les fibres endommagées pour les réparer et aussi la fusion des myoblastes entre eux pour former de nouvelles fibres musculaires (Schultz 1996, Cooper, Tajbakhsh et al. 1999). 1.5 Modèles animaux Pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques, les causes moléculaires et les pistes thérapeutiques dans la DMD, les chercheurs étudient les modèles animaux spécifiques qui reproduisent les caractéristiques de cette myopathie. Il existe plusieurs modèles animaux de la DMD dont les plus utilisés sont la souris mdx et le chien GRMD. 1.5.1 La souris mdx C’est le modèle murin le plus utilisé pour les recherches sur la DMD. Elle possède une mutation nonsens, à la position 3185 sur l’exon 23 responsable de l’apparition d’un codon stop prématuré et donc de l’absence de la dystrophine dans les fibres musculaires (Sicinski, Geng et al. 1989). Cette mutation s’est produite au départ chez la souris C57BL/10 ScSn. C’est donc une souris mutante atteinte d’une dystrophie primaire liée au chromosome X qui est plus prononcée entre l’âge de 2 et 8 semaines. Par rapport au patient DMD, la souris mdx présente cependant un phénotype léger dû à sa capacité de régénération musculaire importante. En effet, on observe peu de fibres en nécrose, les fibres endommagées sont réparées et ne sont pas remplacées par du tissu conjonctif. En plus, la souris mdx a la capacité de se reproduire. À l’âge d’environ 1 mois, le cycle régénération/dégénération est semblable à l’humain (Grounds and McGeachie 1992). 12 1.5.2 Le chien GRMD Le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy) est le modèle canin le plus utilisé. Il constitue le meilleur modèle de DMD jusqu’à présent, car l’évolution de la maladie est très semblable à l’humain. Dans ce cas, la mutation est un remplacement d’une base A par une base G à l’intérieur d’un site d’épissage sur l’intron 6. L’aspect dégénératif et fibrotique prédomine laissant ainsi place à une perte progressive de la structure et de la fonction de la fibre musculaire (Sharp, Kornegay et al. 1992). Il meurt vers l’âge d’un an de troubles respiratoires ou cardiaques. 1.6 Différentes pistes thérapeutiques Il n’existe aucune thérapie curative pour la DMD. Cependant, plusieurs équipes de chercheurs essaient de trouver une thérapie efficace. Les traitements utilisés actuellement ont pour but d’améliorer la qualité de vie des malades et de retarder l’apparition des complications (orthopédiques, cardiaques et respiratoires). Les pistes thérapeutiques dans la DMD sont multiples et complémentaires ciblant la maladie à différents niveaux. 1.6.1 Thérapie pharmacologique Les corticostéroïdes sont les seuls médicaments utilisés de façon régulière pour le traitement des patients DMD. Dans la DMD, il existe une inflammation du tissu musculaire qui contribue à la nécrose des fibres musculaires. Ainsi, les corticostéroïdes améliorent le phénotype dystrophique par la réduction de l’inflammation. Plusieurs essais ont été réalisés avec la Prednisone, la Prednisolone et le Deflazacort, dérivé de la Prednisolone et ont montré une amélioration clinique des patients DMD (Bonifati, Ruzza et al. 2000, Biggar, Politano et al. 2004, Gaud, Simon et al. 2004). Certains facteurs de croissance pourraient améliorer le phénotype des malades DMD comme l’IGF-1. Certaines équipes de recherche ont utilisé des inhibiteurs de myostatine ainsi que des anticorps antimyostatine pour augmenter la masse et la force musculaires chez les souris mdx. Le système de myostatine limite la masse musculaire; en présence de la myostatine, les myoblastes arrêtent de proliférer ou de se différencier. 1.6.2 Thérapie génique Elle consiste au transfert de copies fonctionnelles du gène de la dystrophine dans les noyaux de fibres musculaires dystrophiques lesquelles pourront ainsi synthétiser la dystrophine. Différentes approches existent : d’une part les approches permettant d’introduire le gène fonctionnel, d’autre part les approches permettant de modifier l’ARN messager. Deux types de méthodes sont utilisés pour introduire le gène fonctionnel: les vecteurs viraux et les vecteurs non viraux. 13 Les vecteurs viraux Ce sont des particules virales véhiculant un génome modifié in vitro en regard de celui de la souche virale dont le vecteur est dérivé. Ces particules ne contiennent aucun des gènes essentiels à la réplication virale et renferment donc un génome modifié portant le gène de la dystrophine complet ou tronqué à la place du génome viral. Plusieurs vecteurs viraux sont utilisés : les rétrovirus, les lentivirus, les adénovirus, l’herpès simplex type 1 et les AAV. Les rétrovirus peuvent assurer le transfert de la mini-dystrophine, mais ils sont peu utilisés à cause du risque de tumorigénèse dû à leur intégration dans le génome du patient lors de la division des cellules (Li, Dullmann et al. 2002). Les rétrovirus ne sont pas de bons vecteurs pour les fibres musculaires, car ces dernières sont des cellules quiescentes et les rétrovirus ne peuvent donc pas s’intégrer, ils ne s’intègrent que dans les cellules en division cellulaire (Dunckley, Wells et al. 1993, Roe, Reynolds et al. 1993, Kay, Glorioso et al. 2001). Seuls les adénovirus et les Herpès simplex de type 1 peuvent contenir le gène de la dystrophine dans son entièreté (Raper, Chirmule et al. 2003, van Deutekom and van Ommen 2003, Goncalves, Holkers et al. 2006). Cependant, le problème majeur des adénovirus est la réponse immunitaire importante de l’hôte (Acsadi, Lochmuller et al. 1996, Howell, Lochmuller et al. 1998, Wang, Li et al. 2000, Li, Kimura et al. 2005). Leur utilisation est aussi limitée par l’absence d’intégration des transgènes dans le génome. Les lentivirus ont l’avantage de s’intégrer même dans les cellules quiescentes, mais leur capacité de clonage n’est que de 8 kb d’ADN exogène limitant ainsi leur utilisation au transfert de la mini-dystrophine (6.2 kb) et de la micro-dystrophine (3.6 kb) (Ailles, Schmidt et al. 2002, Kobinger, Louboutin et al. 2003, Li, Kimura et al. 2005). Actuellement les AAV sont les meilleurs vecteurs viraux en thérapie génique, ils représentent les vecteurs de choix pour le développement de la thérapie génique de la DMD. Néanmoins, ils présentent l’inconvénient de ne pouvoir incorporer que des gènes de petite taille. Il existe plusieurs sérotypes différents d’AAV possédant des capacités différentes d’infection et qui peuvent être soit injectés directement dans la circulation sanguine soit administrés localement dans le muscle squelettique (Gregorevic, Allen et al. 2006, Pichavant, Aartsma-Rus et al. 2011). Pour certains chercheurs les meilleurs sérotypes pour les muscles semblent être le AAV1 et AAV6 (Chao, Liu et al. 2000, Gregorevic, Blankinship et al. 2004, Ghosh, Yue et al. 2006). Les études menées avec les sérotypes 1 et 2 chez la souris mdx ont montré que ces AAV couplés à un gène de micro- ou de mini-dystrophine restaurent l’expression de la micro- ou de la mini-dystrophine en quantité presque normale dans les muscles (Wang, Li et al. 2000, Wang, Li et al. 2008). Les sérotypes 6 et 8 ont été utilisés chez le chien, la dystrophine a été exprimée, mais une réponse immune a également été observée (Wang, Storb et al. 2010, Pichavant, Aartsma-Rus et al. 2011). Les AAV ont également été testés chez des primates non humains, les premières études ont donné des résultats encourageants (Rodino-Klapac, Montgomery et al. 2011). L’équipe de Mendell a réalisé un essai clinique de phase I afin d’évaluer la faisabilité et la tolérance de 14 l’administration en intramusculaire d’un AAV-mini-dystrophine chez des patients DMD (Mendell, Campbell et al. 2010). Le principal problème posé par les AAV chez l’humain est l’existence d’ anticorps préformés contre certains sérotypes, ce qui diminue leur efficacité. Pour les sérotypes pour lesquels il n’y a pas d’anticorps préformés, il y’ a une réaction immune qui prévient une réadministration du même sérotype (Yuasa, Sakamoto et al. 2002, Wang, Kuhr et al. 2007, Yuasa, Yoshimura et al. 2007). Pour contrer ce problème, les chercheurs utilisent des immunosuppresseurs. Les vecteurs non viraux Les vecteurs non viraux comme les plasmides ou les vecteurs lipidiques peuvent contenir des gènes de grande taille et sont moins susceptibles de provoquer une réaction immunitaire importante. Les vecteurs plasmidiques d’ADN permettent d’apporter l’ADN complémentaire de la dystrophine aux fibres musculaires par l’injection intramusculaire du plasmide ou par d’autres méthodes (Danko, Fritz et al. 1993, Zhang, Wooddell et al. 2010). L’efficacité du transfert de gène semble moindre comparativement aux AAV. En effet, l’injection des plasmides contenant le gène de la dystrophine dans le muscle de souris mdx n’a permis d’observer que 1% des muscles exprimant la dystrophine (Acsadi, Dickson et al. 1991). Des essais cliniques réalisés chez des patients atteints de DMD n’ont pas donné de résultats satisfaisants (Romero, Braun et al. 2004). Ainsi, on tente d’améliorer cette approche par l’utilisation de techniques physiques telle que l’électroporation qui a permis d’augmenter l’efficacité de distribution et d’expression du plasmide (Hartikka, Sukhu et al. 2001, Vilquin, Kennel et al. 2001). Le saut d’exon La DMD est due à une mutation qui change le cadre de lecture du gène de la dystrophine, induisant ainsi un codon stop prématuré et l’absence de l’expression de la dystrophine. La technique du saut d’exon permet de contrôler l’épissage de l’ARN messager du gène de la dystrophine, en sautant un ou plusieurs exons, afin de rétablir le cadre normal de lecture et aboutir ainsi à l’expression d’une forme plus courte de la dystrophine qui est fonctionnelle (Mann, Honeyman et al. 2001). Cette technique permet la conversion du phénotype de la DMD en phénotype de dystrophie musculaire de Becker (BMD). La BMD est une forme moins sévère de dystrophies où les délétions d’exons du gène de la dystrophine n’entrainent pas un décalage du cadre de lecture et induisent la synthèse d’une dystrophine tronquée, mais plus ou moins fonctionnelle. Pour contrôler l’épissage du gène de la dystrophine et corriger la mutation, on utilise des oligonucléotides antisens. Un oligonucléotide antisens est un court ARN constitué de 20 à 30 nucléotides complémentaires à une séquence spécifique de l’exon cible qui sera sauté afin de rétablir le cadre de lecture (Heemskerk, de Winter et al. 2009). Les oligonucléotides antisens peuvent être soit injectés seuls dans l’organisme, soit transportés par un vecteur viral AAV. Plusieurs recherches sont menées sur l’utilisation des oligonucléotides antisens ayant une meilleure efficacité thérapeutique (Mann, Honeyman et al. 2002, Lu, Mann et al. 2003, Aartsma-Rus, Kaman et al. 2004). Cette thérapie a plusieurs limites dont 15 sa courte demi-vie (2 à 4 mois), la variabilité possible des mutations et les réactions immunitaires (Wells, Ferrer et al. 2002). 1.6.3 Thérapie cellulaire La transplantation des cellules myogéniques est une approche expérimentale pour le traitement des myopathies, dont la DMD (Skuk and Tremblay 2000, Skuk, Paradis et al. 2010). Les premières cellules myogéniques utilisées dans cette approche étaient les myoblastes (Partridge, Grounds et al. 1978). En effet, les myoblastes ont été les premières cellules greffées chez certains animaux, dont la souris (Watt, Morgan et al. 1984). Les premiers essais cliniques effectués chez l’humain dans les années 1990 ont fait suite aux travaux de Partridge qui, avec son groupe, ont été les premiers à démontrer que la transplantation des myoblastes sains chez la souris mdx conduisait à l’expression de la dystrophine par les fibres musculaires hybrides nouvellement formées (Partridge, Morgan et al. 1989). Ainsi, la thérapie cellulaire par transplantation des myoblastes normaux consiste à greffer des myoblastes provenant de sujets sains dans les muscles des patients DMD. Ces myoblastes sont capables de fusionner avec les fibres musculaires de sujets DMD et former des fibres hybrides qui expriment la dystrophine (Karpati, Pouliot et al. 1989, Skuk and Tremblay 2000, Skuk, Roy et al. 2004). La technique est assez simple, elle débute par une biopsie musculaire prise chez un donneur sain suivie de l’extraction des myoblastes qui seront par la suite mis en culture et prolifèreront in vitro avant d’être transplantés dans le muscle dystrophique. L’équipe du Dr Tremblay a démontré que la greffe de myoblastes normaux réalisée dans les modèles animaux permettait de rétablir l’expression de la dystrophine dans les fibres musculaires lorsque ces animaux étaient immunosupprimés avec le tacrolimus. Ainsi, des essais cliniques ont été menés chez les patients DMD (Gussoni, Pavlath et al. 1992, Huard, Bouchard et al. 1992, Tremblay, Malouin et al. 1993). Les résultats ont été parfois peu concluants, car seules 10 % des fibres des muscles greffés exprimaient la dystrophine. Les essais cliniques plus récents, menés par l’équipe de Dr Tremblay, basés sur les expériences sur les primates non humains, ont montré l’expression de la dystrophine provenant des myoblastes sains dans jusqu’à 26 % des fibres musculaires des patients DMD (Skuk, Roy et al. 2004, Skuk, Goulet et al. 2006, Skuk, Goulet et al. 2007). Plusieurs problèmes diminuent l’efficacité de cette thérapie; il s’agit principalement de la mort précoce des myoblastes greffés, la faible migration des myoblastes greffés et la réponse immunitaire spécifique de l’hôte. La mort cellulaire précoce des myoblastes greffés Plusieurs équipes de recherche ont constaté la mort de la majeure partie des myoblastes greffés dans les 5 premiers jours suivant la greffe (Fan, Maley et al. 1996, Guerette, Skuk et al. 1997, Beauchamp, Morgan et al. 1999). Diverses causes ont été évoquées, à savoir le stress physique lors de l’injection peut être responsable de la mort cellulaire par nécrose ou par apoptose (Baines and Molkentin 2005). Les 16 neutrophiles, à travers la réaction inflammatoire qu’ils occasionnent, sont aussi impliqués dans la mort des myoblastes greffés (Guerette, Skuk et al. 1997). L’ischémie et l’hypoxie ont été également incriminées (Bouchentouf, Benabdallah et al. 2008). Quelques pistes de solutions ont permis d’améliorer la survie des myoblastes greffés. En effet, certaines études ont utilisé un anticorps dirigé contre un récepteur de lymphocytes, le LFA-1, cela a réduit sensiblement la mortalité des myoblastes greffés (Guerette, Asselin et al. 1997). Certains préconditionnements à la chaleur améliorent aussi la survie des myoblastes greffés via la production des protéines de choc thermique (Suzuki, Smolenski et al. 2000, Bouchentouf, Benabdallah et al. 2004); d’autres travaux ont exploité des préconditionnements à l’hypoxie (Azarnoush, Maurel et al. 2005, Li, Zhu et al. 2007). La faible migration des myoblastes greffés Les myoblastes de souris, après 4 jours d’injection, migrent sur une surface allant de 2.6 à 9.5 × 105 µm² à partir du site d’injection (Ito, Hallauer et al. 1998). Quelques études ont noté la faible migration des myoblastes injectés à partir de leur site d’injection (Skuk and Tremblay 2000). Pour résoudre ce problème, on effectue des trajectoires d’injection à chaque millimètre, ce qui permet d’assurer une bonne distribution des myoblastes dans le muscle, mais cela rend le protocole assez invasif (Skuk, Goulet et al. 2000, Skuk, Roy et al. 2004, Skuk, Goulet et al. 2006, Skuk, Goulet et al. 2007). La faible migration des myoblastes greffés peut être liée à l’effet de la matrice extracellulaire. Certaines études ont utilisé des inducteurs de métalloprotéinases qui sont des agents chimiques qui peuvent digérer la matrice extracellulaire; ces inducteurs de métalloprotéinases ont été utilisés avant la transplantation des myoblastes. Ce prétraitement a nettement amélioré la migration des myoblastes dans le muscle (Ito, Hallauer et al. 1998) . D’autres études ont utilisé les facteurs de croissance IGF-1 et MGF qui régulent positivement le système protéolytique et donc améliorent la capacité migratoire des myoblastes (Allen, Teitelbaum et al. 2003, Lafreniere, Mills et al. 2004). La réponse immunitaire de l’hôte Plusieurs travaux ont démontré que la transplantation des myoblastes effectuée chez des singes ou des souris, sans une immunosuppression soutenue, est suivie d’un rejet aigu de ces myoblastes greffés (Wernig and Irintchev 1995, Skuk, Roy et al. 1999). Certains travaux ont démontré la présence d’une importante infiltration lymphocytaire chez la souris une semaine après la transplantation des myoblastes (Skuk, Caron et al. 2002). Pour pouvoir empêcher ce rejet immunologique, il faut soit associer un immunosuppresseur soit induire une tolérance immunologique. Le tacrolimus ou FK506 est l’immunosuppresseur qui a été le plus efficace chez le singe et chez la souris (Lochmuller, Petrof et al. 1996, Skuk, Goulet et al. 2000). Malheureusement, les immunosuppresseurs sont responsables de nombreux effets secondaires tels que les infections à répétitions, la néphrotoxicité, la neurotoxicité, le diabète ainsi que les cancers (McDiarmid, Busuttil et al. 1995). Ainsi la solution à ces effets secondaires c’est l’établissement des protocoles d’induction de tolérance immunologique. 17 Chapitre 2 : L’immunité adaptative et les lymphocytes T régulateurs Le système immunitaire humain a pour fonction de protéger l’organisme contre les agents infectieux (virus, bactéries, parasites, champignons) et toutes autres substances ou molécules étrangères (toxines, cellules cancéreuses,…). Ce mécanisme de défense est capable de différencier entre ce qui lui appartient (le soi c’est-à-dire ses propres molécules, cellules et organes) et ce qui ne lui appartient pas (le non-soi d’origine étrangère). Pour cela, le système immunitaire comporte 3 lignes de défense. La première ligne de défense est formée par les barrières mécaniques (Ex. : la peau), chimiques (Ex. : l’acidité du suc gastrique) et biologiques (Ex. : les bactéries commensales) qui protègent l’organisme. En cas de rupture de ces barrières, la deuxième et la troisième ligne de défense vont pouvoir intervenir : d’abord le système immunitaire inné puis enfin le système immunitaire adaptatif (Thao Doan 2013). Un nombre important de moyens de défense dont les molécules senseurs et médiatrices de signaux intracellulaires ainsi qu’un système spécialisé de cellules hématopoïétiques et de protéines du sérum qui, ensemble, fournissent les mécanismes nécessaires à la reconnaissance des organismes pathogènes ainsi qu’à leur élimination de l’organisme (DeFranco, Robertson et al. 2009). 2.1 Origine des cellules du système immunitaire Toutes les cellules du système immunitaire dérivent des mêmes précurseurs : ce sont les cellules souches hématopoïétiques (CSH) pluripotentes de la moelle osseuse (Janeway, Travers et al. 2003). À chaque division cellulaire, une CSH donne naissance à une autre CSH ainsi qu’à une cellule progénitrice au potentiel de développement plus restreint destinée à produire de cellules différenciées. Il existe deux lignées principales de cellules immunitaires : la lignée myéloïde et la lignée lymphocytaire (DeFranco, Robertson et al. 2009). La lignée myéloïde donne naissance aux cellules du système immunitaire inné tandis que la lignée lymphocytaire conduit aux cellules du système immunitaire adaptatif. Le système immunitaire inné (ou naturel) constitue la deuxième ligne de défense de l’organisme contre l’infection (Thao Doan 2013); il est composé des cellules phagocytaires (macrophages, neutrophiles, NK et cellules dendritiques) et des molécules (TLRs, protéines du complément et cytokines) qui reconnaissent des motifs conservés des micro-organismes les distinguant ainsi des cellules de l‘hôte (Heeger, Lalli et al. 2005, Murphy, Porrett et al. 2011). La réponse immunitaire innée est précoce, car ce système est activé dès le premier contact avec l’antigène, mais malheureusement sa spécificité est limitée et aussi elle n’est pas dotée de mémoire immunologique (Heeger and Dinavahi 2012). Ce système participe aussi à l’activation et à la régulation de la plupart des fonctions effectrices de l’immunité adaptative (Delves and Roitt 2000). 19 Le système immunitaire adaptatif (ou acquis) fait intervenir les lymphocytes et nécessite l’activation par les mécanismes immunitaires innés lors du premier contact avec l’antigène, mais agit immédiatement lors de contacts ultérieurs : c’est la mémoire immunitaire. Ce système est beaucoup plus spécifique que l’immunité innée (Delves and Roitt 2000). 2.2 Le système immunitaire adaptatif Les lymphocytes jouent un rôle important dans la défense immune spécifique. Il existe deux populations principales de lymphocytes, chacune chargée de rôles immunitaires différents et porteuse de types distincts de récepteurs d’antigènes à leur surface: il s’agit des lymphocytes B et des lymphocytes T. 2.2.1 Différenciation et maturation des lymphocytes Les lymphocytes B (ou cellules B) se différencient dans la moelle osseuse même où ils sont produits, ils ne migrent pas dans le thymus. Après leur différenciation, ils portent le récepteur de cellules B (ou BCR) ainsi que des immunoglobulines et produisent des anticorps circulants (immunoglobulines). Ce sont des cellules spécialisées dans la reconnaissance des antigènes de surface des germes vivant en dehors des cellules. Les lymphocytes T (ou cellules T) migrent dans le thymus, par la circulation sanguine, pour leur différenciation (Griesemer, Sorenson et al. 2010, Alpdogan and van den Brink 2012). Dans le thymus les lymphocytes T immatures provenant de la moelle osseuse sont appelés des prothymocytes (ou thymocytes corticaux). A ce stade ils n’expriment aucune molécule de surface telle que CD4, CD8, CD3 ou TCR (récepteurs des lymphocytes T). A la suite de leurs interactions avec les cellules épithéliales du cortex thymique les prothymocytes deviennent des thymocytes « doubles négatifs » car ils n’expriment pas encore les molécules CD4 ni les molécules CD8 puis ensuite, ils vont devenir des thymocytes « doubles positifs » CD4+CD8+ après l’expression des TCR, associés au complexe CD3 et l’expression des molécules CD4 et CD8. Les thymocytes « doubles positifs » CD4+CD8+ vont subir deux étapes de sélection, à savoir la sélection positive et la sélection négative, pour vérifier leur capacité à distinguer « le soi » du « non-soi ». Enfin après cette sélection les thymocytes qui vont survivre seront capables de former des lymphocytes T matures « simples positifs CD4+/CD8- ou CD8+/CD4- ». La sélection positive est une étape de sélection vis-à-vis du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) qui se réalise dans le cortex du thymus. Les lymphocytes T «doubles positifs» CD4 +CD8+ sont exposés aux molécules du CMH du soi qui leur sont présentées par les cellules épithéliales du cortex thymique. Seuls les lymphocytes T « doubles positifs » CD4+CD8+ interagissant avec ces molécules du CMH recevront un « signal de survie »; ceux qui ne réagiront pas avec les molécules du CMH vont mourir par apoptose et seront tout simplement éliminés. La sélection positive permet aussi de différencier les lymphocytes T CD4+ ou CD8+. En effet les thymocytes « doubles positifs » CD4+CD8+ qui vont interagir avec les CMH de classe I vont cesser d’exprimer le CD4 et vont devenir des cellules « simples positives» 20 CD8+; il en est de même des thymocytes « doubles positifs » CD4+CD8+ qui vont interagir avec les CMH de classe II, ils vont cesser d’exprimer le CD8 et deviendront des cellules « simples positives » CD4+. Les lymphocytes T CD4+ et CD8+ ainsi sélectionnés positivement passent ensuite dans la médullaire du thymus où ils subiront la deuxième sélection. La sélection négative (ou délétion clonale) est l’étape de sélection vis-à-vis du peptide; elle vise à s’assurer que les lymphocytes T ne s’attaqueront pas aux cellules du « soi » (Alam, Travers et al. 1996). Dans la médullaire thymique, ces lymphocytes T CD4+ et CD8+ seront exposés aux molécules du CMH du soi qui sont complexées avec des peptides du soi et présentées par des cellules présentatrices d’antigènes (CPA). Tous les lymphocytes T qui auront des interactions entre leurs TCR et les CMH du soi sont potentiellement des cellules autoréactives qui seront soit éliminées par apoptose soit transformées en lymphocytes T régulateurs. Cette deuxième étape de sélection est importante pour développer une tolérance centrale au soi (Ramsdell and Fowlkes 1990). Après la différenciation et la maturation dans les organes lymphoïdes centraux, les lymphocytes migrent par voie sanguine ou lymphatique vers les organes lymphoïdes périphériques ou secondaires (ganglions lymphatiques, rate et tissus lymphoïdes des muqueuses) qui sont des sites de leur activation par l’antigène. Les lymphocytes B et T matures qui n’ont pas encore rencontré d’antigène sont appelés lymphocytes naïfs (ou cellules naïves); ils circulent continuellement du sang vers les organes lymphoïdes périphériques. Lors d’une infection, les lymphocytes qui reconnaissent l’agent infectieux sont stoppés dans l’organe lymphoïde périphérique, où ils prolifèrent et se différencient en cellules effectrices capables d’activer ou de détruire d’autres cellules: ce sont des lymphocytes effecteurs. 2.2.2 Les lymphocytes T Les lymphocytes T sont des cellules essentielles du système immunitaire adaptatif qui jouent un rôle clé dans les réponses immunes. Les lymphocytes T reconnaissent essentiellement les pathogènes qui vivent dans la cellule et qui leur sont présentés sous forme de peptides par des molécules du CMH sur les CPA. Après leur différenciation et maturation chaque lymphocyte T porte à sa surface un TCR unique spécifique pour un peptide antigénique présenté par les molécules du CMH de classe I ou II. Les TCR sont des hétérodimères de 80-90 kD formés de deux chaines polypeptidiques α (48-54 kD) et β (37-42 kD) ou γ et δ liées de manière covalente par des ponts disulfures (Abbas, Williams et al. 1991, Gary S. Firestein 2009, Thao Doan 2013). Les lymphocytes T αβ et γδ sont des lignées cellulaires différentes et ont des propriétés différentes. Plus de 90 % des lymphocytes T circulants portent des TCR de type αβ, les lymphocytes T γδ sont peu nombreux dans le sang et dans les organes lymphoïdes périphériques. Sur la membrane des lymphocytes T, les TCR s’associent de manière non covalente avec le complexe CD3, plus un de deux clusters de différenciation CD4 ou CD8. 21 Les chaines du complexe CD3 (2 CD3Ɛ + 1 CD3γ +1 CD3δ +1 CD247 δ-δ homodimère) ne possèdent pas de sites de liaison à un ligand, mais jouent simplement le rôle de transmettre le signal d’activation du TCR lors de l’interaction du TCR avec le peptide porté par la molécule du CMH. Ainsi, le CD3 est responsable de la signalisation intracellulaire. Les molécules CD4 et CD8 contribuent à la stabilisation de l’interaction TCR-CMH et participent ainsi à la transduction du signal activateur (Figure 6). Contrairement aux anticorps, les TCR n’interagissent pas avec des épitopes solubles (Thao Doan 2013). Figure 6 : Récepteurs d’un lymphocyte T et ses sous-unités membranaires. Le TCR s’associe au complexe CD3 ainsi qu’aux molécules CD4 et CD8 localisées à la surface du lymphocyte T. Les lymphocytes T CD8+ naïfs reconnaissent les peptides du pathogène présentés par des molécules du CMH de classe I et vont se différencier en lymphocytes T cytotoxiques effecteurs (Lu and Rudensky 2009). Les lymphocytes T cytotoxiques effecteurs ont pour rôle de tuer les cellules infectées par des virus ou certaines bactéries intracellulaires limitant ainsi la prolifération de ces agents infectieux (DeFranco, Robertson et al. 2009). Les lymphocytes T CD4+ naïfs reconnaissent les peptides du pathogène présentés par des molécules CMH de classe II. Lors de la reconnaissance de l’antigène, le lymphocyte T CD4 + naïf reçoit le premier signal d’activation et sous l’influence des différentes cytokines, il se différencie en l’une des deux sous-populations fonctionnelles de lymphocytes T CD4+ effecteurs, spécialisées dans diverses activités (Figure 7): Les lymphocytes T auxiliaires (TH1, TH2, TH17) activent d’autres cellules du système immunitaire. En effet, ils reconnaissent des fragments peptidiques générés à partir des micro-organismes internalisés par les phagocytes, ou l’antigène internalisé dans les cellules B, ceci les stimule à sécréter des cytokines qui activent à leur tour ces cellules pour qu’elles tuent les micro-organismes (phagocytes) ou qu’elles sécrètent des anticorps (cellules B) (DeFranco, Robertson et al. 2009). Les lymphocytes T régulateurs (Treg) suppriment (régulent) l’activité des autres lymphocytes et contribuent ainsi au contrôle des réponses immunes. Nous les détaillerons dans les lignes qui suivent. 22 Figure 7 : Différenciation des lymphocytes T CD4+. Après stimulation antigénique le lymphocyte T CD4+ se différencie en l’une des sous-populations suivantes : TH1, TH2, TH17, Treg. L’activation des lymphocytes T naïfs nécessite une interaction d’affinité suffisante entre le TCR et le complexe peptide-CMH (premier signal) mais aussi, en même temps un signal de costimulation fourni par une CPA spécialisée (second signal) (Alpdogan and van den Brink 2012). 2.3 Les cellules présentatrices d’antigènes Les CPA les plus importantes sont les cellules dendritiques qui sont des cellules phagocytaires localisées dans les tissus, les seules cellules capables d’activer efficacement les lymphocytes T naïfs (Figure 8). Les cellules dendritiques immatures expriment une grande variété de récepteurs phagocytaires (TLR, CLR, CCR1, CCR2, CCR5, récepteur de Fc et du complément), qui leur permettent d’internaliser les microorganismes par phagocytose et par macropinocytose; elles n’expriment que quelques molécules du CMH de classe I et presque pas de molécules du CMH de classe II. Elles sont activées au cours de la réponse immunitaire innée, permettant ainsi leur migration vers les organes lymphoïdes périphériques ainsi que leur maturation (DeFranco, Robertson et al. 2009). Les cellules dendritiques matures n’expriment plus les récepteurs phagocytaires, mais expriment un nombre important de molécules du CMH de classe I et II à leur surface. Elles sont alors spécialisées dans la présentation aux lymphocytes T de l’antigène, qu’elles ont internalisé dans les tissus périphériques. Elles expriment aussi des niveaux élevés de molécules de costimulation, molécules qui vont participer à leur interaction avec les lymphocytes T naïfs circulants, et enfin elles sécrètent des cytokines inflammatoires (Sayegh and Turka 1998, Clarkson and Sayegh 2005). Ainsi l’expansion clonale des 23 lymphocytes T naïfs induite par l’antigène nécessite un second signal ou signal de costimulation fourni par la même CPA que celle sur laquelle le lymphocyte T a reconnu l’antigène (Mellman and Steinman 2001). Les molécules de costimulation les mieux caractérisées sont les molécules B7-1 (CD80) et B7-2 (CD86), deux molécules apparentées dont le récepteur sur le lymphocyte T est le CD28. CD28 est le principal récepteur de costimulation, car sa liaison avec les molécules B7 est nécessaire pour l’expansion clonale optimale des lymphocytes T naïfs (Clarkson and Sayegh 2005, Alpdogan and van den Brink 2012). La costimulation passant par CD28 contribue à la production d’IL-2. D’autres molécules de la famille de CD28 sont aussi induites sur les cellules T activées et permettent de modifier le signal de costimulation au cours de la différenciation du lymphocyte T. L’une d’entre elles est le CTLA-4 (CD152), un autre récepteur des molécules B7, qui est normalement séquestré dans l’appareil de Golgi des lymphocytes T naïfs; il va migrer à la membrane cellulaire externe pour interagir avec CD80/86 avec lesquels son affinité est 100 fois supérieure par rapport à celle de CD28. CTLA-4 inhibe l’activation des lymphocytes T dépendant de CD28, la progression du cycle cellulaire ainsi que l’expression de l’ARN messager de l’IL-2 arrêtant ainsi la prolifération des lymphocytes T (Walunas, Lenschow et al. 1994, Walunas, Bakker et al. 1996). Par conséquent, la fixation de CTLA-4 sur les molécules B7 est essentielle pour limiter la réponse proliférative en réponse à l’antigène et à B7 des lymphocytes T activés. 2.4 Les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité Les molécules du CMH sont des glycoprotéines de surface cellulaire codées par des gènes du CMH localisés sur le bras court du chromosome 6 (6p21.31). Les gènes du CMH sont répartis en trois classes : les gènes CMH de classe I et II qui codent les molécules CMH des CPA, et les gènes CMH de classe III qui constituent un groupe assez disparate (Margulies and McCluskey 2003, Trowsdale and Parham 2004). Historiquement les molécules du CMH humaines sont appelées HLA; elles ont le rôle de surveiller les compartiments internes des cellules. Les molécules du CMH de classe I (HLA A, B, C) sont exprimées sur toutes les cellules nucléées de l’organisme, elles surveillent le cytosol et les compartiments sécrétoires des cellules et présentent les peptides produits par les protéasomes aux cellules T CD8+ (Rock, York et al. 2004). Les molécules du CMH de classe II (HLA DR, DP, DQ) surveillent les compartiments endosomiques et lysosomiques des cellules spécialisées et ne sont normalement exprimées que sur les phagocytes (les cellules dendritiques, les lymphocytes B et les cellules spécialisées du thymus); elles présentent les peptides produits à partir des agents pathogènes ou par les cellules du soi aux lymphocytes T CD4+ auxiliaires (Villadangos and Ploegh 2000, Goldberg, Cascio et al. 2002). 24 2.5 Les lymphocytes T effecteurs La reconnaissance de l’antigène (sous forme de complexe peptide-CMH), à la surface d’une cellule dendritique mature activée dans les tissus lymphoïdes périphériques, par le TCR de lymphocytes T naïfs induit la synthèse ou l’activation des facteurs de transcription NFAT, NFκB et AP-1 (Figure 8). Ces facteurs se lient à la région promotrice du gène de l’IL-2 et sont indispensables à sa transcription. Ainsi les lymphocytes T activés entrent dans un programme de prolifération et de différenciation en lymphocytes T effecteurs fonctionnels. Ils vont induire la synthèse de l’IL-2 ainsi que celle de la chaine α du récepteur de l’IL-2 (CD25) (Davis and Bjorkman 1988, Macian 2005). L’IL-2 est le facteur de croissance essentiel des lymphocytes T car elle favorise leur prolifération et leur différenciation en lymphocytes T effecteurs. Le récepteur de l’IL-2 comporte 3 chaines : α, β et γ. Les lymphocytes T naïfs n’expriment que les chaines β et γ qui fixent l’IL-2 avec une affinité modérée; ces cellules ne peuvent donc répondre qu’à de très fortes concentrations d’IL-2. L’activation des lymphocytes T induit la synthèse de la chaine α, un récepteur doté d’une affinité beaucoup plus forte, ce qui permet à la cellule de répondre à de très faibles concentrations d’IL-2. La liaison de l’IL-2 au récepteur de haute affinité permet au cycle cellulaire de s’achever. L’importance de l’IL-2 dans le déclenchement de la réponse immunitaire adaptative est bien illustrée par les médicaments immunosuppresseurs les plus couramment utilisés lors d’une greffe d’organe; il s’agit de la cyclosporine A et du tacrolimus (FK506) qui inhibent la production de l’IL-2 en bloquant le signal provenant du TCR. La reconnaissance de l’antigène en absence de costimulation inactive les lymphocytes T naïfs, les plaçant dans un état d’anergie (Schwartz 2003, Heeger and Dinavahi 2012). Les lymphocytes T anergiques sont incapables de produire l’IL-2, ce qui empêche leur prolifération et leur différenciation en lymphocytes T effecteurs lorsqu’ils rencontrent l’antigène. D’où la nécessité d’avoir deux signaux, la reconnaissance de l’antigène et le signal de costimulation, ce qui évite que les lymphocytes T ne répondent aux antigènes du soi des cellules qui n’ont pas d’activité de costimulation (Figure 8). 25 Figure 8 : Activation des lymphocytes T en lymphocytes T effecteurs. Elle nécessite l’activation de deux signaux, le premier signal (la reconnaissance de l’antigène) et le deuxième signal (signal de costimulation) et conduit à la production de l’IL-2. 2.6 Les lymphocytes T régulateurs Le système immunitaire dispose de mécanismes (immunité innée et immunité adaptative) qui lui permettent de reconnaitre et d’éliminer les organismes pathogènes qui menacent l’intégrité de l’organisme. Pour le maintien de son homéostasie, le système immunitaire dispose aussi de mécanismes lui permettant de revenir au repos lorsque la menace est écartée. En plus, il doit être capable d’empêcher les réactions vis-à-vis de son propre organisme, d’où la notion de régulation périphérique négative de la réponse immunitaire ou tolérance immunitaire périphérique. La notion de régulation périphérique négative de la réponse immunitaire effectuée par une souspopulation des lymphocytes, appelés lymphocytes T suppresseurs, date de plus de 30 ans (Gershon and Kondo 1970, Gershon and Kondo 1971). Cependant, ce n’est qu’en 1995 que le groupe de Shimon Sakaguchi au Japon a identifié une sous-population des lymphocytes T CD4+, les lymphocytes T CD4+CD25+ immunosuppresseurs (Sakaguchi, Sakaguchi et al. 1995). Les travaux de Sakaguchi réalisés sur des souris déficientes en CD4+CD25+ ont montré le développement d’un syndrome auto-immun chez ces souris; ainsi, il a été suggéré que ces cellules avaient la capacité de réguler les réactions autoimmunes d’où l’appellation des lymphocytes T régulateurs (Wing and Sakaguchi 2010). Les lymphocytes T régulateurs constituent une sous-population des lymphocytes T CD4+ effecteurs qui expriment la molécule CD25 à leur surface ainsi que le facteur de transcription Foxp3 dans leur noyau. Les lymphocytes T régulateurs sont impliqués dans la régulation des réponses immunitaires et dans 26 l’inhibition des réponses auto-immunes (Roncarolo and Battaglia 2007, Sakaguchi, Yamaguchi et al. 2008, Canavan, Afzali et al. 2013). Ils jouent ainsi un rôle vital dans le maintien de l’homéostasie entre les réponses immunes effectrices et les réponses tolérogéniques (Gregori, Goudy et al. 2012, Hilbrands, Howie et al. 2013). La fonction des lymphocytes T régulateurs est d’inhiber l’activation de lymphocytes T effecteurs (CD4 + et CD8+) ainsi que celle de toutes les autres cellules immunitaires (lymphocytes B, cellules dendritiques et monocytes) en réponse aux antigènes du soi et du non-soi (Thornton and Shevach 1998, Xiaohong, Maogen et al. 2013). À l’inverse les lymphocytes T régulateurs ont malheureusement tendance à protéger les tumeurs de l’immunité anti- tumorale de l’hôte (Chen and Konkel 2010, Zhou, Kong et al. 2011). 2.6.1 Types des lymphocytes T régulateurs On distingue deux principaux groupes de lymphocytes T régulateurs : les lymphocytes T régulateurs naturels (nTreg) produits dans le thymus et les lymphocytes T régulateurs adaptatifs (ou induits) (iTregs) produits en périphérie (Lan, Fan et al. 2012, Schmitt and Williams 2013). Toutes ces cellules ont les mêmes phénotypes et les mêmes caractéristiques fonctionnelles; elles expriment les mêmes marqueurs à savoir le CD25, Foxp3, GITR et le CTLA-4, mais les différences entre les deux groupes ne sont pas encore universellement admises (Xiaohong, Maogen et al. 2013). Ainsi, il n’existe pas encore des marqueurs fiables pour distinguer les 2 groupes de lymphocytes T régulateurs, néanmoins les lymphocytes T régulateurs naturels expriment fortement le PD-1, le nrp1, le Ikzf2 et le CD73 par rapport aux lymphocytes T régulateurs induits (Weiss, Bilate et al. 2012, Yadav, Louvet et al. 2012, Schmitt and Williams 2013). Quelques études ont démontré des différences spécifiques entre les deux souspopulations des lymphocytes T régulateurs sur le plan des modifications épigénétiques ainsi que sur leur stabilité; ces différences confirment la notion que ces cellules représentent des sous-groupes uniques mais qui sont distincts (Xiaohong, Maogen et al. 2013). Les lymphocytes T régulateurs naturels Les nTreg sont formés dans le thymus (Figure 9). En effet, la plupart d’entre eux sont des cellules T CD4+ autoréactives induites à se différencier en cellules régulatrices par la reconnaissance de complexes peptide-CMH de classe II dans le thymus (Yagi, Nomura et al. 2004). C’est donc une population qui est orientée vers un destin régulateur déjà dans le thymus. La différenciation en cellules T régulatrices et la sélection négative sont les deux destinées possibles des cellules T autoréactives en cours de développement. Le choix entre ces deux destinées implique le facteur de transcription Foxp3 et semble dépendre de la nature de la reconnaissance du complexe peptide-CMH de classe II. Une fois différenciées, les nTreg expriment le facteur de transcription Foxp3, la chaine α du récepteur d’IL2 (CD25) ainsi que le récepteur de la sélectine L (CD62L). En plus, ils se distinguent des autres lymphocytes T effecteurs par la faible expression de CD127 et de CD49d et aussi par la déméthylation de 27 l’ADN au niveau d’une région spécifique du gène de Foxp3 appelée TSDR (Baron, Floess et al. 2007, Kleinewietfeld, Starke et al. 2009, Miyara, Yoshioka et al. 2009). Dans les conditions inflammatoires les nTreg présentent une instabilité et peuvent même, en présence de l’IL-6, se transformer en lymphocytes Th17. Ces cellules sécrètent aussi l’IL-10 et le TGF-β, deux médiateurs importants qui inhibent la prolifération des lymphocytes T effecteurs conventionnels (Josien, Douillard et al. 1998, Hara, Kingsley et al. 2001). Leur fonction suppressive peut être mise en évidence in vitro par différents tests montrant leur capacité à inhiber la prolifération des lymphocytes T effecteurs conventionnels. Les nTreg naturels jouent un rôle important dans le contrôle de l’auto-immunité ainsi que dans le maintien de la tolérance fœtale. Les lymphocytes T régulateurs adaptatifs ou induits Ce sont des cellules qui se différencient en périphérie, à partir de lymphocytes T CD4+ naïfs que TGF-β ou l’acide rétinoïque induit à exprimer Foxp3 sous l’influence de conditions environnementales particulières (Fantini, Becker et al. 2004, Lan, Fan et al. 2012). La production des iTregs ne dépend pas du thymus mais plutôt de la présence de l’IL-2 (-). Dans les conditions inflammatoires, in vivo et même in vitro, ces cellules sont stables (Schmitt and Williams 2013). Leur rôle est de contrôler les lymphocytes T naïfs autoréactifs ayant échappé à la sélection dans le thymus. Elles produisent les cytokines IL-10 et TGF-β qui inhibent les réponses immunes de cellules T. Ces cytokines inhibitrices donnent à ces cellules une activité régulatrice, qui est importante dans le maintien de la tolérance au soi durant des fortes réactions immunitaires à des pathogènes. Les iTregs peuvent aussi être induits in vitro à partir des cellules T CD4+CD25-Foxp3-, cela en présence de l’IL-2, de TGF-β ou de l’acide rétinoïque (Horwitz, Zheng et al. 2008, Zhou, Wang et al. 2010, Hilbrands, Howie et al. 2013). D’autres populations de lymphocytes T régulateurs induits à action suppressive ont été décrites : ce sont des iTregs Foxp3- qui se distinguent des autres cellules T régulatrices par l’absence de l’expression de Foxp3 (Miller, Lider et al. 1992, Okamura, Fujio et al. 2012). Il s’agit d’un groupe hétérogène qui diffère par leur phénotype, leurs propriétés et les conditions favorisant leur différenciation: Cellules TH3 : sécrètent le TGF-β; elles prédominent dans les muqueuses où elles sont capables de supprimer ou de contrôler les réponses immunitaires qui pourraient s’y déclencher (Miller, Lider et al. 1992). Cellules TR1 : sécrètent des taux élevés d’IL-10, mais des taux bas d’IL-2 et des taux variables d’IL-5 et d’IFN-γ; elles ne sécrètent pas d’IL-4 (Groux, O'Garra et al. 1997). 2.6.2 Mécanismes d’action des lymphocytes T régulateurs Foxp3+ Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+ , naturels et induits, mettent en jeu plusieurs mécanismes moléculaires, directs ou indirects, pour supprimer les réponses immunes; parmi ces mécanismes on cite le contact cellulaire, la modulation des cellules dendritiques, la sécrétion des cytokines inhibitrices, ainsi que 28 d’autres mécanismes métaboliques (Sakaguchi, Miyara et al. 2010, Gregori, Goudy et al. 2012, Canavan, Afzali et al. 2013). Le mécanisme dépendant du contact cellulaire n’est pas encore complètement élucidé, néanmoins le contact cellulaire direct est essentiel pour que ces cellules exercent leurs fonctions immunorégulatrices (Thornton and Shevach 1998, Jonuleit, Schmitt et al. 2001) . Leurs fonctions suppressives dépendent de la force du signal TCR qu’elles reçoivent ainsi que de l’environnement en cytokines, plus précisément de la présence de l’IL-2 (O'Garra and Vieira 2004). La modulation de la fonction des cellules dendritiques passe par l’expression par les lymphocytes T régulateurs de CTLA-4 qui peut inhiber l’activité des CPA; en outre, la fixation de CTLA-4 sur les molécules de costimulation CD80 et CD86 des CPA conduit à l’activation de l’enzyme IDO (Cederbom, Hall et al. 2000, Miyara and Sakaguchi 2007, Wing, Onishi et al. 2008). Cet enzyme provoque la déplétion d’un acide aminé essentiel, le tryptophane, et la production des molécules inhibitrices, les kynurenines, responsables de l’inhibition de la prolifération des cellules T (Fallarino, Grohmann et al. 2006). Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+ sécrètent des cytokines immunosuppressives dont l’IL-10, le TGFβ et l’IL-35 (Asseman, Mauze et al. 1999, Collison, Workman et al. 2007, Canavan, Afzali et al. 2013). Elles ne sécrètent pas d’IL-2 après la stimulation du TCR et ne peuvent donc pas stimuler leur propre expansion. Comme les autres cellules T CD4+, les nTreg répondent au complexe peptide du soi-CMH de classe II présenté par les cellules dendritiques matures qui sont présentes dans les zones à cellules T des organes lymphoïdes secondaires, et ce signal est régulé positivement par des molécules de costimulation et par CD28. À l’instar des lymphocytes T CD4+ naïfs qui répondent à l’antigène, les lymphocytes T régulateurs prolifèrent vigoureusement in vitro si on leur fournit de l’IL-2. Leur fonction immunosuppressive est bloquée par la reconnaissance immunitaire innée de l’infection; si le signal des molécules de costimulation est fort les cellules T effectrices deviennent réfractaires à l’effet suppresseur des nTreg. En effet quand les cellules dendritiques libèrent des cytokines inflammatoires (en particulier l’IL-6) qui interfèrent avec la suppression par les cellules T régulatrices , ceci suggère que les nTreg ne peuvent pas supprimer la prolifération des cellules T effectrices conventionnelles fortement activées leur permettant ainsi de combattre l’infection (Zheng, Wang et al. 2008, Lu, Wang et al. 2010). 2.6.3 Usages thérapeutiques des lymphocytes T régulateurs Les propriétés immunosuppressives des lymphocytes T régulateurs justifient leur utilisation comme drogues immunothérapeutiques dans diverses pathologies cliniques (Becker, Bopp et al. 2012, Canavan, Afzali et al. 2013). Dans le champ de l’alloréactivité les lymphocytes T régulateurs sont utilisés pour induire la tolérance aux greffes allogéniques (Hara, Kingsley et al. 2001, Liu, Xu et al. 2012). En effet la greffe d’organe ou de tissus se heurte très souvent au phénomène de rejet de greffons. Bien que les 29 médicaments immunosuppresseurs réduisent efficacement le rejet aigu, une forte proportion des patients présente encore les rejets chroniques. L’activation spécifique des lymphocytes T régulateurs du greffon constituerait une piste prometteuse pour l’induction de la tolérance immunologique à la greffe. Ceci pourrait ainsi permettre d’éviter le rejet de la greffe et la nécessité de prise d’immunosuppresseurs et enfin, cela pourrait améliorer la survie à long terme de la greffe (Waldmann, Adams et al. 2008, Long and Wood 2009). Plusieurs recherches ont démontré l’efficacité des lymphocytes T régulateurs dans le contrôle des réponses alloimmunes à la base de la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) aussi bien lors des transplantations d’organes que de cellules sur des modèles animaux (Tsang, Tanriver et al. 2008, Nadig, Wieckiewicz et al. 2010, Di Ianni, Falzetti et al. 2011, Canavan, Afzali et al. 2013). Dans des conditions où le greffon contient un grand nombre de lymphocytes T régulateurs au moment de la greffe cela peut retarder ou même prévenir l’apparition de la GVHD (Cohen, Trenado et al. 2002, Jones, Murphy et al. 2003, Hippen, Merkel et al. 2011, Alpdogan and van den Brink 2012). Ainsi, les lymphocytes T régulateurs peuvent être incorporés dans différents protocoles de tolérance immunologique afin de réduire l’usage des immunosuppresseurs qui sont dotés de plusieurs effets indésirables. Les données récentes suggèrent aussi l’utilisation des lymphocytes T régulateurs dans le champ de l’auto-immunité du fait que ces pathologies sont souvent associées à un déficit de ce type de cellules. En effet les recherches sur les modèles animaux démontrent que les lymphocytes T régulateurs peuvent être utilisés dans le traitement des maladies inflammatoires auto-immunes telles que le diabète de type 1, les maladies inflammatoires de l’intestin, le lupus érythémateux disséminé, l’arthrite rhumatoïde et la gastrite auto-immune (Jaeckel, von Boehmer et al. 2005, Tang, Bluestone et al. 2012). Les lymphocytes T régulateurs ont aussi été utilisés dans des pathologies allergiques comme l’asthme bronchique et certaines allergies (Wing and Sakaguchi 2006, Larche 2007). Étant donné le rôle des lymphocytes T régulateurs dans l’immunité antitumorale leur déplétion peut être exploitée dans le traitement de certaines tumeurs (Beyer and Schultze 2006). Figure 9 : Production et fonction des lymphocytes T régulateurs naturels. Les nTreg sont produits dans le thymus alors que les iTregs sont produits en périphérie à partir des lymphocytes T CD4+ naïfs. 30 2.7 Forkhead box protein 3 Membre de la famille des facteurs de transcription forkhead/winged-helix, Forkhead box protein 3 (Foxp3) est le facteur de transcription responsable de la programmation des propriétés fonctionnelles des cellules T régulatrices (Fontenot, Gavin et al. 2003, Yagi, Nomura et al. 2004, Lin, Haribhai et al. 2007). Chez l’homme, Foxp3 est codé par un gène du chromosome X et il n’est exprimé que par 5 à 10 % des lymphocytes T périphériques appartenant exclusivement au lignage αβ ; il s’agit pour l’essentiel (dans 80 %) de lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+. Foxp3 est donc un marqueur spécifique de l’activité régulatrice des lymphocytes T régulateurs (Fontenot, Gavin et al. 2003, Zheng and Rudensky 2007). Son expression est essentielle pour la différenciation des lymphocytes T régulateurs et leur fonction suppressive (Hilbrands, Howie et al. 2013). Le gène Foxp3 est composé de 11 exons et contient des séquences codant pour des domaines protéiques très conservés au cours de l’évolution parmi lesquels le domaine forkhead, également appelé winged-helix du fait de la structure tertiaire en hélice du domaine protéique, contient une séquence de localisation nucléaire et fonctionne comme un facteur de transcription. Les mutations spontanées du gène Foxp3 aboutissent à son non-fonctionnement et sont responsables des syndromes dysimmunitaires de type IPEX chez l’homme et du caractère scurfy chez la souris (Bennett, Christie et al. 2001, Brunkow, Jeffery et al. 2001, Wildin, Ramsdell et al. 2001). L’IPEX est un syndrome auto-immun caractérisé par des atteintes polyendocriniennes, des entéropathies sévères ainsi que des allergies alimentaires multiples. La structure de la protéine Foxp3 comprend un domaine riche en proline (PRD) à l’extrémité N-terminale, un domaine C2H2 zinc finger (ZnF), un domaine leucine-zipper (ZIP) et un domaine winged-helix/ forkhead (FKH) en C-terminal (Figure 10). Le domaine FKH est nécessaire pour la localisation nucléaire de Foxp3 et entre en compétition avec NFAT et NFκB pour la fixation sur les gènes qui codent pour les cytokines telles que l’IL-2 et l’IFN-γ, empêchant ainsi leur transcription (Bettelli, Dastrange et al. 2005, Torgerson, Genin et al. 2009). Quant au domaine ZIP, il contribue à l’homodimérisation ou à l’hétérodimérisation de Foxp3 et enfin le domaine PRD est impliqué directement dans la répression transcriptionnelle (Bettelli, Dastrange et al. 2005, Schmitt and Williams 2013). La transduction par un vecteur rétroviral ou lentiviral du gène Foxp3 permet de convertir des lymphocytes T conventionnels en lymphocytes T régulateurs fonctionnels capables d’exercer une activité suppressive in vitro et in vivo, mais le risque de développement des cancers limite leur usage dans le traitement clinique des maladies. Dans une perspective clinique, les lymphocytes T régulateurs étant une souspopulation rare et difficile à purifier du fait de l’absence de marqueur de surface réellement spécifique, la transduction de la protéine Foxp3 peut être une stratégie plus efficace et plus sécurisante. 31 Figure 10 : Organisation et fonction de la protéine Foxp3. Les principaux domaines de Foxp3 sont le domaine PRD du côté N-terminal suivi du domaine ZnF, ZIP, et du domaine FKH qui contient les NLS en C-terminal. Chaque domaine a une fonction bien spécifique. 32 Chapitre 3: La greffe et la tolérance immunologique La greffe est un traitement chirurgical important qui consiste à remplacer un organe malade par un organe sain, appelé greffon (ou transplant) provenant d’un donneur. Beaucoup de pathologies peuvent être traitées en fournissant à un patient des cellules, des tissus ou des organes d’un individu donneur (DeFranco, Robertson et al. 2009). 3.1 Types des greffes En fonction de l’origine du greffon ou de relations génétiques entre le receveur et le donneur les greffes peuvent être classifiées en 4 catégories (Benjamini, Coico et al. 2000, Janeway, Travers et al. 2003) : Autogreffe : le greffon provient du même individu et est déplacé d‘un endroit à un autre sur son corps; il s’agit essentiellement des tissus ou des cellules comme c’est le cas de la greffe de la peau. Le taux de réussite est de 100%. Isogreffe ou greffe syngénique (ou isogénique) : le greffon est échangé entre individus génétiquement identiques tels que des jumeaux monozygotes; ces transplants ne sont pas rejetés. Cette greffe est courante chez les animaux de laboratoire de souches congéniques qui ont des CMH identiques. Allogreffe ou greffe allogénique: le greffon est échangé entre individus génétiquement distincts, mais d’une même espèce telle qu’un frère et une sœur, un parent et son enfant ou deux individus qui n’ont aucun lien génétique; le greffon est d’abord accepté puis est ensuite rejeté environ 10 à 13 jours après la greffe. C’est le type de greffes le plus fréquemment rencontré. Xénogreffe ou greffe xénogénique : le greffon est échangé entre espèces différentes (Ex : greffe du cœur d’un primate chez un humain) et est généralement rejeté rapidement. 3.2 Risques des greffes 3.2.1 Rejet des greffes Dans la plupart des cas de greffes, les réponses immunitaires adaptatives contre les tissus greffés constituent le principal obstacle au succès de la greffe (DeFranco, Robertson et al. 2009). Le rejet est causé par des réponses immunes contre des alloantigènes portés par le greffon et qui sont reconnus comme étrangers par le receveur. Ce type de rejet dépend surtout des lymphocytes T (Janeway, Travers et al. 2003). 33 Mécanismes de reconnaissance des alloantigènes de greffons Les alloantigènes des greffons peuvent être reconnus comme étrangers par les cellules T de deux manières différentes : La reconnaissance directe : les lymphocytes T alloréactifs naïfs du receveur sont activés par les CPA allogéniques du greffon, qui portent à la fois les molécules du CMH allogéniques et exercent une activité de costimulation. Les lymphocytes T effecteurs alloréactifs activés reviennent ensuite dans le greffon qu’ils attaquent directement. La conséquence est une réponse immunitaire très vigoureuse responsable du rejet du greffon. La reconnaissance indirecte : la présentation par les CPA du receveur de peptides dérivés de molécules du CMH ou d’autres molécules polymorphes du greffon appelées antigènes d’histocompatibilité mineurs, aux lymphocytes T alloréactifs. Les réponses sont moins fortes dans ces derniers cas. Types de rejet d’une greffe Tous les mécanismes effecteurs de l’immunité acquise peuvent contribuer au rejet d’une greffe; il existe trois types de rejet d’une greffe (DeFranco, Robertson et al. 2009) : Le rejet hyperaigu: c’est le type de rejet le plus rapide. Les alloanticorps préexistants contre les antigènes du CMH peuvent provoquer, dans les minutes qui suivent la greffe, un rejet très rapide dépendant du complément, des lymphocytes NK et/ ou des anticorps préexistants (Thao Doan 2013). Ce type de réaction est observé avec les greffons d’organes vascularisés où les antigènes ABO du receveur et du donneur, qui sont présents sur les cellules endothéliales, sont incompatibles ou quand le receveur a des anticorps reconnaissant les molécules du CMH de classe I. Ceci provoque la coagulation, l’hémorragie et la nécrose tissulaire. Le rejet hyperaigu peut être évité avant la transplantation par un test sérologique appelé cross-match qui permet de vérifier l’absence d’anticorps préexistants dans le sérum du receveur contre les lymphocytes T du donneur. Le rejet aigu : il est associé à une inflammation intense du tissu greffé suite à une réponse cellulaire et humorale spécifique survenant 7 jours après la transplantation, temps nécessaire à l’activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+. Sa sévérité diminue après 3 mois. Ce type de rejet peut être contrôlé par des traitements immunosuppresseurs agressifs. Le rejet chronique : c’est une réaction de rejet plus lente pouvant être provoquée par des anticorps dirigés contre les molécules du CMH de classe I ou par des cellules T CD4 + sans intervention d’anticorps. Elle ne répond pas à la thérapie immunosuppressive. Le taux de perte de greffe dû au rejet chronique n’a pas vraiment changé depuis 30 ans, malgré des améliorations considérables du traitement des rejets aigus. 34 3.2.2 La maladie du greffon contre l’hôte La greffe de CSH allogéniques est de plus en plus utilisée pour soigner des maladies héréditaires des cellules de la moelle osseuse (Ex. : aplasie médullaire ou déficits immunitaires) et pour un traitement efficace dans certaines hémopathies malignes comme les leucémies aigües lymphoblastiques et myéloblastiques ainsi que les leucémies myéloïdes chroniques. L’une des complications spécifiques de cette greffe est la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) qui est la principale cause de décès après transplantation des CSH allogéniques (Thomas, Bryant et al. 1971). Elle est due à la reconnaissance par les lymphocytes T matures contenus dans la moelle osseuse du donneur des antigènes d’histocompatibilité majeurs et mineurs présentés par les CPA du receveur. Ce qui peut provoquer ainsi une maladie inflammatoire sévère qui se caractérise par des érythèmes, une diarrhée et une pneumopathie inflammatoire. La prévention de la GVHD repose essentiellement sur l’administration des médicaments immunosuppresseurs. La présence de cellules T alloréactives peut facilement être démontrée de façon expérimentale grâce à la réaction lymphocytaire mixte (MLR), dans laquelle les lymphocytes du donneur sont mélangés aux lymphocytes irradiés du receveur; si les lymphocytes du donneur contiennent des cellules T alloréactives, celles-ci vont répondre par une division cellulaire. 3.3 Modes d’action des immunosuppresseurs Les médicaments immunosuppresseurs sont nécessaires pour protéger les cellules et les organes greffés du rejet immunologique (Wood, Bushell et al. 2012, Thao Doan 2013). Le taux de survie à court terme d’une greffe a fortement augmenté grâce à l’utilisation de ces médicaments immunosuppresseurs puissants (Page, Dar et al. 2012). L’action des immunosuppresseurs est essentiellement centrée sur le contrôle des réponses immunes des cellules T; ainsi, ils sont capables d’éteindre le système immunitaire en inhibant l’activation des cellules T. Ces médicaments immunosuppresseurs non spécifiques provoquent une immunosuppression globale et peuvent s’avérer très toxiques à cause des nombreux effets secondaires dont l’hypertension artérielle, les maladies cardio-vasculaires, le diabète et d’autres complications métaboliques, l’ostéoporose, les infections opportunistes, la néphrotoxicité et enfin le risque des cancers (Alexander, Smith et al. 2008, Feng 2008, Ravindra, Wu et al. 2009). En outre, ces médicaments nécessitent un traitement à vie (Thao Doan 2013). Les anciens immunosuppresseurs utilisés pour supprimer les réactions immunitaires sont répartis en 4 catégories : les corticostéroïdes, les cytostatiques, les inhibiteurs de la calcineurine ainsi que les anticorps monoclonaux. 35 Les corticostéroïdes : ces médicaments, plus particulièrement les glucocorticoïdes, sont des anti- inflammatoires puissants et des immunosuppresseurs à action rapide. Ils sont couramment utilisés dans le traitement de maladies inflammatoires, des maladies auto-immunes, des maladies allergiques, de l’asthme ainsi que dans la prévention de rejets d’organes. À doses élevées, ils inhibent l’expression et la transcription de plusieurs cytokines dont l’IL-2, l’IL-1β, IL-3, IL-6, IFN-γ et TNF-α. Ils inhibent ainsi l’activation, la prolifération, la différenciation ainsi que la survie des cellules inflammatoires dont les lymphocytes T (Gary S. Firestein 2009). Ils ont aussi beaucoup d’autres effets sur les autres cellules du système immunitaire telles que les lymphocytes B. L’un des corticostéroïdes le plus utilisé est la Prednisone, analogue synthétique du cortisol (Heeger and Dinavahi 2012). Les cytostatiques : ce sont des agents antiprolifératifs couramment utilisés dans la chimiothérapie du cancer; ils inhibent la synthèse de l’ADN et sont donc cytotoxiques pour les cellules en division, dont les cellules T. L’azathioprine est l’un des plus couramment utilisés; il est rapidement transformé in vivo en 6-mercaptopurine qui bloque la biosynthèse des nucléotides puriques nécessaires à la synthèse de l’ADN. Les inhibiteurs de la calcineurine : la cyclosporine et le tacrolimus (FK506) sont des produits naturels qui forment un complexe avec une protéine intracellulaire connue sous le nom d’immunophiline; ce complexe se lie ensuite à la calcineurine et l’inhibe. La calcineurine est une protéine phosphatase qui est activée par la calmoduline lorsque la concentration du calcium augmente dans la cellule. La calcineurine joue un rôle dans la transmission des signaux du TCR jusqu’au noyau. Une des cibles de la calcineurine dans les cellules T est le NFAT, qui stimule la transcription des gènes de cytokines, dont ceux de l’IL-2, l’IL-4, CD40L et FasL (Figure 10). L’inhibition de la calcineurine conduit donc à l’inhibition de la sécrétion de l’IL-2 qui est nécessaire pour l’activation des lymphocytes T (Heeger and Dinavahi 2012) (Figure 10). La cyclosporine est un agent immunosuppresseur important qui a été découvert en 1976 et qui est responsable de nombreux effets indésirables dont la néphrotoxicité, la neurotoxicité et l’hépatotoxicité. Le tacrolimus est un antibiotique de la famille des macrolides qui dérive de la bactérie Streptomyces tsukubaensis; il est 50 à 100 fois plus puissant que la cyclosporine. Ses effets indésirables sont semblables à ceux observés avec la cyclosporine (Thao Doan 2013). Mais plusieurs études démontrent que l’utilisation prolongée des inhibiteurs de la calcineurine conduit à une déplétion des lymphocytes T régulateurs (Demirkiran, Sewgobind et al. 2009). Les anticorps monoclonaux : ce sont des anticorps dirigés contre des antigènes spécifiques, des molécules fonctionnelles situées à la surface des cellules T. Le plus courant est OKT3, qui reconnaît le composant CD3 du TCR (Kirk 2006). OKT3 induit une synthèse rapide et forte de cytokines et entraine aussi l’internalisation du complexe TCR rendant ainsi les lymphocytes T insensibles à toute nouvelle stimulation antigénique pendant quelques jours, le patient est dépourvu d’immunité cellulaire T. OKT3 36 permet d‘empêcher le rejet aigu du greffon, mais il n’induit pas de tolérance de longue durée envers le greffon et l’administration d’immunosuppresseurs doit être poursuivie après le traitement par cette drogue. Son utilisation est très limitée à cause de ses effets secondaires sévères après la dose initiale (Tang, Bluestone et al. 2012). Les nouveaux immunosuppresseurs comprennent la rapamycine ainsi que d’autres anticorps monoclonaux. La rapamycine (ou sirolimus) est un antibiotique de la famille des macrolides, isolée à partir du champignon S.hygroscopicus. Sa cible est le mTOR, une protéine kinase qui régule l’augmentation du taux de synthèse des protéines pendant la prolifération cellulaire. L’inhibition du mTOR conduit à l’inhibition de la prolifération des lymphocytes T activés (Battaglia, Stabilini et al. 2005, Coenen, Koenen et al. 2006). Les effets indésirables de la rapamycine sont l’hyperlipidémie, la leucopénie et la thrombopénie. Néanmoins, des études ont démontré que la rapamycine est associée à une augmentation relative des lymphocytes T régulateurs, donc la rapamycine est tolérogène (Segundo, Ruiz et al. 2006). La nouvelle génération d’anticorps monoclonaux immunosuppresseurs sélectifs comprend l’anti-CD25, l’antiCD80/CD86 (le CTLA-4Ig) et l’anti-LFA-1 qui ciblent spécifiquement le système immunitaire. Le CTLA-4Ig (ou anti-CD80 et anti-CD86) est une protéine chimérique ou de fusion contenant du côté Nterminal le domaine extracellulaire de CTLA-4 qui lie avec une forte affinité les molécules costimulatrices B7-1 et B7-2 sur les cellules dendritiques, les lymphocytes B activés et les macrophages et, du côté Cterminal la partie Fc de l’IgG qui prolonge la durée de vie de la molécule dans le sang. Ainsi, CTLA-4Ig est capable de bloquer le signal de costimulation (signal 2) nécessaire à l’activation des lymphocytes T, ce qui induit sélectivement l’anergie des cellules T et prévient le rejet des greffes (Kirk, Harlan et al. 1997). Dans ce groupe on cite Abatacept (Orencia, Bristol-Myers Squibb) et Belatacept (Nulojix, Bristol-Myers Squibb) qui sont des protéines de fusion composées de CTLA-4 et d’immunoglobuline IgG1 (CTLA-4Ig). Belatacept a été reconnu par la FDA en 2011 comme un agent immunosuppresseur pour les greffes rénales (Vincenti, Larsen et al. 2005). 3.4 La tolérance immunitaire Le système immunitaire adaptatif présente deux aspects importants : la mémoire immunitaire et la tolérance immunitaire. La mémoire immunitaire est la capacité que possèdent les lymphocytes de reconnaitre les antigènes dès la première exposition et d’y répondre rapidement et spécifiquement lors des contacts ultérieurs. La tolérance immunitaire est un état de non-réponse du système immunitaire adaptatif à un antigène; c’est la capacité de l’organisme à accepter un ou plusieurs antigènes étrangers de manière spécifique tout en restant fonctionnel à 100 %. La notion de tolérance immunitaire a été découverte en 1945 par Ray Owen (Owen 1945). Depuis, plusieurs recherches sur l’induction de la tolérance dans les transplantations d’organes ont conduit au développement d’agents biologiques et pharmacologiques (Page, Dar et al. 2012). Cela est lié au fait que la promotion de la tolérance 37 immunologique peut conduire à la survie à long terme des greffons (Alpdogan and van den Brink 2012, Wood and Goto 2012). Le but ultime de la transplantation est d’induire la tolérance immunitaire, là où le système immunitaire ne réponde pas à la greffe, mais est fonctionnel complètement, cela sans recours à des immunosuppresseurs (Heeger and Dinavahi 2012). La nécessité d’établir une tolérance immunitaire du soi est rencontrée grâce à la tolérance centrale et la tolérance périphérique. 3.4.1 La tolérance centrale C’est un état de non-réponse immunitaire établie pendant le développement lymphocytaire dans le thymus au cours duquel les lymphocytes T qui réagissent au soi sont soit détruits soit convertis en lymphocytes T régulateurs (Surh and Sprent 1994, Starr, Jameson et al. 2003, Alpdogan and van den Brink 2012). Dans le thymus, le lymphocyte T passe par deux étapes de sélection rigoureuse, cela afin de s’assurer qu’il sera capable de s’attaquer efficacement au « non-soi » (sélection positive) et ne réagira pas au « soi » (sélection négative) (Sykes 2007). L’une des approches expérimentales pouvant permettre d’obtenir une tolérance centrale est le chimérisme hématopoïétique. Le chimérisme hématopoïétique C’est la coexistence harmonieuse dans un même organisme de la moelle osseuse du donneur et du receveur. Les CSH du donneur vont produire des cellules dendritiques qui pourront migrer dans le thymus du receveur et participer à la sélection lymphocytaire; ceci pourra permettre l’élimination des lymphocytes T qui auront une trop forte affinité pour le CMH du donneur. La présence préalable de lymphocytes matures alloréactifs chez le receveur peut limiter l’établissement du chimérisme hématopoïétique; d’où il faut d’abord éliminer ces lymphocytes matures alloréactifs avant d’injecter les CSH du receveur. Le chimérisme hématopoïétique permet de résoudre le problème de rejet aigu et chronique des greffes allogéniques et évite ainsi la prise prolongée d’immunosuppresseurs qui sont nécessaires pour le maintien de la fonction et de la survie des greffes. Il existe trois catégories de chimérisme hématopoïétique : le micro-chimérisme (les cellules immunitaires du donneur sont inférieures à 1 %), le chimérisme partiel (les cellules immunitaires du donneur sont comprises entre 1 et 99 %) et le chimérisme total (les cellules immunitaires du donneur sont à 100 %). 3.4.2 La tolérance périphérique Il existe des mécanismes qui opèrent dans les organes lymphoïdes périphériques pour empêcher ou limiter l’activation des lymphocytes réactifs au soi qui n’ont pas été éliminés par la tolérance centrale. Certaines cellules autoréactives quittent le thymus et rejoignent les organes lymphoïdes périphériques; elles circulent entre ces organes et finissent par rencontrer les complexes peptides du soi-CMH de classe II, ce qui va déclencher une activation abortive qui mènera à une mort cellulaire (Ferber, Schonrich et al. 1994, Wells, Li et al. 1999). Les lymphocytes T CD4+ naïfs moins réactifs envers les complexes peptides 38 du soi-CMH de classe II peuvent persister longtemps dans la périphérie. Les lymphocytes T régulateurs semblent être à la base des mécanismes de la tolérance immunitaire périphérique. L’association thérapeutique lymphocytes T régulateurs et greffe de la moelle osseuse rapportée dans plusieurs recherches a permis d’obtenir un chimérisme mixte durable et une tolérance immunologique à long terme des greffes cutanées sans conditionnement cytoréducteur chez la souris (Pilat, Baranyi et al. 2010). 39 Chapitre 4 : Hypothèse et Objectifs 4.1 Hypothèse de travail La thérapie cellulaire est l’une des approches thérapeutiques possibles de la DMD; elle consiste à effectuer des allotransplantations des myoblastes sains dans le muscle dystrophique. Une fois greffés, ces myoblastes sont capables de former des fibres musculaires hybrides exprimant la dystrophine. Cependant, le rejet immunologique constitue un obstacle majeur au succès de cette thérapie, d’où la nécessité d’associer des immunosuppresseurs puissants pour prévenir cette réponse immune. Malheureusement, ces immunosuppresseurs causent de nombreux effets indésirables, dont les infections opportunistes, la toxicité rénale, le diabète ainsi que les cancers. Notre laboratoire a préalablement effectué des transplantations des CSH du donneur pour obtenir un chimérisme hématopoïétique chez la souris à l’aide du protocole de tolérance immunologique TTCB puis il a ensuite procédé à la greffe des myoblastes chez ces souris. Ce protocole de tolérance immunologique a permis d’obtenir des résultats de greffe de myoblastes aussi bons qu’une immunosuppression soutenue avec le tacrolimus (Stephan, Pichavant et al. 2006). Mais pour une application clinique, la difficulté principale est d’obtenir cette tolérance immunologique en utilisant un protocole qui comporte peu des risques. Notre laboratoire essaie d’induire un micro-chimérisme durable avant la transplantation des myoblastes, en réalisant des allogreffes des CSH combinées à l’administration de lymphocytes T régulateurs. Le nombre de lymphocytes T régulateurs étant limité dans l’organisme, il est nécessaire de les augmenter afin d’assurer la stabilité des CSH greffées. Nous pensons que l’administration de la protéine Foxp3 pourrait induire la conversion des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs, afin d’augmenter leur nombre aux niveaux nécessaires pour une tolérance immunologique périphérique efficace. 4.2 Objectifs de ce mémoire L’objectif à long terme de notre travail est donc de développer un protocole de tolérance immunologique permettant de prévenir le rejet de myoblastes greffés ainsi que des fibres musculaires hybrides chez un patient atteint de DMD, cela sans recours à une immunosuppression soutenue. Le premier objectif spécifique de mon travail de maîtrise était donc de produire la protéine Tat-Foxp3 dans des bactéries compétentes. Le deuxième objectif spécifique était d’effectuer la transduction de la protéine Tat-Foxp3 dans des lymphocytes T CD4+ naïfs des souris. Le troisième objectif spécifique était de vérifier la transformation de ces lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs induits (CD4+ CD25+Foxp3+). 41 Chapitre 5 : Méthodologies, résultats et discussions 5.1 Matériel et méthodes 5.1.1 Construction du vecteur d’expression Le vecteur d’expression pET16b-6xHis-Tat-Foxp3 a été construit à partir du plasmide pET-16b (Novagen, Germany) (Figure 11) qui contient une séquence de polyhistidine (6xHis) à son extrémité N-terminale. A l’origine pET-16b contenait le gène de la frataxine, mais celui-ci a été retiré afin d’être remplacé par le gène Foxp3. L’étiquette 6xHis a permis d’effectuer la purification de la protéine recombinante 6xHis-TatFoxp3 par chromatographie d’affinité. Tat est une petite protéine activatrice de la transcription codée par le VIH-1. Elle possède une séquence peptidique (Tat), appelée domaine de transduction protéique, qui lui confère la propriété d’être transportée par endocytose à l’intérieur des cellules sans l’intermédiaire d’un récepteur spécifique. Ce domaine peptidique fusionné à d’autres protéines permet leur internalisation et leur accès au cytoplasme (Frankel and Pabo 1988, Yang, Ma et al. 2002). Ainsi, le peptide Tat est donc l’instrument qui pourra faciliter la transduction intracellulaire de Foxp3 dans les cellules. Le plasmide pET16b a été amplifié par PCR (C1000 Touch™, Bio-Rad) avec des amorces spécifiques (Tableau 1). Le gène Foxp3 a été étudié afin de concevoir des amorces sens et antisens spécifiques (Tableau 1) servant à son amplification par PCR (C1000 Touch™, Bio-Rad) à partir du plasmide pCMMPFoxp3-IRESeGFP (qui nous a été fourni par Dr N. Pilat, Medical University of Vienna, Austria) (Pilat, Baranyi et al. 2010). Les paramètres d’amplification par PCR sont résumés dans le tableau 2. 43 Tableau 1. Séquences des amorces utilisées pour la construction du vecteur pET16b-6xHis-TatFoxp3 Gènes Séquences amorces 5’-3’ Séquences amorces 5’-3’ Tat-Foxp3 Amorces sens: Paires de bases Paires de bases 65 TACGGACGAAAAAAACGACGACAACGA CGACGAGGATCCGGAATGCCCAACCC TAGGCCAGCCAA Amorces anti-sens: 39 TTAGCAGCCGGATCCTCAAGGGCAGGG ATTGGAGCACTT pET16b 25 Amorces sens: GGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGA 39 Amorces anti-sens: TTTTTTTCGTCCGTAATGGCCGCTGC TGTGATGATGATG Tableau 2 : Programme d’amplification des gènes d’intérêt par PCR Étape Température (⁰C) Durée Nombre de cycles Dénaturation initiale 98 30 secondes 1 Dénaturation 98 10 secondes Hybridation 65 20 secondes Polymérisation 72 3 minutes 35 La présence de l’ADN a été vérifiée par la suite après une migration à la bonne taille sur un gel d’agarose 1 % pendant 45 minutes à 100 volts. Puis ensuite une purification et une précipitation de l’ADN ont été effectuées par la méthode phénol/chloroforme. Un volume de phénol/chloroforme égal à celui de la solution d’ADN a été utilisé. Le tout a été mélangé au vortex puis passé deux minutes à la centrifugeuse à 44 la vitesse de rotation maximale, soit 13200 rpm. La phase du dessus a été récupérée et 1/10 du volume de NaCl 5M a été ajouté avant de bien mélanger. Deux volumes d’éthanol 100 % ont été additionnés et la solution a été plongée une minute dans l’azote liquide puis centrifugée à 13200 rpm pendant 7 minutes. Le culot a été ensuite lavé à l’éthanol 70 % puis resuspendu dans l’eau. Le produit final a été mis à migrer sur un gel d’agarose 1 % pendant 45 minutes à 100 volts. L’extraction de l’ADN a été réalisée sur gel à l’aide des colonnes Qiagen (Qiagen, Germany) suivi du dosage de sa concentration. L’ADN a été ensuite inséré dans le plasmide pET-16b par la méthode In fusion qui consiste à mélanger 1 µl de réactif In fusion avec 1 µl du vecteur, 2 µl d’insert et 1 µl d’eau bidistillée (Chester and Marshak 1993). Ensuite, le mélange a été incubé pendant 20 minutes à 50◦ C. Le plasmide recombinant (100 ng) a été incorporé dans 100 µl des bactéries E. coli (DH5α) thermocompétentes. Le mélange a été placé à 4◦C pendant 30 minutes. Ensuite un choc thermique à 42◦C pendant 90 secondes a été appliqué pour favoriser l’entrée du plasmide dans les bactéries. Le mélange a été ensuite replacé à 4◦C pendant 3 minutes. Par la suite 300 µl de milieu LB (Luria-Bertani) stérile ont été ajoutés au mélange et le tout a été incubé à 37◦C pendant 1 heure, sous agitation à une vitesse de 280 rpm. Le mélange a été ensuite étalé sur une boite de pétris contenant du LB, de l’agar solide (15g/l) et de l’ampicilline (50 µg/ml) afin de sélectionner les bactéries ayant intégré le plasmide. La boite a été incubée pendant la nuit à 37◦C. Le lendemain matin, 5 clones ont été sélectionnés et cultivés chacun dans 5 ml de LB liquide en présence de l’ampicilline (50 µg/ml), à 37◦C et à 280 rpm, pendant toute la nuit. Par la suite l’ADN plasmidique de ces clones a été extrait à l’aide de Miniprep Kit (Qiagen, Germany) et les transformations ont été confirmées grâce au séquençage de l’ADN plasmidique. Figure 11 : Représentation schématique du plasmide pET16b 45 5.1.2 Production de la protéine recombinante 6xHis-Tat-Foxp3 Transformation des bactéries compétentes La souche de bactéries utilisée pour la production de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 est la souche E. coli BL21 (DE3), soit une souche de bactéries compétentes. 100 µl des bactéries E.coli BL21 (DE3) provenant du congélateur à - 80◦C ont été placés à 4◦C pendant 10 minutes puis 100 ng de plasmides recombinant pET16b-6xHis-Tat-Foxp3 ont été ajoutés et, le mélange a été placé à 4◦C pendant 30 minutes. Ensuite, un choc thermique à 42◦C pendant 90 secondes a été appliqué pour favoriser l’entrée du plasmide dans les bactéries. Le mélange a été ensuite replacé à 4◦C pendant 3 minutes. Par la suite 300 µl de milieu LB stérile ont été ajoutés au mélange et le tout a été incubé à 37◦C pendant 1 heure, sous agitation à une vitesse de 280 rpm. Culture des bactéries transformées Après l’identification correcte des boites de pétris contenant du LB, de l’agar solide et les antibiotiques appropriés (Ampicilline 50 µg/ ml et chloramphénicol 34 µg/ ml) afin de sélectionner les bactéries ayant intégré le plasmide, 100 µl du mélange ont été étalés sur toute la surface du pétris et incubé à 37 ◦C toute la nuit pour permettre aux bactéries transformées de se multiplier. Le lendemain matin, une colonie bactérienne a été sélectionnée et cultivée dans 5 ml du milieu LB en présence des mêmes antibiotiques appropriés (Ampicilline 50 µg/ ml et chloramphénicol 34 µg/ ml), à 37◦C toute la nuit, à une vitesse de 280 rpm. Le troisième jour les bactéries transformées ont été cultivées à 37◦C dans un volume de 200 ml de milieu LB toujours en présence de ces mêmes antibiotiques, jusqu’à ce que la densité optique atteigne 0,8 à 600 nm ce qui correspond à la phase de croissance exponentielle. Induction à l’Isopropyl-β-D-galactosidase La production de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 a été induite par l’ajout de l’Isopropyl-β-D-galactosidase (IPTG) à une concentration finale de 1 mM (Chang, McGary et al. 1989). Après 4 heures d’induction, les bactéries ont été centrifugées à 4◦C pendant 20 minutes, à une vitesse de 6500 g (rotor 1500, Sorvall® RC 5B Plus); ensuite le culot des bactéries a été conservé à - 80◦C. La production de la protéine 6xHisTat-Foxp3 a été vérifiée grâce à une électrophorèse sur gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) coloré avec le Coomassie Blue R-250. 46 5.1.3 Purification de la protéine recombinante 6xHis-Tat-Foxp3 Lyse des cellules bactériennes Le culot de bactéries induites a été resuspendu dans un tampon de lyse contenant 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl et 8 M urée (pH 8.0) puis la suspension a été soumise à une sonication (Branson Sonifier 450) à 4◦C pour fragmenter l’ADN et faciliter la filtration de la solution. La protéine 6xHis-Tat-Foxp3 a été purifiée en conditions dénaturantes. Le lysat obtenu a été centrifugé à 4◦C à une vitesse de rotation de 9500 rpm (rotor SS-34, Sorvall® RC 5B Plus) pendant 30 minutes afin de séparer la fraction soluble (surnageant) et celle insoluble contenant les débris cellulaires et les protéines insolubles (culot). Le surnageant a été ensuite filtré avec un filtre de 0.45 µm. Purification de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 par chromatographie d’affinité La purification par chromatographie d’affinité métallique sur colonne de nickel est une méthode qui est basée sur l’affinité spécifique entre la queue polyhistidine ajoutée du côté N- ou C-terminal des protéines et les ions Ni2+ immobilisés sur la matrice hydrophile par chélation (Crowe, Dobeli et al. 1994, Crowe, Masone et al. 1995). Le surnageant a été déposé sur un gel d’affinité contenant des billes d’agarose chargées avec du nickel (HIS-SELECT HF Nickel Affinity Gel, Sigma, Germany) et équilibré au préalable avec 10 ml de tampon de lyse. Une centrifugation de 5 minutes à 5000 g a permis d’éliminer les protéines non fixées sur le gel d’affinité. Deux lavages successifs avec un tampon de lavage contenant 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole et 8 M urée (pH 8.0) ont été effectués et le surnageant a été à chaque fois éliminé par centrifugation (5 minutes, 5000 g). L’élution a été finalement réalisée avec 10 ml de tampon d’élution contenant 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazole et 8 M urée (pH 8.0). Un aliquot de fractions correspondant à chaque surnageant a été analysé sur gel SDS-PAGE coloré avec le Coomassie Blue R-250 ainsi que sur Western Blot. Dessalage et renaturation de la protéine recombinante Après purification la protéine a été dessalée dans des colonnes Zeba™ Spin desalting Columns (Thermo Scientific, Rockford, USA); le dessalage a été effectué dans le même tampon que celui utilisé pour la lyse des bactéries et dans lequel on a dû ajouter de la L-arginine (la concentration finale est de 100 mM) pour permettre la renaturation de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3, ainsi que du glycérol 20% pour assurer sa stabilité lors de la conservation. Après cette étape la protéine a été dosée selon la courbe étalon de BCA (Pierce® BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific, Rockford, USA) puis aliquotée avant d’être conservée à - 80◦C. Un aliquot a été analysé sur gel SDS-PAGE et sur Western Blot. 47 5.1.4 Purification des lymphocytes T CD4+ Les lymphocytes T CD4+ ont été isolés à partir des rates de souris C57BI/10J (10J). Les expériences sur les souris ont été approuvées par le comité de protection des animaux du Centre de recherche du Centre Hospitalier Universitaire de Québec (CHUL). Les souris ont été sacrifiées selon les protocoles standards de l’animalerie et leurs rates ont été prélevées de manière stérile. Ces rates ont été placées dans 3 ml de tampon isotonique HBSS « Hank’s Balanced Salt Solution » stérile (Invitrogen, USA) puis ont été broyées à l’aide d’un pilon. La suspension cellulaire obtenue a été filtrée à l’aide d’un filtre à pore de 20 µm. La séparation des lymphocytes des autres splénocytes a été réalisée grâce au Ficoll (GE Healthcare, UK). La procédure a consisté à mettre 3 ml de Ficoll dans un tube puis à faire couler très lentement la suspension cellulaire le long du tube de manière à ne pas mélanger les deux solutions. Par la suite les cellules ont été centrifugées à une vitesse de rotation de 400 g pendant 40 minutes, à 20 ◦C. L’étape suivante a consisté aux lavages de ces lymphocytes avec du HBSS stérile. L’isolation des lymphocytes T CD4+ de la population lymphocytaire a été faite par «magnetic activated cell sorting» communément appelée MACS (Miltenyi Biotec, USA) (Dialynas, Quan et al. 1983). En effet après centrifugation des cellules à une vitesse de rotation de 300 g pendant 10 minutes, le culot cellulaire a été resuspendu dans un tampon isotonique. Par la suite ces cellules ont été incubées avec les microbilles anti-CD4 magnétiques [CD4 (L3T4) MACS Microbeads, Miltenyi Biotec, USA] à 4◦C pendant 15 minutes. Ces microbilles s’étaient liées aux cellules reconnues par l’anti-CD4. Après lavages, les cellules ont été resuspendues dans une solution tampon pour être enfin passées dans la colonne de séparation (MACS Columns, Miltenyi Biotec, USA) située dans un champ magnétique (MACS Separators, Miltenyi Biotec, USA). Les cellules CD4+ ont été retenues par l’aimant de la colonne; la fraction négative, celle ayant passé au travers de la colonne a été éliminée. Finalement, la colonne a été retirée du champ magnétique et les lymphocytes T CD4+ ont été récupérés par élution dans un tampon isotonique. 5.1.5 Culture des lymphocytes T CD4+ Les lymphocytes T CD4+ ont été mis en culture dans des plaques de 24 puits contenant le milieu Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) (Gibco, Burlington, ON, CA) supplémenté de 10 % de sérum fœtal de bœuf décomplementé (FBS, fetal bovine serum, Gibco, Burlington, ON, CA), 1 % de pénicillinestreptomycine, 1 % d’acides aminés non essentiels, 1 % de pyruvate de sodium et de 50 µM de βmercaptoéthanol. Les plaques ont été placées dans un incubateur à 37◦C, à atmosphère humide et à 5% de CO2, cela pendant 24 heures. Cette culture des lymphocytes T CD4+ a été réalisée en présence de 10 µg/ml d’anti-CD3 (BD Pharmingen, San Jose, CA) et 1 µg/ml d’anti-CD28 (BD Pharmingen, San Jose, CA). 48 5.1.6 Transduction de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 dans des lymphocytes T CD4+ Au jour 2, le milieu de culture a été remplacé par un milieu complet frais puis 12 µg de la protéine TatFoxp3 ont été incubés pendant 24 heures. Au jour 3, les cellules ont été lavées avec du HBSS et ensuite les échantillons ont été répartis en 2 groupes : dans le premier groupe les cellules ont été incubées pendant 10 minutes avec 100 µl de trypsine, dans le deuxième groupe la trypsine n’a pas été ajoutée dans les puits. La trypsine est une protéase qui a été ajoutée dans le but de digérer toutes les protéines qui se trouveraient dans le milieu extracellulaire; et comme elle ne traverse pas la membrane plasmique, elle ne peut pas digérer les protéines qui sont à l’intérieur de la cellule. Ainsi, le rôle de la trypsine était de confirmer si la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 se trouvait réellement à l’intérieur de la cellule. Pour stopper l’effet de la trypsine, 1 ml de milieu complet contenant du FBS a été ajouté dans les puits et les cellules ont été par la suite centrifugées. 5.1.7 Détection de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 par Western Blot Une fois la transduction terminée, la première chose à faire était de confirmer par Western Blot la présence de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 à l’intérieur des cellules en culture. Pour ce faire, les cellules de chaque puits ont été d’abord placées dans un tube à centrifuger (1.5 ml) puis lavées avec le HBSS; 200 µl de tampon de lyse [10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 1 % SDS; Sigma, Mississauga, ON, CA] ont été ajoutés dans chaque tube et, les protéines ont été précipitées par la méthode méthanol-chloroforme (Wessel and Flugge 1984, Chapdelaine, Vignola et al. 2001). Dans le tube contenant 200 µl de lysat des cellules, 600 µl de méthanol ont d’abord été ajoutés puis 200 µl de chloroforme et enfin 500 µl d’eau. Le mélange a ensuite été vigoureusement vortexé et centrifugé pendant 3 minutes. Les phases supérieure et inférieure ont été minutieusement retirées et jetées, l’interface contenant les protéines a été laissée dans le tube. 800 µl de méthanol ont été ajoutés dans le tube et ont été ensuite mélangés au vortex puis centrifugés pendant 5 minutes. Le surnageant a été retiré et le culot des protéines a été séché à l’aide d’un concentrateur (Speed Vac Concentrator Savant) pendant 10 minutes. Après précipitation, le culot de protéines a été resuspendu dans 20 µl de SDS-PAGE loading buffer (0.06 M Tris-HCl, pH 6.8, 1% SDS, 1 % 2-mercaptoethanol, 10 % glycérol, 0.025 % Bromophenol Blue) et bouillie pendant 5 minutes. Par la suite 12 µg de chaque échantillon ont été déposés sur un gel de polyacrylamide, composé d’un gel de séparation de 10 % et d’un gel de concentration de 4 %. Le gel de polyacrylamide a été soumis d’abord à un courant électrique de 70 volts pendant 15 minutes puis de 100 volts pendant 90 minutes de façon à séparer les protéines selon leurs poids moléculaires. Les protéines ont été par la suite transférées sur une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad, Germany) durant 1 heure à 200 mA et à 4◦C. Les sites d’interaction non spécifiques ont ensuite été bloqués pendant 1 heure, à température ambiante avec une 49 solution de tampon phosphate (PBS) contenant 0,05 % de Tween20® (Laboratoire Mat, Beauport, Québec, CA) et 5 % de lait en poudre écrémé. Ensuite la membrane a été incubée toute la nuit à 4◦C avec un anticorps monoclonal de souris contre Foxp3 (clone 150D, Biolegend, San Diego, USA), dans une solution de PBS-Tween20® (0.05 %) avec 5 % de lait en poudre écrémé. La membrane a été lavée trois fois avec du PBS-Tween20® (0.05 %). Le Tween est un détergent permettant d’enlever les anticorps fixés moins solidement suite à une liaison non spécifique. L’anticorps secondaire est une immunoglobuline antisouris (lapin) (Dako, Carpinteria, Californie, USA) couplée à horseradish peroxydase (HRP), diluée à 1 :1,000 dans du PBS-Tween 0.05 % avec 5 % de lait en poudre écrémé. La membrane a été incubée avec l’anticorps secondaire pendant 1 heure. Une autre série de lavages a été nécessaire avant de faire tremper la membrane pendant 4 minutes dans une solution pour induire la chimiluminescence (Bio-Rad, USA). Le résultat a été visualisé en exposant la membrane pendant deux minutes à un film autoradiographique HyBlot® CL (Denville Scientific, USA). 5.1.8 Analyse par cytométrie en flux Afin de vérifier s’il y a eu expansion des lymphocytes T régulateurs suite à la transduction de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3, nous avons effectué un marquage de lymphocytes T, obtenus à partir des rates des souris, avec des anticorps contre les récepteurs de surface CD4 couplés au PE-Cy5 (clone RM 4-5, Biolegend) et CD25 couplés à la phycoérythrine (PE) (clone 3C7, Biolegend). Les cellules ont ensuite été lavées avec le tampon PBS 2 % FBS et analysées par cytométrie en flux (FACS). 5.2 Résultats 5.2.1 Construction du vecteur d’expression pET16b-6xHis-Tat-Foxp3 La première étape de cette expérience était de construire un vecteur d’expression. Le plasmide pET16b ainsi que le plasmide pCMMP-Foxp3-IRESeGFP étaient déjà disponibles au laboratoire. Afin de s’assurer de la qualité de nos gènes, nous avons réalisé une électrophorèse sur gel d’agarose 1%, le marqueur de poids moléculaire 1 kb a été utilisé afin d’évaluer la taille des fragments amplifiés (Figures 12 et 13). Nous avons réussi à construire un vecteur d’expression pET16b-6xHis-Tat-Foxp3 qui possède une étiquette polyhistidine du côté N-terminal suivi de Tat qui est lié à Foxp3. Après clonage, ce vecteur d’expression a été vérifié par séquençage (résultats non présentés). 50 bp MW 1 1500 1000 500 Figure 12 : Électrophorèse sur gel d’agarose 1% après amplification du gène Foxp3. MW. Marqueur de poids moléculaire 1. Gène Tat-Foxp3 à 1300 bp (Flèche) MW 1 2 bp 5000 3000 2000 1500 1000 Figure 13 : Électrophorèse sur gel d’agarose 1% après amplification du plasmide pET16b. MW. Marqueur de poids moléculaire 1-2. Plasmide pET16b à 5700 bp (Flèche). 5.2.2 Production et purification de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 La production et la purification de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 ont représenté une étape critique durant cette expérience. La figure 14 illustre l’électrophorèse SDS-PAGE réalisée sur les bactéries E.coli BL21 (DE3) avant et après l’induction à l’IPTG ; les bactéries induites expriment une bande à environ 49 kDa correspondant au poids moléculaire théorique de la protéine Foxp3. 51 MW AVI API kDa 70 55 40 Figure 14 : Induction des bactéries compétentes E.coli BL21. L’électrophorèse SDS-PAGE faite sur les bactéries avant l’induction (AVI) et après l’induction (API) montre une bande à 49 kDa dans ces dernières (Flèche), correspondant au poids moléculaire théorique de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3. MW. Marqueur de poids moléculaire L’étape suivante a été la purification de la protéine recombinante. Malgré plusieurs tentatives de purification en conditions natives, nous n’avons pas pu aboutir à des résultats concluants (Figure 15). Suite à ces résultats négatifs, nous avons choisi d’effectuer la purification en conditions dénaturantes en ajoutant l’urée 8 M dans tous nos tampons. Ce qui nous a permis de purifier la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 par chromatographie d’affinité sur résine de nickel. Une électrophorèse SDS-PAGE correspondant aux différentes étapes de purification de la protéine est présentée à la figure 16. Il est à noter que la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 est soluble. L’absence de contaminants dans la fraction d’élution témoigne d’un degré important de pureté. Les rendements obtenus varient entre 0,28 à 0,31 µg de protéine recombinante par µl. kDa MW 1 2 3 4 5 70 55 40 Figure 15 : Purification de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 (en conditions natives). L’électrophorèse SDSPAGE ne montre aucune bande à 49 kDa dans la fraction d’élution. MW. Marqueur de poids moléculaire 1. Bactéries avant induction 2. Bactéries après induction 3. Fraction protéique totale 4. Fraction soluble 5. Absence de fraction éluée 52 kDa MW 1 2 3 4 5 6 70 55 40 Figure 16: Purification de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 (en conditions dénaturantes). L’électrophorèse SDS-PAGE montre une bande à environs 49 kDa dans les deux fractions d’élution (flèche) MW. Marqueur de poids moléculaire 1. Bactéries avant induction 2. Bactéries après induction 3. Fraction protéique totale 4. Fraction soluble 5-6 Fraction d’élution. Étant donné la dénaturation de la protéine lors de sa purification, nous avons effectué sa renaturation afin de rendre la protéine dans une bonne conformation. Pour confirmer la présence de la protéine 6xHis-TatFoxp3 nous avons réalisé successivement deux expériences de Western Blot en utilisant deux anticorps primaires différents, l’anti-His reconnaît spécifiquement l’étiquette polyhistidine et l’anti-Foxp3 reconnaît la protéine Foxp3. Nos résultats affichent une bande à environ 49 kDa correspondant au poids moléculaire théorique de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3. Ceci est présenté à la figure 17. À cette étape il était clair que la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 a été produite. 1 2 3 4 5 6 49 kDa Anti-His 49 kDa Anti-Foxp3 Figure 17 : Détection par Western Blot de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 aux différentes étapes de purification 1. Contrôle négatif 2. Fraction protéique totale 3. Fraction soluble 4. Fraction après colonne 5. Fraction éluée 6. Fraction renaturée. 5.2.3 Localisation intracellulaire de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 Les lymphocytes T CD4+ ont été mis en culture en présence de l’anti-CD3 et l’anti-CD28 durant 24 heures. Nous avons noté une bonne prolifération 24 heures après. Ce qui nous a permis de procéder à la transduction de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3. Pour évaluer la pénétration de la protéine recombinante 6xHis- Tat-Foxp3 à l’intérieur des lymphocytes T CD4+ nous avons incubé les cellules avec des quantités 53 croissantes de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 (6 µg - 12 µg) pendant 24 heures. Avant de procéder à l’extraction des protéines par la méthode méthanol- chloroforme certains puits ont été traités à la trypsine qui avait pour rôle de digérer toutes les protéines qui se trouveraient dans le milieu extracellulaire; d’autres puits n’avaient pas bénéficié d’un traitement à la trypsine. Le Western Blot réalisé a montré une bande à environ 49 kDa dans tous les puits, mais le signal est moins intense dans les puits ayant bénéficié du traitement à la trypsine comparativement au puits non traité avec cette protéase. Notre résultat pourrait suggérer que le peptide Tat a permis la pénétration par endocytose de la protéine recombinante 6xHis-Tat-Foxp3 à l’intérieur des lymphocytes T CD4+ , toutes les protéines qui se trouvaient dans le milieu extracellulaire ont été digérées par la trypsine (Figure 18). Anti-His 49 kDa Figure 18 : Détection par Western Blot de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 après transduction dans les lymphocytes T CD4+. 1. Contrôle négatif (lymphocytes T CD4+ non transduits) 2. Contrôle positif (protéine 6xHis-Tat-Foxp3 purifiée) 3-4. Lymphocytes T CD4+ transduits (6 et 12µg) traités à la trypsine 5. Lymphocytes T CD4+ transduits (12µg) non traités à la trypsine. 5.2.4 Caractéristiques des lymphocytes T CD4+ transduits Nous avons étudié le phénotype de lymphocytes T CD4+ transduits afin de déterminer si la transduction de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 assure la conversion des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs induits. L’analyse par cytométrie en flux (Figures 19 et 20), a montré que dans la population des lymphocytes T CD4+ naïfs non stimulés (Figure 19-A) le pourcentage des cellules T CD4+CD25+ n’est que de 8 % sur l’ensemble des cellules T CD4+. Suite à la stimulation avec l’anti-CD3 et l’anti-CD28 (Figure 19-B) le pourcentage des cellules T CD4+CD25+ grimpe aux alentours de 25.8 % dans la fraction stimulée. Après la transduction de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 le pourcentage des cellules T CD4+CD25+ s’élève à 63.7 % (Figure 19-C). Le pourcentage exact des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+Foxp3+ ne peut être obtenu qu’en faisant le marquage intracellulaire de Foxp3. 54 A B C Figure 19: Marquage des lymphocytes T CD4+CD25+ A) Cellules non stimulées : les cellules T CD4+CD25+ ne représentent que 8% du nombre total des cellules T CD4+. B) Cellules stimulées pendant 24h : le pourcentage des cellules T CD4+CD25+ est d’environ 26% C) Cellules après transduction avec Tat-Foxp3 pendant 24h : le taux final de cellules T CD4+CD25+ s’élève à environ 64% 55 Marquage de lymphocytes T CD4+CD25+ 120 Pourcentage 100 95,4 93,8 93,4 80 63,7 60 Total cellules 40 20 25,8 9,8 8 CD4+ 8,9 8,1 Contrôle stimulé (B) Echantillon +Tat-Foxp3(C) CD4+CD25+ 0 Contrôle non stimulé (A) Lymphocytes Figure 20: Analyse cytométrique des lymphocytes marqués avec les anticorps anti-CD4-PE-Cy5 et anti-CD25-PE 5.3 Discussion Le but de ce travail de recherche était de produire la protéine recombinante Tat-Foxp3 qui devait servir à la transformation des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs induits afin d’augmenter le nombre de ces derniers aux niveaux nécessaires pour développer une tolérance immunologique périphérique efficace. Le développement de la tolérance immunologique est une solution envisageable pouvant faire face au rejet immunologique observé au cours de la thérapie cellulaire, laquelle fait partie des approches thérapeutiques possibles dans le cadre de la recherche d’un traitement pour la DMD. Les lymphocytes T régulateurs sont des cellules du système immunitaire adaptatif qui jouent un rôle important dans la tolérance immunologique périphérique et donc, dans le contrôle du rejet immunologique lors des allotransplantations (Canavan, Afzali et al. 2013). Plusieurs études récentes ont démontré l’usage thérapeutique des lymphocytes T régulateurs dans les allotransplantations, mais leur nombre est assez limité (Edinger and Hoffmann 2011, Wright, Ehrenstein et al. 2011). L’induction des lymphocytes T régulateurs en périphérie peut être obtenue par la transduction de la protéine Foxp3 et, cela peut permettre d’augmenter le nombre des Treg dans l’organisme. La protéine Foxp3 est le facteur de transcription qui contrôle le développement et la fonctionnalité des lymphocytes T régulateurs; son expression est essentielle pour la différentiation des Treg et assure le maintien des caractéristiques des Treg à long terme in vitro et même in vivo (Ochs, Oukka et al. 2009, Hilbrands, Howie et al. 2013). Afin de transformer les lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs induits, dans un premier temps, les expériences effectuées nous ont permis de produire la protéine recombinante Foxp3 qui est couplée au peptide Tat lequel a pour rôle essentiel de permettre sa pénétration dans les lymphocytes T 56 CD4+ naïfs. Nous avons d’abord procédé à la construction du vecteur d’expression pET16b-6xHis-TatFoxp3 à partir du vecteur pET16b qui a été choisi pour sa propriété intégrative. Cela nous a permis de produire la protéine recombinante 6xHis-Tat-Foxp3 dans des bactéries E.coli puis ensuite de la purifier. Les lymphocytes T CD4+, prélevés à partir des rates des souris, ont été incubés avec différentes concentrations de la protéine pendant 48 heures. Les protéines ont été extraites de ces cellules après 2 heures, 24 heures puis 48 heures de culture cellulaire. Le bon fonctionnement de la transduction de la protéine recombinante 6xHis-Tat-Foxp3 a été vérifié par Western Blot. Après 2 heures d’incubation, la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 n’avait pas pu être détectée à l’intérieur des lymphocytes T CD4+. Des résultats contraires ont été obtenus par Liu et collaborateurs qui, dans une étude réalisée sur la transduction de la protéine de fusion PTD-hFoxp3 dans des lymphocytes T CD4+CD25- humains ont démontré par cytométrie en flux une efficacité d’environ 80 %, cela 2 heures après l’incubation avec la protéine recombinante. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer ces résultats discordants. Tout d’abord l’origine des lymphocytes T utilisés, l’équipe de Liu a travaillé avec les lymphocytes T humains et nous, nous avons travaillé avec des lymphocytes T de souris. D’autre part les deux protéines pourraient être transduites en quantité trop différente. Enfin, un encombrement défavorable lié à la présence de la queue polyhistidine sur notre protéine recombinante pourrait retarder le processus de transduction. En fait, la microscopie confocale ainsi que le Western Blot réalisés par l’équipe de Liu ont démontré qu’une grande quantité de cette protéine était accolée à la surface cellulaire et n’était donc pas rentrée dans la cellule (Liu, Xu et al. 2012). Donc leur conclusion que la protéine était transduite dans les cellules en seulement deux heures n’est pas supportée par ces observations. Dans notre expérience la transduction a été efficace seulement après 24 heures d’incubation avec la protéine, cela a été bien démontré par le Western Blot fait sur des cellules traitées avec la trypsine extracellulaire pour dégrader la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 demeurée à l’extérieur des cellules. Nous avons aussi noté qu’une certaine quantité de la protéine n’était pas rentrée dans la cellule, car elle a été digérée après 10 minutes d’incubation des cellules avec la trypsine (Figure 18). Après 48 heures d’incubation avec la protéine, le signal n’était pas plus intense, cela peut démontrer que la protéine recombinante est potentiellement progressivement dégradée par les protéases de la cellule, ce qui prévient d’obtenir des concentrations intracellulaires plus élevées. L’équipe de Liu a fait aussi le même constat. La protéine Foxp3 contrôle le développement et le devenir des lymphocytes T régulateurs lesquels présentent une augmentation de l’expression de CD25, TGF-β et de l’IL-10 (Chen, Rowell et al. 2006). Nous avons donc ensuite cherché à évaluer les caractéristiques phénotypiques des lymphocytes T CD4 + naïfs 24 heures après la transduction de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 afin de vérifier la fonctionnalité de la protéine recombinante 6xHis-Tat-Foxp3. Pour cela nous avons réalisé une cytométrie en flux, laquelle a nettement démontré une augmentation de l’expression de CD25 dans ces cellules. Plusieurs études ont démontré que la protéine Foxp3 augmente l’expression de CD25 dans les cellules CD4+CD25- transduites 57 avec la protéine Foxp3 (Hori, Nomura et al. 2003, Allan, Passerini et al. 2005). Par contre, d’autres études récentes ont démontré que la population des lymphocytes T régulateurs étant hétérogènes, certains d’entre eux n’expriment pas le récepteur CD25 (Yan and Liu 2009, Ohkusu-Tsukada, Toda et al. 2010). Nous pouvons émettre l’hypothèse que la production de CD25 est sous le contrôle de Foxp3. L’équipe de Liu a plutôt noté une diminution de l’expression de CD25 après transduction de la protéine PTD-hFoxp3. La capacité de reproduire les résultats d’expériences publiés par d’autres groupes de chercheurs suggère que la protéine recombinante 6xHis-Tat-Foxp3 que nous avons produite avait une bonne conformation après sa renaturation et qu’elle était active. Toutefois, d’autres tests in vitro doivent absolument être effectués afin de vérifier si la protéine recombinante Tat-Foxp3 a pu assurer la transformation des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs induits. Parmi ces tests nous citerons la QRTPCR pour vérifier l’expression des gènes de TGF-β et de l’IL-10, le MLR pour vérifier le potentiel d’inhibition directe des cellules T CD4+CD25+ résultants de la transduction de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3. Après la confirmation in vitro de l’activité de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3, la prochaine étape de nos travaux sera l’injection intraveineuse de la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 à des souris afin de vérifier la transformation des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs induits in vivo. Les effets in vivo de cette protéine seront peut-être plus variables, car plusieurs facteurs encore inconnus pourront les influencer. Par la suite les souris seront sacrifiées et leurs rates seront prélevées, broyées et les cellules seront analysées par FACS. Une fois l’effet de la protéine testée in vivo, la dernière étape de ces expériences sera d’incorporer ce protocole de tolérance immunologique périphérique au protocole de tolérance centrale. Des greffes des CSH allogéniques seront faites à des souris mdx afin de déterminer si la production de lymphocytes T régulateurs par l’injection de la protéine 6xHis-Tat-foxp3 permet l’implantation de ces cellules souches allogéniques. Des tentatives de greffes de myoblastes provenant du même donneur pourront alors être effectuées sur ces souris mdx ayant développé un micro-chimérisme pour vérifier si la survie de ces greffes permet la formation de fibres musculaires hybrides exprimant la dystrophine. 58 Conclusion Dans ces présents travaux, nous avons démontré que la production de la protéine recombinante TatFoxp3, avec une étiquette polyhistidine, dans des bactéries s’est avérée relativement simple. Mais en raison de problèmes de conformation, sa purification a été beaucoup plus complexe. Cela a d’ailleurs nettement limité de façon importante d’autres tests in vitro ainsi que les expériences in vivo. Pour le moment la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 peut être produite et purifiée en conditions dénaturantes. Les travaux effectués ont permis de prouver la pénétration de la protéine recombinante 6xHis-Tat-Foxp3 dans les lymphocytes T CD4+ naïfs des souris. Toutefois, les résultats obtenus sont préliminaires et plusieurs expériences plus approfondies sont nécessaires afin de vérifier son activité in vitro. De plus, la protéine 6xHis-Tat-Foxp3 ainsi produite devra être injectée à des souris afin de voir sa fonctionnalité in vivo et déterminer si elle permet d’induire une tolérance périphérique. Cette expérience sera ensuite suivie de la greffe des CSH allogéniques, car la présence des lymphocytes T régulateurs pourra permettre le développement d’un chimérisme mixte suffisant pour induire une tolérance immunologique centrale. Ainsi, la greffe de myoblastes normaux aux souris mdx qui auront développé le chimérisme mixte pourra ensuite avoir lieu. C’est seulement lorsque toutes ces expériences seront effectuées chez la souris mdx que des expériences pourront être effectuées chez le singe afin de s’assurer que ce protocole pourra éventuellement être utilisé chez le patient DMD. Le développement d’une tolérance immunologique pourra permettre la survie à long terme des myoblastes sains greffés; c’est donc une approche prometteuse pour améliorer le succès de greffes des myoblastes dans le cadre d’une thérapie cellulaire contre la DMD. Pour terminer, nous pensons que le développement d’un protocole de tolérance immunologique pourrait éventuellement permettre la réalisation non seulement des greffes d’autres types de cellules, mais aussi des greffes de certains organes comme le rein sans une immunosuppression soutenue évitant ainsi les nombreux effets secondaires observés avec les médicaments immunosuppresseurs. 59 Bibliographie Aartsma-Rus, A., W. E. Kaman, M. Bremmer-Bout, A. A. Janson, J. T. den Dunnen, G. J. van Ommen and J. 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