Étude de la réponse des lymphocytes T CD4+ au cours de l`infection

Tables des matières
Tables des matières ................................................................................................................................1
Liste des abréviations.............................................................................................................................4
Liste des figures ......................................................................................................................................9
Summary ............................................................................................................................................... 10
Résumé ................................................................................................................................................. 13
Introduction ......................................................................................................................................... 16
Le cytomégalovirus ......................................................................................................................... 17
A. Epidémiologie ..................................................................................................................... 17
B.
Structure du virus ............................................................................................................... 17
C. Réplication virale ................................................................................................................ 19
D.
Excrétion virale............................................................................................................... 21
E. Drogues antivirales ............................................................................................................. 23
F.
Manifestations cliniques .................................................................................................... 25
a.
Sujets immunocompétents ............................................................................................ 25
b.
Sujets immunodéprimés ................................................................................................ 26
I.
Patients receveurs de greffe d’organe solide .......................................................... 26
II.
Patients receveurs de greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques
26
III.
c.
Patients infectés par le VIH ................................................................................. 27
Foetus............................................................................................................................... 28
Les lymphocytes T antiviraux ....................................................................................................... 29
A. L’activation du lymphocyte T CD4+ .............................................................................. 30
I . La cellule dendritique .................................................................................................... 30
II.
Le complexe TCR .................................................................................................. 32
III.
Costimulation ......................................................................................................... 35
1
IV.
B.
Immunomodulation par le CMV ......................................................................... 38
Cinétique de la réponse des lymphocytes T CD4+ ....................................................... 40
C. Différenciation fonctionnelle du lymphocyte T CD4+ ................................................ 40
D.
Différenciation phénotypique des lymphocytes T CD4+ ........................................ 43
E. Différenciation des lymphocytes T CD4+ au cours de l’infection par le CMV ....... 46
F.
Fonctions antivirales des lymphocytes T CD4+ ....................................................... 48
I.
Aide aux lymphocytes B ............................................................................................ 48
II.
Aide aux lymphocytes T CD8+ ........................................................................... 48
III.
Action antivirale directe ........................................................................................ 50
IV.
Protection contre la réplication virale ................................................................. 50
A. Régulation fonctionnelle dans infections persistantes .................................................. 51
a.
Epuisement ..................................................................................................................... 51
I.
b.
Découverte .................................................................................................................. 51
II.
Description ............................................................................................................. 51
III.
PD-1 ......................................................................................................................... 54
IV.
Tim-3 ....................................................................................................................... 57
Sénescence cellulaire ...................................................................................................... 57
Modèles animaux ............................................................................................................................ 59
A. Modèles d’infection par le CMV chez les non-primates............................................... 59
B.
Modèles d’infection par le CMV chez les primates ....................................................... 60
Objectif ................................................................................................................................................. 62
Résultats................................................................................................................................................ 65
Functional exhaustion of CD4+ T lymphocytes during primary CMV infection ................ 66
Postnatal acquisition of primary rhesus cytomegalovirus infection is associated with
prolonged virus shedding and impaired CD4+ T lymphocyte function ................................ 68
Discussion et perspectives ................................................................................................................. 69
Expansion de lymphocytes T CD4+ dysfonctionnels au cours de l’infection primaire par le
CMV ................................................................................................................................................. 70
2
Déterminants de la fonction réduite des lymphocytes T CD4+.............................................. 75
Différenciation ............................................................................................................................ 75
Récepteurs inhibiteurs ................................................................................................................ 77
Autres mécanismes inhibiteurs ................................................................................................. 81
Lien entre la fonction des CD4+ et la réplication virale ........................................................... 83
Intérêt de la modulation de la fonction des lymphocytes T dans le contrôle viral ............... 86
Thèse annexe ....................................................................................................................................... 90
Les cellules de la leucémie lymphoïde chronique sont apparentées aux lymphocytes B1
effecteurs naturels : implications thérapeutiques potentielles .................................................. 91
Références ............................................................................................................................................ 93
Curriculum vitae ................................................................................................................................ 121
3
Liste des abréviations
A
ADN
Acide désoxyribonucléique
AP-1
Activator protein 1
B
Bcl-2
B-cell lymphoma 2
Bcl-XL
B-cell lymphoma XL
C
CIITA
MHC class II transactivator
CCL
C-C Chemokine ligand
CCR
C-C Chemokine receptor
CD
Cluster of differentiation
Cdk2
Cyclin-dependent kinase 2
CDR
Complementarity-Determining Region
CMH
Complexe majeur d’histocompatibilité
CMV
Cytomégalovirus
CRTh2
Chemoattractant Receptor-homologous molecule expressed on Th2 cells
CTLA-4
Cytotoxic T lymphocyte antigen 4
cSMAC
Central supramolecular activation cluster
CXCR3
CXC chemokine receptor 3
D
DAG
Diacyl glycérol
DDR
DNA damage response
DHFR
Dihydrofolate réductase
E
E
Gènes viraux précoces (Early)
EBV
Epstein-Barr virus
Erk
Extracellular signal regulated kinase
4
F
FAS
Apoptosis stimulating fragment
FoxP3
Forkhead box P3
G
Gads
Grb2-Related Adaptor Downstream of Shc
GATA3
GATA binding protein 3
gB
Glycoprotein B
gCI
Glycoprotein complex I
gCII
Glycoprotein complex II
gCIII
Glycoprotein complex III
gH
Glycoprotein H
gL
Glycoprotein L
Glut1
Glucose transporter 1
gM
Glycoprotein M
gN
Glycoprotein N
gO
Glycoprotein O
gpUL
Glycoprotein encoded by a gene located in the UL segment
GRB2
Growth factor receptor-bound protein 2
GSK-3
Glycogen synthase kinase 3
GVHD
Graft versus host disease
H
HAART
Highly active antiretroviral therapy
HHV5
Human herpesvirus 5
HHV6
Human herpevirus 6
HLA-E
Human leukocyte antigen E
HPK1
Hematopoietic progenitor kinase 1
HSV
Herpes simplex virus
I
ICOS
Inducible T-cell costimulator
IE
Immediate early gene
5
IFN
Interferon
IgA/G
Immunoglobulin A/G
IkB
NFkB inhibitor
IKK
IkB kinase
IL
Interleukin
ILT2
Ig-like transcript 2
IP3
Inositol triphosphate
ITAM
Immunoreceptor tyrosine-based activation motif
ITIM
Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif
Itk
Interleukin-2-inducible T-cell kinase
ITSM
Immunoreceptor tyrosine-based switch motif
J
JNK
Jun aminoterminal kinases
K
kbp
1000 base pairs
L
L
Late viral genes
LAG-3
Lymphocyte activation gene 3
LAT
Linker for the activation of T cells
Lck
Leukocyte C-terminal Src kinase
LCMV
Lymphocytic choriomeningitis virus
M
MAPK
Mitogen-associated protein kinase
mCP
Minor capsid protein
MCP
Major capsid protein
MCP-1
Monocyte chemoattractant peptide 1
mDC
Myeloid dendritic cell
MDSC
Myeloid derived suppressor cells
MIE
Major IE genes
MIP1β
Macrophage inflammatory protein 1β
6
MTOC
Microtubule organizing center
N
NEPRC
New England Primate Research Center
NFAT
Nuclear factor of activated T cells
NFkB
Nuclear factor kB
NIK
NFkB inducing kinase
NK
Natural killer
NKG2A/D/C
Natural killer group 2 A/D/C
P
PD-1
Programmed cell death protein 1
pDC
Plasmacytoid dendritic cell
PDGF
Platelet derived growth factor receptor
PDK1
Phosphoinositide-dependent kinase-1
PD-L1/2
Programmed death ligand 1/2
PI3K
Phopshoinositol 3 kinase
PIP2
Phopshatidylinositol bisphosphate
PIP3
Phopshatidylinositol bisphosphate
PKCθ
Protein kinase Cθ
PLCγ1
Phospholipase Cγ1
PP2A
Protein phosphatase 2
pp65
Phopshoprotein 65
ppUL
Phosphoprotein encoded by an UL gene
pSMAC
Peripheral supramolecular activation cluster
pUL
Protein encoded by an UL gene
R
Rb
Protéine du rétinoblastome
RORγt
Retinoid-related orphan receptor gamma t
S
SIDA
Syndrome d’immunodéficience acquise
SLP-76
Src homology 2 domain containing leukocyte phosphoprotein of 76 kDa
7
STAT
Signal transducer and activation of transcription
T
Tbet
T-box protein expressed in T cells
TCM
Central memory T cell
TCR
T cell receptor
TEM
Effector memory T cell
Tfh
Follicular helper T cell
TGFβ
Transforming growth factor β
Th
T helper
Tim-3
T cell immunoglobulin mucin 3
TLR
Toll-like receptor
TNF
Tumor necrosis factor
TRAF
TNF receptor associated factor
TRAIL
TNF-related apoptosis inducing ligand
U
UL
Unique long region
US
Unique short region
V
VIH
Virus de l’immunodéficience humaine
VSV
Vesicular stomatitis virus
Z
ZAP70
Zeta-chain associated protein kinase 70
8
Liste des figures
Figure 1 Structure du cytomégalovirus humain. Page 18
Figure 2 Excrétion urinaire et virémie au cours de l’infection primaire par le CMV chez l’homme. Page 22
Figure 3 Cascade de signalisation intracellulaire en aval du TCR. Page 33
Figure 4 Effets de la co-stimulation via le récepteur CD28. Page 36
Figure 5 Différenciation fonctionnelle du lymphocyte T CD4+. Page 42
Figure 6 Différenciation phénotypique du lymphocyte T CD4+. Page 45
Figure 7 Perte hiérarchique de fonction par le lymphocyte T CD8+ épuisé. Page 53
Figure 8 Signalisation intracellulaire en aval des récepteurs de la famille CD28. Page 55
Figure 9 Production d’IL-2 parmi les lymphocytes T CD4+ en réponse au lysat de CMV chez le singe rhésus.
Page 72
Figure 10 Production d’IFNγ et de TNFα par les lymphocytes T CD4+ chez le singe rhésus en réponse au lysat
de CMV. Page 73
Figure 11 Etude de la polyfonctionnalité des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV chez l’être humain.
Page 74
Figure 12 Effet du blocage de PD-1 a sur la production de cytokines. Page 79
Figure 13 Etude de l’affinité fonctionnelle en fonction de l’expression du CD28. Page 80
9
Summary
10
Cytomegalovirus infection is mostly asymptomatic in immunocompetent hosts but leads to
severe morbidity and mortality in immunocompromised subjects and foetuses.
After primary infection, CMV establishes lifelong persistence but can reactivate intermittently.
This is associated with the expansion of highly differentiated CD4+ T lymphocytes exhibiting
helper functions and cytolytic activity.
Primary infection is characterised by an intense viral replication lasting several months. It has
been shown that prolonged exposure to elevated antigen concentrations induces a progressive
loss of function by T lymphocytes called exhaustion. This state of functional impairment is
associated to the expression of inhibitory receptors. The consequence of the intense viral
replication seen in primary CMV infection on CD4+ T cell function is unknown.
CD4+ T cell function has been studied in human and rhesus macaque during primary CMV
infection. Chronic CMV carriers have been used as controls.
The results show that primary CMV infection is associated to the detection of circulating
CD4+ T lymphocytes exhibiting weak proliferative capacities and reduced cytokine
production affecting IL-2 in particular.
The impact of differentiation on lymphocyte function has been explored in detail in human.
An increased proportion of terminally differentiated CD4+ T cells (CD28-) is observed
during primary infection. These lymphocytes are unable to secrete IL-2 in response to CMV
antigens. Interestingly, CD28+ CMV-specific CD4+ T cells also exhibit reduced IL-2
production during primary infection. This is part of a global reduction of cytokine production
affecting IFNγ and TNFα as well. The impaired cytokine production is associated to reduced
polyfunctionality and is independent of differentiation. Exhaustion of CMV-specific CD4+ T
lymphocytes contributes to the reduced functionality as shown by an increased expression of
the inhibitory receptor PD-1 and improved proliferative responses in the presence of PD-1
blocking antibodies.
The relationship between viral replication and lymphocyte function has been explored in
rhesus macaques. CMV infection is observed in juvenile and adult monkeys but not in
newborns. Excretion in urine and saliva is significantly more frequent and intense in juvenile
monkeys than adults. As in primary infection in human, CMV-specific CD4+ T lymphocytes
are less polyfunctional and have lower proliferative capacities in juveniles as compared to
adults. This is associated with an increased expression of PD-1 in juvenile monkeys. CD4+ T
11
cell proliferative responses are increased when PD-1 blocking antibodies or exogenous IL-2
are added to the culture medium. Finally, an inverse association between lymphocyte function
and urinary excretion has been observed in adult macaques.
These results indicate that CMV infection shares common features in human and rhesus
macaque. Primary infection is associated to the detection of CD4+ T lymphocyte displaying
lower functional capacities as compared to chronic infection. Exhaustion contributes to the
functional impairment and the inhibitory receptor PD-1 could be targeted by
immunomodulatory strategies aiming at improving lymphocyte functions and controlling viral
replication. Natural CMV infection in rhesus macaque might be useful as a model to evaluate
the efficacy and safety of immunomodulatory approaches.
12
Résumé
13
L’infection par le cytomégalovirus est le plus souvent asymptomatique chez les sujets
immunocompétents mais entraine une morbidité et une mortalité importantes chez les
patients immunocompromis et en cas d’infection congénitale.
Après l’infection primaire, le virus persiste tout au long de la vie à l’état latent mais peut se
réactiver de manière intermittente. Ceci est associé à l’expansion de lymphocytes T CD4+
fortement différenciés ayant des fonctions auxiliaires et cytolytiques. L’infection primaire est,
par contre, caractérisée par une réplication virale intense qui dure plusieurs mois. Il a été
montré que l’exposition prolongée à des concentrations élevées d’antigènes entraine une perte
progressive de fonction par les lymphocytes T appelée épuisement et caractérisée par
l’expression de récepteurs inhibiteurs. L’impact de la réplication virale intense observée au
cours de l’infection primaire par le CMV sur la fonction des lymphocytes T CD4+ n’est pas
bien connu.
La fonctionnalité des lymphocytes T CD4+ a été explorée chez l’humain et le singe rhésus au
cours de l’infection primaire et comparée à celle de sujets porteurs chroniques du virus.
Les résultats montrent que l’infection primaire par le CMV est associée à la détection de
lymphocytes T CD4+ circulants ayant une faible capacité de prolifération et de production de
cytokines et d’IL-2 en particulier.
L’impact de la différenciation sur la fonction des lymphocytes a été exploré en détail chez
l’humain. Il a été observé qu’un degré de différenciation plus élevé des lymphocytes T CD4+
spécifiques du CMV joue un rôle dans la production réduite d’IL-2. Toutefois, la fraction
moins différenciée (exprimant la molécule CD28) présente également une sécrétion d’IL-2
moindre au cours de l’infection primaire. Ceci fait partie d’une diminution globale de la
production de cytokines au cours de l’infection primaire qui affecte également la sécrétion
d’IFNγ et TNFα, entraine une polyfonctionnalité réduite et est indépendante de la
différenciation. L’épuisement des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV contribue à leur
fonctionnalité moindre comme l’indique l’expression accrue du récepteur inhibiteur PD-1 et
l’augmentation des réponses prolifératives en présence d’anticorps bloquant PD-1.
Le lien entre excrétion virale et fonction lymphocytaire a été étudié chez le macaque rhésus.
L’infection par le CMV est observée chez les singes juvéniles et adultes mais pas chez les
nourrissons. L’excrétion urinaire et salivaire est significativement plus fréquente et intense
chez les singes juvéniles par rapport aux adultes. Comme chez l’humain au cours de
l’infection primaire, les lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus sont moins
14
polyfonctionnels et prolifèrent moins efficacement chez les singes juvéniles par rapport aux
singes adultes. Ceci est associé à l’expression accrue du récepteur inhibiteur PD-1 chez les
singes juvéniles. La réponse proliférative des lymphocytes T CD4+ est accrue en présence
d’anticorps bloquant PD-1 ou d’IL-2 exogène. Enfin, une association inverse entre fonction
lymphocytaire et excrétion urinaire a été mise en évidence chez les macaques adultes.
Ces résultats indiquent que l’infection par le CMV présente des caractéristiques semblables
chez l’humain et le singe rhésus. L’infection primaire est associée à la détection de
lymphocytes T CD4+ ayant une fonctionnalité moindre qu’au cours de l’infection chronique.
L’expression du récepteur inhibiteur PD-1 typique des cellules épuisées est l’un des
mécanismes impliqués et pourrait être la cible de stratégies immunomodulatrices visant à
améliorer les fonctions lymphocytaires et le contrôle de la réplication virale. Les résultats
présentés indiquent que l’infection naturelle chez le singe rhésus constitue un modèle
potentiellement utile à l’étude de la réponse immune au CMV humain et à l’évaluation de
stratégies immunomodulatrices.
15
Introduction
16
Le cytomégalovirus
A. Epidémiologie
Le cytomégalovirus (CMV) humain est un virus ubiquitaire. L’excrétion abondante et
prolongée dans les fluides corporels (urine, salive, lait, sécrétions vaginales et sperme) qui suit
la contamination ainsi que la rareté des symptômes chez les sujets immunocompétents
permettent la diffusion très efficace du virus. Dans le monde, la séroprévalence du CMV
(basée sur la détection d’IgG anti-CMV) au sein de populations adultes varie de 35% à
presque 100%. Elle est la plus élevée en Afrique, Amérique du Sud et Asie, elle est la plus
faible en Europe Occidentale et aux Etats-Unis. De multiples facteurs influencent la
prévalence (1). Celle-ci augmente avec l’âge et atteint au moins 60% après 50 ans dans tous les
groupes étudiés. L’origine ethnique influence la prévalence : elle est plus faible chez les
caucasiens par rapport aux autres. La prévalence varie également selon le niveau socioéconomique des sujets : elle est plus élevée chez les individus à niveau socio-économique
faible par rapport aux sujets ayant un niveau socio-économique élevé. Enfin la prévalence
semble légèrement plus élevée chez les sujets de sexe féminin par rapport à ceux de sexe
masculin. D’autres facteurs comme les conditions hygiéniques, la durée de l’allaitement et le
nombre de partenaires sexuels sont également associés à la prévalence du CMV (2-4).
Dans les pays en voie de développement, la plupart des enfants acquièrent le CMV au cours
des premières années de vie. C’est le cas en Gambie par exemple où la prévalence atteint
environ 90% à un an (5). Chez les femmes enceintes infectées avant la grossesse, le virus peut
être transmis au foetus en cas de réactivation virale. Ce risque s’élève à 0.15-3% selon les
populations étudiées (6).
Dans les populations au niveau socio-économique élevé, l’acquisition du virus est plus tardive.
Une proportion importante des femmes en âge de procréer est séronégative en début de
grossesse. Chez ces femmes, le risque d’acquérir le virus en cours de grossesse s’élève à 0.74.1%. En cas de primo-infection pendant la grossesse, le risque de transmission du CMV au
foetus s’élève à 20 à 40% (6).
B. Structure du virus
Le CMV humain fait partie de la famille des herpesviridae et est également appelé HHV5
(herpesvirus humain 5). Il partage certaines propriétés biologiques avec les autres membres de
la famille : son génome complexe code pour un large panel d’enzymes, l’assemblage de la
17
capside s’effectue dans le noyau, les cellules infectées sont détruites en cas de réplication
active et le virus persiste à l’état latent après la résolution de l’infection primaire (7).
Le virus mature mesure 150-200 nm de diamètre. L’enveloppe lipidique externe contient
plusieurs glycoprotéines virales dont gB (gpUL55), gN (gpUL73), gO (gpUL74), gH
(gpUL75), gM (UL100), gL (gpUL115) et les glycoprotéines codées par les gènes UL128,
UL130 et UL131. Celles-ci sont impliquées dans l’entrée du virus dans la cellule, la
dissémination du virus de cellule à cellule et la maturation de la particule virale (8). Des
analyses mutationnelles ont montré que l’interruption de la transcription de gB, gH, gL ou gM
entrainait l’incapacité à produire des particules infectieuses (9). La glycoprotéine gB joue un
rôle essentiel dans l’attachement du virus en se liant aux protéoglycans héparan sulfate sous la
forme d’homo-dimères (gCI) et est la cible d’anticorps neutralisants (10). C’est pour cette
raison qu’elle est l’une des protéines virales choisies pour le développement de vaccins (11).
Les hétéro-oligomères gH-gL-gO (gCIII), gH-gL-UL128-UL130-UL131 et l’hétéro-dimère
gM-gN (gCII) sont d’autres cibles d’anticorps neutralisants (10, 12, 13).
Figure 1
Structure du cytomégalovirus humain (14).
L’enveloppe protège une couche protéique appelée tégument ou matrice. De nombreuses
protéines la composent et pourraient influencer la maturation des particules virales ainsi que
les événements viraux et cellulaires précoces suivant la fusion tels que la libération du génome
viral ou la régulation des promoteurs viraux et cellulaires (ppUL69, ppUL82, UL69, UL82)
18
(15). Leurs fonctions sont toutefois encore mal connues. La plupart des protéines du
tégument sont immunogènes. La protéine pp65 est une des plus abondantes et constitue la
cible de tests de détection d’antigénémie. Cette protéine est hautement conservée entre
différentes souches virales. Elle interagit avec plusieurs protéines cellulaires et virales comme
Polo-like kinase 1 et pUL97 qui possèdent une activité sérine/thréonine kinase et est
impliquée dans la régulation transcriptionnelle et le transport de l’ARN viral hors du noyau
(16). pp65 intervient également dans l’assemblage de nouveaux virions (17).
Le tégument renferme la nucléocapside icosaédrique de 100 nm de diamètre qui contient le
génome viral. Cette dernière est composée de quatre protéines virales : pUL46, pUL48.5, la
protéine mineure de capside (mCP) et la protéine majeure de capside (MCP). Le génome du
CMV humain est constitué d’ADN double brin linéaire et mesure 230 kbp (ce qui en fait le
plus vaste parmi les herpesviridae). Il est organisé en deux segments uniques, un long (UL) et
un court (US), chacun bordés de courtes séquences répétées.
C. Réplication virale
Les études réalisées sur cadavres ont montré que le CMV infecte de nombreux types
cellulaires. L’infection productive a été observée dans les cellules épithéliales, les cellules
endothéliales, les cellules musculaires lisses, les cellules mésenchymateuses, les hépatocytes et
les macrophages (18-21). De l’ADN viral latent a été détecté dans les précurseurs médullaires
de macrophages et granulocytes ainsi que dans les monocytes (22, 23).
L’attachement et la pénétration du virus sont des phénomènes rapides et efficaces à la fois
dans les cellules permissives et dans celles qui ne le sont pas. L’évènement initial est la liaison
de faible affinité entre la glycoprotéine gB et les protéoglycans d’héparan sulfate (24). La
glycoprotéine gB interagit ensuite avec le récepteur au PDGF ce qui rend la liaison entre le
virus et la cellule plus stable. Le complexe gCIII intervient dans la fusion de l’enveloppe virale
avec la membrane cellulaire permettant l’entrée de la nucléocapside et du tégument dans le
cytoplasme puis le noyau où la protéine pp65 peut être détectée moins d’une heure après
l’infection (25).
Au cours de l’infection productive, les gènes viraux sont transcrits de manière régulée et
coordonnée dans le temps sous la forme de trois cascades de transcription définissant trois
catégories de gènes et protéines viraux : les gènes et protéines très précoces (Immediate Early,
IE), les gènes et protéines précoces (Early, E) et les gènes et protéines tardifs (Late, L).
L’expression défectueuse de ces gènes semble être le facteur déterminant la permissivité de la
19
cellule plus que la capacité d’entrée dans celle-ci. L’expression des premiers gènes IE débute
endéans la première heure d’infection. Font partie des gènes IE les gènes majeurs IE1 et IE2
(MIE) et les gènes auxiliaires. Les gènes MIE régulent la transcription de nombreux gènes
viraux et cellulaires (26). IE1 augmente l’expression des MIE ainsi que celle des gènes E et L.
IE1 influence également le cycle de la cellule infectée en interagissant avec des membres de la
famille de la protéine Rb comme p107 ce qui induit, par exemple, l’augmentation de
l’expression de dihidrofolate réducatse (DHFR), enzyme importante pour la synthèse d’ADN
(27, 28). IE2 joue un rôle critique dans l’expression des gènes E qui ne sont pas exprimés en
son absence. Ce gène régule également l’expression des gènes L, l’expression de gènes
cellulaires (en particulier de facteurs régulant le cycle cellulaire comme p53 et Rb) et la
transition de la transcription des gènes IE vers les gènes E en inhibant la transcription des
gènes MIE (26, 29-32). IE2 bloque également la cellule infectée en phase S précoce induisant
la production des éléments constitutifs de l’ADN sans que ceux-ci ne soient utilisés par la
cellule pour synthétiser de l’ADN ce qui crée un environnement favorable à la production
d’ADN viral (33, 34). Les autres gènes IE remplissent diverses fonctions. Certains coopèrent
avec les gènes MIE dans la régulation de l’expression des gènes E. D’autres ont des propriétés
anti-apoptotiques (UL36, UL37) (35, 36). Enfin, US3 inhibe l’expression du complexe majeur
d’histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface de la cellule ce qui diminue la présentation
d’antigène par le CMH-1, un des mécanismes d’évasion immune utilisés par le CMV (37).
Les gènes précoces sont divisés en deux sous-classes selon leur délai d’expression : les gènes
E sont exprimés entre 4 et 8 heures après l’infection, les gènes E-L entre 8 et 24 heures après
l’infection. Les gènes E codent principalement pour des protéines non structurelles telles que
des facteurs de réplication de l’ADN viral, des enzymes de réparation et des protéines
impliquées dans l’évasion immune. Les gènes UL112/113 codent pour des protéines liant
l’ADN impliquées dans l’organisation des centres de réplication nucléaires où l’action de
l’ADN polymérase virale (UL54) s’exerce favorisée par son cofacteur UL44 (38). Les
glycoprotéines codées par US2 et US11 lient les chaines lourdes du CMH-I en entrainent sa
dégradation par le protéasome (39, 40). US28 est un récepteur de chémokines (comme CCL5
ou MCP1) qui entraine leur élimination du milieu extracellulaire ce qui protège la cellule
infectée de la destruction par les cellules immunitaires de l’hôte (41).
La réplication de l’ADN survient dans le noyau des cellules infectées et requiert l’activité de
protéines virales essentielles ainsi que la contribution de plusieurs protéines cellulaires. En
effet, le génome viral ne code pas pour toutes les enzymes nécessaires à la synthèse de
20
déoxyribonucléotides comme la thymidine kinase, la dihydrofolate réductase, la thymidylate
synthétase et la ribonucléotide réductase. Afin que la cellule produise une quantité suffisante
de nucléotides, le CMV stimule le métabolisme cellulaire. Les cellules infectées partagent
certaines caractéristiques avec des cellules non infectées exposées aux facteurs de croissance :
translocation nucléaire de Cdk2, hyperphosphorylation de Rb, activation des oncogènes cmyc, c-jun et c-fos (42). L’expression des enzymes impliquées dans le métabolisme des
nucléotides est accrue. C’est le cas pour la thymidine kinase, l’ornithine décarboxylase, la
dihydrofolate réductase, la topoisomérase II, la thymidylate synthétase et la ribonucléotide
réductase par exemple (7). Par ailleurs, sous l’effet d’inhibiteurs viraux, la réplication de
l’ADN cellulaire est bloquée afin d’éviter l’utilisation des nucléotides par la cellule (42, 43).
Dans cet environnement favorable, la réplication de l’ADN viral est contrôlée par de
nombreuses protéines. En particulier, l’ADN polymérase UL54 est la cible d’un inhibiteur
spécifique possédant un effet anti-viral puissant : le ganciclovir.
La présence dans le noyau d’ADN nouvellement synthétisé est requise pour l’expression des
gènes L (26). Ceux-ci sont exprimés après la 24ème heure d’infection. Les gènes L ont un rôle
principalement structurel et participent à l’assemblage du virus (38). L’assemblage de
nucléocapsides contenant l’ADN viral se passe dans le noyau. Les nucléocapsides
s’accumulent au niveau d’inclusions nucléaires qui confèrent l’aspect typique « en œil de
hibou » aux noyaux des cellules infectées. Les nucléocapsides quittent le noyau et atteignent le
cytoplasme où elles sont recouvertes par les protéines du tégument. Les particules recouvertes
de tégument acquièrent leur enveloppe en pénétrant ensuite dans l’appareil de Golgi (44). Les
nouveaux virus s’accumulent au sein de l’appareil de Golgi, sont acheminés vers la surface de
la cellule au sein de vésicules de transport puis libérés dans le compartiment extracellulaire à
partir de la 72ème heure d’infection.
D. Excrétion virale
Par sa capacité à infecter de nombreux types cellulaires de manière productive, la présence de
virus a été détectée dans le sang, la salive, l’urine, les larmes, les sécrétions cervico-vaginales et
le sperme. Toutefois, l’étude de la cinétique de la réplication virale au cours de l’infection
primaire par CMV chez les sujets immunocompétents est rendue difficile par l’absence de
symptômes associés à celle-ci. Une étude a suivi de manière prospective des adolescents et
jeunes adultes séronégatifs et identifié 6 cas de séroconversion (tous asymptomatiques) (45).
La charge virale a été mesurée au niveau urinaire, salivaire, cervicovaginal et sanguin. Cette
étude a montré que l’acquisition du virus est suivie par une phase d’excrétion virale prolongée
21
persistant plusieurs mois : presque 80% des sujets sont virémiques 16 semaines après
l’infection et plus de 80% excrètent du virus au niveau urinaire 24 semaines après l’infection.
Cette étude a également montré que l’excrétion virale au cours de la première année suivant
l’infection est plus fréquente au niveau urinaire par rapport à d’autres sites comme la salive ou
le tractus génito-urinaire. Chez les enfants infectés in utero ou tôt après la naissance, il a été
montré que l’excrétion du virus au niveau urinaire pouvait durer plusieurs années (46).
Figure 2
Excrétion urinaire et virémie au cours de l’infection primaire par le CMV chez l’homme, adapté de (45).
Après la résolution de l’infection primaire, le CMV persiste à l’état latent tout au long de la
vie. Plusieurs études ont mesuré l’excrétion virale de manière transversale chez des femmes
séropositives. Le diagnostic de séropositivité était basé sur la détection d’IgG anti-CMV. Les
infections récentes indiquées par la présence d’IgM n’ont pas été exclues et contribuent donc
à l’excrétion virale observée. Une étude conduite sur des jeunes femmes noires provenant de
milieux socio-économiques défavorisés et ayant récemment accouché a mesuré l’excrétion
urinaire tous les 6 mois pendant 3 ans. 83% des femmes incluses ont présenté au moins un
prélèvement urinaire positif. Environ un tiers de celles-ci n’a présenté qu’un prélèvement
positif (sur une médiane de 5 visites de suivi) (47). Une autre étude conduite sur des femmes
issues de milieux socio-économiques défavorisés a montré que l’excrétion de CMV diminue
avec l’âge. Alors que le taux d’excrétion virale est de 15% et 8% au niveau génital et urinaire
respectivement chez les femmes de 11 à 14 ans, il devient proche de 0% chez les femmes de
plus de 31 ans (48). Ceci a été confirmé par une autre étude au cours de laquelle l’excrétion au
niveau cervico-vaginal et urinaire a été mesurée chez des femmes sexuellement actives ayant
consulté une clinique de prise en charge de maladies sexuellement transmissibles (49). Dans
cette population, 25.4% des femmes de moins de 25 ans excrétaient du virus contre 6.7% des
22
femmes de plus de 25 ans. L’activité sexuelle et la détection d’autres pathogènes au niveau
génital étaient associées à l’excrétion du CMV au niveau cervico-vaginal mais pas urinaire.
Dans l’ensemble, ces observations indiquent que l’excrétion virale intermittente est un
phénomène fréquent après la résolution de l’infection primaire.
E. Drogues antivirales
Plusieurs drogues ont été montrées capables d’inhiber la réplication du CMV. Malgré leur
relative spécificité pour les kinases et ADN polymérases virales, elles ne sont pas dénuées de
toxicité ce qui en limite l’utilisation chez des patients fragiles et recevant souvent des
traitements lourds.
Le ganciclovir fut la première molécule enregistrée pour le traitement du CMV. Le
valganciclovir est une pro-drogue absorbée par voie orale et rapidement convertie en
ganciclovir. Le ganciclovir, 9-[(1,3,-dihydroxy-2-propoxy)méthyl]guanine, est un analogue de
la guanosine. Sous l’action de la kinase virale codée par le gène UL97 le ganciclovir est
phosphorylé en ganciclovir diphosphate puis triphosphate dont la concentration est dix fois
plus importante au sein des cellules infectées par rapport aux cellules saines (50). Le
ganciclovir triphosphate est un inhibiteur compétitif de l’incorporation de déoxyguanosine
triphosphate dans l’ADN. Il inhibe préférentiellement les DNA polymérases virales. Le
ganciclovir est utilisé dans le traitement des infections par le CMV chez les sujets immunocompromis (infections avancées par le VIH au stade SIDA, patients receveurs de greffe
d’organe ou de cellules souches hématopoïétiques). En cas de traitement prolongé, des
résistances peuvent apparaitre. Des mutations au niveau de la kinase virale codée par UL97 ou
de l’ADN polymérase virale codée par UL54 sont associées à la résistance au traitement.
Environ 80% des cas de résistance au ganciclovir sont associés à l’une des sept mutations de
UL97 suivantes : M460V/I, H520Q, C592G, A594V, L595S et C603W (51) Ces mutations
affectent la capacité de UL97 à phosphoryler le ganciclovir sans altérer de manière
significative son activité de kinase envers ses substrats habituels. D’autres mutations de UL97
associées à la résistance au ganciclovir peuvent toucher les codons 405, 460 , 466 et 590-607
(51, 52). Les mutations de UL97 confèrent une résistance modérée au ganciclovir
exclusivement alors que les mutations de UL54 entrainent une résistance marquée au
ganciclovir, au cidofovir et, parfois, au foscarnet. Certaines situations cliniques constituent des
facteurs de risque de résistance aux ganciclovir. Chez les patients receveurs de transplantation
d’organe solide, le plus haut risque d’apparition de résistance est observé chez les receveurs
séronégatifs d’organe de donneurs séropositifs (53). L’obtention de concentrations sub23
optimales d’antiviraux est également associée à l’émergence de résistance (54). L’utilisation de
valganciclovir ou de ganciclovir intraveineux permet d’obtenir des concentrations optimales
chez la plupart des patients mais certaines conditions peuvent, toutefois, diminuer les
concentrations plasmatiques comme la malabsorption, l’incompliance thérapeutique,
l’intolérance ou la récupération de la filtration glomérulaire après greffe (55). Malgré sa
relative spécificité pour les cellules infectées, le ganciclovir présente une toxicité
principalement hématologique. Le ganciclovir peut induire une leucopénie. Ce risque n’est pas
négligeable car les patients nécessitant un traitement antiviral sont souvent fragiles sur le plan
hématologique de par la maladie sous-jacente (HIV, hémopathies malignes) ou les traitements
qu’ils reçoivent (immunosuppresseurs). Enfin, l’usage du ganciclovir est délicat chez les
patients traités par des molécules néphrotoxiques. La diminution de l’élimination rénale du
ganciclovir chez ces patients les expose en effet à un risque accru de toxicité hématologique.
Le foscarnet (trisodium phosphonoformate) est un analogue du pyrophosphate. Il se lie de
manière réversible au site de liaison du pyrophosphate sur l’ADN polymérase virale et bloque
l’élongation de la chaine d’ADN. Son affinité pour l’ADN polymérase humaine est de deux
ordres de grandeur inférieure à celle pour l’ADN polymérase virale. L’apparition de résistance
est liée à certaines mutations touchant l’ADN polymérase virale mais pas UL97 (51). La
résistance au foscarnet est liée aux mutations du domaine catalytique de la polymérase virale.
Lorsque la région III du domaine est altérée, une résistance croisée au ganciclovir et/ou au
cidofovir peut être observée (52). Le foscarnet est toxique pour les cellules tubulaires rénales.
Une manifestation précoce de cette toxicité est l’apparition d’une polyurie-polydypsie
secondaire à la perte du pouvoir de concentration des urines. L’administration simultanée
d’autres médicaments néphrotoxiques augmente le risque alors que l’hyperhydratation des
patients le prévient. Le foscarnet peut également induire des troubles électrolytiques : hyper
ou hypocalcémie, hypokaliémie, hypomagnésémie et hyper ou hypophosphatémie. D’autres
effets secondaires ont été rapportés chez les patients traités par foscarnet : crises convulsives,
ulcérations génitales, anémie et nausées.
Le cidofovir fut le premier analogue nucléotidique approuvé pour un usage clinique. Après
phosphorylation en cidofovir diphosphate, il inhibe de manière compétitive l’incorporation de
déoxycytidine triphosphate dans l’ADN viral et bloque l’élongation. Comme il n’est pas
phosphorylé par une kinase virale, les mutations affectant UL97 n’entrainent pas de
résistance. La résistance au cidofovir (croisée à la résistance au ganciclovir) est associée aux
mutations de la polymérase UL54 localisées dans le domaine exonucléase et le codon 987
24
(52). La principale toxicité du cidofovir est rénale et est diminuée par l’administration
concomitante de solution de NaCl 0.9% et probenecid qui diminue l’accumulation de la
drogue au niveau des cellules épithéliales du tubule proximal. D’autres effets indésirables
associés à ce traitement sont les nausées et vomissements, l’apparition d’un rash cutané et la
neutropénie.
Malgré l’existence de traitements antiviraux efficaces, leur efficacité est limitée par l’apparition
de résistances et leur usage limité par une toxicité importante.
F. Manifestations cliniques
a. Sujets immunocompétents
L’infection primaire par le CMV est le plus souvent asymptomatique chez les sujets
immunocompétents (56). Parfois, un syndrome mononucléosique peut être observé associant
pyrexie prolongée (2-3 semaines), myalgies et adénopathies cervicales. Différemment du virus
Epstein-Barr (EBV), le CMV n’induit que rarement une atteinte pharyngée et amygdalienne
ainsi qu’une splénomégalie alors que les arthralgies sont plus marquées (57). Dans les pays
industrialisés, la primo-infection par le CMV doit être considérée comme une cause possible
de syndrome mononucléosique jusqu’à 50 ou 60 ans. Les complications très rares de
l’infection primaire par CMV sont l’arthrite, la colite, la pneumonie, l’hépatite, la méningite et
la myocardite. 5 à 10% des patients atteint de syndrome de Guillain-Barré présentent des
stigmates biologiques de primo-infection par CMV et une réactivité croisée de certains
anticorps anti-CMV envers le ganglioside GM2 a été mise en évidence (58). Après l’infection
primaire, le virus persiste tout au long de la vie et peut se réactiver malgré l’apparition d’une
réponse immune chez l’hôte infecté. Ceci a été observé en cas de stress chirurgical ou de
sepsis par exemple (59). Des observations récentes suggèrent que le CMV pourrait jouer un
rôle dans plusieurs pathologies chez les individus immunocompétents comme les maladies
inflammatoires de l’intestin, le lupus érythémateux disséminé, le psoriasis, l’athérosclérose et
la re-sténose après angioplastie coronaire ou encore certaines tumeurs (60).
Chez la femme enceinte, l’infection par le CMV est également asymptomatique. Les
complications liées à l’infection sont principalement liées au risque de transmission au foetus.
Le CMV est la première cause d’infection congénitale dans le monde. Le risque de
transmission s’élève à 20-40% en cas d’infection primaire pendant la grossesse. Les femmes
porteuses du virus avant le début de la grossesse peuvent également le transmettre à leur
foetus dans 0.15 à 3% des cas (6).
25
b. Sujets immunodéprimés
I.
Patients receveurs de greffe d’organe solide
Le traitement immunosuppresseur et l’acte chirurgical favorisent la réplication du CMV après
la greffe d’organe. Les patients séronégatifs recevant un organe provenant d’un donneur
séropositif présentent le risque le plus élevé de développer une maladie à CMV (infection
symptomatique) suite à l’absence d’immunité préalable (61-63). D’autres facteurs de risque
sont l’usage d’anticorps anti-lymphocytes T et l’infection concomitante par HHV6 (62, 64).
Les études histologiques montrent que la pathologie induite par le CMV débute en général au
niveau de l’organe greffé (hépatite du greffon, néphrite du greffon) avant de s’étendre au
niveau systémique avec atteinte digestive, pulmonaire ou neurologique par exemple. Chez les
patients receveurs de greffe rénale, l’infection par CMV, même asymptomatique, est associée
à une mortalité et à un risque de rejet du greffon accrus (65). En cas de greffe de poumons, le
CMV reste la deuxième cause d’infection après la pneumonie bactérienne. Le CMV favorise
également l’infection par d’autres germes opportunistes et augmente le risque de rejet
chronique (66, 67). La pneumonie à CMV est la manifestation la plus fréquente de maladie à
CMV après greffe de poumons mais d’autres organes peuvent être atteints (hépatite,
gastroentérite, colite)(68, 69). L’infection par le CMV peut également entrainer une
diminution de la fonction médullaire (70). Une réduction des taux de plaquettes et
neutrophiles expose les patients à des risques accrus de saignements et d’infections
bactériennes sévères. Il a été observé que l’infection par le CMV retarde la récupération
plaquettaire après greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques (71). Des cas de
faillite médullaire tardive ont également été attribués au CMV (72). L’infection des
précurseurs hématopoïétiques et l’altération de la production de facteurs de croissance par le
stroma médullaire semblent être les mécanismes impliqués dans la diminution de la fonction
médullaire (72).
L’administration de traitements antiviraux prophylactiques ou préemptifs a permis de
diminuer mais pas d’annuler l’incidence et la mortalité liées à la maladie à CMV chez les
patients receveur de greffe d’organe solide.
II.
Patients receveurs de greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques
Suite à une greffe de cellules souches allogéniques, le risque de séroconversion est
principalement lié à l’usage de dérivés sanguins provenant d’individus séropositifs. En effet, le
taux de séroconversion n’est que de 19% lorsqu’un patient séronégatif reçoit des cellules
souches provenant d’un donneur séropositif (73, 74). Les stratégies visant à limiter le risque
26
de séroconversion consistent à utiliser des dérivés sanguins provenant de donneurs
séronégatifs ou des dérivés sanguins déleucocytés (75). Avant l’utilisation de traitements
antiviraux, les receveurs CMV+ de cellules souches hématopoïétiques avaient 70-80% de
risque de réactivation du virus et un tiers de ceux-ci présentaient une maladie à CMV. Les
facteurs de risque de développer une infection symptomatique à CMV sont la séropositivité
du receveur, un titre viral élevé, la transplantation de cellules souches de donneur non familial,
l’âge, le conditionnement myéloablatif, la GVHD aiguë et l’utilisation de cellules souches
CD34+ sélectionnées (76-79). La greffe de cellules T provenant d’un donneur séropositif
permet de diminuer ce risque (80, 81). Les manifestations cliniques sont multiples : fièvre
d’origine indéterminée, pneumonie interstitielle, colite ou entérite sont les plus fréquentes
(74). La pneumonie à CMV entraîne une mortalité d’environ 50% même en cas de traitement
associant antiviraux et immunoglobulines. L’infection active par le CMV est également
associée à une altération de la fonction médullaire entrainant une réduction du taux de
plaquettes et de neutrophiles (70). Ceci expose les patients atteints à des risques de
saignements ou d’infections bactériennes sévères. Des cas de faillite médullaire après greffe
allogénique de cellules hématopoïétiques ont été attribués au CMV (72). L’infection des
précurseurs hématopoïétiques et l’altération du stroma médullaire contribuent à la diminution
de la fonction médullaire (70, 72, 82). L’administration préemptive d’antiviraux a
considérablement réduit l’incidence et la sévérité de la maladie à CMV et retardé son
apparition mais le risque de maladie à CMV tardive persiste malgré ce traitement.
III.
Patients infectés par le VIH
Chez les patients infectés par le VIH, les manifestations cliniques liées au CMV apparaissent
surtout lorsque le nombre de lymphocytes T CD4+ est inférieur à 50/µl de sang. Il s’agit
principalement de réactivations virales. Avant l’apparition du traitement HAART la rétinite à
CMV était observée chez 21 à 44% des patients au stade SIDA et conduisait à une perte
visuelle pouvant aller jusqu’à la cécité (83, 84). L’introduction du traitement HAART a réduit
l’incidence de rétinite d’environ 80% mais cette complication survient toujours chez les
patients sévèrement immunocompromis ou réfractaires au traitement antirétroviral (85). Il a
également été observé que la survenue d’une rétinite à CMV reste possible au cours de la
phase précoce de la reconstitution immune chez des patients traités ayant un taux sanguin de
lymphocytes T CD4+ supérieur à 50/µl (86). D’autres organes peuvent être atteints par le
CMV chez les patients infectés par le VIH. Le tube digestif en fait partie. Avant l’introduction
du traitement HAART, la maladie gastro-intestinale à CMV survenait chez environ 5% des
malades au stade SIDA (84). Tout le tube digestif peut être touché (oesophagite, gastrite,
27
entérite, colite). L’introduction du traitement HAART a réduit l’incidence de cette
complication et la mortalité qui lui est associée. D’autres sites atteints par le CMV chez les
patients au stade SIDA sont le système nerveux central et le poumon. Malgré la réduction de
morbidité et de mortalité attribuables au CMV depuis l’introduction du traitement HAART, le
CMV reste un pathogène opportuniste potentiellement mortel chez les patients infectés par le
VIH.
c. Foetus
Les manifestations cliniques liées à l’infection par le CMV chez le foetus sont très variables.
Elles sont plus sévères chez les nouveau-nés infectés suite à une primo-infection maternelle
par rapport à ceux dont la mère était porteuse du virus avant la grossesse (87). En cas
d’infection congénitale suite à la primo-infection maternelle, environ 10% des nouveau-nés
infectés présentent une atteinte modérée à sévère touchant plusieurs organes dont le foie et le
système nerveux central (microcéphalie). La mortalité en cas d’infection congénitale
symptomatique atteint 12% au cours des 6 premières semaines de vie. Les manifestations
cliniques les plus fréquentes incluent les pétéchies (76%), l’ictère (67%) et l’hépatosplénomégalie (60%). La plupart des nouveau-nés symptomatiques présenteront des séquelles
telles que surdité, retard mental, infirmité motrice cérébrale ou diminution d’acuité visuelle. La
perte auditive est la séquelle la plus fréquente et affecte 58% des nouveau-nés
symptomatiques. De manière imprévisible, 7 à 25% des nouveau-nés infectés
asymptomatiques développeront également des séquelles (principalement des défauts
auditifs)(6).
Les mécanismes impliqués dans la transmission du virus au foetus sont encore mal compris.
L’infection du placenta semble jouer un rôle dans la transmission. La présence d’anticorps
maternels à un titre élevé semble limiter l’extension de l’infection placentaire. Ceci pourrait
protéger le foetus contre l’acquisition du CMV. En effet, la détection d’anticorps de faible
avidité ou avec une capacité de neutralisation limitée est associée à la transmission du CMV
au foetus (87, 88).
28
Les lymphocytes T antiviraux
Le CMV persiste tout au long de la vie de l’hôte infecté. Après l’infection primaire, le système
immunitaire contrôle la réplication virale chez l’hôte immunocompétent. De nombreux types
cellulaires y participent comme les cellules NK (Natural Killer), les lymphocytes B et T.
Il a été observé que les cellules NK participent au contrôle de l’infection par le CMV chez la
souris (89). Chez l’homme le rôle protecteur des cellules NK n’est pas bien connu mais
quelques observations le suggèrent comme l’association entre l’infection congénitale
symptomatique et une activité réduite des cellules NK envers le CMV (90). Les cellules NK
contribuent également à la protection contre la réactivation virale après greffe allogénique de
cellules souches hématopoïétiques (91).
Le rôle des lymphocytes B dans le contrôle de l’infection est mieux connu. Chez la souris, les
immunoglobulines préviennent la dissémination virale (92) et le transfert adoptif de
lymphocytes B limite la réplication virale (93). Chez les patients receveurs de greffe rénale,
l’immunisation passive par l’administration d’immunoglobulines intraveineuses protège contre
l’infection et la maladie (94).
Les lymphocytes T jouent un rôle capital dans l’élimination de nombreux agents infectieux.
Les pathogènes intracellulaires et les virus en particulier sont les cibles principales de leur
action. Ils regroupent les lymphocytes T conventionnels αβ (CD4+ ou CD8+) et non
conventionnels γδ.
Les lymphocytes T γδ répondent aux infections de manière indépendante du CMH. Ils
reconnaissent des antigènes bactériens non peptidiques ou les ligands du récepteur activateur
NKG2D exprimés par les cellules infectées. Leur participation au contrôle de l’infection par
le CMV commence à être connue. L’expansion de cellules T γδ capables de lyser des cellules
infectées par le CMV a été observée après greffe allogénique de cellules souches
hématopoïétiques (95). Après transplantation rénale, l’expansion précoce des lymphocytes T
γδ est associée à une sévérité moindre de l’infection par le CMV (96). Enfin, l’infection
congénitale est associée à l’expansion oligoclonale de lymphocytesγδT dirigés contre les
cellules infectées par le CMV (97).
Les lymphocytes T CD8+ acquièrent surtout des fonctions cytolytiques après avoir été
activés. Ils sont capables de pénétrer dans les tissus et détruire les cellules infectées en libérant
des molécules cytolytiques et des cytokines antivirales. L’infection primaire par le CMV
stimule l’expansion oligoclonale de lymphocytes T CD8+. Des fréquences élevées de
29
lymphocytes T CD8+ anti-CMV persistent chez les porteurs chroniques du virus. Le rôle
protecteur des lymphocytes T CD8+ est suggéré par l’effet bénéfique du transfert adoptif de
cellules T CD8+ chez les patients receveurs d’allogreffe de moelle osseuse et atteints de
maladie à CMV (98). Toutefois la détection de lymphocytes T CD8+ anti-CMV ne semble
pas protéger contre la maladie à CMV après greffe rénale (99) ou en cas d’infection
congénitale (100).
Les lymphocytes T CD4+ jouent un rôle fondamental dans la réponse immunitaire adaptative
à de nombreux pathogènes. Ils coordonnent à la fois l’immunité cellulaire et l’immunité
humorale en produisant plusieurs cytokines activatrices ou inhibitrices. Au cours des
infections virales, de nombreuses observations indiquent que le soutien par les lymphocytes T
CD4+ est nécessaire au développement de réponses optimales par les lymphocytes T CD8+
et B (101). Les lymphocytes T CD4+ peuvent également acquérir des fonctions antivirales
directes en produisant des cytokines ou des molécules cytolytiques. Le rôle protecteur des
lymphocytes T CD4+ au cours de l’infection primaire a été mis en évidence chez la souris
après déplétion en lymphocytes T CD4+. La réplication virale est accrue dans les glandes
salivaires et les poumons en l’absence de cellules T CD4+ (102). Chez l’homme, l’apparition
tardive de lymphocytes T CD4+ spécifiques est associée à la maladie à CMV après greffe
rénale de donneurs séropositifs chez les receveurs séronégatifs (99). Enfin, les lymphocytes T
CD4+ interviennent dans la mémoire immunologique comme l’indique la susceptibilité
accrue aux infections observée lorsque leur nombre diminue ou leurs fonctions sont abolies.
L’exemple principal est celui de l’infection par le VIH au cours de laquelle les infections
opportunistes, dont la réactivation du CMV (103), surviennent quand la concentration
sanguine en lymphocytes T CD4+ diminue. Suite à leurs multiples fonctions, les lymphocytes
T CD4+ occupent donc une position centrale dans la défense contre les infections virales et
le CMV.
A. L’activation du lymphocyte T CD4+
L’activation du lymphocyte T CD4+ naïf implique l’interaction du lymphocyte avec une
cellule présentatrice d’antigène. Plusieurs molécules y participent qui contrôlent la spécificité
antigénique de l’interaction et la différenciation fonctionnelle du lymphocyte.
I . La cellule dendritique
Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d’antigènes professionnelles : elles
sont les plus efficaces pour activer les lymphocytes T CD4+ naïfs et, donc, initier une
réponse immune adaptative. D’autres cellules comme les macrophages et les lymphocytes B
30
possèdent également des capacités de présentation d’antigène. Il existe plusieurs types de
cellules dendritiques ayant des fonctions, des localisations et des phénotypes différents. Les
cellules dendritiques immatures circulent au niveau des tissus comme la peau, les poumons et
le tractus digestif. Elles capturent les antigènes microbiens via les récepteurs TLR qu’elles
expriment puis migrent vers les ganglions lymphatiques où elles activent les lymphocytes.
Plusieurs populations de cellules dendritiques peuvent être identifiées dans le sang
humain dont les principales sont les cellules dendritiques myéloïdes (mDC) et les cellules
dendritiques plasmacytoïdes (pDC) (104). Les mDC expriment des niveaux élevés de CMHII. Elles sont subdivisées en deux sous-populations : les mDCs CD1c+ et les mDCs
CD141+. Les mDCs CD1c+ expriment préférentiellement les récepteurs Toll-like 1, 2, 4, 5 et
8 et sécrètent, après activation, de l’IL-12 et les chémokines CCL17 et CCL22 qui lient le
récepteur CCR4 (105-107). Les mDCs CD141+ produisent de l’IFNβ etésentent
pr
les
antigènes microbiens aux lymphocytes T CD8+ après activation via le récepteur Toll-like 3
(107-109). Les pDC se différencient dans la moelle osseuse à partir de précurseurs myéloïdes
et lymphoïdes puis gagnent le flux sanguin. Elles expriment les marqueurs CD303 et CD68
(109). En cas d’infection virale, elles détectent la présence d’acides nucléiques viraux grâce aux
récepteurs TLR7 et TLR9 et y répondent par la production de quantités importantes
d’interférons de type 1 qui vont favoriser l’activation d’autres cellules impliquées dans la
réponse antivirale (mDC, lymphocytes T et B, cellules NK) (109-111).
La reconnaissance d’un antigène microbien par la cellule dendritique immature entraine son
activation et sa maturation. Les récepteurs aux chémokines exprimés à sa surface changent,
CCR7 remplace CCR5 et CCR1, ce qui modifie le tropisme de la cellule qui quitte le site
inflammatoire et se dirige vers le ganglion lymphatique (112). La cellule dendritique voit
également augmenter sa capacité d’activation de lymphocyte T naïf : la concentration de
molécules du CMH-II et de molécules co-stimulatrices (CD80, CD86) augmente à sa surface
et la cellule commence à produire des cytokines (112). Enfin, les antigènes capturés sont
dégradés sous l’action de protéases lysosomales en peptides de taille adéquate pour permettre
leur liaison avec le CMH-II. Les complexes CMH-II-peptide formés au sein des endosomes
migrent ensuite vers la membrane afin d’être exposés à l’extérieur. La cellule dendritique
mature et le lymphocyte T CD4+ naïf se rencontrent au niveau de la zone T du ganglion
lymphatique.
31
II.
Le complexe TCR
Le lymphocyte T CD4+ porte à sa surface un ensemble de molécules dénommé complexe
TCR qui en détermine la spécificité antigénique. Le TCR est un récepteur hétérodimérique
composé de deux chaînes transmembranaires α et β comportant chacune une région Ig-like
N-terminale variable (V), une région Ig-like constante (C), une région transmembranaire et
une courte région intracytoplasmique. La région variable contient plusieurs sites où se
concentre la variabilité entre différents TCRs appelées régions hypervariables ou CDRs
(Complementarity-Determining Regions). Trois CDRs sur la chaîne α sont juxtaposés à trois
CDRs sur la chaîne β pour former la portion reconnaissant un peptide spécifique (113). Le
TCR est dépourvu de capacité de signalisation intracellulaire. Les complexes CD3
(hétérodimères εγ et εδ et dimèresζ ζ) s’associent au TCR pour transmettre un signal
intracytoplasmique en cas de liaison du TCR. Les domaines intracytoplasmiques des chaînes ε,
γ et δ contiennent chacun un domaine ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation
motif), ceux des chaînes ζ trois chacun. Ces domaines ITAM jouent un rôle fondamental dans
la transmission du signal intracytoplasmique du complexe TCR en agissant comme sites
d’ancrage de protéines de transdution (114-116). L’interaction entre le TCR et le complexe
peptide-CMH-II reconnu est stabilisée par la liaison entre le corécepteur CD4 et une portion
constante de la molécule du CMH-II (117). La molécule CD4 est une glycoprotéine
transmembranaire qui possède la capacité de transmettre un signal intracellulaire via
l’association de son domaine intracytoplasmique avec la kinase de tyrosine Lck (118). De
nombreuses protéines participent à la régulation de l’activité de Lck dont la phosphatase de
tyrosine transmembranaire CD45 (119). Lck existe sous trois isoformes : inactive
(phosphorylée sur la tyrosine 505), réceptive (non phosphorylée) et active (phosphoryée sur la
tyrosine 394). La protéine CD45 favorise le maintien de Lck sous sa forme réceptive prête à
être activée en cas de liaison du TCR.
L’étape initiale de la signalisation intracellulaire déclenchée par la reconnaissance d’un
complexe peptide-CMH-II par le TCR est le recrutement des kinases Lck et Fyn et la
phosphorylation des domaines ITAM. La protéine Zap-70 est recrutée et constitue le noyau
du complexe multimoléculaire de signalisation qui s’assemble ensuite (119-122). Parmi les
protéines qui le composent, LAT (Linker for the Activation of T cells) et SLP-76 (src
homology 2 domain containing leukocyte phosphoprotein of 76 kDa) sont toutes les deux
fondamentales et l’absence de l’une d’elle entraine la perte quasi complète de la capacité de
transduction de signal en aval du TCR (123-125). La protéine LAT contient neufs tyrosines
qui sont phosphorylées après liaison du TCR et lient la phospholipase
γ1 (PLCγ1)
C
32
, la
phosphoinositol 3 kinase (PI3K) et les protéines adaptatrices GRB2 et Gads. SLP-76 est
ensuite recrutée par LAT phosphorylé et Gads (126). SLP-76 interagit avec de nombreuses
protéines dont Vav1, Itk, PLCγ1 et HPK1 entre autres (127). Des interactions croisées entre
les différentes protéines qui constituent le complexe de signalisation stabilisent celui-ci. Au
sein du complexe, Itk (IL-2 induced tyrosine kinase) phosphoryle et active la PLCγ1 ce qui
entraine le clivage de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) membranaire en diacyl
glycérol (DAG) et inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) (120).
Figure 3
Cascade de signalisation intracellulaire en aval du TCR (128).
La production de DAG entraine l’activation de deux voies de signalisation impliquant les
protéines Ras et PKCθ (Protein Kinase C θ). L’activation en cascade de Ras, de Raf -1 et des
MAPK (Mitogen-Associated Protein Kinase) kinases mène à l’activation des MAPK Erk1 et
Erk2 (Extracellular Signal Regulated Kinase 1 et 2). Les protéines Erk activent la transcription
de STAT3 (Signal Transducer and Activation of Transcription 3) et le facteur de transcription
Elk1 qui stimule l’expression de Fos qui, associé à la protéine Jun, constitue le complexe de
régulation transcrptionnelle AP-1 (Activator Protein 1) (129). La PKCθ active initie les
33
événements nécessaires à la phosphorylation de IkB (Inhibitor of NF-kB) qui est ensuite
ubiquitinylé et dégradé. Ceci permet la translocation de NFkB (Nuclear Factor kB) vers le
noyau où il régule l’expression de gènes impliqués dans la fonction, la survie et l’homéostasie
des lymphocytes T (130, 131). La production d’IP3 déclenche un mouvement de calcium du
réticulum endoplasmique et de l’espace extracellulaire vers le cytoplasme (132). Ceci entraine
l’activation des protéines de signalisation et des facteurs de transcription dépendants du
calcium et de la calmoduline (133). La calcineurine en fait partie et déphosphoryle les
membres de la famille des NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) entrainant leur
translocation dans le noyau.
Dans le noyau, les cascades de signalisation intracellulaires sont intégrées suite à la
coopération entre différents facteurs de transcription. Ceci résulte en l’expression
différentielle de gènes et secondairement un profil fonctionnel différent selon le contexte
dans lequel le TCR a été activé. L’interaction la mieux étudiée est celle entre NFAT et AP-1.
Leur action simultanée induit l’expression de gènes importants pour l’activation du
lymphocyte T comme celui de l’IL-2. Au contraire, lorsque NFAT agit sans la coopération
d’AP-1 le programme transcriptionnel induit mène à l’anergie du lymphocyte caractérisée par
un défaut de production d’IL-2 (134). La coopération entre NFAT et les protéines STAT
(activées en aval des récepteurs à plusieurs cytokines) influence également le profil de
cytokines que le lymphocyte activé produira en induisant l’expression de facteurs de
transcription spécifiques (Tbet pour les lymphocytes T CD4+ Th1 et GATA3 pour les Th2)
(133).
La reconnaissance d’un complexe peptide-CMH-II par le TCR entraine un réarrangement du
cytosquelette d’actine qui participe à l’activation du lymphocyte. En effet, les inhibiteurs de la
polymérisation d’actine entravent les interactions entre le lymphocyte T et la cellule
présentatrice d’antigène et abolissent les événements proximaux en aval du TCR (135). Suite à
la stimulation du TCR, les filaments d’actine s’accumulent à proximité de la surface de
stimulation, la cellule s’arrondi et la fluidité membranaire augmente. L’afflux de calcium
semble jouer un rôle dans ces modifications ainsi que la protéine SLP-76 qui sert d’ancrage à
plusieurs protéines impliquées dans l’accumulation d’actine à proximité du TCR (136, 137).
Une autre conséquence de l’activation du TCR est la polarisation de la cellule. Le MTOC
(Microtubule Organizing Center) se déplace vers la surface de contact entre le lymphocyte et
la cellule présentatrice d’antigène (138). Cette étape est capitale pour la formation de la
synapse immunologique.
34
La synapse immunologique est une structure supramoléculaire organisée et dynamique qui se
forme au niveau de la zone de contact entre le lymphocyte et la cellule présentatrice
d’antigène. Deux régions concentriques la composent : une zone centrale enrichie en
complexes TCR (cSMAC, central supramolecular activation cluster), une couronne externe
riche en intégrines (pSMAC, peripheral supramolecular activation cluster) (139, 140). Les
fonctions du cSMAC ne sont pas encore bien comprises. Cette structure était initialement
considérée comme un mécanisme d’amplification du signal du TCR mais il a été montré que
ce signal culmine avant la formation de la synapse immunologique (141). Il a été ensuite
suggéré que le cSMAC soit la zone de dégradation du TCR (142, 143). Il semble que les deux
phénomènes co-existent au sein du cSMAC et que l’équilibre entre ceux-ci soit déterminé par
la qualité de l’antigène présenté (144). Par ailleurs, il existe au sein du cSMAC des régions
pauvres en TCR mais riches en molécules CD28 ce qui suggère un rôle potentiel du cSMAC
dans la transduction du signal des molécules costimulatrices (voir plus loin)(145).
III.
Costimulation
Afin d’induire une réponse immune par des lymphocytes fonctionnels, la liaison d’autres
récepteurs membranaires doit accompagner la reconnaissance d’un peptide antigénique par le
TCR. Ce phénomène est appeler co-stimulation. Il contribue à stimuler le métabolisme, à
déclencher le cycle cellulaire, module l’apoptose et influence la différenciation cellulaire. La
stimulation du lymphocyte T par son TCR uniquement induit un état non fonctionnel appelé
anergie. Les cellules anergiques ne répondent pas à une stimulation ultérieure : elles
deviennent tolérantes vis-à-vis de l’antigène reconnu. Ce phénomène évite que les antigènes
présentés en dehors d’un contexte inflammatoire comme les antigènes du soi ou les antigènes
environnementaux non pathogènes activent les lymphocytes T CD4+.
Plusieurs récepteurs liant les molécules co-stimulatrices exprimées par les cellules
présentatrices d’antigènes ont été identifiés. Parmi eux, la molécule CD28 semble être la
principale (146).
35
Figure 4
Effets de la co-stimulation via le récepteur CD28 (146).
La molécule CD28 est une protéine transmembranaire exprimée de manière constitutive par
les lymphocytes T sous la forme d’homodimères. Ses ligands, CD80 (B7-1) et CD86 (B7-2),
sont exprimés par les cellules dendritiques matures. Des réponses immunitaires affaiblies ont
été observées chez des souris déficientes pour le CD28 ou traitées par des anticorps bloquant
l’interaction de CD28 avec ses récepteurs. Cette observation a été effectuée dans de
nombreux modèles : infection, allogreffe, graft-versus-host disease (GVHD) et asthme (147153). L’absence de co-stimulation via CD28 réduit la prolifération des lymphocytes T in vitro
et in vivo et la production de cytokines (154-158). La nécessité d’un signal complémentaire
transmis par le CD28 est particulièrement présente en cas de stimulation du TCR de faible
intensité (159-161). Le signal transmis par le CD28 favorise l’activation des facteurs de
transcription NFkB, NFAT et AP-1 (qui contrôlent la prolifération, la mort et la
différenciation cellulaires) et augmente l’expression de cytokines (comme l’IL-2 et l’IFNγ), de
chémokines, de récepteurs aux cytokines et aux chémokines (comme les récepteurs de l’IL-2
ou de l’IL-12) et d’autres molécules comme CTLA-4 (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4),
OX40 et ICOS (Inducible Co-Stimulatory molecule) (146, 162-165). Ces modifications
participent à l’acquisition de fonctions effectrices et à la génération d’une mémoire à long
terme. Suite à la liaison de CD28 à l’un de ses récepteurs, la sous-unité régulatrice p85 de la
PI3K s’associe à un motif YMNM phosphorylé contenu dans l’extrémité cytoplasmique du
CD28 (166). p85 recrute la sous-unité catalytique p110 ce qui entraine la conversion locale de
36
PIP2 en PIP3. L’accumulation locale de PIP3 sert de site d’ancrage à PDK1 (3Phophoinositide Dependent Protein Kinase 1) et à son substrat Akt. L’activation d’Akt
stimule la translocation nucléaire de NFkB ce qui favorise l’expression de gènes impliqués
dans la survie cellulaire comme Bcl-XL. Akt influence également la transcription des gènes
régulés par NFAT comme l’IL-2 en inactivant GSK-3 (Glycogen-Synthase Kinase 3), une
kinase de sérine et thréonine qui favorise la sortie de NFAT hors du noyau (167). Enfin, la
stimulation simultanée du TCR et de CD28 augmente aussi l’expression membranaire de
Glut1 ce qui favorise l’entrée de glucose et la glycolyse (168, 169). Ces événements
déterminent le rôle joué par CD28 dans la croissance et la survie cellulaire. L’accumulation
locale de PIP3 permet l’ancrage d’Itk et Lck qui se lient à la portion intracytoplasmique de
CD28. L’activation d’Itk par Lck participe à l’amplification des flux de calcium observée suite
à la stimulation du CD28. Enfin, l’activation du CD28 augmente l’activité de l’arginine
méthyl-transférase. La méthylation de protéines de signalisation intracellulaire, comme Vav1,
pourrait soutenir la production d’IL-2 (170). La plupart des voies de signalisation activées en
aval de CD28 le sont aussi après stimulation isolée du TCR. La co-stimulation via CD28
augmente l’intensité de la réponse et semble donc jouer un rôle d’amplificateur quantitatif de
la réponse à la reconnaissance d’antigène. Ces différences quantitatives sont quant à elles à la
base de profils fonctionnels qualitativement différents.
Il a été observé que toutes les réponses immunitaires ne sont pas considérablement affectées
par la perte du CD28 ce qui a suggéré l’existence d’autres récepteurs capables de transmettre
un signal co-stimulateur (171). Parmi ceux-ci figurent CD27, CD2, CD5, CD30, OX40 et
ICOS par exemple. Tous semblent influencer le nombre de cellules effectrices ou mémoire
générées à partir d’un lymphocyte T naïf ainsi que leurs fonctions.
Le récepteur CD27 est un membre de la famille des récepteurs au TNF qui est exprimé de
manière constitutive par les lymphocytes T. Son expression est accrue après activation (172).
Son ligand est la protéine CD70 exprimée à la surface des cellules présentatrices d’antigène en
réponse à l’activation via TLR4, TLR9, CD40 et l’IFN
γ (172). Le domaine intracellulaire du
récepteur CD27 s’associe aux facteurs associés au récepteur au TNF (TRAFs) qui lient
l’activation du récepteur aux voies de signalisation inflammatoires. Les TRAFs lient IkBα
(Inhibitor of NFkB α), IKKβ (IkB kinase β) et NIK (NFkB inducing kinase) ce qui active
NFkB (173, 174). Ceci augmente l’expression des molécules anti-apoptotiques Bcl-2 et BclXL qui prolonge la survie cellulaire (175, 176). L’activation du récepteur CD27 joue
également un rôle synergique avec le signal transmis via le TCR dans l’activation de JNK, AP1
37
et NFAT (172). Ceci contribue à la progression du cycle cellulaire, la production de cytokines
(IL-2 et IFNγ) et l’expression des récepteurs aux cytokines (IL -2Rα et IL-12Rβ) amplifiant la
réponse cellulaire à ces facteurs de croissance et différenciation cellulaire (177). Globalement,
le récepteur CD27 contribue à l’expansion de lymphocytes effecteurs et mémoire.
Certains ligands des molécules co-stimulatrices peuvent également transmettre un signal
inhibiteur. Parmi eux, le récepteur CTLA-4 est le mieux connu. CTLA-4 se lie aux molécules
co-stimulatrices CD80 et CD86 exprimées par les cellules dendritiques matures. Ce récepteur
exerce un effet inhibiteur sur les fonctions lymphocytaires (178). Le domaine
intracytoplasmique lie la PI3K activatrice mais également les phosphatases PP2A et SHP-2
inhibitrices. L’activation simultanée de ces voies de signalisation induit l’anergie de la cellule
sans augmenter l’apoptose (179).
La cellule présentatrice d’antigène fournit également un troisième signal sous la forme de
cytokines. Ces dernières vont influencer la polarisation du lymphocyte T CD4+ activé et
l’orienter vers un profil fonctionnel particulier caractérisé par la production de certaines
cytokines. Le troisième signal peut être complété par les cytokines produites par d’autres
cellules qui modifient l’environnement dans lequel le lymphocyte T CD4+ est activé et
influencent donc sa différenciation fonctionnelle.
IV.
Immunomodulation par le CMV
Le CMV a développé de multiples stratégies visant à diminuer la pression exercée par le
système immunitaire de l’hôte sur sa dissémination (180). Plusieurs mécanismes
immunomodulateurs ont été observés dans les cellules infectées comme la réduction de
l’expression du complexe majeur d’histocompatibilité, l’inhibition de la mort cellulaire,
l’inhibition des cellules NK et la production d’analogues de cytokines immunosuppressives.
L’infection des cellules dendritiques est associée à l’altération de leurs fonctions activatrices.
Les mécanismes liés à la dysfonction des cellules dendritiques ont d’abord été étudiés à l’aide
de cellules dendritiques dérivées de monocytes après culture in vitro en présence de
granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (GM-CSF) et IL-4. Une étude à montré que
l’infection est associée à la diminution de l’expression du CMH-I/II (181). Une autre étude a
observé une expression réduite des molécules co-stimulatrices et une production moindre
d’IL-12 (182). Ces deux études ont montré que les cellules dendritiques infectées n’induisent
pas efficacement la prolifération des lymphocytes T.
38
De nombreuses protéines virales diminuent l’expression du CMH-I/II comme US2, US3,
US6, US10, US11, UL82 et UL83. Ces protéines induisent la dégradation des molécules du
CMH par le protéasome ou interfèrent avec leur maturation au niveau du réticulum
endoplasmique (183, 184). Le microRNA viral miR-US4-1 inhibe l’expression d’ERAP1, une
aminopeptidase impliquée dans la dégradation des protéines virales en peptides de longueur
adéquate pour être présenté par le CMH (185). Le CMV est également capable de réduire
l’expression du CMH-II en interférant avec l’activation du promoteur du facteur de
transcription CIITA (Class II transactivator) ou avec les voies de signalisation intracellulaires
induisant l’expression de CIITA (186). Tous ces phénomènes interfèrent avec la présentation
des peptides viraux aux lymphocytes T.
L’expression réduite du CMH-I par les cellules infectées pourrait induire l’activation des
cellules NK. Le génome viral code pour des protéines inhibitrices comme UL18 qui lie le
récepteur inhibiteur ILT2 à la surface des cellules NK ou comme UL40 qui induit
l’expression de la molécule HLA-E dont le ligand est le récepteur inhibiteur NKG2A (184).
D’autres mécanismes inhibent la prolifération des lymphocytes de manière indépendante de la
présentation d’antigènes. La protéine virale UL18 induit une production accrue d’IL-10 et
l’expression de CD83 (187). L’IL-10 est une cytokine qui inhibe les fonctions lymphocytaires
(188). La molécule CD83 peut être libérée sous une forme soluble qui inhibe la prolifération
des lymphocytes T (189). D’autres stratégies d’évasion immune utilisées par le CMV
comportent la sécrétion par les cellules infectées d’un homologue d’IL-10 (190, 191),
l’expression de ligands inhibiteurs comme PD-L1 à la surface des cellules dendritiques
infectées (192) ou l’inhibition de la fonction de la protéine CD45 par la protéine virale UL11
(193).
Malgré les mécanismes d’évasion associés au CMV, les hôtes infectés développent des
réponses immunes caractérisées par l’expansion de lymphocytes T CD4+ et CD8+ capables
de produire des cytokines et d’exercer une action cytolytique. Les données obtenues sur les
cellules dendritiques dérivées de monocytes ne semblent pas refléter exactement la situation
in vivo. Il a été observé que l’infection des cellules dendritiques myéloïdes isolées directement
à partir du sang induit une expression accrue de molécules du CMH (194). La même équipe a
montré que les cellules dendritiques myéloïdes infectées conservent la capacité de stimuler la
prolifération des lymphocytes T et leur différenciation en lymphocytes Th1 (195). Le rôle de
l’évasion immune au cours de l’infection chez l’humain reste donc à préciser.
39
B. Cinétique de la réponse des lymphocytes T CD4+
Après avoir été correctement activés dans le ganglion lymphatique, les lymphocytes T CD4+
prolifèrent. Cette phase d’expansion conduit à l’augmentation de la fréquence de lymphocytes
T dirigés contre les épitopes du pathogène de plusieurs ordres de grandeur (196). Elle dure
quelques jours ou semaines et est suivie par la phase de contraction qui suit l’élimination du
pathogène. Au cours de cette phase, la majorité des lymphocytes T CD4+ spécifiques du
pathogène meurent mais certains survivent et deviennent des lymphocytes mémoire (197).
Ces derniers persistent tout au long de la vie et assurent la protection de l’hôte en cas de
nouveau contact avec le même pathogène. Ils ont une capacité de réponse rapide et limitent
ainsi la réplication du pathogène chez un hôte ayant résolu une primo-infection (197).
Au cours de l’infection primaire par le CMV, l’expansion des lymphocytes T CD4+ a été mise
en évidence chez les receveurs séronégatifs de greffons rénaux de donneurs séropositifs (99).
Cette expansion dure quelques semaines et est suivie d’une phase de contraction. Alors que
pour les infections résolues la fréquence de lymphocytes mémoires reste stable au cours du
temps, une particularité de l’infection chronique par le CMV est l’augmentation progressive
de la population de lymphocytes T CD4+ anti-CMV au cours du temps (198). Ce phénomène
a d’abord été identifié chez la souris pour les lymphocytes T CD8+ et est appelé « memory
inflation ». La réactivation intermittente du virus semble en être la cause. Des lymphocytes T
naïfs sont en effet activés tout au long de la vie de l’hôte infecté et de nouvelles cellules
mémoires s’accumulent progressivement (199). Ce phénomène pourrait contribuer aux
dysfonctions immunitaires observées chez les sujets âgés CMV+ comme une sensibilité
accrue aux infections et une réduction des réponses vaccinales. L’expansion de lymphocytes T
CD4+ spécifiques du CMV pourrait en effet réduire le nombre de lymphocytes naïfs
circulants et la variabilité du répertoire en TCRs différents.
C. Différenciation fonctionnelle du lymphocyte T CD4+
Suite à l’activation du TCR par un complexe peptide-CMH-II, le lymphocyte T CD4+ se
différencie sur le plan fonctionnel. L’environnement en cytokines, la dose et l’avidité de
l’antigène et la co-stimulation présents lors de l’activation jouent un rôle capital dans
l’orientation du lymphocyte T CD4+ vers un profil fonctionnel déterminé (200, 201). Chaque
profil fonctionnel est caractérisé par la production de certaines cytokines ayant des actions
effectrices et/ou exerçant des rétrocontrôles positifs ou négatifs sur la différenciation des
lymphocytes (202, 203).
40
Les lymphocytes Th1 stimulent l’immunité cellulaire et sont responsables de l’élimination de
pathogènes intracellulaires comme les virus, les mycobactéries et les parasites intracellulaires
(Leishmania, Toxoplasma)(204, 205). Ils peuvent aussi être impliqués dans certaines réponses
pathologiques et en particulier dans certains processus auto-immuns. Les lymphocytes T
CD4+ développent un profil fonctionnel Th1 lorsqu’ils sont activés en présence d’IL-12
(203). Ils produisent de l’IFNγ, de la lymphotoxine, de l’IL-2 et du TNFα. Le facteur de
transcription T-bet joue un rôle central dans la production d’IFN
γ c aractéristique du profil
Th1 (206). T-bet stimule l’expression de la sous-unité β2 du récepteur à l’IL -12 et stabilise sa
propre expression. Enfin, T-bet induit l’expression du récepteur de chémokines CXCR3 qui
permet l’accumulation de lymphocytes Th1 dans les tissus périphériques (207).
Les cellules Th2 produisent de nombreuses cytokines (IL-4, IL-5, IL-13), stimulent
l’immunité humorale et interviennent dans l’élimination de pathogènes extracellulaires comme
les helminthes intestinaux. Elles sont également impliquées dans l’asthme et l’allergie lorsqu’ils
stimulent une réponse exagérée envers certains antigènes environnementaux (208). Ce profil
est induit lorsque le lymphocyte T CD4+ est activé en présence d’IL-4. Le facteur de
transcription GATA-3 contrôle l’expression des cytokines IL-4, IL-5 et IL-13 (209, 210).
GATA-3 induit également l’expression du récepteur de chémokines CCR4 et du récepteur de
la prostaglandine D2 CRTh2 (211). Les lymphocytes T CD4+ CRTh2+ isolés ex-vivo
expriment fortement GATA-3, produisent de grandes quantités de cytokines Th2 et
répondent aux allergènes (212, 213).
41
Figure 5
Différenciation fonctionnelle du lymphocyte T CD4+ (101).
Les lymphocytes T CD4+ cytolytiques produisent du granzyme A, du granzyme B, de la
perforine et expriment le ligand de FAS. Ils ont la capacité de détruire les cellules infectées.
L’expression du facteur de transcription eomésodermine est associée à ce phénotype (214).
Les conditions d’activation induisant des lymphocytes T CD4+ cytolytiques sont encore mal
connues mais l’IL-2 semble y participer (214).
Les cellules Th17, induites en présence de TGF
β en combinaison avec l’IL
-6, sont
caractérisées par la production d’IL-17a et d’IL-17f (203, 215). Elles luttent contre les
bactéries extracellulaires et les champignons en stimulant les polynucléaires neutrophiles et
l’inflammation mais participent aussi à certaines pathologies auto-immunes (216). Le facteur
de transcription RORγt contrôle l’expression d’IL-17 et induit l’expression du récepteur de
chémokines CCR6 (217-219). Grâce à l’expression de CCR6, les lymphocytes Th17
s’accumulent dans la peau et l’intestin.
42
Les lymphocytes T follicular helper (Tfh) se différencient en présence d’IL-6 et d’IL-21. Ils
participent à la formation des centres germinatifs et y soutiennent la production d’anticorps
par les lymphocytes B (220).
Les lymphocytes T régulateurs inductibles participent au maintien de la tolérance immune en
régulant l’homéostasie, l’activation et la fonction des lymphocytes. Ils se différencient après
activation en présence de TGFβ et IL-2 (221, 222).
Au cours de l’infection par le CMV, la production de cytokines par les lymphocytes T CD4+
spécifiques du virus a été la mieux caractérisée chez les porteurs chroniques. Des lymphocytes
T CD4+ producteurs de cytokines ont été détectés en réponse à un large panel de protéines
virales (223). Ces cellules sont capables de produire des cytokines après une stimulation de
rappel in vitro par des antigènes viraux. Comme attendu, elles ont un profil Th1 et produisent
de l’IFNγ, du TNFα et de l’IL-2 (224-227).
Au cours de l’infection primaire par le CMV, les lymphocytes T CD4+ producteurs d’IFNγ
apparaissent rapidement chez les receveurs séronégatifs d’un greffon rénal provenant d’un
donneur séropositif (99, 228).
Chez l’hôte immunocompétent, des cellules T CD4+
productrices d’IFNγ sontégalement détectables au cours de l’infection primaire (229). Des
observations réalisées chez des sujets infectés par le VIH et atteint de primo-infection par le
CMV suggèrent que la proportion de cellules productrices d’IL-2 soit plus faible au cours de
l’infection primaire par rapport à celle mesurée chez les porteurs chroniques (229, 230). La
qualité de la réponse immune cellulaire semble donc évoluer au cours de l’infection par le
CMV.
D. Différenciation phénotypique des lymphocytes T CD4+
La polarisation fonctionnelles observée suite à l’activation du lymphocyte T CD4+ est
accompagnée d’une différenciation sur le plan phénotypique. L’expression des molécules de
surface est modifiée afin d’orienter le lymphocyte vers le site le plus propice à son action. En
effet, la réponse immune adaptative est initiée au niveau des organes lymphoïdes alors que les
infections peuvent toucher tous les tissus. Les différentes étapes de différenciation ont été le
mieux caractérisées pour les lymphocytes T CD8+ grâce à l’utilisation de multimères de
CMH-I porteurs de peptides spécifiques. Les caractéristiques principales de la différenciation
semblent toutefois être partagées entre les lymphocytes T CD4+ et CD8+.
Les lymphocytes T CD4+ naïfs sont situés au niveau des organes lymphoïdes secondaires
(ganglions lymphatiques périphériques, plaques de Peyer, rate) où ils entrent en contact avec
43
les cellules dendritiques et peuvent être activés. Ils expriment le récepteur CCR7 qui se lie aux
cytokines chémotactiques CCL19 et CCL21 produites de manière constitutive par les cellules
réticulaires fibroblastiques dans la zone T du ganglion lymphatique et est responsable de la
migration des cellules dendritiques et des lymphocytes T vers la même zone du ganglion
(231). Les lymphocytes T CD4+ naïfs expriment également les récepteurs co-stimulateurs
CD28 et CD27 et l’isoforme RA de la molécule CD45 (232). Les lymphocytes T CD4+ naïfs
se concentrent donc aux endroits où ils sont susceptibles d’être activés et portent à leur
surface les différentes molécules impliquées dans leur activation.
Les lymphocytes T CD4+ spécifiques d’antigènes circulant au niveau du sang périphérique
sont appelés lymphocytes mémoires. Les lymphocytes T CD4+ mémoires sont divisés en
deux grandes catégories (233, 234) selon l’expression du récepteur CCR7.
Les lymphocytes T CD4+ central memory (TCM) expriment les récepteurs CCR7 et CD62L
(L-sélectine) et circulent au niveau des organes lymphoïdes comme les lymphocytes naïfs
(235, 236). L’expression de l’isoforme RO de la molécule CD45 permet de les distinguer des
lymphocytes naïfs. Par rapport aux lymphocytes T CD4+ naïfs, les lymphocytes T CD4+
TCM possèdent un seuil d’activation diminué et sont moins dépendants de la co-stimulation
(237). Après activation, ils expriment la molécule CD40L en plus grande quantité et activent
plus efficacement la cellule dendritique en retour ainsi que le lymphocyte B (233). Les
lymphocytes T CD4+ TCM produisent de l’IL-2, ce qui leur confère une capacité de
prolifération élevée, mais pas de cytokines spécifiques d’un profil Th particulier (238). Les
lymphocytes T CD4+ TCM constituent toutefois une population hétérogène composée de
cellules engagées vers différents profils de polarisation. L’expression membranaire de
récepteurs aux chémokines permet d’identifier le profil fonctionnel que la cellule exprimera
en réponse à une nouvelle stimulation antigénique : l’expression de CXCR3 caractérise les
futures cellules Th1 alors que l’expression de CCR4 est observée sur les futures cellules Th2
(239).
44
Figure 6
Différenciation phénotypique du lymphocyte T CD4+ (240).
Les lymphocytes T CD4+ qui n’expriment pas le récepteur CCR7 et peu ou pas la L-sélectine
sont appelés lymphocytes T effector memory (TEM). Ils expriment des récepteurs aux
chémokines qui leur confèrent la capacité d’infiltrer les tissus enflammés comme CCR4
(peau), CCR9 (intestin), CCR5 et CXCR3 (poumon) (241). Ils possèdent la capacité d’exercer
des fonctions effectrices très rapidement en cas de contact avec leur épitope et produisent des
cytokines ainsi que des molécules cytolytiques (perforine et granzymes)(233).
Il a été montré que l’acquisition d’un phénotype central ou périphérique n’est pas un
processus linéaire et fixe. Les lymphocytes TCM sont capables de se différencier en TEM
après avoir proliféré. A l’inverse, les TEM peuvent également exprimer à nouveau la molécule
CCR7 (242). Il est donc important de considérer la différenciation des lymphocytes T comme
un processus dynamique et la proportion finale des différentes sous-populations comme le
reflet de l’interaction entre le pathogène et le système immunitaire de l’hôte.
Les lymphocytes TEM constituent une population hétérogène sur le plan phénotypique et
fonctionnel. Comme les lymphocytes TCM, les cellules T CD4+ TEM regroupent des
lymphocytes ayant des profils auxiliaires différents caractérisés par l’expression de récepteurs
45
de chémokines: CCR5 et CXCR3 à la surface des lymphocytes T CD4+ Th1 ; CCR3, CCR4
et CRTh2 à la surface des lymphocytes T CD4+ Th2 ; CCR6 et CCR4 à la surface des
lymphocytes T CD4+ Th17 (232). Plusieurs sous-populations peuvent également être
identifiées selon l’expression des molécules CD27 et CD28. Les lymphocytes T CD4+
mémoire effecteurs précoces expriment CD27 et CD28, les lymphocytes T CD4+ mémoire
effecteurs intermédiaires expriment CD28 mais pas CD27 et enfin les lymphocytes T CD4+
mémoire effecteurs terminaux n’expriment ni CD27 ni CD28 (232). Ces trois souspopulations ont des profils fonctionnels spécifiques. La perte d’expression de CD27 et CD28
est associée à l’apparition de molécules cytolytiques comme les granzymes. En particulier, les
lymphocytes T CD4+ CD27- CD28- produisent de la perforine et sont capables d’induire la
lyse de cellules cibles sous contrôle du CMH-II (243). Les lymphocytes T CD4+ CD27CD28- sont également capables de produire de l’IFN
γ et du TNFα mais ne produisent pas
d’IL-2. En accord avec ceci, ces cellules présentent la capacité de prolifération la plus faible
après stimulation in vitro par des antigènes de rappel (238).
La classification des lymphocytes T CD4+ en TCM et TEM (précoces, intermédiaires et
terminaux) permet d’étudier la contribution des différentes sous-populations dans la fonction
globale des lymphocytes T CD4+ spécifiques d’un pathogène. Cette classification ne tient
toutefois pas compte de la durée de vie des lymphocytes. Le concept de mémoire
immunologique repose sur la persistance de cellules immunitaires spécifiques d’un pathogène
en l’absence de celui-ci. Les infections résolues comme influenza et les réponses aux antigènes
vaccinaux sont des modèles qui permettent d’étudier la mémoire immunologique des
lymphocytes. Les infections chroniques ou persistantes sont également associées à l’expansion
de lymphocytes T CD4+ appartenant aux différentes populations définies plus haut mais la
persistance des antigènes ne permet pas de conclure quant à leur caractère de mémoire à long
terme. L’expression du récepteur à l’IL-7 (CD127) est associée à une survie prolongée et
participe au maintien de lymphocytes spécifiques d’un antigène en l’absence de celui-ci (244).
Au cours des infections persistantes, l’activation continue de lymphocytes naïfs semble
contribuer au maintien d’une population de lymphocytes spécifiques circulants indépendante
de l’expression de niveaux élevés de CD127 (199, 245). Ces cellules expriment un phénotype
de cellules mémoire mais ont une durée de vie courte.
E. Différenciation des lymphocytes T CD4+ au cours de l’infection par le CMV
Le phénotype des lymphocytes T CD4+ a été caractérisé de manière exhaustive au cours de
l’infection chronique par le CMV. Chez l’homme, les lymphocytes T CD4+ spécifiques sont
46
distribués parmi les différentes sous-populations précédemment décrites. Des lymphocytes T
CD4+ capables de produire des cytokines en réponse à une stimulation in vitro par des
antigènes du virus sont détectés parmi les TCM et les TEM (225). Au sein des TEM, les trois
sous-populations déterminées par l’expression des molécules CD27 et CD28 sont également
représentées. Une des spécificités de l’infection par le CMV est d’induire des fréquences
élevées de lymphocytes T CD4+ CD27- CD28- (243, 246, 247). La proportion de cellules
CD28- augmente avec l’âge au sein des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV (248). Des
contacts répétés avec les antigènes viraux pourraient être responsables de l’accumulation de
lymphocytes T fortement différenciés au cours du temps. Les lymphocytes T CD4+ antiCMV représentent donc une population hétérogène chez les porteurs chroniques du virus et
ceci est associé à l’acquisition de nombreuses fonctions : production de cytokines,
prolifération intense après stimulation in vitro par des antigènes de rappel et action
cytolytique (240, 249).
La différenciation des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV est moins bien caractérisée
au cours de l’infection primaire. Des observations réalisées chez des individus
immunocompétents (229) et des sujets infectés par le VIH (230) indiquent qu’au cours de
l’infection primaire par le CMV les lymphocytes T CD4+ anti-CMV comportent une
proportion importante de TEM. Il a également été observé que des lymphocytes T CD4+
CD28- apparaissent en quelques semaines après la contamination (250). Une caractéristique
des lymphocytes T CD4+ anti-CMV au cours de l’infection primaire est leur faible capacité
de prolifération in vitro en réponse aux antigènes viraux. En effet, malgré la détection rapide
de cellules spécifiques du virus, plusieurs mois sont nécessaires à l’apparition de réponses
prolifératives (45). L’état de différenciation avancée des lymphocytes T CD4+ spécifiques du
virus pourrait jouer un rôle dans ce phénomène. Les TEM ont en effet une capacité de
prolifération moindre que les TCM.
L’acquisition lente de réponses prolifératives détectables après stimulation de rappel in vitro
est associée à la transmission du virus au foetus en cas d’infection primaire au cours de la
grossesse. Plusieurs études ont montré que ce défaut fonctionnel est plus marqué en cas de
transmission (251-253). L’étude des mécanismes impliqués dans ce défaut fonctionnel
pourrait permettre une meilleure compréhension des interactions entre le système
immunitaire de l’hôte infecté et la réplication virale.
47
F. Fonctions antivirales des lymphocytes T CD4+
I.
Aide aux lymphocytes B
Au cours d’une infection virale, la production d’anticorps neutralisants joue un rôle central
dans l’élimination du virus. La production d’anticorps par les lymphocytes B est contrôlée et
soutenue par les lymphocytes T CD4+. Plusieurs sous-populations de lymphocytes auxiliaires
y participent. Les lymphocytes Tfh sont spécialisés dans l’aide aux lymphocytes B et contrôle
le switch isotypique en produisant certaines cytokines dont l’IL-21 qui favorise la production
IgG1, IgG3 et IgA (254). Leur rôle au cours de l’infection par le CMV reste toutefois mal
connu. Les lymphocytes Th1 prédominent au sein des lymphocytes T CD4+ antiviraux.
L’IFNγ qu’ils produisent soutient la production d’IgG2a qui est l’isotype dominant dans de
nombreuses infections virales chez la souris (255). Les mécanismes moléculaires impliqués
dans l’aide des lymphocytes T CD4+ aux lymphocytes B comportent l’interaction de la
molécule CD40L (exprimée à la surface des lymphocytes T CD4+ activés) avec son ligand,
CD40, exprimé à la surface des lymphocytes B (101). La production d’IL-21 par les
lymphocytes Tfh participe à la différenciation des lymphocytes B en plasmatocytes
producteurs d’immunoglobulines (256). Enfin, l’expression de la molécule ICOS par les
lymphocytes Tfh contribue quant à elle à la formation des centres germinatifs (254).
Le rôle fondamental des lymphocytes T CD4+ dans la génération d’une réponse optimale par
les lymphocytes B au cours de l’infection par le CMV a été mis en évidence dans le modèle
murin. La production d’anticorps est en effet abolie chez les souris infectées après déplétion
en lymphocytes T CD4+ (102). Au cours de l’infection par le CMV chez l’homme, des
anticorps neutralisants dirigés contre le complexe gH/gL/UL128/UL130/UL131, le
complexe gM/gN ou la glycoprotéine gB ont été mis en évidence (257-259).
II.
Aide aux lymphocytes T CD8+
La présence de lymphocytes T CD4+ joue un rôle fondamental dans le développement d’une
réponse optimale par les lymphocytes T CD8+ (260, 261). Les mécanismes impliqués dans
l’aide des lymphocytes T CD4+ aux lymphocytes T CD8+ sont moins bien connus que ceux
de l’aide aux lymphocytes B. L’interaction entre les molécules CD40 et CD40L semble jouer
un rôle central. Elle est à la base du phénomène de « licensing » qui consiste en l’activation
rétrograde de la cellule dendritique par le lymphocyte T CD4+ qu’elle active induisant une
production accrue de cytokines comme l’IL-1, l’IL-6, le TNFα et l’IL-15 (262, 263). Les
cellules dendritiques ainsi activées voient leur capacité de stimuler les lymphocytes T CD8+
accrue. L’importance de ce phénomène au cours des infections virales reste toutefois peu
48
connue. L’absence de lymphocytes T CD4+ a en effet été associée à un défaut de génération
de réponse cytolytique primaire seulement au cours de certaines infections comme celles à
HSV ou influenza (262, 264). La présence de lymphocytes T CD4+ ne semble pas nécessaire
à la génération d’une réponse primaire optimale par les lymphocytes T CD8+ au cours des
infections associées à une activation intense des cellules dendritiques. Le rôle des lymphocytes
T CD4+ est par contre fondamental dans la génération d’une réponse mémoire par les
lymphocytes T CD8+ (260, 261, 265, 266). Ces cellules, lorsqu’elles sont activées en l’absence
de lymphocytes T CD4+, n’acquièrent pas la capacité de proliférer et produire des cytokines
rapidement en cas de nouveau contact avec l’antigène. Elles présentent également une
tendance accrue à l’apoptose liée à l’expression de la molécule TRAIL qui transmet un signal
induisant la mort cellulaire en cas de nouvelle rencontre avec l’antigène (267, 268).
L’activation des lymphocytes T CD8+ en présence de cellules T CD4+ permet également la
génération de lymphocytes T CD8+ exprimant des niveaux moindres de la molécule
inhibitrice PD-1 qui ont une action antivirale optimale (269). Les mécanismes moléculaires
sous-jacents impliquent des contacts indirects via la cellule dendritique ou directs entre les
lymphocytes T CD4+ et CD8+ dans lesquels le couple CD40L-CD40 joue un rôle central
(263, 270). L’action paracrine de l’IL-2 produite par les lymphocytes T CD4+ augmente la
réponse des lymphocytes T CD8+ à une stimulation de rappel par le LCMV murin (271).
L’aide des lymphocytes T CD4+ induit également une expression accrue du CD25 (la chaine
α du récepteur à l’IL -2) à la surface des lymphocytes T CD8+ au cours des infections par le
VSV (272). Les lymphocytes T CD4+ produisent également de l’IL-21 qui diminue
l’expression de TRAIL par les cellules T CD8+ (273). Les populations de lymphocytes T
CD4+ contribuant à une réponse optimale par les cellules T CD8+ restent mal connues. Leur
identification revêt une grande importance dans le développement de nouveaux vaccins.
Au cours de l’infection par le CMV, la présence de lymphocytes T CD4+ est nécessaire à la
survie prolongée des lymphocytes T CD8+. Ceci a été montré après greffe allogénique de
cellules souches hématopoïétiques. Chez les patients atteints d’infection active par le CMV, la
persistance de lymphocytes T CD8+ anti-CMV après transfert adoptif est influencée par la
détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus (98). Plus récemment, une autre étude
a montré une corrélation étroite entre la récupération de la réponse au CMV par les
lymphocytes T CD8+ et la détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques (274). Cette étude
a également montré une association entre la récupération précoce de lymphocytes T CD4+
spécifiques du CMV et l’absence de réactivation virale.
49
III.
Action antivirale directe
Les lymphocytes T CD4+ peuvent exercer une action antivirale directe indépendante de leur
activité d’aide aux autres cellules du système immunitaire. L’acquisition d’un phénotype
effecteur est associée à la capacité de migrer vers les tissus et à des fonctions spécifiques
(275). De nombreux modèles animaux ont permis d’étudier le rôle anti-viral direct des
lymphocytes T CD4+ (101). Deux mécanismes sont impliqués dans cette fonction. La
production de cytokines (IFNγ et TNFα) joue un rôle capital dans l’action des lymphocytes T
CD4+ anti-viraux (276-281). L’IFNγ, par exemple, induit unétat anti -viral dans les tissus
environnants et active les macrophages (282). Le deuxième mécanisme est lié à l’acquisition
d’une activité cytolytique directe au cours de certaines infections et au cours de l’infection par
le CMV en particulier. Cette fonction implique la synthèse de perforine et de granzyme. Il a
été montré qu’elle apparait chez les lymphocytes T CD4+ fortement différenciés (CD27-,
CD28-). Ces cellules sont capables d’exercer une action cytolytique (240, 249) et pourraient
jouer un rôle important dans l’élimination des cellules myéloïdes infectées par le virus. Par
ailleurs, bien que le CMH-II ne soit exprimé de manière constitutive que par les cellules
présentatrices d’antigène professionnelles, son expression est accrue à la surface d’autres types
cellulaires comme les cellules épithéliales en cas d’infection ou d’état inflammatoire (283, 284).
Ceci suggère que l’action des lymphocytes T CD4+ cytotoxiques pourrait contribuer à
l’élimination de virus de manière plus importante qu’attendue.
IV.
Protection contre la réplication virale
Suite à leurs nombreuses fonctions, les lymphocytes T CD4+ exercent une action importante
dans le contrôle de la réplication du CMV. La contribution des lymphocytes T CD4+ dans le
contrôle de l’infection primaire par le CMV a été confirmée chez la souris à l’aide d’anticorps
induisant une déplétion en cellules T CD4+ (102). Chez les souris traitées, des titres de virus
plus élevés sont observés dans la salive et les poumons. Il a également été observé qu’après
déplétion en lymphocytes T CD8+, les lymphocytes T CD4+ sont capables d’acquérir des
fonctions effectrices qui compensent le déficit en cellules T CD8+ et permettent le contrôle
de la réplication virale avec une cinétique comparable (285).
Chez l’humain, des observations réalisées chez les patients immunocompromis ont confirmé
le rôle des lymphocytes T CD4+ dans le contrôle de la réplication virale. Chez les receveurs
séropositifs de cellules souches hématopoïétiques de donneurs séropositifs, le taux de
lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV est plus élevé chez les patients n’ayant pas
nécessité de traitement par rapport à ceux ayant du être traités par ganciclovir (286). Une
50
autre étude a comparé le risque de réactivation du CMV et la reconstitution immune après
greffe allogénique de moelle osseuse ou de cellules souches hématopoïétiques mobilisées par
l’administration de facteurs de croissance (287). Un risque accru de réactivation virale et de
maladie à CMV est observé avec la deuxième technique qui est associée à une reconstitution
retardée de la réponse immune spécifique des lymphocytes T CD4+ (et CD8+). Enfin, après
greffe allogénique de cellules hématopoïétiques de sang de cordon ombilical, la reconstitution
d’une population de lymphocytes T CD4+ CD45RA+ est un des déterminants du contrôle de
la virémie (288). De manière intéressante, la détection précoce de lymphocytes T CD8+
spécifiques du CMV n’était pas associée à la résolution de la virémie dans cette étude. Ceci
illustre de manière supplémentaire le rôle central des lymphocytes T CD4+ dans le contrôle
de la réplication du CMV.
A. Régulation fonctionnelle dans infections persistantes
a. Epuisement
I.
Découverte
L’épuisement fonctionnel (exhaustion) est un phénomène de régulation de la fonction des
lymphocytes T initialement observé sur les lymphocytes T CD8+ en cas d’exposition
prolongée à un antigène. Ce phénomène a été décrit pour la première fois dans un modèle
murin d’infection chronique à LCMV (289). Les lymphocytes T CD8+ dirigés contre les
souches présentant une réplication virale intense et prolongée disparaissaient avec le temps
alors que ceux dirigés contre les souches moins actives persistaient. L’utilisation de
multimères de CMH-I porteurs de peptides a permis par la suite de préciser que les
lymphocytes T CD8+ deviennent non fonctionnels en cas de persistance d’antigène (290).
Plus récemment, des phénomènes de régulation fonctionnelle similaires ont été observés pour
les lymphocytes T CD4+ au cours d’infections persistantes.
II.
Description
L’épuisement des lymphocytes T a été observé dans de nombreuses infections et pathologies
tumorales malignes. Dans ces différents modèles, des lymphocytes T fonctionnels
apparaissent puis perdent leurs fonctions de manière hiérarchique. La capacité de production
d’IL-2 est l’une des premières fonctions qui disparait suivie par la production de TNFα alors
que la capacité de production d’IFNγ est plus résistante à l’inactivation (291-293). Ce
phénomène peut aller jusqu’à l’incapacité totale de production de cytokines, de prolifération
ou de survie. La forme la plus sévère d’épuisement est la disparition des lymphocytes T
51
spécifiques du virus. Malgré leur absence de fonction, les lymphocytes T épuisés expriment
un phénotype de cellules effectrices activées (CD69+) en réponse à une stimulation
antigénique.
La capacité d’un lymphocyte à produire plusieurs cytokines est appelée polyfonctionnalité.
Selon le nombre de cytokines détectées, des cellules quadruples, triples, doubles ou
monofonctionnelles peuvent être observées. L’épuisement des lymphocytes est associé à une
augmentation de la proportion de cellules monofonctionnelles au dépend des
multifonctionnelles. Ceci a été observé au cours de l’infection par le VIH où la persistance de
cellules multifonctionnelles est associée à la protection contre la réplication virale (294-296).
Chez les porteurs chroniques du CMV, les cellules monofonctionnelles produisent moins de
cytokine par cellule par rapport aux cellules doubles ou triples fonctionnelles et expriment des
niveaux plus faibles de CD40L après stimulation (226). Ceci suggère que les cellules
multifonctionnelles soient qualitativement supérieures aux monofonctionnelles. Chez la
souris, l’induction de lymphocytes T multifonctionnels par vaccination est associée à une
meilleure protection contre l’infection par Leishmania major (297).
L’exposition prolongée aux antigènes viraux (ou tumoraux) est le paramètre déterminant
menant à l’épuisement du lymphocyte T. Les interventions visant à réduire la charge
antigénique permettent de restaurer partiellement les fonctions du lymphocyte.
Les bases moléculaires de l’épuisement sont complexes. L’expression de nombreux récepteurs
inhibiteurs comme PD-1, Tim-3, LAG-3 ou CTLA-4 joue un rôle central (298). La perte de
réponse aux cytokines homéostatiques IL-7 et IL-15, la susceptibilité accrue aux cytokines
régulatrices IL-10 et TGFβ et l’influence des lymphocytes égulateurs
T r
sont d’autres
mécanismes pouvant favoriser l’épuisement et dont la contribution reste à définir.
52
Figure 7
Perte hiérarchique de fonction par le lymphocyte T CD8+ épuisé (299).
L’expression de TCRs de faible affinité fonctionnelle pour leurs antigènes est une des
caractéristiques des lymphocytes T épuisés. L’affinité fonctionnelle exprime la sensibilité de la
réponse lymphocytaire à une concentration donnée d’antigène. Des lymphocytes T porteurs
de TCR de haute affinité fonctionnelle verront leur réponse diminuer moins rapidement en
fonction de la dilution de l’antigène par rapport à des lymphocytes T porteurs de TCR de
faible affinité. L’expansion de lymphocytes T CD8+ de haute affinité fonctionnelle est
associée au contrôle de la réplication virale au cours de l’infection par le VIH (300) et
l’hépatite C (301). Chez les sujets infectés par le VIH, l’expansion de clones de lymphocytes T
CD4+ porteurs de TCR de haute affinité fonctionnelle est également associée à une
réplication virale moindre (302). Les déterminants d’une affinité fonctionnelle élevée ne sont
pas encore complètement connus. Chez les individus infectés par le VIH, l’expression de
TCR de haute avidité moléculaire pour les complexes peptide-CMH qu’ils reconnaissent
semble contribuer à la polyfonctionnalité des lymphocytes T CD8+ (303). La modulation des
signaux intracellulaires transmis par l’activation du TCR pourrait également jouer un rôle.
L’expression de récepteurs inhibiteurs influence l’activation des cascades de signalisation
intracellulaires en aval du TCR et pourrait être un des mécanismes par lesquels les infections
53
virales persistantes sont associées à l’expansion de lymphocytes T de faible affinité
fonctionnelle.
III.
PD-1
Parmi les récepteurs inhibiteurs impliqués dans l’épuisement lymphocytaire, le mieux
caractérisé est PD-1. La protéine PD-1 est un récepteur transmembranaire de 288 acides
aminés. La portion intracytoplasmique contient un domaine ITIM (immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif) et un domaine ITSM (immunoreceptor tyrosine-based switch motif)
qui est essentiel dans la fonction inhibitrice de PD-1 (304, 305). La protéine PD-1 est
exprimée transitoirement au cours de la maturation thymique des lymphocytes mais pas par
les lymphocytes T CD4+ naïfs (306). Après activation, l’expression de PD-1 peut être induite
à la surface des lymphocytes T CD4+ et CD8+ et d’autres cellules du système immunitaire
(cellules NK, cellules B, monocytes et certaines populations de cellules dendritiques). En
particulier, l’expression de PD-1 est induite par la stimulation du TCR et reste élevée en cas
d’exposition persistante à un antigène. Les cytokines comme l’IFNα et celles dont les
récepteurs partagent la chaineγ commune
(IL-2, IL-7, IL-15, IL-21) peuvent également
induire l’expression de PD-1 (307, 308). La transcription de PD-1 est régulée par le facteur
NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) au sein des lymphocytes T et les inhibiteurs de
calcineurine inhibent son expression (309).
Les ligands de PD-1 sont B7-H1 (PD-L1) et B7-DC (PD-L2). PD-L1 est exprimé de manière
constitutive par de nombreux types cellulaires : hématopoïétiques (lymphocytes T, cellules
dendritiques, macrophages, mastocytes) et non hématopoïétiques (cellules endothéliales,
cellules épithéliales, cellules pancréatiques, astrocytes, neurones, cellules trophoblastiques,
cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien). L’activation des cellules hématopoïétiques
augmente l’expression de PD-L1 (305). Au contraire, PD-L2 est exprimé de manière
inductible seulement à la surface des cellules dendritiques, des macrophages, des cellules B1
péritonéales, des cellules B mémoires et des mastocytes dérivés de précurseurs médullaires in
vitro. L’affinité de l’interaction entre PD-1 et PD-L2 est trois fois supérieure à celle de
l’interaction avec PD-L1 (305). L’expression des deux ligands est accrue en cas
d’inflammation. Les IFNs de type 1 et 2, le TNFα, l’IL-2, l’IL-7, l’IL-15 et l’IL-10 ont été
montrés capables d’induire ou d’accroitre l’expression de PD-L1/2 (305, 307, 310).
Au cours de la réponse immune, les interactions transmises via PD-1 sont souvent
bidirectionnelles. La fonction de PD-1 est la mieux connue pour les lymphocytes T mais des
effets ont également été observés sur la fonction des lymphocytes B, des macrophages et des
54
cellules dendritiques. La liaison de PD-1 à un de ses ligands inhibe la prolifération, la
production de cytokines, la survie cellulaire et la fonction cytolytique (311). Ces effets sont
particulièrement marqués pour des niveaux d’activation du TCR de faible intensité. PD-1
inhibe l’activation de la PI3K, d’Akt, de ZAP70, de la PKCθ et de Erk (305, 312). La costimulation par CD28 et l’IL-2 peuvent contrecarrer l’inhibition transmise par PD-1. L’IL-2
peut en effet activer Akt et Erk via la protéine de transduction STAT5 (313).
Figure 8
Signalisation intracellulaire en aval des récepteurs de la famille CD28 (312).
Le rôle de PD-1 a été initialement étudié chez la souris au cours de l’infection par différentes
souches de LCMV (Armstrong et clone 13) (314). Alors que la réponse primaire des
lymphocytes T CD8+ aux deux souches est similaire, des différences fonctionnelles
apparaissent dès le huitième jour post-infection. Chez les souris infectées par le clone 13,
l’expression de PD-1 est accrue à la surface des lymphocytes T CD8+ qui perdent la capacité
de produire plusieurs cytokines à la fois. Ces cellules monofonctionnelles sont associées à la
détection de charges virales élevées. L’inhibition de l’interaction de PD-1 avec PD-L1 restore
partiellement la fonction des lymphocytes T et s’accompagne d’une réduction des charges
virales (315). Il a été observé dans un modèle murin de LCMV que l’exhaustion des
lymphocytes T CD8+ est plus marquée en l’absence de lymphocytes T CD4+ (316).
55
Chez l’humain, le rôle de PD-1 dans l’exhaustion fonctionnelle des lymphocytes T CD8+
cytolytiques est bien connu au cours des infections par le VIH et par les virus des hépatites B
et C. Il a été montré que l’expression de PD-1 est accrue à la surface des lymphocytes
cytotoxiques spécifiques du VIH (317). Ex vivo, ces cellules produisent moins de cytokines et
ne prolifèrent pas en réponse à une stimulation de rappel par les antigènes viraux. Le blocage
de la signalisation via PD-1 restaure leur capacité de prolifération et de production de
cytokines (318, 319). L’expression de PD-1 par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques est
plus faible chez les individus présentant une charge virale indétectable (320) et est corrélée à la
charge virale chez les individus virémiques (317). De manière intéressante, les patients
recevant un traitement par HAART présentent une diminution de l’expression de PD-1 à la
surface de leurs lymphocytes cytotoxiques ce qui suggère un rôle de l’exposition aux antigènes
viraux dans l’expression de PD-1 (319). Les hépatites chroniques sont également associées à
l’exhaustion des lymphocytes T cytotoxiques. L’expression de PD-1 est accrue à la surface des
lymphocytes T CD8+ chez les individus atteints d’infection chronique par HBV (321). Ceci
est associé à une production de cytokines moindre et à une faible capacité de prolifération ex
vivo et le blocage de PD-1 induit une augmentation de la prolifération et de la production de
cytokines (322-324). Enfin, au cours de l’infection par HCV également, le blocage de
l’interaction de PD-1 avec ses ligands restaure la fonction des lymphocytes T CD8+ (325).
L’expression de PD-1 à la surface des lymphocytes T CD4+ a également été observée au
cours d’infections virales. Elle est associée à l’exhaustion fonctionnelle des lymphocytes T
CD4+ spécifiques du VIH (317). Comme pour les lymphocytes T cytolytiques, le traitement
antiviral est associé avec une diminution de l’expression de PD-1 (326). Le blocage de
l’interaction entre PD-1 et PD-L1 augmente la production de cytokines et la prolifération des
lymphocytes T CD4+ spécifiques du HIV (327). Certains auteurs ont observé un effet du
blocage de PD-1 sur la prolifération mais pas sur la production de cytokines par les
lymphocytes T CD4+ au cours de l’infection par le VIH (328). Le rôle de PD-1 a également
été étudié chez les sujets atteints d’hépatite. Une étude a montré que le blocage de
l’interaction entre PD-1 et son ligand PD-L1 augmentait la production d’IFNγ et IL-2 par les
lymphocytes T CD4+ chez les individus atteints d’hépatite C (329).
Le rôle du récepteur PD-1 au cours de l’infection par le CMV commence à être étudié. Après
greffe rénale, une association inverse a été observée entre la virémie et l’expression de PD-1 à
la surface des lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus (330). Une observation similaire a
été réalisée après greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques (331). Le rôle de
56
PD-1 sur la fonction des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV n’est pas connu chez
l’hôte immunocompétent.
IV.
Tim-3
La protéine Tim-3 a été découverte en 2002 à la surface de cellules T CD4+ Th1 et CD8+
cytotoxiques (332). Son ligand est la galectine 9 qui en se liant à Tim-3 induit la mort cellulaire
et inhibe la fonction lymphocytaire. Il a été montré que le blocage de l’interaction entre Tim-3
et son ligand in vivo (par l’utilisation d’anticorps bloquants ou une protéine de fusion Tim-3
Ig soluble) exacerbait les manifestations de l’encéphalite allergique expérimentale et du
diabète de type 1 (332, 333). Une sécrétion accrue d’IFNγ a également été observée par les
lymphocytes T activés en présence d’anticorps bloquants (334). Chez l’homme, Tim-3 est
exprimé par les lymphocytes T CD8+ au cours de l’infection par le VIH et associé à une
production de cytokines, une capacité de prolifération et une action cytolytique réduites (335,
336). Chez les individus infectés par le virus de l’hépatite C, l’expression de Tim-3 à la surface
des lymphocytes T cytotoxiques est associée à la persistance du virus et son inhibition
augmente la production de cytokines, la prolifération et l’action cytolytique de ces cellules
(337). Des observations similaires ont été effectuées pour les lymphocytes T CD8+ chez des
patients atteints d’hépatite B (338).
Tim-3 participe au contrôle de la fonction des lymphocytes T CD4+ également. Il est
exprimé et contribue à l’exhaustion des cellules T CD4+ au cours des infections par le VIH
ou par les virus des hépatites B et C par exemple (336, 339, 340). Son rôle au cours de
l’infection par le CMV n’est pas connu.
b. Sénescence cellulaire
La sénescence cellulaire a été décrite dans les années ’60 suite à l’observation de l’arrêt de la
croissance de fibroblastes après de nombreux cycles de réplication (341, 342). L’érosion des
télomères a été identifiée comme une des causes de ce phénomène. Les télomères sont des
séquences répétées situées aux extrémités des chromosomes. Ils se raccourcissent de 50 à 100
bases à chaque cycle de réplication jusqu’au moment où l’extrémité exposée de l’ADN est
reconnue comme une cassure. Ceci entraîne l’activation d’un ensemble de protéines ayant
pour fonction de réparer l’ADN, phénomène appelé DDR (DNA Damage Response). La
sénescence cellulaire peut aussi être la conséquence de la dégradation de l’ADN par des
radicaux libres, des radiations ou l’activation de cascades intracellulaires de stress liées au
manque de facteurs de croissance par exemple. La plupart de ces situations vont mener à
57
l’activation de la DDR. Indépendamment de la cause d’activation de la DDR, lorsque l’ADN
ne peut être réparé la croissance cellulaire s’arrête.
La sénescence cellulaire peut altérer la capacité de prolifération des lymphocytes T humains
(343). La longueur des télomères diminue au cours du processus de différenciation des
lymphocytes T (344). Les lymphocytes T CD27- CD28- présentent les télomères les plus
courts et une capacité de prolifération minime après stimulation de rappel in vitro (345, 346).
Ces cellules restent toutefois capables de produire des cytokines comme l’IFNγ ou le TNFα
et d’exercer une action cytolytique (238). La sénescence des lymphocytes T constitue donc un
état différent de l’épuisement caractérisé par une capacité de prolifération faible associée à la
persistance des autres fonctions effectrices. L’accumulation de lymphocytes T CD4+
sénescents a été observée au cours de l’infection chronique par le CMV (345). Ceci est associé
à l’augmentation de la proportion de lymphocytes T CD4+ CD27- CD28- au sein des cellules
spécifiques du CMV avec l’âge (347). L’influence de la sénescence cellulaire sur la fonction
des lymphocytes T CD4+ au cours de l’infection primaire par le CMV reste toutefois mal
connue.
58
Modèles animaux
Alors que les modèles in vitro d’infection par CMV se sont révélés très utiles à l’étude des
mécanismes de réplication virale ou d’immunomodulation, la découverte des corrélats de
protection contre la réplication virale in vivo nécessaire à la mise au point de vaccins implique
l’étude de modèles animaux plus proches de l’homme.
A. Modèles d’infection par le CMV chez les non-primates
Les trois modèles animaux les plus étudiés chez les non-primates sont le CMV murin, le
CMV du rat et le CMV du cochon d’Inde.
Le modèle murin est probablement le plus utilisé. La pathologie observée chez la souris est
toutefois différente de celle observée chez l’humain. Chez la souris immunocompétente
l’infection est principalement localisée au niveau des glandes salivaires. Chez la souris irradiée,
l’infection est systémique et associée à des dysfonctions d’organes (348). Une autre différence
majeure est l’absence d’infection congénitale dans ce modèle (349). Certains auteurs ont
contourné ce problème en introduisant directement le virus au niveau placentaire. Malgré ces
limitations, le modèle murin a permis d’explorer le rôle de différents compartiments de
l’immunité adaptative dans le contrôle de la réplication virale. Au cours de l’infection
primaire, la déplétion en lymphocytes T CD4+ est associée à une réplication virale plus
intense au niveau des glandes salivaires et des poumons et à une production d’anticorps
effondrée (102). Ceci indique que les lymphocytes T CD4+ jouent un rôle central dans la
réponse à l’infection primaire par le virus. Le rôle des différents compartiments du système
adaptatif dans la protection contre la réactivation virale a été exploré. Il a été montré
qu’environ 70% des souris chroniquement infectées étaient atteintes de réactivation virale
après déplétion simultanée en lymphocytes T CD4+ et CD8+ (350). Ce pourcentage ne
s’élève qu’à environ 4% et 12% en cas de déplétion isolée en lymphocytes T CD8+ ou CD4+
respectivement suggérant un rôle redondant des différentes populations lymphocytaires dans
le maintien du virus à l’état latent. Le phénomène de « memory inflation » associé à l’infection
chronique par le CMV a également été mis en évidence initialement dans le modèle murin
(351). Le rôle de l’activation continue de lymphocytes T CD8+ naïfs et de l’aide des
lymphocytes T CD4+ dans ce phénomène a été mis en évidence (199, 352). L’épuisement
fonctionnel des lymphocytes T n’a pas été exploré dans le modèle murin. Enfin, le modèle
murin d’infection par le CMV a été très utile à l’étude des agents antiviraux.
Le CMV de rat est très semblable au CMV murin. La pathologie qu’il induit est proche de
celle observée chez la souris. Le CMV n’entraine pas d’infection congénitale chez le rat. Au
59
contraire, le CMV traverse le placenta chez le cochon d’Inde ce qui le rend un excellent outil
pour l’étude de l’infection congénitale et l’évaluation de vaccins visant à protéger contre celleci. Certains vaccins dirigés contre la glycoprotéine gB ont démontré leur efficacité dans la
prévention de l’infection congénitale dans ce modèle (353, 354). Comme chez la souris, les
agents antiviraux ont été largement étudiés chez le cochon d’Inde.
La réponse immunitaire au CMV n’a pas été caractérisée de manière exhaustive chez le rat ou
le cochon d’Inde.
B. Modèles d’infection par le CMV chez les primates
Le chimpanzé, le macaque rhésus et le babouin son les trois primates chez lesquels l’infection
par le CMV a été étudiée. Le CMV du chimpanzé est le plus proche du CMV humain mais les
études basées sur ce modèle sont extrêmement chères ce qui en limite l’utilisation.
Parmi les trois modèles cités, l’infection par le CMV chez le macaque rhésus est la mieux
caractérisée. La pathologie associée à l’infection est très proche de celle observée chez
l’homme. Comme chez l’humain, la primo-infection par le CMV est asymptomatique chez le
singe rhésus mais est associée à une morbidité et une mortalité importante chez le singe coinfecté par le SIV (équivalent simien du VIH). La prévalence du CMV atteint près de 100%
chez les macaques rhésus adultes élevés en colonie et le virus semble être acquis au cours des
premières années de vie (355). Alors que l’excrétion virale est faible chez l’humain porteur
chronique, elle reste relativement fréquente chez le macaque rhésus. Une étude a montré
environ 40% de prélèvements salivaires positifs chez des males adultes âgés de 6 à 10 ans
(356). L’infection primaire naturelle par le CMV est mal connue chez le singe rhésus. Une
étude a montré que l’excrétion virale persiste plusieurs années après injection sous-cutanée de
virus chez des singes séronégatifs (357). L’infection primaire par le CMV pourrait donc être
associée à une réplication virale prolongée chez le singe rhésus comme chez l’homme.
L’infection congénitale par le CMV existe mais est difficile à détecter au sein d’une colonie.
L’inoculation intra-amniotique de virus a été utilisée afin d’étudier l’impact de l’infection
congénitale chez le singe rhésus. Il a été montré que l’infection intra-utérine induit des lésions
du système nerveux central particulièrement lorsqu’elle survient au cours du premier trimestre
de grossesse (358).
Comme l’humain, le singe rhésus développe une réponse cellulaire spécifique du virus. Des
lymphocytes T CD4+ producteurs de cytokines en réponse à une stimulation de rappel sont
détectés au niveau du sang périphérique (359). Ces lymphocytes sont dirigés contre plusieurs
60
protéines dont la glycoprotéine gB qui partage 75% de similarité avec son homologue humain
(360). Comme chez l’humain, cette glycoprotéine est la cible d’anticorps neutralisants (361).
Cette observation confirme l’intérêt du modèle d’infection par le CMV chez le singe comme
outil d’évaluation de vaccins potentiels. Le rôle protecteur des lymphocytes T CD4+ a
également été investigué. Dans une étude conduite sur des macaques rhésus co-infectés par le
CMV et SIV (équivalent simien du VIH), une association entre l’absence de réponse
détectable par les lymphocytes T CD4+ et la virémie a été observée (362). Les singes
virémiques présentaient par ailleurs des signes de maladie induite par le CMV. Enfin, il a été
montré qu’au cours de l’infection par le SIV, les lymphocytes T du macaque partagent
certains mécanismes de régulation fonctionnelle avec les lymphocytes T humains comme
l’expression du récepteur inhibiteur PD-1 (363, 364).
Dans l’ensemble, ces observations indiquent que le macaque rhésus pourrait être un modèle
utile à l’étude de la réponse immune cellulaire au CMV.
61
Objectif
62
Le CMV est associé à une morbidité et mortalité importantes chez les sujets
immunocompromis et en cas d’infection congénitale. Les lymphocytes T CD4+ jouent un
rôle central dans le contrôle de la réplication virale en stimulant la production d’anticorps par
les lymphocytes B et la génération d’une réponse optimale des lymphocytes T CD8+. Ils
exercent également des fonctions effectrices directes (production de cytokines et action
cytolytique).
Une des caractéristiques de la réponse des lymphocytes T CD4+ à l’infection primaire par le
CMV est l’expansion rapide de lymphocytes spécifiques du virus mais l’apparition très lente
de réponses prolifératives in vitro après stimulation de rappel. Ce phénomène est plus marqué
chez les femmes enceintes atteintes d’infection primaire dont le foetus est infecté in utero.
Les déterminants de la fonctionnalité réduite observée au cours de l’infection primaire sont
mal connus. Un état de différenciation avancé pourrait y participer. La réponse immune
cellulaire à l’infection primaire par le CMV est en effet caractérisée par une proportion accrue
de lymphocytes TEM par rapport aux porteurs chroniques et l’apparition rapide de
lymphocytes ayant un profil de différenciation terminal. L’épuisement fonctionnel des
lymphocytes pourrait également contribuer aux faibles réponses prolifératives observées car
l’infection primaire par le CMV est accompagnée d’une réplication virale intense et prolongée
qui pourrait induire l’expression de récepteurs inhibiteurs comme dans d’autres infections
virales chroniques.
Le premier objectif du travail est l’étude de l’impact de la différenciation et de l’épuisement
sur la fonction des lymphocytes T CD4+ au cours de l’infection primaire par le CMV. La
fonction et le phénotype des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV ont été explorés chez
des femmes enceintes atteintes d’infection primaire et des porteurs chroniques du virus. Les
lymphocytes T CD4+ dirigés contre d’autres antigènes ont également été étudiés afin
d’évaluer la spécificité antigénique des différences observées. Les résultats sont présentés en
détail dans l’article intitulé « Functional exhaustion of CD4+ T lymphocytes during primary
cytomegalovirus infection ».
Le deuxième objectif du travail est la validation de l’infection naturelle par le CMV chez le
macaque rhésus comme outil d’étude de la réponse cellulaire humaine au virus. Ce primate
très proche de l’homme est naturellement infecté lorsqu’il est élevé en colonie. L’excrétion
virale salivaire et urinaire, la charge virale plasmatique et la réponse des lymphocytes T CD4+
ont été étudiées chez des singes de différentes catégories d’âge. Ce travail a également permis
63
l’étude plus détaillée du lien entre la fonction des lymphocytes T CD4+ et la réplication virale.
Les résultats sont présentés dans l’article intitulé « Postnatal acquisition of primary rhesus
cytomegalovirus infection is associated with prolonged virus shedding and impaired CD4+ T
lymphocyte function ».
64
Résultats
65
Functional exhaustion of CD4+ T lymphocytes during primary CMV
infection
Objectif
L’infection par le CMV est le plus souvent asymptomatique chez les sujets
immunocompétents mais entraine une morbidité et une mortalité importantes chez les
patients immunocompromis et en cas d’infection congénitale. Le virus persiste tout au long
de la vie à l’état latent mais peut se réactiver de manière intermittente ce qui est associé à
l’expansion de lymphocytes T CD4+ ayant des fonctions auxiliaires et cytolytiques.
L’infection primaire est, par contre, caractérisée par une réplication virale intense qui dure
plusieurs mois. De nombreuses études ont montré que l’exposition prolongée à des
concentrations élevées d’antigènes entraine une perte progressive de fonction par les
lymphocytes T appelée épuisement. L’impact de la réplication virale intense observée au cours
de l’infection primaire par le CMV sur la fonction des lymphocytes T CD4+ n’est pas bien
connu. Dans cette étude, la fonctionnalité des lymphocytes T CD4+ a été explorée chez des
femmes enceintes atteintes d’infection primaire et comparée à celle de porteurs chroniques du
virus.
Résultats
Cette étude montre que l’infection primaire par le CMV est associée à la détection de
lymphocytes T CD4+ circulants ayant une faible capacité de prolifération et de production
d’IL-2. Une proportion importante de ces lymphocytes n’exprime pas la molécule costimulatrice CD28 qui joue un rôle central dans la production d’IL-2. Toutefois, la fraction
exprimant le CD28 présente également une sécrétion d’IL-2 moindre au cours de l’infection
primaire. La faible capacité de production d’IL-2 (et de prolifération) fait partie d’une
diminution globale de la production de cytokines au cours de l’infection primaire qui affecte
également la sécrétion d’IFNγ et TNFα et est indépendante de l’expression du CD28. Enfin,
l’affinité fonctionnelle des lymphocytes T CD4+ est moindre au cours de l’infection primaire.
L’expression du récepteur inhibiteur PD-1 contribue au défaut fonctionnel observé comme
l’indique l’augmentation des réponses prolifératives en présence d’anticorps bloquant.
Conclusions
Ces résultats indiquent que l’infection primaire par le CMV est associée à la détection de
lymphocytes T CD4+ ayant une affinité fonctionnelle moindre qu’au cours de l’infection
66
chronique. L’expression du récepteur inhibiteur PD-1 typique des cellules épuisées est l’un
des mécanismes impliqués et pourrait être la cible de stratégies immunomodulatrices visant à
améliorer les fonctions lymphocytaires et le contrôle de la réplication virale.
67
Postnatal acquisition of primary rhesus cytomegalovirus infection is
associated with prolonged virus shedding and impaired CD4+ T
lymphocyte function
Objectif
Les lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV sont rapidement détectés au cours de
l’infection primaire par le virus mais présentent un état d’exhaustion fonctionnelle qui dure
plusieurs mois. Afin d’évaluer l’intérêt du macaque rhésus comme modèle d’infection
primaire par le CMV, l’excrétion virale et la réponse immune cellulaire été étudiées chez des
singes naturellement infectés. En particulier, les charges virales plasmatiques, urinaires et
salivaires ainsi que la réponse des lymphocytes T CD4+ ont été mesurées dans une cohorte
de macaques rhésus stratifiés selon l’âge en nourrissons, juvéniles et adultes.
Résultats
L’infection par le CMV a été observée chez les singes juvéniles et adultes mais pas chez les
nourrissons. L’excrétion urinaire et salivaire était significativement plus fréquente et intense
chez les singes juvéniles par rapport aux adultes. Chez les macaques juvéniles, les lymphocytes
T CD4+ spécifiques du virus étaient moins polyfonctionnels et proliféraient moins
efficacement que chez les singes adultes. Ceci était associé à l’expression accrue du récepteur
inhibiteur PD-1 chez les singes juvéniles. La réponse proliférative des lymphocytes T CD4+
était accrue en cas d’ajout d’anticorps bloquant PD-1 ou d’IL-2 au milieu de culture.
Conclusions
Cette étude montre que l’infection naturelle chez le macaque rhésus est associée à une
excrétion virale prolongée et à l’expansion de lymphocytes T CD4+ ayant une fonctionnalité
réduite. Ces deux caractéristiques sont partagées avec l’infection primaire chez l’homme.
L’infection naturelle chez le singe rhésus constitue donc un modèle potentiellement utile à
l’étude de la réponse au CMV humain.
68
Discussion et perspectives
69
Expansion de lymphocytes T CD4+ dysfonctionnels au cours de
l’infection primaire par le CMV
La réponse immune au CMV a été étudiée au cours de l’infection naturelle chez l’humain et le
singe rhésus. Les caractéristiques fonctionnelles des lymphocytes T CD4+ associées à la
réplication virale active ont été identifiées et les mécanismes régulateurs sous-jacents explorés.
L’infection par le CMV est suivie d’une période de réplication virale intense et prolongée chez
l’homme. La réplication virale n’a pas été étudiée de manière longitudinale au cours du travail
exposé. D’autres études ont suivi la virémie et l’excrétion virale au cours du temps chez des
sujets atteints d’infection primaire. Chez les jeunes adultes immunocompétents infectés par le
CMV de manière asymptomatique, la proportion de sujets virémiques s’élève à presque 80%
16 semaines après l’infection et l’excrétion urinaire persiste chez environ 80% des sujets 24
semaines après la contamination
(45). Une autre étude a suivi la virémie de receveurs
séronégatifs de greffons rénaux provenant de donneurs séropositifs au cours du temps. Les
patients atteints de séroconversion présentent une période de virémie qui dure plusieurs mois
(99). Une mesure de la charge virale plasmatique a été réalisée à l’inclusion chez les femmes
enceintes étudiées dans ce travail. Le pourcentage de femmes virémiques s’élevait à 53% ce
qui est en accord avec les observations précédentes réalisées au cours de l’infection primaire
chez l’humain.
Chez le macaque rhésus, l’âge d’acquisition du CMV et la durée de la réplication virale active
restent mal connus. Une étude a montré que la prévalence du CMV est proche de 100% chez
les macaques rhésus élevés en colonie et que le virus est acquis au cours des premières années
de vie (355). Une autre étude a montré que l’injection sous-cutanée de CMV est suivie d’une
phase d’excrétion urinaire qui dure plusieurs années (357). Dans ce travail, la réplication virale
a été étudiée chez les singes rhésus infectés naturellement. Différents groupes d’âge ont été
comparés (1 an, 2 ans, 3 ans et adultes de plus de 5 ans). La charge virale a été mesurée au
niveau de la salive, de l’urine et du sang. Les résultats obtenus montrent que l’excrétion virale
est particulièrement intense chez tous les singes âgés de 2 et 3 ans alors qu’elle est absente
chez les singes âgés de 1 an et plus faible chez les singes adultes. Ces observations indiquent
que l’âge d’acquisition du virus se situe entre 1 et 2 ans chez les singes de la colonie du
NEPRC. Ces observations soutiennent également que l’infection naturelle par le CMV est
suivie d’une phase de réplication virale intense et prolongée comme chez les singes infectés
artificiellement. Chez les singes adultes, l’excrétion virale est moins fréquente et les titres
viraux mesurés chez les excréteurs sont plus faibles que chez les singes juvéniles. L’infection
70
naturelle des singes rhésus par le CMV constitue donc un modèle d’infection associée à une
réplication virale prolongée, intense pendant les premières années puis partiellement contrôlée
chez les animaux chroniquement infectés.
L’infection naturelle chez l’homme et le singe rhésus partagent donc deux caractéristiques
importantes: la contamination est suivie d’une phase de réplication virale intense et prolongée
dans les deux modèles et la réplication virale diminue chez les porteurs chroniques du virus à
un niveau plus faible que celui mesuré chez les individus atteints d’infection primaire.
Les lymphocytes T CD4+ coordonnent la réponse immune adaptative au CMV : ils
soutiennent la production d’anticorps et la génération de lymphocytes T CD8+ mémoire chez
la souris (102). Les lymphocytes T CD4+ peuvent également acquérir des fonctions
antivirales directes (249). Grace à leurs multiples fonctions, ces cellules jouent un rôle central
dans le contrôle de la réplication virale. La réponse des lymphocytes T CD4+ au CMV a été
étudiée dans les deux modèles utilisés. Les cellules mononucléées ont été isolées à partir du
sang périphérique de femmes enceintes et de macaques rhésus juvéniles atteints d’infection
primaire par le CMV. Les lymphocytes T CD4+ de ces deux groupes partagent un profil
dysfonctionnel par rapport aux lymphocytes T CD4+ des sujets contrôles (porteurs
chroniques du virus et macaques rhésus adultes).
Au cours de l’infection primaire par le CMV, les lymphocytes T CD4+ ont une capacité de
prolifération effondrée en réponse à une stimulation in vitro de rappel par les antigènes
viraux. Ceci est observé chez l’humain et le singe rhésus malgré la présence de cellules T
CD4+ spécifiques du CMV détectables par marquage intracytoplasmique de cytokines. Au
contraire, les réponses prolifératives aux antigènes contrôles mesurées chez l’humain sont
comparables chez les sujets atteints d’infection primaire et les porteurs chroniques du virus.
Le défaut de réponse proliférative atteint, donc, de manière spécifique les lymphocytes dirigés
contre le CMV. Des observations similaires ont été effectuées au cours d’autres infections
virales persistantes comme celle par le VIH ou les hépatites. Chez les individus infectés par le
VIH, une capacité de prolifération réduite par les lymphocytes T CD4+ est observée en cas
de réplication virale active (365, 366). Dans ce modèle, l’infection des lymphocytes par le VIH
pourrait influencer leur capacité de prolifération. Le virus de l’hépatite C n’infecte pas les
lymphocytes T CD4+ et de faibles réponses prolifératives sont également observées chez les
individus évoluant vers une forme chronique de la maladie (367-370). Les infections virales
persistantes sont donc associées à la détection de faibles réponses prolifératives par les
lymphocytes T CD4+. L’infection primaire par le CMV partage cette caractéristique.
71
Chez les sujets infectés par le VIH (371-373) ou atteints d’hépatite chronique (368), l’ajout
d’IL-2 au milieu de culture restaure la prolifération des lymphocytes T CD4+. Le même
phénomène a été observé au cours de l’infection primaire par le CMV chez l’homme et chez
le singe rhésus. Dans les deux cas, en présence d’IL-2 exogène, des réponses prolifératives
comparables ont été mesurées chez les sujets atteints d’infection primaire et les porteurs
chroniques du virus.
Une capacité réduite de production d’IL-2 par les lymphocytes T CD4+ a été mise en
évidence chez les individus infectés par le VIH et virémiques (372-375). Les mêmes
observations ont été réalisées chez les patients atteints d’hépatite C chronique (368, 369).
Dans les deux cas, la dysfonction des lymphocytes T CD4+ est associée à la réplication virale
active. Chez le macaque rhésus infecté par le SIV, la dysfonction des lymphocytes T CD4+
est associée à la virémie et à la progression de la maladie (376). La production d’IL-2 a été
mesurée chez l’homme et le singe rhésus. Une capacité moindre de sécrétion d’IL-2 au cours
de l’infection primaire par le CMV a été mise en évidence chez l’humain. Cette observation
est en accord avec les résultats obtenus chez les individus infectés par le VIH (230) ou les
femmes enceintes (229, 377) au cours de l’infection primaire par le CMV. Comme chez
l’humain, les singes juvéniles présentaient un pourcentage de cellules produisant le l’IL-2
parmi les cellules productrices de cytokines inférieur aux adultes.
Figure 9 (résultats complémentaires)
Production d’IL-2 parmi les lymphocytes T CD4+ en réponse au lysat de CMV chez le singe rhésus.
La production faible d’IL-2 était associée à un défaut global de production de cytokines. Alors
que les fréquences de cellules spécifiques du CMV productrices d’IFNγ et TNFα étaient
comparables chez l’humain au cours des infections primaire et chronique, la quantité de
chaque cytokine produite par cellule était moindre chez les femmes enceintes atteintes
72
d’infection primaire par rapport aux porteurs chroniques du virus. La production d’IFNγ et
de TNFα par cellule était également réduite chez les singes juvéniles par rapport aux adultes.
Figure 10 (résultats complémentaires)
Production d’IFNγ et de TNFα par les lymphocytes T CD4+ chez le singe rhésus en réponse au lysat de CMV.
Au cours de la réponse à un agent infectieux, la capacité à produire différentes cytokines n’est
pas acquise de manière aléatoire. En particulier, les cellules qui acquièrent la capacité de
produire de l’IL-2 sont détectées au sein des cellules capables de produire également de
l’IFNγ et du TNFα. Les cellules T CD4+ productrices d’IL-2 représentent donc une souspopulation de lymphocytes T capables de produire plusieurs cytokines en même temps et
sont polyfonctionnelles. La proportion de cellules T CD4+ productrices d’IL-2 parmi
l’ensemble des cellules productrices de cytokines reflète étroitement le degré de
polyfonctionnalité des cellules spécifiques d’un pathogène. Dans les deux modèles étudiés,
l’infection primaire par le CMV était associée à une polyfonctionnalité moindre des cellules
spécifiques du CMV. Une association entre un degré de polyfonctionnalité faible et un niveau
de réplication virale intense a été observée au cours d’autres infections virales persistantes.
Chez les individus infectés par le VIH et virémiques ou les patients atteints d’hépatite
chronique, les lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus sont moins polyfonctionnels par
73
rapport aux sujets qui ne présentent pas de réplication virale active (294, 295, 378).
Figure 11 (résultats complémentaires)
Etude de la polyfonctionnalité des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV chez l’être humain.
Les proportions des différentes populations fonctionnelles au sein des cellules productrices de cytokines sont
représentées dans la partie supérieure. Les proportions des différentes populations fonctionnelles au sein des
lymphocytes T CD4+ sont représentées dans la partie inférieure.
Dans l’ensemble, ces résultats indiquent que la réponse des lymphocytes T CD4+ à l’infection
primaire par le CMV chez l’homme et le macaque rhésus partagent un profil fonctionnel
caractérisé par une faible capacité de prolifération et de production de cytokines typique des
réponses observées au cours d’autres infections virales persistantes. Ces observations valident
l’infection du macaque rhésus par le CMV comme modèle utile à l’étude approfondie des
mécanismes impliqués dans la maturation fonctionnelle de la réponse immune adaptative au
virus.
74
Déterminants de la fonction réduite des lymphocytes T CD4+
Les déterminants du défaut fonctionnel touchant les lymphocytes T CD4+ au cours de
l’infection primaire par le CMV ont été explorés.
Différenciation
Leur degré de différenciation conditionne la fonction des lymphocytes T. Chaque stade de
différenciation présente un profil fonctionnel spécifique (238). La distribution des
lymphocytes T spécifiques d’antigène parmi les différents stades varie selon le pathogène
contre lequel ils sont dirigés (379). Au cours de l’infection primaire par le CMV, une
proportion accrue de lymphocytes TEM (CCR7-) a été observée parmi les cellules T CD4+
spécifiques du CMV par rapport à l’infection chronique (230). Par ailleurs, les lymphocytes T
effecteurs terminaux (CD28-) perdent la capacité à produire de l’IL-2 et l’expression forcée du
récepteur CD28 rétablit cette fonction (380, 381). L’IL-2 est la cytokine dont la production
est la plus faible au cours de la réponse à l’infection primaire par le CMV. Une particularité de
la réponse immune au CMV est l’accumulation progressive de lymphocytes T CD4+ CD27CD28- (243, 250). La proportion de lymphocytes T CD4+ anti-CMV CD28- a été mesurée
chez les femmes enceintes atteintes d’infection primaire et les porteurs chroniques du virus.
Une proportion significativement plus élevée de cellules T CD4+ spécifiques du CMV
n’exprimant pas le CD28 a été détectée au cours de l’infection primaire. Des études
antérieures ont montré que la proportion de cellules CD28- augmente au sein des
lymphocytes T CD4+ anti-CMV avec l’âge (382, 383). Il a également été observé que la taille
de la population de lymphocytes T spécifiques du CMV augmente avec l’âge (247, 347, 384).
Ceci soutient l’hypothèse selon laquelle des stimulations antigéniques répétées pendant
plusieurs années induisent l’accumulation progressive de lymphocytes T fortement
différenciés. Les observations réalisées au cours de l’infection primaire et présentées dans ce
travail suggèrent que la différenciation des lymphocytes T en cellules CD28- survient
également rapidement en cas de réplication virale intense.
La perte d’expression de la molécule CD28 à la surface des lymphocytes T est considérée
comme un des marqueurs de sénescence cellulaire. La perte de la capacité de prolifération est
la caractéristique principale des cellules sénescentes qui conservent, par ailleurs, la capacité à
produire des cytokines (IFNγ, TNFα) (238). Les observations conduites chez les humains ont
montré que l’ajout d’IL-2 restaurait les réponses prolifératives à des niveaux comparables
chez les sujets atteints d’infection primaire et les porteurs chroniques du virus. La
contribution relative des cellules CD28+ et CD28- aux réponses prolifératives mesurées n’a
75
pas été déterminée. Cependant, il semble peu probable que les lymphocytes T CD4+ CD28+
anti-CMV présents en faible proportion au cours de l’infection primaire contribuent seuls aux
réponses prolifératives mesurées. Ceci suggère que les lymphocytes T CD4+ CD28spécifiques du virus y contribuent également en présence d’IL-2 exogène. Ces observations
indiquent que le défaut de prolifération observé est lié au défaut de production de cette
cytokine mais pas à un déficit de prolifération intrinsèque des lymphocytes T CD4+
spécifiques du CMV. Les résultats présentés permettent également de comparer les cellules T
CD4+ CD28- spécifiques du CMV chez les sujets atteints d’infection primaire et les porteurs
chroniques du virus. Si l’accumulation de lymphocytes T CD4+ CD28- était le déterminant
principal du défaut fonctionnel précédemment décrit, une capacité de production de
cytokines similaire par ces cellules est attendue chez les sujets atteints d’infection primaire et
les porteurs chroniques du virus. Au contraire, elles présentent des caractéristiques très
différentes dans les deux groupes. La production de cytokines par cellule est moindre au
cours de l’infection primaire. L’expression de marqueurs d’activation (CD38, HLA-DR) et la
susceptibilité à l’apoptose sont accrues. Les cellules T CD4+ CD28- anti-CMV présentent
donc, au cours de l’infection primaire, un état activé associé à un défaut de production de
cytokines qui n’est pas typique des cellules sénescentes. Bien que les résultats discutés ne
permettent pas d’exclure que les cellules T CD4+ CD28- spécifiques du virus soient
sénescentes, ils soutiennent l’hypothèse que d’autres mécanismes de régulation fonctionnelle
soient impliqués. La mesure de l’expression d’autres marqueurs de sénescence cellulaire
comme KLRG1 ou CD57 ou la mesure de la longueur des télomères s’avèrent nécessaires
pour statuer sur la contribution réelle de cet état dans le défaut de prolifération observé.
Le rôle de la molécule CD28 sur la réponse des lymphocytes T CD4+ aux antigènes viraux a
été exploré en comparant la qualité de la réponse des cellules CD28+ et CD28- chez les
femmes enceintes et les porteurs chroniques. Comme attendu une très faible production d’IL2 par les lymphocytes T CD4+ CD28- a été observée. De manière inattendue, le pourcentage
de cellules productrices d’IL-2 était moindre également parmi les lymphocytes T CD4+
CD28+ anti-CMV au cours de l’infection primaire. Par ailleurs la quantité d’IFN
γ et TNFα
produite par cellule était réduite au sein des lymphocytes T CD4+ CD28- et CD28+. Dans
l’ensemble, ces résultats soutiennent l’hypothèse selon laquelle des mécanismes régulateurs
indépendants de la différenciation sont impliqués dans le défaut fonctionnel des lymphocytes
T CD4+ observé au cours de l’infection primaire par le virus. Un argument supplémentaire
est apporté par le modèle simien où le pourcentage de cellules CD28- n’est pas accru chez les
singes juvéniles par rapport aux singes adultes.
76
Récepteurs inhibiteurs
Le profil fonctionnel mis en évidence dans les groupes atteints par une réplication virale
intense est comparable au phénotype d’épuisement observé au cours d’autres infections
virales persistantes. Cet état d’altération fonctionnelle, caractérisé par une réduction des
capacités de prolifération et de production de cytokines, est associé à l’expression de
récepteurs inhibiteurs dont les mieux connus sont PD-1 et Tim-3 (299, 385). L’expression de
PD-1 est associée à une faible capacité de prolifération et de production de cytokines chez les
individus infectés par le VIH et virémiques ou chez les patients atteints d’hépatites B ou C
chroniques (299, 317-319, 323, 386-391) . L’expression de Tim-3 à la surface des lymphocytes
T CD4+ est associée à leur exhaustion fonctionnelle au cours de l’hépatite C (339).
L’expression de PD-1 a été mesurée à la surface des lymphocytes T CD4+ anti-CMV chez
l’humain et le singe rhésus. Celle-ci est plus élevée au cours de l’infection primaire par
rapport à l’infection chronique. L’expression de PD-1 semble jouer un rôle dans le défaut de
prolifération associé à la réplication virale intense dans les deux modèles d’infection naturelle
comme l’indique l’augmentation des réponses prolifératives in vitro en présence d’anticorps
bloquant.
Ces résultats sont en accord avec des observations réalisées chez les sujets atteints d’infection
par le CMV après greffe rénale. Une étude a montré que l’expression de PD-1 est accrue à la
surface des lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus et que ceci est associé à un défaut de
prolifération chez les individus virémiques (330). Des observations similaires ont été réalisées
chez les patients receveurs de greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques (331).
Les résultats présentés montrent que ce défaut fonctionnel n’est pas lié exclusivement à la
virémie mais associé à la réplication virale active. Ils montrent également que l’exhaustion des
lymphocytes T CD4+ participe à la régulation fonctionnelle des lymphocytes T CD4+
spécifiques du CMV au cours de l’infection naturelle chez l’hôte immunocompétent.
L’expression de PD-1 est influencée par l’état de différenciation des lymphocytes. Les
lymphocytes T CD4+ CD28+ spécifiques du CMV présentent une expression de PD-1
accrue au cours de l’infection primaire alors que les cellules T CD4+ CD28- présentent des
niveaux d’expression de PD-1 comparables chez les sujets récemment infectés et les porteurs
chroniques. Ces observations sont en accord avec celles réalisées chez les individus infectés
par le VIH. Une étude a montré que l’expression de récepteurs inhibiteurs (PD-1, CTLA-4 et
Tim3) est plus marquée à la surface des cellules CD28+ par rapport aux CD28- (328). Une
autre étude a exploré les mécanismes de régulation de l’expression de PD-1 au cours de
77
l’hépatite B (321). Le rôle des protéines de signalisation JNK, Erk et PI3K/AKT a été
observé. Le récepteur CD28 contribue à l’activation de ces voies de signalisation et pourrait
donc contribuer à l’induction de PD-1. Il a également été décrit récemment que l’expression
de Blimp-1 inhibe l’expression de PD-1 par les lymphocytes T CD8+ au cours de l’infection
aiguë par LCMV chez la souris (392). L’expression de Blimp-1 et la perte d’expression de
CD28 sont caractéristiques des lymphocytes T CD4+ et CD8+ effecteurs fortement
différenciés (393, 394). Ceci pourrait constituer un deuxième mécanisme limitant l’expression
de PD-1 par les lymphocytes T CD4+ CD28-.
Les résultats présentés dans ce travail soutiennent la contribution du récepteur inhibiteur PD1 dans le défaut fonctionnel observé au cours de l’infection primaire. Ce récepteur n’est
cependant pas responsable seul du défaut fonctionnel comme l’indique l’expression accrue de
PD-1 à la surface des lymphocytes T CD4+ CD28+ mais une fonctionnalité réduite des
cellules CD28+ et CD28-. Par ailleurs, le blocage de la signalisation transmise via le récepteur
PD-1 induit une augmentation des réponses prolifératives n’atteignant pas les niveaux
mesurés en présence d’IL-2 exogène. Enfin, le récepteur PD-1 ne semble pas influencer la
production de cytokines comme l’indique l’absence d’effet de l’ajout d’anticorps bloquant lors
de la stimulation de rappel in vitro. Ceci est en accord avec les observations réalisées chez les
patients receveurs de greffe de rein où le blocage du récepteur PD-1 était associé à une
augmentation de la réponse proliférative des cellules T CD8+ spécifiques du CMV sans
augmentation de la capacité de production de cytokines (395). Une autre étude n’a pas
observé d’effet des antagonistes de PD-1 sur la production de cytokines par les lymphocytes
T CD8+ spécifiques du VIH et du CMV chez les sujets infectés par le VIH (318). La même
observation a été réalisée pour les lymphocytes T CD4+ au cours de l’infection par le VIH
(328). D’autres études ont suggéré un effet du blocage de PD-1 sur la production de cytokines
par les lymphocytes T CD4+ au cours de l’hépatite C (329) ou de l’infection par le VIH (327).
Les cytokines ont toutefois été mesurées tardivement au cours de ces études ce qui ne permet
pas d’exclure que l’augmentation observée soit le résultat de la prolifération des cellules
productrices de cytokines.
78
Figure 12 (résultats complémentaires)
Effet du blocage de PD-1 sur la production de cytokines chez l’humain.
Les proportions des différentes populations fonctionnelles au sein des cellules productrices de cytokines sont
représentées dans la partie supérieure de la figure. Les proportions des différentes populations fonctionnelles au
sein des lymphocytes T CD4+ sont représentées dans la partie inférieure de la figure.
Une autre particularité des cellules T au cours des infections persistantes est leur affinité
fonctionnelle réduite. L’affinité fonctionnelle des lymphocytes T CD4+ dirigés contre les
protéines virales pp65 et gB a été étudiée chez l’humain au cours de l’infection primaire et
chez les porteurs chroniques du virus. La production de cytokines diminue plus rapidement
chez les sujets atteints d’infection primaire suite à la dilution de l’antigène ce qui traduit une
affinité fonctionnelle moindre des lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus. Les
mécanismes impliqués dans ce phénomène restent mal connus. L’expression de récepteurs
inhibiteurs modulant la signalisation en aval du TCR pourrait y contribuer. L’expression
accrue de PD-1 n’est observée qu’à la surface des lymphocytes T CD4+ CD28+ spécifiques
du virus. Cette sous-population est minoritaire au cours de l’infection primaire et il est donc
peu probable que le récepteur inhibiteur PD-1 soit responsable du défaut de production de
cytokines observé sur l’ensemble des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV. L’analyse
des courbes de réponse en fonction de la dilution de l’antigène selon l’expression de CD28 ne
permet pas de conclure quant à la contribution de PD-1 au phénomène. En effet, la réponse
des cellules CD28+ décroit plus rapidement en réponse à la dilution de l’antigène par rapport
79
à la réponse des cellules CD28- au cours de l’infection primaire mais également chez les
porteurs chroniques du virus. Par ailleurs, l’affinité fonctionnelle des cellules CD28+ et
CD28- est moindre au cours de la phase primaire par rapport à la phase chronique de
l’infection.
Figure 13 (résultats complémentaires)
Etude de l’affinité fonctionnelle en fonction de l’expression du CD28 chez l’humain.
La régulation fonctionnelle des lymphocytes T CD4+ au cours de l’infection primaire
pourrait impliquer d’autres récepteurs inhibiteurs non recherchés dans ce travail. L’expression
concomitante de plusieurs récepteurs inhibiteurs a été observée à la surface de lymphocytes T
épuisés (338, 396).
Il est possible que les lymphocytes T CD4+ exprimant plusieurs récepteurs n’aient pas été
mis en évidence dans ce travail. L’épuisement consiste en effet en une perte hiérarchique de
fonctions par le lymphocyte T atteint (298, 299). La capacité de prolifération et de production
d’IL-2 sont les premières fonctions abolies. L’absence de sécrétion de TNF
α puis d’IFNγ et
MIP1β caractérise les stades suivant de l’épuisement. Enfin, la mort cellulaire des clones
80
épuisés constitue le dernier stade. La détection des lymphocytes T CD4+ spécifiques
d’antigène basée sur le marquage intracytoplasmique de cytokines ne permet donc pas
d’étudier les cellules les plus fortement affectées. L’existence de lymphocytes T exprimant
plusieurs récepteurs inhibiteurs et ne produisant plus de cytokines au cours de l’infection
primaire par le CMV ne peut être exclue. La mise au point de tétramères permettant la
détection directe de lymphocytes T CD4+ spécifiques de complexes CMH-II-peptides viraux
est nécessaire afin de répondre à cette question.
Autres mécanismes inhibiteurs
D’autres mécanismes de régulations pourraient affecter directement les protéines impliquées
dans la signalisation en aval du TCR comme la surexpression éléments impliqués dans les
boucles de régulation négative, l’expression réduite de protéines de signalisation ou des
modifications post-traductionnelles des protéines du TCR ou en aval (glycosylation)(119). Le
travail d’Ariane Huygens à l’Institut d’Immunologie Médicale a porté sur la régulation de la
cascade intracellulaire de transmission du signal du TCR au cours de l’infection par le CMV
chez le nouveau-né. Une expression réduite des protéines PLCγ1, SLP-76 et LAT, impliquées
dans la transmission du signal intracellulaire en aval du TCR, a été observée au sein des
cellules T CD4+ fortement différenciées. L’hypothèse d’un niveau d’expression différent de
ces protéines au cours de l’infection primaire ou chronique par le CMV reste à investiguer
chez l’adulte.
L’expansion de populations cellulaires inhibitrices est un autre mécanisme qui pourrait
influencer la fonction des lymphocytes T CD4+ au cours de l’infection primaire.
La proportion de lymphocytes T régulateurs CD25+FoxP3+ au sein des lymphocytes T
CD4+ circulants a été mesurée au cours de l’infection primaire et chronique chez l’homme.
La même proportion a été mesurée dans les deux populations. Ces résultats suggèrent que
l’expansion de lymphocytes T régulateurs ne contribue pas au défaut fonctionnel des
lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV au cours de l’infection primaire. Leur rôle ne peut
cependant pas être formellement exclu car la population de lymphocytes T régulateurs
spécifiques du CMV n’a pas été quantifiée.
Les cellules suppressives dérivées de la lignée myéloïde (myeloid derived suppressor cells,
MDSC) constituent une autre population inhibitrice détectée en cas d’infection. Ces cellules
sont définies par l’expression des marqueurs phénotypiques CD33+CD14-CD11b+ ou
CD33+HLA-DR- sans expression de marqueurs de cellules myéloïdes ou lymphoïdes
81
matures. Des cellules myéloïdes suppressives ont également été isolées au sein de la
population CD15+. Elles sont capables d’inhiber la réponse des lymphocytes T à une
stimulation par des cellules présentatrices d’antigènes allogéniques grâce à la production de
facteurs inhibiteurs comme l’arginase 1 ou le NO (397). La proportion de MDSC au cours de
l’infection par le CMV n’a pas été déterminée. L’expansion de cette population pourrait
constituer un autre mécanisme inhibiteur au cours de l’infection primaire.
82
Lien entre la fonction des CD4+ et la réplication virale
Dans les deux modèles étudiés, la détection de lymphocytes T CD4+ dysfonctionnels est
associée à un niveau de réplication virale élevée. Cette association a été la mieux caractérisée
dans le modèle simien. Les singes juvéniles présentent tous une réplication virale intense et
des lymphocytes T CD4+ moins fonctionnels par rapport aux adultes. Les macaques rhésus
adultes constituent un groupe plus hétérogène sur le plan de l’excrétion virale composé
d’animaux n’excrétant pas de virus, d’autres excrétant au niveau salivaire et urinaire et enfin
de certains n’excrétant qu’au niveau d’un site. La comparaison entre singes adultes et juvéniles
soutient l’existence d’une association inverse entre réplication virale et fonction
lymphocytaire. Toutefois, l’impact de l’âge sur le profil fonctionnel des lymphocytes T CD4+
observé ne peut être exclu. Afin d’écarter le rôle de l’âge sur les différences observées, la
relation entre l’excrétion virale et la capacité de prolifération des lymphocytes T CD4+ a été
explorée chez les singes adultes. L’excrétion virale au niveau urinaire était significativement
plus élevée chez les macaques rhésus adultes ayant les réponses prolifératives les plus faibles.
Aucune association n’a par contre été observée entre l’excrétion au niveau salivaire et la
prolifération des lymphocytes T CD4+. Ces observations soutiennent l’existence d’une
association inverse entre réplication virale et fonction des cellules T CD4+ au cours de
l’infection par le CMV indépendante de l’âge. Cette association semble toutefois être
différente en fonction du site de réplication virale. Une différence majeure entre glande
salivaire et rein est le débit sanguin avec lequel ces organes sont perfusés. Le débit au niveau
des artères rénales représente environ 20% du débit sanguin total alors que celui destiné aux
glandes salivaires est nettement moindre. La réplication virale au niveau des reins pourrait
donc avoir un impact plus important sur la fonction des lymphocytes T CD4+ circulants.
L’efficacité du recrutement de lymphocytes au niveau des différents organes, déterminée par
la production locale de chimiokines et l’expression de molécules d’adhésion,
pourrait
également intervenir (241). Enfin, l’efficacité de la présentation d’antigènes aux lymphocytes
T CD4+ est un troisième mécanisme susceptible d’influencer la représentativité des
lymphocytes circulants. En effet, chez la souris, le contrôle de la réplication du CMV au
niveau des glandes salivaires repose entièrement sur les lymphocytes T CD4+ suite à la
répression complète de l’expression du CMH-I (398, 399). Comme pour l’expression du
CMH-I, les mécanismes immunomodulateurs viraux pourraient affecter différemment
l’expression du CMH-II dans différents organes. L’identification des mécanismes impliqués
dans la régulation de la réponse immune au sein de chaque organe s’avère nécessaire pour
répondre à cette question.
83
L’association inverse entre réplication virale et fonction des lymphocytes T CD4+ soulève la
question de la relation causale entre ces deux paramètres.
De nombreuses observations ont montré que l’exposition prolongée à des concentrations
élevées d’antigène induit la perte progressive de fonction des lymphocytes T.
Chez les
individus infectés par le virus du VIH et virémiques, l’instauration d’un traitement antiviral est
associée à la restauration de la fonctionnalité des lymphocytes T CD4+ (400). Cette
observation soutient l’hypothèse selon laquelle l’exposition à des charges antigéniques élevées
induit l’épuisement fonctionnel des lymphocytes T CD4+. Des observations similaires ont été
effectuées chez les patients atteints d’hépatite. Le traitement de l’hépatite B est associé à une
restauration de la fonction des lymphocytes T CD8+ (401-403). Chez les patients atteints
d’hépatite C, l’instauration précoce d’un traitement anti-viral évite l’épuisement des
lymphocytes T CD4+ (370). Des mécanismes similaires pourraient intervenir au cours de
l’infection par le CMV. Le traitement antiviral pourrait donc permettre de limiter l’inhibition
fonctionnelle des lymphocytes T secondaire à l’exposition prolongée à des charges virales
élevées. L’effet du traitement anti-viral sur la fonction des lymphocytes T CD4+ reste mal
connu chez les patients atteints d’infection active par le CMV.
La détection de lymphocytes T CD4+ dysfonctionnels au cours de l’infection active par le
CMV suggère que ces cellules ne soient pas seules responsables du contrôle de la réplication
virale en cas de charge antigénique élevée. D’autres composants du système immunitaire
doivent y contribuer également. Les lymphocytes T CD8+ présentent un profil fonctionnel
similaire à celui des cellules T CD4+ et ne semblent donc pas être les principaux responsables
du contrôle de la réplication virale.
Les cellules T non conventionnelles γδ participentà la réponse au CMV.
Plusieurs travaux
ont montré l’expansion oligoclonale de cellules γδ chez les patients receveurs de greffe
allogénique d’organe solide (404) ou de cellules souches hématopoïétiques (95) et chez le
foetus (97). Ces cellules acquièrent la capacité de lyser des cellules infectées (95, 97). Après
transplantation rénale, l’expansion des lymphocytes γδ
T est associ
ée à la résolution de
l’infection par le CMV (96). Malgré plusieurs observations chez les patients receveurs de
transplantation, le rôle des lymphocytes T γδ reste mal connu chez l’hôte immunocompétent.
Les cellules NK constituent une autre population de cellules pouvant contribuer au contrôle
de la réplication virale. L’expansion de lymphocytes NK a été observée chez les porteurs
chroniques du virus (405) et au cours de l’infection primaire après transplantation d’organe
84
solide (406). Après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques, les cellules NK exprimant
le récepteur NKG2C prolifèrent (407). De manière intéressante, ces cellules présentent une
fonctionnalité accrue lorsqu’elles proviennent d’un donneur porteur du CMV par rapport à
celles provenant d’un donneur séronégatif. Ce phénomène pourrait contribuer à l’effet
protecteur observé chez les patients porteurs du virus recevant une greffe de cellules souches
hématopoïétiques provenant d’un donneur séropositif par rapport à celles récoltées chez un
donneur séronégatif. Une association entre le contrôle de la réplication virale et l’expansion
de cellules NK exprimant le récepteur NKG2C a également été observée après greffe
allogénique de cellules souches hématopoïétiques (408). Enfin, chez un patient dépourvu de
lymphocytes T et atteint d’infection par le CMV, le contrôle de l’infection a été associé à
l’expansion des lymphocytes NK (409). Ces observations suggèrent que les cellules NK
participent au contrôle de la réplication virale. La cinétique d’expansion de cette population
n’a pas été explorée en détail au cours de l’infection primaire chez le sujet immunocompétent.
La dernière question relative à l’association entre réplication virale et fonction des
lymphocytes T CD4+ concerne le mécanisme par lequel les lymphocytes T CD4+ spécifiques
du CMV deviennent fonctionnels lors de la résolution de l’infection primaire. Le niveau
d’inhibition fonctionnelle touchant les lymphocytes T CD4+ pourrait évoluer au cours de
l’infection. Selon cette hypothèse, la diminution de la charge virale pourrait être accompagnée
de la restauration fonctionnelle de lymphocytes T transitoirement dysfonctionnels. Une autre
hypothèse pourrait être le remplacement progressif de lymphocytes T dysfonctionnels par
d’autres activés dans un environnement où la charge antigénique est moindre et dotés d’une
fonctionnalité accrue. Le suivi longitudinal de la composition clonale des lymphocytes T
CD4+ dirigés contre le CMV soutient la seconde hypothèse. En effet, il a été montré que le
turnover clonal est important au cours de l’infection primaire par le CMV et que la population
de lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus observée tôt dans l’histoire de l’infection est
composée de cellules différentes de celle observée après résolution de la phase de réplication
virale active (410). Malgré cette observation, la récupération fonctionnelle de clones épuisés
persistants ne peut être exclue. L’étude longitudinale du répertoire clonal et de la
fonctionnalité des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV au cours de l’infection primaire
par le CMV s’avère nécessaire afin de comprendre les mécanismes impliqués dans l’expansion
de lymphocytes fonctionnels après la résolution de la phase de réplication active.
85
Intérêt de la modulation de la fonction des lymphocytes T dans le
contrôle viral
L’observation de lymphocytes T CD4+ dysfonctionnels associés à la réplication virale active
soulève la question de l’impact de stratégies visant à restaurer la fonction des lymphocytes T
CD4+ sur la réplication virale. En effet, l’administration d’agents antiviraux est associée à une
toxicité importante en particulier rénale et hématologique. L’induction de thrombopénie et
neutropénie expose les patients à des risques hémorragiques et infectieux supplémentaires et
ceci particulièrement chez les patients receveurs de greffe allogénique de cellules souches
hématopoïétiques qui ont une réserve médullaire faible. L’utilisation des lymphocytes T
CD4+ et CD8+ afin de contrôler la réplication virale pourrait permettre de limiter l’utilisation
d’agents antiviraux. L’effet du transfert adoptif de lymphocytes spécifiques du CMV a été
étudié chez les patients receveurs de greffe de cellules souches hématopoïétiques. Chez ces
patients, la reconstitution de réponses dirigées contre le CMV par les lymphocytes T est
associée à la protection contre la maladie à CMV (411, 412). Il a également été montré que le
transfert de lymphocytes T spécifiques du CMV générés in vitro permettait de restaurer
l’immunité contre le virus chez les patients dépourvus de lymphocytes (98, 413, 414). Ces
dernières études ont également montré que l’ampleur de la réponse des lymphocytes T CD8+
décroit au cours du temps en absence de reconstitution de la réponse des lymphocytes T
CD4+. L’expansion de lymphocytes T CD4+ et CD8+ in vivo après transfert adoptif n’est
pas toujours associée à la protection du receveur contre la progression de la maladie à CMV.
Une étude a montré que, malgré une réduction initiale de la charge virale plasmatique chez
tous les receveurs de lymphocytes T spécifiques du CMV, 4 patients sur 15 sont décédés de
complications liées à l’infection virale (415). Trois d’entre eux ne présentaient pas d’expansion
des cellules transférées. De manière intéressante, un des patients décédés présentait une
réponse détectable. Les déterminants des échecs du transfert adoptif restent mal connus. La
caractérisation des mécanismes impliqués dans le défaut de prolifération des cellules
transférées ou dans leur incapacité à contrôler l’infection est capitale. Les récepteurs impliqués
dans l’épuisement fonctionnel des lymphocytes T pourraient être la cible de stratégies
immunomodulatrices visant à renforcer le contrôle de la réplication virale.
L’effet du blocage de la signalisation transmise via le récepteur PD-1 a été investigué dans
plusieurs modèles animaux d’infections persistantes. Chez la souris infectée par le VIH,
l’injection d’anticorps bloquant PD-L1 induit une réduction de la virémie et une
augmentation du taux de lymphocytes T CD4+ circulants (416). La même intervention chez
86
la souris infectée par le virus de l’hépatite B restaure les fonctions effectrices des lymphocytes
T CD8+ intra-hépatiques et accélère le contrôle de la réplication virale (417).
Le rôle de PD-1 dans le contrôle de la réplication du SIV a également été étudié. Il a été
montré que l’injection de d’anticorps bloquant PD-1 est associée à la restauration de la
réponse immune au SIV, à la diminution de la virémie et à l’augmentation de la survie des
macaques rhésus traités (418). Toutes ces études montrent que la modulation de la réponse
immune aux virus par l’inhibition de la signalisation transmise via le récepteur inhibiteur PD-1
est possible.
Les réponses endogènes aux tumeurs sont une autre situation associée à une stimulation
antigénique persistante. PD-1 est également impliqué dans la régulation fonctionnelle des
lymphocytes T infiltrant les tumeurs. Les premières études visant à évaluer l’impact de
l’inhibition de PD-1 sur la réponse anti-tumorale chez l’homme ont été publiées récemment.
L’administration d’anticorps bloquant PD-L1 chez des patients atteints de néoplasies
avancées est associée à une régression du volume tumoral chez 6 à 17% des patients et à une
stabilisation de la pathologie à 24 mois chez 22 à 53% des patients selon la pathologie traitée
et la dose administrée (419). Dans une autre étude, l’utilisation d’anticorps bloquant PD-1 est
associée à un taux de réponse allant jusqu’à 41% (420). Ces études indiquent que l’utilisation
d’anticorps bloquant l’activation du récepteur inhibiteur PD-1 est associée à une amélioration
des réponses immunes chez l’humain. Le rôle de cette approche au cours des infections
persistantes reste à évaluer. Les résultats présentés indiquent que l’infection naturelle par le
CMV chez le macaque rhésus pourrait être un modèle utile afin d’étudier l’effet de
l’administration d’anticorps bloquant la signalisation via le récepteur PD-1 sur la réplication
virale.
La limitation principale de cette approche est liée au rôle du récepteur PD-1 dans le contrôle
de l’auto-immunité. Les souris déficientes pour PD-1 développent une atteinte auto-immune
systémique ressemblant au lupus érythémateux humain (glomérulonéphrite et arthrite) et une
cardiomyopathie dilatée dans les populations C57BL/6 et BALB/C respectivement (421423). Elles constituent également un modèle utile à l’étude du diabète de type 1 (424). Dans
un modèle murin de myocardite auto-immune expérimentale, les souris déficientes pour PD-1
présentent des lésions plus sévères que celles exprimant normalement PD-1 (425). Chez
l’humain, les premières études sur l’utilisation de bloquant de la voie de signalisation de PD-1
sont en cours chez des patients atteints de néoplasies non contrôlées. Les effets indésirables
liés aux traitements par anti-PD-1 ou anti-PD-L1 comportent certaines atteintes d’organes
87
comme les pneumonies, les colites, les hépatites, les hypophysites, les thyroïdites et le vitiligo
(419, 420). Ces pathologies semblent être liées à des phénomènes auto-immuns.
Dans le cadre de la greffe de cellules souches allogéniques, une des complications majeures
liée au traitement est la maladie du greffon contre l’hôte au cours de laquelle les lymphocytes
T du donneur réagissent contre les tissus du receveur. Ceci constitue un autre exemple de
stimulation antigénique persistante où le récepteur PD-1 pourrait jouer un rôle inhibiteur
cette fois bénéfique pour le patient. Le rôle de PD-1 dans le contrôle de la réaction du greffon
contre l’hôte n’est pas complètement connu. L’expression de PD-1 à la surface des
lymphocytes T alloréactifs a été observée chez la souris et chez l’homme (331, 426). Le rôle
régulateur de PD-1 au cours de la maladie du greffon contre l’hôte a été étudié dans le modèle
murin. L’expression accrue de PD-L1 dans le tissu cardiaque par rapport à l’iléon semble le
protéger contre la destruction tissulaire associée à l’infiltration par des lymphocytes T CD4+
(427). Une autre étude a montré que les deux ligands de PD-1 ne contribuent pas de manière
égale à l’inhibition de la réponse : PD-L2 semble en effet jouer un rôle prédominant dans
l’inhibition fonctionnelle des lymphocytes T CD8+ alloréactifs (428). En accord avec cette
observation, une autre étude a montré que l’administration d’anticorps bloquant PD-L1 n’est
pas associée à une aggravation de la maladie du greffon contre l’hôte (429). Afin d’évaluer le
risque d’exacerbation de maladie du greffon contre l’hôte lié à l’administration d’anticorps
bloquant la signalisation via PD-1, l’étude exhaustive du rôle de PD-1 et de ses ligands au
cours de cette pathologie est nécessaire.
Une autre limitation à l’utilisation d’anticorps bloquant la voie de signalisation de PD-1
pourrait être l’augmentation de la pathologie immune associée à la réponse au virus.
L’immunopathologie regroupe l’ensemble des lésions causées par la réponse immune à un
pathogène. Certains pathogènes n’induisent pas de lésions sévères directement mais stimulent
intensément le système immunitaire de l’hôte infecté qui à son tour contribue à la destruction
tissulaire. Les mécanismes de régulation fonctionnelle jouent un rôle bénéfique. Ce
phénomène a été décrit au cours de l’infection par le virus de la grippe au cours de laquelle
l’activité excessive des lymphocytes T CD8+ est responsable de pneumonies parfois
mortelles. Chez les souris infectées, l’expression de récepteurs Tim-3 porteurs de mutations
amplifiant leur action inhibitrice à la surface des lymphocytes T CD8+ est associée à un
meilleur pronostic (430). Toujours dans le modèle murin, l’expression du récepteur PD-1 joue
un rôle protecteur au cours de l’hépatite (431) et de la tuberculose (432). Le rôle du récepteur
PD-1 dans la limitation de l’immunopathologie associée à l’infection par le CMV n’est pas
88
connu. L’administration d’anticorps bloquant aux macaques rhésus naturellement infectés
permettra de répondre à cette question.
Les résultats présentés dans ce travail apportent une contribution à la compréhension des
mécanismes impliqués dans la régulation fonctionnelle de la réponse des lymphocytes T
CD4+ au cours de l’infection par le CMV. La poursuite de l’étude de ces mécanismes
permettra l’utilisation de stratégies immunomodulatrices visant à limiter la réplication virale
chez les sujets atteints d’infection non contrôlée.
89
Thèse annexe
90
Les cellules de la leucémie lymphoïde chronique sont apparentées aux
lymphocytes
B1 effecteurs
naturels :
implications
thérapeutiques
potentielles
La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est une maladie lymphoproliférative caractérisée par
l’accumulation de lymphocytes matures exprimant le phénotype CD5+, CD23+, CD20+. Elle
constitue la leucémie la plus fréquente chez l’adulte en Occident. La LLC est une pathologie
hétérogène au niveau moléculaire et fonctionnel. Les cellules de LLC peuvent exprimer des
immunoglobulines ayant subi des mutations somatiques (mutated, LLCm) ou non
(unmutated, LLCu). Cette distinction a une valeur pronostique. En effet, les LLCu ont une
évolution plus rapide et un comportement plus agressif que les LLCm (433). De nombreuses
autres mutations affectant des protéines impliquées dans diverses fonctions cellulaires
(signalisation intracellulaire en aval du BCR ou du TLR, réparation de l’ADN, remodelage de
la chromatine, épissage de l’ARN) ont été décrites (434). Afin de comprendre quelles sont les
mutations principales impliquées dans l’oncogenèse, l’identification de la population cellulaire
dont les cellules leucémiques dérivent revêt une grande importance. L’expression
d’immunoglobulines mutées ou non suggère que les cellules de LLCm dérivent de
lymphocytes B ayant été activés au sein d’un centre germinatif et que celles de LLCu dérivent
de lymphocytes B n’ayant pas transité par le centre germinatif. Par ailleurs, l’expression de la
molécule CD5 par les cellules leucémiques a longtemps été considérée comme l’expression
aberrante d’un marqueur de lymphocyte T. Toutefois, des lymphocytes B CD5+ peuvent être
détectés dans le sang de sujets sains. Une étude de profil d’expression génique a montré que
les progéniteurs de cellules leucémiques appartiennent à cette population. Les lymphocytes B
CD5+ circulants constituent une population hétérogène contenant des cellules CD27- et
CD27+. Des cellules exprimant une immunoglobuline mutée ou non peuvent également y
être détectées. Au sein des lymphocytes B CD5+, les lymphocytes B1 effecteurs naturels
récemment identifiés chez l’homme présentent un phénotype proche de celui des cellules de
LLC (CD5+, CD27+, CD43+) et pourraient en être la population d’origine (435).
L’objectif du travail est d’identifier la population dont les cellules de LLC dérivent afin de
mieux en comprendre les mécanismes oncogénétiques.
La première phase de travail visera à préciser le phénotype des différentes populations
contenues dans la fraction CD5+ chez les sujets sains. En particulier, au sein des lymphocytes
B CD5+ CD27+, des marqueurs spécifiques de lymphocytes B1 ou de lymphocytes B
91
mémoires seront recherchés. L’expression de molécules exprimées à la surface des cellules
leucémiques (CD25, CD69, CD71) sera mesurée sur les trois sous-populations de
lymphocytes B CD5+ observées chez les sujets sains (436). L’identification de marqueurs
exprimés de manière spécifique sur les cellules leucémiques ou les cellules saines permettra
d’approfondir la comparaison de ces cellules chez des individus atteints de LLC. Au cas où
une distinction phénotypique nette entre cellules saines et cellules leucémiques ne serait pas
mise en évidence, la suite du projet comparera les cellules leucémiques avec les différentes
populations CD5+ provenant de sujets sains.
La deuxième phase du projet consistera en l’étude du profil d’expression génique par
microarray après séparation des différentes populations par tri cellulaire. L’analyse des
résultats en composantes principales devrait permettre d’identifier la population CD5+ saine
dont les cellules leucémiques sont les plus proches. L’analyse des gènes différemment
exprimés entre les cellules leucémiques et leurs cellules d’origine devrait permettre de préciser
les mécanismes impliqués dans l’oncogenèse. Cette approche pourrait être complétée par la
comparaison du génome et/ou de la méthylation de l’ADN de ces populations cellulaires.
Ce travail devrait permettre une compréhension précise des mécanismes impliqués dans
l’oncogenèse de la LLC et servir de base à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
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120
Curriculum vitae
Pierre Antoine
Born on 17 May 1979, Ixelles (Belgium)
Education
Special competence in Haematology (2012-2014)
- Université Libre de Bruxelles, Belgium
- Ongoing
Specialisation in Internal Medicine (2005-2012)
- Université Libre de Bruxelles, Belgium
- Internal Medicine Specialist title obtained in September 2012 (summa cum laude)
Researcher (2007-2011)
-
Institut d’Immunologie Médicale, Charleroi, Belgium
-
Supervisor : Docteur Arnaud Marchant
-
Title of the project : Cellular immune response to primary CMV infection
-
PhD obtained in October 2014
MD student (1998-2005)
-
Université Libre de Bruxelles, Belgium
-
MD degree obtained in June 2005 (magna cum laude)
Succeeded at the entry exam to the Faculty of Applied Sciences in 1998
High school (1993-1998)
-
Liceo Scientifico E. Torricelli, Faenza, Italy
121
Working experience
Physician
-
Hôpital Molière (April 2014 – now)
Assistant physician in Haematology (2012-2014)
-
Hôpital Erasme, Bruxelles (April 2012 – September 2012): general haematology
-
Institut Jules Bordet, Bruxelles (October 2012 – March 2014): bone marrow transplantation
Specializing physician in Internal Medicine (2005-2012)
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Hôpital Erasme, Bruxelles (October 2011 – September 2012)
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Hôpital Saint-Pierre, Bruxelles (April 2007 - September 2007)
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Institut Jules Bordet, Bruxelles (October 2006 - March 2007)
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Hôpital Tivoli, La Louvière (October 2005 - September 2006)
Researcher funded by the Fonds National de la Recherche Scientifique (2007 – 2011)
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Institut d’Immunologie Médicale, Charleroi (October 2007 – September 2011)
Publications
Virological and immunological correlates of mother-to-child transmission of cytomegalovirus
in the Gambia
Kaye S, Miles D, Antoine P, Burny W, Ojuola B, Kaye P, Rowland-Jones S, Whittle H, van
der Sande M, Marchand A.
J Infect Dis. 2008 May 1;197(9):1307-14
Functional Exhaustion of CD4+ T Lymphocytes during Primary Cytomegalovirus Infection.
Antoine P, Olislagers V, Huygens A, Lecomte S, Liesnard C, Donner C, Marchant A.
J Immunol. 2012 Sep 1;189(5):2665-72.
122
Pseudohyperkaliémie et hyperleucocytose
Goubella A, Thooft A, Antoine P, Créteur J, Vincent J-L.
Rev Med Brux 2013 ; 34 :179-80
Postnatal acquisition of primary rhesus cytomegalovirus infection is associated with
prolonged virus shedding and impaired CD4+ T lymphocyte function.
Antoine P, Varner V, Carville A, Connole M, Marchant A, Kaur A.
J Infect Dis. 2014 Oct 1;210(7):1090-9.
CD4+ T lymphocyte response to primary CMV infection
Antoine P, Olislagers V, Lecomte S, Liesnard C, Donner C, Marchant A
Retrovirology 2009, 6(Suppl 1) : P7 (22 July 2009)
Experience abroad
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April – September 2010 and March-April 2011 : New England Primate Research Center (Harvard
Medical School, Boston, USA), research fellowship aiming at characterising the cellular
immune response to CMV in rhesus macaques.
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February 2007 : Ouadane (Mauritania), physician for the association Désert et Santé providing
free care to the local population.
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March 2005 - May 2005 : Medical Research Council Center (Fajara, The Gambia), research project
entitled « Immunological determinants of CMV transmission from mother to child »
supervised by Pr Michel Goldman.
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August 2002 : Centre Hospitalier National Yalgado Ouedraogo in Ouagadougou (Burkina Faso),
medical student in the Infectious Diseases and Cardiology departments.
Prices
Prix Fleurice Mercier 1999
Prix Pfizer Educational Grant 2012
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Meetings
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Two posters presented at the « 13th International CMV and betaherpesvirus workshop »
(Nuremberg, Germany, 14-17/05/2011)
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One poster presented at the « 4th Measurement of Antigen-Specific Immune Responses »
(Mykonos, Greece, 9-13/06/2010)
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Oral communication at the joined EMBO-ENII meeting entitled « Tackling and Imaging the
Complexity of the Immune Systems » (Capo Caccia, Sardinia, Italy, 20-24/04/2009)
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One poster presented at the « 2nd European Congress of Immunology » (Berlin, Germany, 1316/09/2009)
Languages
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French : mother tongue
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Italian : fluent (residence and education in Italy between 1988 and 1998)
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English : fluent
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