V - Arpege

Date : 27/03/2012
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Introduction au RET et à ses applications pour
étudier les interactions protéine-protéine
V – APPLICATION DES TECHNIQUES DE RET A L’ANALYSE DES INTERACTIONS PROTEINE-
PROTEINE : CAS DES RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G (RCPG)
Les RCPG sont des protéines à sept domaines transmembranaires exprimées au
niveau de la membraneplasmiquedescellules.Al’interfaceentrelemilieuextra- et
intracellulaire, ces récepteurs assurent la reconnaissance de stimuli extracellulaires
et initient en réponse des cascades d’événements intracellulaires. Les RCPG ont
longtemps été considérés comme des récepteurs présents à la membrane
uniquement sous forme de monomères. Les avancées techniques de RET et les
nombreux travaux réalisés dans le domaine de la réceptologie ont toutefois permis
de remettre en question ce dogme. Il a ainsi été proposé que les RCPG pouvaient
être aussi exprimés à la membrane plasmique sous forme d’oligomères. La notion
d’oligomérisation est un terme général qui décrit l’association de protéines au sein
d’un même complexe. La structure minimale d’un oligomère s’organise autour de
deux protéines formant un dimère. Une association en homodimères correspond à
une interaction entre deux protéines identiques et une association en hétérodimères
à deux protéines différentes. Cependant, les techniques d’analyse de RET ne
permettent pas toujours de distinguer les formes dimériques des autres formes
oligomériques (trimères, tétramères, etc.).
L’objetdecechapitreestde présenter les avantages et les limites des méthodes de
RET les plus couramment utilisées pour mettre en évidence des interactions
protéine-protéine.Deplus,nousdiscuteronsbrièvementdel’influencedelatailleet
du positionnement des sondes fluorescentes par rapport à la taille des complexes
protéiques étudiés etparrapportautransfertd’énergie.
A/ LES FLUOROPHORES ORGANIQUES EN FRET ET TR-FRET
24
Les fluorophores organiques sont de petites molécules qui nécessitent d’être
couplées soit à des groupements réactifs (TétraCystéine FlAsH par exemple)
lesquels vont réagir directement avec la protéine cible, soit couplés à des « sondes »
(anticorps, SNAP-tag, Halo-tag, etc.). Leur utilisation en RET implique donc d’utiliser
des méthodes qui permettent de marquer spécifiquement les protéinesd’intérêtavec
24
Voir la revue Cottet M et al., Frontier in Endocrinology 2012.

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des fluorophores soit donneur soit accepteurd’énergie
25
. Nous ne décrirons ici que
les techniques couramment utilisées sur la plateforme ARPEGE.
 Les sondes de type anticorps
Les anticorps couplés à des fluorophores (anticorps fluorescents) sont utilisés depuis
de nombreuses années en microscopie de fluorescence et en cytométrie de flux.
Depuis les années 2000, les anticorps sont également utilisés comme sondes
fluorescentes pour étudier en RET l’oligomérisation des Récepteurs Couplés aux
Protéines G (RCPG) à la surface cellulaire
26
. La grande diversité des anticorps et
leur facilité de marquage avec des molécules fluorescentes en font un outil très
puissant pour ce genre d’analyse.
Principe de la méthode :
Casdel’homodimérisation
Des cellules exprimant le récepteur membranaire d’intérêtsontincubéesavecdeux
anticorps monoclonaux portant respectivement les fluorophores donneur et
accepteurd’énergie. Cesdeux anticorps sont soit dirigés contre le même épitope
27
(étude d’homodimères) soit dirigés contre deux épitopes différents (étude
d’hétérodimères). Si les deux anticorps marqués d’un fluorophore donneur et
accepteur sont dirigés contre le même épitope, il est nécessaire de les utiliser à la
même concentration afin de ne pas favoriser le marquage du récepteur par un
anticorps plutôt que l’autre
28
. Sous cette condition, les deux anticorps donneur et
accepteur d’énergie ont la même probabilité de marquer les récepteurs d’intérêt.
Ainsi, statistiquement 50% des homodimères seront marqués avec un anticorps
donneuretaccepteurd’énergiealorsque25%seront marqués avec deux anticorps
donneur et 25% avec deux anticorps accepteurs d’énergie(Figure 34).
25
Hinner MJ and Johnsson K, Curr Opin Biotechnol. 2010.
26
Maurel D et al., Anal Biochem. 2004.
27
Unépitopeestlapartied’unantigènereconnueparunanticorps.Danslecasdel’étudedel’oligomérisation
des RCPG les épitopes sont souvent de petites étiquettes ou tag (HA, FLAG, etc.) insérées au niveau de la
séquence codante du domaine N-terminal des RCPG.
28
On considère que le marquage chimique d’un même anticorps avec un fluorophore donneur ou accepteur
d’énergienemodifiepasl’affinitépoursonépitope.

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Donneur Accepteur
Donneur Donneur
Accepteur Accepteur
RET
Pas de RET
Pas de RET
50%
25%
25%
Figure 34. Etude del’homodimérisation des RCPG avec des anticorps fluorescents en RET. Le
signal de RET mesuré représente 50% des homodimères présents à la membrane. 25% des
homodimères sont respectivement marqués soit avec deux anticorps donneur soit avec deux
anticorps accepteurs d’énergie qui ne permettent pas untransfertd’énergie.
Casdel’hétérodimérisation
Pour étudier des hétérodimères de RCPG, deux anticorps monoclonaux distincts
portant les fluorophores donneuret accepteurd’énergie sont généralement utilisés.
Les affinités des deux anticorps pour leurs épitopes respectifs peuvent être
différentes et doivent donc être déterminées au préalable en réalisant des courbes
de saturation
29
.
Dans le cas où les deux anticorps ont la même affinité pour leur cible alors 100% des
hétérodimères seront ciblés par un anticorps donneur et un anticorps accepteur
d’énergie (Figure 35). L’efficacité du marquage, correspondant au nombre de
récepteurs sur lesquels se fixe un anticorps, dépenddel’affinitédesanticorpspour
leurs épitopes. Cette efficacité peut être optimisée en faisant varier la concentration
des anticorps et/ouletempsd’incubation.
29
Lescourbesdesaturationconsistentàincuberjusqu’àl’équilibredescellulesexprimant lerécepteurd’intérêt
avecdesconcentrationscroissantesd’anticorps.Descellulesn’exprimantpaslerécepteur (cellules Mock) sont
utilisées pour déterminer le marquage non spécifique desanticorpssurlescellules.Unefoisl’équilibreatteint,
les cellulessontlavéesetlesignalspécifiquedéterminé.LeKd(constantededissociation)del’anticorpspoursa
cibleest déterminéenreprésentantlesignal spécifiqueenfonctionde laconcentrationd’anticorpsutilisée.A
l’équilibre,lesvitessesd’association et de dissociation des anticorps sur leur épitope sont égales.

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Donneur Accepteur
RET
100%
Figure 35. Etude del’hétérodimérisation des RCPG avec des anticorps fluorescents en RET. Le
signal de RET mesuré représente 100% des hétérodimères co-marqués (+/- bruit de fond).
N.B. : si les récepteurs étudiés ne forment pas que des hétérodimères (existence de
monomères, homodimères, etc.) toutes les paires d’anticorps ne donneront pas un
signal de RET. D’autrepart,sil’affinitédel’anticorps pour son épitope se situe autour
du nanomolaire (nM), il faudra incuber les cellules avec une concentration
d’anticorpsautourde10 nM (équivaut à 1.5 g/ml)
30
pour être saturant àl’équilibre
31
c’estàdirepourmarquer 90% des épitopes (récepteurs). Enfin, la gêne stérique peut
diminuerl’accessibilitédesépitopesauxanticorps.
Avantages de cette méthode :
Les anticorps monoclonaux utilisés dans les techniques de RET sont généralement
dirigés contre de petites étiquettes (ou tag) de 6 à 15 résidus (HA, myc, FLAG, 6his,
etc.). L’impactdecesétiquettessurlaconformationdesrécepteursestgénéralement
faible surtout lorsque celles-ci sont insérées au niveau des domaines N-terminaux
des récepteurs de type RCPG. De plus, les anticorps disponibles dans le commerce
présentent de bonnes affinités pour leurs épitopes ce qui permet de les utiliser à de
faibles concentrations (1 – 10 nM) réduisant ainsi les problèmes de marquage non
spécifique des cellules.
Danslecadredel’étudedesphénomènesd’oligomérisationdesRCPG,l’utilisation
d’anticorps fluorescents est un atout. En effet, les anticorps sont incapables de
traverser la membrane plasmique et par conséquent, seuls les récepteurs exprimés
30
Lamassemolaired’unanticorps de type IgG est de 150000 g/moles.
31
Ilaétémontréquel’équilibreestatteintauboutde8hà4°Cpourunanticorpsanti-HA-Alexa647 utilisé à 3
nM sur le récepteur HA-V1a (Albizu L. et al., J. Med. Chem. 2006).

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Noyau
Golgi
à la surface des cellules, sont reconnus. Ainsi, les récepteurs intracellulaires encore
engagés dans les voies de synthèse ne sont pas marqués (Figure 36).
Figure 36. Etude de la dimérisation des RCPG avec des anticorps fluorescents en RET. Le
signal de RET mesuré provient uniquement de récepteurs exprimés à la surface des cellules qui ont
été marqués avec des anticorps fluorescents.
CettetechniquepeutêtreutiliséeenFRETclassiquevial’utilisationdefluorophores
organiques ou en TR-FRETvial’utilisationdecryptatesdelanthanide (chapitre IV).
Limites de cette méthode :
Les anticorps sont de grosses molécules de 150 KDa qui peuvent potentiellement
perturber le fonctionnement des récepteurs cibles. Leur taille peut aussi avoir une
influence sur les analyses de RET. Schématiquement un anticorps de type
immunoglobuline G (IgG)
32
peut être modélisée sous la forme de cylindres
33
(Figure
37).
32
LesIgGsontlaclassed’immunoglobulinelaplusabondantedanslesang(75à80%desanticorps circulants).
33
Tiré de Snapp EL et al., Current Protocols in Cell Biology 2006.