03/10/2013 WINNICKI Camille L2 Tissus sanguin et système
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TISSUS SANGUIN- Les explorations lymphocytaires 03/10/2013 WINNICKI Camille L2 Tissus sanguin et système immunitaire Pr. Robert 8 pages Les explorations lymphocytaires Plan A. Introduction I. Quand explorer les lymphocytes ? II. Principe des explorations B. Phénotypage lymphocytaire I. connaître le type cellulaire II. Comment classer les lymphocytes ? III. Aspects techniques IV. Résultats C. Tests fonctionnels I. Isolation lymphocytes/monocytes II. Activation des lymphocytes III. Fonction des Lymphocytes B IV. Phagocytes A. Introduction I. Quand explorer les lymphocytes? En cas de • Défaut de fonction: déficits immunitaires ◦ Acquis (le plus souvent) ◦ Innés • Exces de fonction ◦ Auto immunité ◦ Allergie • Suivi thérapeutique ◦ Traitement avec des anticorpes monoclonaux afin de suivre les fonctions des leucocytes • Au CHU : recherche clinque • • • II. Principe des explorations explorations phenotypiques : les plus courantes explorations non fonctionelles : compter les celllules ( le = fqt ) explorations fonctionelles : plus rares plus compliquées B. Phénotypage lymphocytaire I. connaître le type de cellule La première chose à savoir est de connaître le type de cellule • • Différencier les T, B ou NK (afin de savoir si le patient n'a pas d'exces/défaut) Compter les sous populations ( vérifier leur capacité d'activation) -Naïves, mémoire 1/8 TISSUS SANGUIN- Les explorations lymphocytaires Connaître la quantification des récepteurs membranaires : • Compter ce qu'exprime chaque type cellulaire ( si les lymphocytes T expriment bien leur TCR, les Natural Killer ( NK) leur Recepteur FC aux Ac et les Lymphcytes B ( LB) leur CD ) II. Comment classer les lymphocytes ? En fonction de : – leur fonction – leur détection par des anticoprs fluorescents – leur récepteurs membranaires (qui reflètent leur fonction) Hématie Leucocyte non identifiable Le lymphocyte est ici une cellule au repos, avec un gros noyau coloré en violet et un petit cytoplasme. Il existe cependant un problème pratique : on a besoin de techniques particulières pour différencier les différents types cellulaires. En effet, lors d'un frottis en microscopie optique à coloration classique, il est impossible de distinguer les différentes classes de lymphocytes les unes par rapport aux autres. La distinction des types cellulaires va se faire par leurs molécules membranaires qui vont être détectées pas des AC monoclonaux marqués. L'utilisation des AC monoclonaux constitue une réelle revolution de la biologie ( pratiqué depuis une trentaine d'année ) car c'est une méthode quasi infaillible pour distinguer les protéines de surfaces. Rappel :AC monoclonal = AC codé par un seul type de lymphocyte. Les AC monoclonaux d'un lymphocyte particulier reconnaitront le même epitope ( même partie) de l'antigène. Premier problème : avant, il fallait mesurer les propritétés biophysiques et chimiques des différents protéines afin de les distinguer ( migration; calcul de la charge ) sauf que les propriétés de celles-ci sont extrêmement proches les une des autres ( même charge, même poids ). Deuxième problème : Pour compter les leucocytes, il faut compter un nombre suffisant de chaque type pour avoir un résultat représentatif de la population du patient. L'échantillon doit donc être suffisament gros pour avoir une population représentative. Or, dans un frottis sanguin on a seulement quelques centaines de leucocytes ( 60 T , 30 B, 10NK). La fluctuation est importante donc le compte pas très juste. De plus cette technique était extrèmement chronophage ce qui entrainait une baisse de rendements considérable. 2/8 TISSUS SANGUIN- Les explorations lymphocytaires De nos jours, un appareil est utilisé : le cytomètre qui détecte le passage de chaque cellule et pourra mesurer l'expression de chaque marqueur ( chaque marqueur correspondant à une couleur ). III. Aspects techniques Le cytomètre permet de détecter le passage de chaque cellule ( comptage des cellules) ainsi que de mesurer l'expression de chaque marqueur ( distinction des différents types cellulaires). Principe : (à connaître, c'est très important) • Dilution extrème des cellules (grace à une solution isotonique) qui passent dans un tube puis une par une devant le détecteur. Les cellules sont séparées longitudinalement car le tube possède un diamètre supérieur à celui des cellules. C'est comme si le liquide était étiré. • Excitation de la fluorescence par un laser • Detection de l'émission de fluorescence par ◦ Jeu de filtres colorés ( « tri » des couleurs) ◦ Photomultiplicateurs ( détection de chaque couleur) ◦ Astuce de distinction des monocytes et lymphocytes : un dernier photomultiplicateur réceptionne la même longeur d'onde que celle émise lors de l'excitation. On sait que plus la cellule a de particules dans son cytoplasme, plus la lumière est diffractée donc déviée et récupérée sur le coté. Plus la cellule est grosse, plus la lumière est atténuée. Ainsi on distingue ➔ Le lymphocyte : cellule quiescente dans le sang qui s'active soit dans les ganglions soit dans les tissus enflammés. Il a donc un petit cytoplasme et un gros noyau ➔ Le polynucléaire neutrophile, à l'inverse, possède deja un stock de molécules effectrices et va avoir un noyau plutôt gros avec de nombreuses vésicules. ➔ Le monocyte: cellule phagocytaire mais qui n'obtient ses fonctions qu'après activation. Sa taille cellulaire est intermédiaire ainsi que sa granulométrie. 3/8 TISSUS SANGUIN- Les explorations lymphocytaires Donc taille polynucléaire > taille monocyte > taille lymphocyte. Ce qui nous permet de détecter par exemple que si la cellule brille en rouge, on détecte la CD3, en vert la CD4 et si on repère les deux, on met en évidence la présence d'un Lymphocyte T4. IV. Résultats de la machine Le résultat se présente sous forme de graph à deux dimensions où chaque point correspond aux données d'une seule cellule. Abscisse : mesure de l'intensité fluorescente de CD3 Ordonnée : mesure de l'intensité fluorescente de CD8 Pour les LB, pas de CD3 mais CD19 donc Abscisse : mesure de CD3 Ordonnée : mesure de CD19 NK: cellule qui n'a pas CD3 ( indissociable du TcR) donc marqueur CD16 ou CD56 ou, le plus souvent, les deux. 4/8 TISSUS SANGUIN- Les explorations lymphocytaires On peut donc distinguer des population de cellules très faibles ; recherche de populations rares et énorme gain de temps ( 10 000 cellule en 1 minute au lieu d'une semaine ) avec une variabilité très faible car l'échantillon est très gros. Marqeurs usuels : • • • • CD45 : marqueur leucoytaire (élimination des hématies). Les résultats peuvent être faussés par les hématies car celles-ci, étant 10 fois plus nombreuses, peuvent être confondues en cas de mauvaise lyse. Le CD45 ne se trouve pas sur les hématies mais enormément sur les leucocytes, son marquage permet de valider les résultats et éviter un mauvais comptage. On peut également éliminer les hématies par hémolyse puisqu'ils sont beaucoup plus sensibles que les leucocytes. CD3 : Lymphocytes T -CD4 : T CD4+ -CD8 : T cytotoxique CD19 : B CD 56/16 : NK (ils sont CD3 négatifs) Marqeurs spéciaux: • Activation – CD25 ( en + marqueur de distinction de T régulateur ) • Cellules T naives/mémoire – CD45 RA/RO ( différence entre Tmem et Tnaif permet d'identifier les problèmes de production. ( ex Tmem > Tnaif ). La normalité est dépendante de l'âge car dépend du Thymus, une personne agée aura tendence à avoir Tmem>Tnaif et une personne très jeune aura plutot Tmem < Tnaif) : • Mesure de la clonalité des T, des Ig ( domaine du cancer) savoir si un clone est prépondérant par rapport a un autre. Le cytomètre de flux est un moyen efficace de repérer des leucémies ( population abérante de LT ) • Tétramère Astuce : le numéro des CD désigne un AC monoclonal et pas la protéine de surface du lymhphocyte mais son ligand et correspond à l'ordre de découverte C. Tests fonctionnels I. Isolation des lymphocytes et monocytes Gradient de centrifugation ( le Ficoll) : on sépare les différents constituants du sang en fonction de leur densité. Le sang est déposé sur un liquide de densité intermédiaire entre celle des mononucléaires/lymphocytes et celle des globules rouges/granulocytes. A partir de ces suspensions, on peut réaliser des tests fonctionnels. Les globules rouges et les garnulocytes restent au fond et les lymphocytes/monocytes se retrouvent au dessus de la solution de Ficoll. 5/8 TISSUS SANGUIN- Les explorations lymphocytaires II. Activation lymphocytaire • • • • Test de prolifération But : Mesurer la capacité des lymphocytes à être activés ( prolifération : prise de décision lymphocytaire finale) Méthode : -Recueil des PBMC -Stimulation ( aux mitogènes ( CD3, PHA, PWM) et antigènes ) -Culture 4 à 7 jours -Décompte des cellules issues de mitoses Décompte des cellules -Radioactivité ( incorporation de thymidine tritiée) : compte de la radioactivité (pb radiocativité car personnel et patient exposés; déchets radioactifs; pièces spécialisées obligatoires. Les coûts sont très élevés) -Cytomètre de flux ◦ Incorporation d'un marqueur cytoplasmique en début de culture ( avant mitose), mesure de la fluorescence moyenne ◦ Mesure de la fluorescence en fin de culture -Diminution de la fluorescence des cellules entrées en mitoses -Fluorescence initiale pour les cellules non divisées Ce sont deux techniques opposées car avec on observe une augmentation de la radioactivité si les cellules se divisent, alors que l'on constate une diminution de la fluorescence si les cellules sont entrées en mitose. En effet, chaque cellule mère donnant 2 cellules filles, la fluorescence est forcemment divisée par 2 à chaque cycle cellulaire. 6/8 TISSUS SANGUIN- Les explorations lymphocytaires III. Fonction des lymphocytes B • dosage des immunoglobulines IV. Les phagocytes • La phagocytose : ▪ Receuil des cellules ▪ Particules recouvertes d'opsonines -zymonzan opsonisé -microsphères ▪ décompte des cellules ayant phagocyté une particule -Manuel ( microscopie en champ clair) -Automatisée ( cytomètre de flux ) => dictinction adhésion/phagocytose • Bactéricidie ▪ dérivés de l'oxygène -Synthèse d'anion superoxyde (O2-), NADPH oxydase -Sunthèse d'H2O : superoxyde dismutase -Peroxydase ( OH, Hcl, Hbr- ) ▪ Bactéricide directe -Coculture leucocytes/bactéries vivantes -Dénombrement à intervalle régulier des bactéries survivantes ▪ Chimiotactisme 7/8 TISSUS SANGUIN- Les explorations lymphocytaires - Substances : fMLF et C5a -Culture avec membrane perméable séparant deux compartiments ( chambre de Boyden) ; dénombrement des cellules ayant migré. (Cf cours précédent où la chambre de Boyden était plus détaillée) À retenir absolument dans ce cours : la technique de la cytométrie de flux et le fait que ce soit une méthode vraiment efficace et révolutionnaire. 8/8
