Immunologie La boite à outils des immunologistess

Immunologie
La boite à outils des immunologistess
V. Garlatti
2012
I.
Détection, mesure et caractérisation des
antigènes et des anticorps associés
A.
1.
a)
Détection directe de l'interaction antigène-anticorps
Les réactions de précipitation
Dénition
C'est la formation d'un réseau entre un antigène soluble et des Immunoglobulines.
La formation du réseau dépend du rapport des concentration entre l'antigène et
l'anticorps (Figure 1.a).
b) Milieu liquide
Le ring-test ou test de l'anneau : Les deux phases (phase inférieure conte-
nant l'anticorps et phase supérieure contenant l'antigène) ne sont pas mélangées.
L'antigène descend lentement au contact de l'anticorps pour former un complexe
Ac-Ag à la zone d'équilibre de la courbe de précipitation. La position de l'anneau
indique la présence de l'Ag ou de l'Ac que l'on recherche. Cet ancien test, surtout
qualitatif, est un peu quantitatif par la position de l'anneau : plus il y a d'antigène,
plus l'anneau est bas.
Techniques de néphélémétrie : Un rayon laser traverse le tube contenant
d'éventuelles particules du précipité. La diraction de la lumière par les particules (nephelos :nuage) est mesurée à la sortie. Plus il y a de précipité Ac-Ag, plus
il y aura de signal sur le photomultiplicateur (appareil qui mesure la diraction).
La mesure, rapide et automatisée, permet un dosage quantitatif.
c)
i
Milieu gélié
Immunodiusion radiale simple : Mancini
On utilise un gel d'agarose qui contient déjà un anticorps : des puits sont percés
dans lesquels on met l'antigène. L'antigène diuse dans le gel, déplaçant la zone
d'équilibre. après 48 heures les rayons des anneaux de précipitation, qui se sont
progressivement éloignés du puits, sont mesurés car ils sont proportionnels à la
quantité d'antigène. On peut tracer une courbe d'étalonnage gràce à des échantillons de concentration connue en antigène et utiliser cette courbe pour déterminer
la concentration en antigène d'intérêt dans un échantillon.
ii
Immunodiusion radiale double : Ouchterlony
Dans de l'agarose, on découpe des puits : dans l'un des puits est placé un anticorps
et dans l'autre puits est versé un antigène. Un précipité apparaît dans la zone
d'équilibre. Ce test est qualitatif et semi-quantitatif : l'arc se déplace selon les
1
concentrations relatives pour se situer le plus près du puits où la concentration
est la plus faible. Lors de l'utilisation d'une série de puits contenant des antigènes
disposés en couronne au tour d'un puits central contenant l'anticorps, la lecture
peut révéler :
- Une identité totale : lorsque les deux lignes de précipitation se rejoignent et fusionnent pour ne former qu'une seule ligne continue, donc les deux puits contiennent
des antigènes identiques qui diusent à la même vitesse et possèdent le même poids
moléculaire.
- Une non identité : les deux préparations antigéniques sont diérentes (leurs déterminants sont diérents). Chaque système de précipitation évolue pour son propre
compte et les deux lignes de précipitation se croisent.
- Une identité partielle : dans ce cas, les deux puits contiennent des antigènes
qui présentent des déterminants antigéniques identiques, mais qui dièrent par
quelques déterminants particuliers que possède un des deux antigènes ce qui entraîne la formation de l'éperon.
iii
Immunoélectrophorèse
Il existe plusieurs méthodes d'immunoélectrophorès. La méthode présentée ici est
la méthode de Grabar et William. Cette technique est utilisée pour la détection
clinique des protéines sériques : détection d'immunodécience (en anticorps par
exemple) ou de maladies immunoprolifératives (lymphomes). C'est une technique
qui est surtout qualitative et partiellement quantitative. Selon la forme et la taille
des arcs de précipitation, on peut en déduire une diminution ou une augmentation
de la quantité de l'antigène analysé.
2.
a)
Les réactions d'agglutination
Dénition
C'est une réaction de précipitation visible entre un antigène particulaire et un
anticorps qui est alors appelé agglutinine. Ce mécanisme dépend de la concentration en anticorps, un excès d'anticorps inhibe l'agglutination : on parle d'eet
prozone.
b)
Agglutination directe
C'est une méthode qualitative dans laquelle on mélange l'anticorps et l'antigène
particulaire pour voir si l'agglutination a lieu. Elle est utilisée pour la détermination
des groupes sanguins et la titration des sérums.
2
(a) Théorie du réseau
(c) Immunodiusion radiale
double : Ouchterlony
(b) Immunodiusion
simple : Mancini
(d) Test de l'anneau
radiale
(e) Immuno-électrophorèse
Figure 1: La détection directe de l'interaction antigène-anticorps via des techniques de précipitation
i
Hemmaglutination
An de tester les groupes sanguins, les hématies du patient sont mélangées à un
anticorps anti-A ou un anticorps anti-B ainsi qu'une solution sans anticorps. Si la
réaction est positive on observera une agglutination des hématies. Une agglutination positive provoque un tapis qui colle au support : tache large alors que lorsque
que l'hémagglutination n'a pas lieu les hématies forme une tache plus petite.
ii
Agglutination bactérienne
En cas d'infection bactérienne, le système immunitaire s'active et fabrique des
anticorps pour éliminer l'intrus. Le plus souvent, ce sont ces anticorps qu'on es3
(a) Hemagglutination
(b) Agglutination indirecte
(c) Inhibition d'agglutination
Figure 2: La détection directe de l'interaction antigène-anticorps via des techniques d'agglutination
saie de détecter pour déterminer la nature de la souche infectieuse. Pour cela, on
prélève le sérum du patient qu'on mélange à une culture pure de la souche bactérienne recherchée. Si des anticorps contre ces bactéries sont présents, on observe
une agglutination des bactéries. Dans ce cas, on peut de plus déterminer un titre
en agglutine en réalisant des dilutions en série du sérum. On dénit le titre en
agglutinine dans le sérum comme l'inverse de la dilution la plus grande qui donne
une réaction positive. Ce type de test peut aussi être utilisé pour identier une
souche bactérienne si l'on dispose d'anticorps spéciques contre cette souche.
c)
Agglutination indirecte
L'agglutination indirecte permet de faire agglutiner des antigènes solubles. Pour
cela, il y a deux solutions : soit on xe l'antigène sur des billes ou des hématies ;
soit on xe l'anticorps sur des billes ou des hématies. C'est aussi une méthode
qualitative.
d)
Inhibition de l'agglutination
L'inhibition d'agglutination consiste a utilisé un test qui contient à la fois l'antigène
sous forme particulaire et les anticorps. Lorsque qu'on ajoute l'échantillon à tester,
4
l'antigène soluble s'il est présent va inhiber l'agglutination. C'est ce qui était utilisé
dans les premiers tests de grossesse.
3.
Immunocytolyse
Dans les immunocytolyses on cherche à identier la présence d'anticorps contre un
déterminant antigénique d'intérêt. Pour cela, le déterminant antigénique est xé
sur une hématie. On ajoute le sérum à tester ainsi que les protéines du complément.
Si les anticorps sont présents, le complément pourra lyser l'hématie via la voie
classique.
B.
1.
Détection indirecte de l'interaction antigène-anticorps
La technique ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay
Le but de cette technique est de doser les anticorps ou les antigènes : c'est une technique quantitative. Dans cette technique, un anticorps est couplé à une enzyme qui
est capable de transformer un substrat incolore en un produit coloré. Cette technique permet de doser un anticorps dans le serum si on utilise la technique ELISA
dite indirecte (gure 3a). Les techniques ELISA dites sandwich (gure 2b) ou par
compétition permettent de doser l'antigène.La technique de compétition comporte
les mêmes étapes qu'un test indirect sauf que l'anticorps utilisé n'est pas un anticorps du patient mais un anticorps primaire de laboratoire qui est pré-incubé avec
le serum du patient. Si l'antigne est présent dans le sérum, il sature les sites de
l'anticorps primaire qui ne se xe donc pas au fond du puit. Pour une meilleure
sensibilité on peut utiliser un produit luxogène (chimioluminescence).
2.
La technique RIA : Radio Immunoassay
La technique RIA permet de doser les antigènes. C'est une des techniques quantitatives les plus spéciques. Elle est très proche de la technique ELISA par compétition. L'antigène à doser ainsi que le même antigène de concentration connue
et sous forme radioactive sont ajoutés à des anticorps adsorbés au fond d'un puit.
On mesure l'inhibition de la xation de l'antigène radioactif.
3.
Western Blot et Dot Blot
Le western-blot et le dot-blot sont des techniques permettant d'identier la présence d'un antigène protéique. Pour le dot-blot l'échantillon de protéine est directement déposé sur une membrane. Pour le western-blot, les protéines sont d'abord
séparées par électrophorèse, puis on tranfert ces protéines sur une membrane enn
on réalise en marquage soit direct via un antigène primaire couplé à une enzyme
soit via un antigène primaire puis un antigène secondaire couplé à une enzyme
dirigé contre l'antigène primaire.
5
(a) ELISA indirect
(b) ELISA sandwich
(c) RIA
Figure 3: Les techniques de dosage indirects
4.
Immunouorescence
Les marquages par immunouorescence se font avec un anticorps primaire couplé à
un uorophore ou un anticorps secondaire couplé à un uorophore. Ils permettent
des marquages de cellules an de les visualiser au microscope ou à l'aide d'un
cytomètre de ux. De plus en plus, les marquages uorescencents sont également
utilisés pour le western-blot.
6
(a) Etapes du Western-blot
(b) Detection
Figure 4: Le western-blot
C.
Les techniques de purication
Chromatographie d'anité :la chromatographie d'anité est une technique
de purication sur colonne. Les billes formant la résine sont recouvertes soit de
l'antigène reconnu et dans ce cas on purie l'anticorps ; soit de l'anticorps et dans
ce cas on purié l'antigène (cf biochimie).
Immunoprécipitation : Une technique proche de l'agglutination indirecte. Des
anticorps contre l'antigène d'intérêt (par exemple une protéine cellulaire) sont xés
sur une bille d'agarose ou sur une bille magnétique. Les billes sont incubées en présence d'un lysat cellulaire puis lavée. Pour les immunoprécipitation sur billes d'agarose la centrifugation permet d'isoler les billes. Pour les immunoprécipitations avec
billes magnétiques, le mélange est déposé sur un support magnétique. L'antigène
associé aux anticorps peut alors être isolé du reste du lysat cellulaire.
7
Figure 5: Technique de co-immunoprécipitation
8
II.
Analyse des populations lymphocytaires
A.
Isolation des lymphocytes
1. Séparation grossière des populations à partir de tissus
Séparation des cellules sanguines par centrifugation sur un gradient
Ficoll-hypaque : Le gradient de Ficoll-hypaque permet de séparer les diérentes
cellules sanguines.
Isolation à partir d'autres tissus : Chez l'homme ou chez les animaux expé-
rimentaux, les lymphocytes peuvent être isolés à partir des organes lymphoïdes.
Dans ces organes, les diérentes populations lymphocytaires sont séparées dans
l'espace (cf cours L2) et il faut séparés ces diérentes régions pour obtenir des
populations lymphocytaires partiellement puriées. Les lymphocytes peuvent également être isolés à partir du site de l'inammation.
2. Isolation de lignées cellulaires homogènes de lymphocytes
hybridomes : Les lymphocytes issus des tissus sont diciles à multiplier ex vivo.
En réalisant des hybrides entre des lymphocytes (diérenciés ou non) et des cellules
cancéreuses, il est possible de créer des lignées cellulaires homogènes de lymphocytes B ou T : par exemple des T eecteurs ou des plasmocytes spéciques d'un
antigène donné. Ces hybrides cellulaires par contre ne permettent pas d'étudier la
régulation de la division cellulaire par les antigènes car elles se divisent en continu
et ne peuvent être injectées dans des animaux car ils donneraient lieu à des tumeurs. On peut par contre utiliser des clones de lymphocytes. Par exemple, à partir
d'une population hétérogène d'une lignée de lymphocytes T, on peut sélectionner
des populations spéciques d'un antigène en stimulant régulièrement la population
avec celui-ci : on obtient une population clonale.
Cytomètre de ux avec trieur de cellule : Le cytomètre de ux est un appareil
qui permet d'analyser les cellules une à une. Chaque cellule passe devant un détecteur qui analyse plusieurs paramètres : la taille de la cellule (csh), la complexité
de la cellule (fsh) et la uorescence de la cellule à diérentes longueurs d'ondes
(en général rouge vert voire bleu). Le plus souvent les cellules sont marquées avant
par immunouorescence. Certains cytomètres sont équipés d'un système de tri qui
permet de séparer les cellules selon les paramètres analysés.
B.
Analyse fonctionnelle des lymphocytes
Les lymphocytes B sont relativement faciles à analyser via les anticorps. La nature membranaire du récepteur des lymphocytes T, le TCR, rend leur étude plus
complexe.
9
(a) Cytomètre de ux avec trieur de cellules (thermoscientic)
(b) Hybridomes (Antibody Station)
Figure 6: isolation de lignées lymphocytaires pures
1. Détermination de la fréquence de lymphocytes Ag-spéciques
Méthode des dilutions limites : Les lymphocytes isolés sont répartis dans
une plaque 96 puits avec des concentrations décroissantes en lymphocytes dans
les puits. Une fois cette répartition eectuée, on ajoute l'antigène et on mesure le
nombre de puits dans lesquels il n'y a aucune réponse à l'antigène : c'est à dire
qui n'ont reçu aucune cellule spécique de l'antigène. On trace un graphique :
pourcentage de cultures négatives en fonction du nombre de cellules. Ce test se
sert de la loi de poisson, loi statistique de répartition des objets au hasard.
ELISPOT : L'ELISPOT est un dérivé de la technique ELISA. Une population
de lymphocyte T est stimulée par un antigène. An de compter le nombre de T
qui réagissent à cet antigène, on va mesurer la sécrétion de cytokine. Pour cela,
on utilise des plaques de test ELISA qui possèdent des anticorps dirigés contre
la cytokine d'intérêt au fond du puits. On ajoute la population de lymphocytes
stimulés. Les lymphocytes qui produisent la cytokine d'intérêt sont xés au fond
du puits et les autres non. Au bout d'un certain on enlève les cellules et on utilise
un anticorps secondaire détectable dirigé contre la cytokine. On verra un marquage tout autour de la position où était xé le lymphocyte activé : chaque spot
10
correspond à un lymphocyte activé par l'antigène.
Identication de diérentes populations de cellules T en marquant les
cytokines : An de mieux connaître la nature des populations lymphocytaires, on
peut marquer les cytokines produites par chaque lymphocyte de deux manières.
Une solution consiste à utiliser une drogue qui bloque la sécrétion des cytokines
qui s'accumulent alors dans le RE. Les cellules sont xées, perméabilisées et on
ajoute un anticorps dirigé contre la cytokine puis un secondaire marqué. La seconde solution consiste à utiliser des anticorps hybrides qui possèdent deux sites
de reconnaissance diérents : l'un spécique de la membrane d'un lymphocyte T
CD4+ par exemple et un site spécique de la cytokine. On utilise un secondaire
uorescent pour détecter le complexe primaire-cytokine. Les résultats peuvent être
analysés par FACs ou par microscopie.
2. Analyse de la spécicité d'un TCR
Utilisation de tétramères de CMH :peptide : Identier la spécicité anti-
génique d'un LT est rendu complexe par le fait qu'il ne reconnaît par un antigène
soluble mais un peptide complexé au CMH et qu'en plus l'anité entre les deux
est assez faible. Des complexes CMH peptides peuvent être produits avec à leur
extrémité une molécule de biotine. Cette biotine reconnaît très fortement la streptavidine, une protéine tetramérique qui peut être rendue uorescente. On arrive
ainsi à fabriquer des tétramères de CMH-peptide et l'avidité d'un LT pour ce
complexe est assez forte pour être détectée.
Utilisation de la résonnance plasmonique de surface : La résonnance plas-
monique de surface est une technique de biophysique qui permet de mesurer les
constantes d'association et de dissociation d'un complexe protéine ligand. L'un
des partenaires est xé sur une puce, le biocenseur. Un ux du second partenaire
est passé sur la puce, si le partenaire se xe on va observer une augmentation du
signal mesuré (la déviation de la lumière) par la puce. Puis on pace sur la puce
un tampon sans le second partenaire. Celui-ci se détache du partenaire xé et on
mesure la dissociation. Cette technique est la seule qui a permis de mesure l'anité
entre un TCR et le complexe CMH-peptide.
Analyse de la diversité dans la spécicité d'une population lymphocytaire : L'idée ici est de savoir dans une population, la diversité des TCR produits.
Pour cela, on utilise la technique de RT-PCR. On extrait les ARNm de la cellule
et on va amplier une région de l'ARNm de la région variable du TCR. Selon les
TCR, cette région ampliée peut être plus ou moins longue et cette longueur dans
une population se réparti selon une gaussienne. Si on observe une déviation par
rapport la répartition de Gauss pour une longueur donnée, c'est que probablement ce récepteur est spécique d'un antigène qui a donné lieu à une expansion
11
(a) ELISPOT : le lymphocytes sécréteurs de cytokines
(b) Tetramères de CMHI : activation des T8 ex vivo
(c) La resonnance plasmonique de surface
Figure 7: Analyse fonctionnelle des populations lymphocytaires
12
clonale.
3. Mesure de la capacité de réponse d'un lymphocyte
Capacité de prolifération : On peut mesurer la prolifération d'une population
cellulaire en incorporant à l'ADN pendant la phase de réplication de la thymidine
tritiée. Si le taux de thymidine tritié incorporé augmente c'est que les cellules se
sont multipliées. On peut mesurer la capacité d'une population lymphocytaire à
se multiplier en utilisant des mitogènes généraux ou mesurer l'expansion clonale
en utilisant un antigène à tester. Tester la cytotoxicité : Pour mesurer la
cytotoxicité d'une population de LT, il faut être capable de mesurer leur capacité
à tuer des cellules cibles qui portent le complexe CMHI-peptide correct. POur cela,
on met en contact les T8 à tester et les des cellules cibles qui ont pré-incorporer
soit du chromate de sodium radiactif (intracellulaire) soit de la thymidine tritiée
(ADN). Si la cellule est tuée, le chromate de sodium radioactif est libéré dans
le milieu et son taux peut être mesuré. De même si la cellule est tuée, l'ADN est
fragmenté et on peut mesurer ce taux de fragmentation en séparant les chromosome
complets des fragments d'ADN.
Tester l'activité T auxiliaire : Pour tester l'activité des lymphocytes T auxi-
liaires, on ne peut mesurer que les cytokines produites ou les signaux co-stimuateurs
de surface. L'expression de ces protéines peut être testée en utilisant diérents
types de marquage via des anticorps monoclonaux, la technique d'ELISPOT ou
encore de taux de ARNm pour la protéine d'intérêt dans la cellule via la tchnique
de QT-RT-PCR.
4.
Phénotypage d'une population
An d'obtenir un panel complet des gènes exprimés dans une cellule, on peut
utiliser des micropuces d'ADN (DNA microarray). Les séquences des diérents
gènes sont adsorbé sur une puce. L'ARNm d'une population lymphocytaire est
extrait et amplié par RTP CR puis on réalise une hybridation entre le cDNA et les
gènes de la puce. On peut ainsi déterminer grâce à des marquages uorescents les
gènes exprimés.
13
III.
A.
Etude in vivo du système immunitaire
Les lignées de souris
Les lignées de souris permettent souvent l'étude du système immunitaire et notamment des réactions liées au CMH. On distingue :
les lignées pures : animaux produits par croisement entre frères et soeurs pendant au moins 20 générations, ils sont tous génétiquement identiques à l'exception
des chromosomes sexuels.
les lignées congéniques : par croisement et sélection, on obtient des animaux
qui ne dièrent que par un locus notamment le locus CMH. On parle d'haplotype H − 2x chaque collection particulière d'allèles de CMH présents dans une
lignées de souris. Douze lignées prototypes ont leur haplotype H-2 désigné par une
lettre.
Lignée
Nom abrégé
Couleur
Haplotype H-2
A
A
Blanc
a
AKR
AKR
Blanc
k
BALB/c
C
Blanc
d
C3H
C3H
Brun
k
CBA
CBA
Brun
k
C57BL/6
B6
Noir
b
C57BL/10
B10
Noir
b
DBA/2
D2
Gris
d
SJL
SJL
Blanc
s
nude
pas de poil/pas de thymus
Table 1: Quelques exemples de lignées
B.
1.
Manipulation du système immunitaire
Immunisation
L'induction délibérée d'une réponse immunitaire par injection d'un antigène est
appelée immunisation. D'un point de vue médical, l'induction d'une réponse protective contre un pathogène courant est appelé, à tord, vaccination. Le terme de
vaccination étant issue de l'immunisation contre la variole de l'homme à partir du
pathogène bovin : la vaccine. Une substance capable de déclencher une réponse
immunitaire est dite immunogène. Si toutes les substances immunogènes sont des
antigènes, tous les antigènes ne sont pas immunogènes. Pour savoir si un antigène
est immunogène ou non, il faut suivre dans l'animal l'apparition de LT cytotoxiques
ou d'anticorps dirigés contre l'antigène. C'est ce qu'on appelle la réponse primaire.
14
Suite à cette réponse primaire, si on re-injecte l'antigène dans l'animal, on observera une réponse immunitaire plus forte, plus rapide qui donne lieu à des LT
et des Ig plus spéciques de l'antigène. De plus, l'isotype des immunoglobulines
changent. C'est ce qu'on appelle la mémoire immunitaire qui donne lieu à une réponse secondaire. L'ecacité de l'immunisation dépend de diérents paramètres :
la voie d'administration de l'antigène, la nature et la dose de l'antigène mais aussi
la nature de l'adjuvant utilisé.
Nature et dose de l'antigène : Pour qu'une immunisation soit eective, il faut
qu'elle puisse à la fois activer les lymphocytes B et les lymphocytes T. Si les
anticorps peuvent reconnaître diérents types de molécules biologiques, les lymphocytes T eux reconnaissent des peptides immunogènes associés au CMH. Cela
suppose que pour activer correctement les lymphocytes T, il faut mieux utiliser
un antigène protéique. Les haptènes sont des molécules organiques de structures
très simples qui ne peuvent pas par eux-mêmes déclencher la production d'anticorps. Par contre, si ces haptènes sont liés covalemment à une protéine porteuse,
on va obtenir des anticorps dirigés soit vers l'haptène (seul ou porté) soit vers la
protéine porteuse (seul ou lié à l'haptène) et des anticorps spéciques du complexe
protéine-haptène. Ainsi, il est possible de conférer une immunité protectrice contre
des molécules non protéiques. La dose d'antigène utilisée pour l'immunisation inuence grandement l'immunité protectrice obtenue. Cette dose doit être supérieure
à un certain seuil pour déclencher une réponse primaire. En augmentant la dose,
on arrive à augmenter la réponse primaire jusqu'à atteindre un plateau, puis une
chut de la réponse au dessus d'une certaine dose. Si on regarde la réponse secondaire obtenue selon la dose utilisée pour l'immunisation, on observe trois zones de
concentration. Si la dose est inférieure au seuil de déclanchement de la réponse
primaire, on n'a pas de réponse secondaire renforcée, c'est la zone basse de tolérance. Si la dose primaire est supérieure au seuil qui entraine une diminution de la
réponse primaire, on n'a pas de réponse secondaire renforcée : c'est la zone haute
de tolérance.
Voie d'administration : Il existe diérente voie d'administration de l'antigène
dans l'ordre d'ecacité : injection subcutanée (entre le derme et épiderme) intradermique, intramusculaire, intraveineuse et orale. On pense que la voie subcutanée
est à l'origine de l'immunisation la plus forte car l'antigène est directement injecté
à proximité des cellules de Langherans (cellules dendritiques) qui vont présenter
l'antigène directement aux ganglions lymphatiques à proximité.
Les adjuvants : La plupart des protéines sont faiblement voire pas du tout immunogénique par elle même. Pour déclencher une réponse immunitaire forte, il faut
qu'elles soient injectées dans une mixture connue sous le nom d'adjuvant. Un adjuvant est n'importe quelle substance qui augmente l'immunogénicité d'un antigène.
15
Les adjuvants peuvent agir de deux façons. Tout d'abord, ils peuvent convertir un
antigène soluble en un antigène particulaire qui est plus facilement ingéré par les
cellules présentatrices de l'antigène. Par exemple, l'antigène peut être adsorbé à
la surface des particules de l'adjuvant : huiles minérales ou solutions colloïdales.
L'autre type d'adjuvant, et certainement les plus ecaces, sont composés de bactéries ou de molécules bactériennes. Si on ne sait pas exactement le rôle de ces
adjuvants dans l'immunogénicité, on pense qu'ils aident à l'activation des cellules
présentatrices de l'antigène et à la production de cytokines inammatoires.
2. Modication des populations lymphocytaires
Déplétion des lymphocytes B ou T : Les rayons X ou les rayons gamma
permettent de dépléter toutes les cellules lymphoïdes à des doses qui ne touchent
pas le reste des cellules de l'organisme. Pour dépleter les lymphocytes T dans un
animal, il sut de lui enlever le thymus juste après la naissance. Dans l'adulte c'est
plus complexe. Il faut enlever le thymus mais également irradié les moelle osseuse
de façon à tuer toutes les cellules souches hématopoïétique. On doit ensuite faire
une gree de moelle à l'animal qui sera incapable de reconstituer sont répertoire de
T. De plus, il existe une lignée de souris appelée nude qui possèdent une mutation
sur un gène empêchant totalement le développement des lymphocytes T. Ceux
sont de bons modèles de souris dépourvus d'immunité cellulaire. Il est plus dicile
de dépléter les cellules B compte tenu qu'elles n'ont pas d'organe spécialisé comme
le thymus sauf chez les oiseaux. Chez les oiseaux, les B sont produits dans les
bourses de Fabricius et la déplétion de celle-ci sut à déléter les B. De plus, chez
la souris on ne connaît aucune mutation à l'origine de ce type de pathologie (existe
chez l'homme).
Transfert de lymphocytes : Une fois les cellules lymphoïdes dépléter on peut
injecter dans l'organisme des cellules lymphoïdes de façon à restaurer totalement
ou partiellement les fonctions immunitaires : populations de lymhocytes T ou B
issus d'un donneur immunisé ou d'une lignée cellulaire.
Transfert de cellules souches hématopoïétiques : Toutes les cellules hé-
matopoïétiques peuvent être éliminées en utilisant des doses élevées de rayons X.
On peut greer de la moelle osseuse à partir d'un donneur pour remplacer totalement les cellules hématopoïétiques. Les animaux résultants sont appelés des
chimères irradiées de moelle osseuse. Cette technique a été utilisée pour étudier le
développement des lymphocytes.
3. Obtention d'organismes génétiquement modiés
Les souris transgéniques :Les souris transgéniques sont obtenues dans un premier temps par injection dans le pronucléus mâle du transgène qui s'insère aléa16
toirement. On obtient des souris transgéniques avec un terrain génétique variable
du à l'insertion variable du transgène. Une souris transgénique est croisée avec un
animal de la lignée dont elle est issue et ce sur une dizaine de génération de façon
à obtenir une lignée stable avec un patrimoine génétique connu.
Les souris Knock-Out : An de mieux connaître la fonction d'un gène, il est
possible de créer des souris KO pour ce gène : le gène est remplacé par une version
non fonctionnel et ceci de façon homozygote. Pour cela, on utilise les propriétés
de la recombinaison homologue entre deux séquences d'ADN. Cette recombinaison
homologue est réalisée par injection dans des cellules souches embryonnaire d'une
copie altérée du gène. Les cellules qui ont correctement intégré le gène muté sont
sélectionnée et ajoutée dans l'embryon au stade blastocyste. Cela donne naissance à
des souris chimérique c'est à dire avec des cellules ayant deux patrimoines génétique
diérents : celles avec le gène muté et celles avec les cellules normales. Ces souris
sont croisées avec des souris normales. Si les chimères ont intégré les cellules mutées
dans leur lignée germinale, le gène muté se transmettra à la descendance. Les
croisements sont réalisés jusqu'à obtenir une lignée homozygote.
Figure 8: Obtention de souris knock-out
17