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UNIVERSITE PARIS VAL DE MARNE FACULTE DE MEDECINE DE CRETEIL ANNEE : 2007 N° THESE POUR LE DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN MEDECINE Discipline : pathologies cardio-vasculaires -----------------Présentée et soutenue publiquement le 24 septembre 2007 A la faculté de médecine de l’hôpital Saint-Antoine -----------------Par AIT-OUFELLA Hafid Né le 12 mai 1976 à AIN EL HAMMAM (Algérie) ------------------ TITRE : Immunomodulation lymphocytaire T de l’athérosclérose expérimentale par la nucléoprotéine du virus de la rougeole PRESIDENT DE THESE : LE CONSERVATEUR DE LA Pr Georges OFFENSTADT BIBLIOTHEQUE UNIVERSITAIRE DIRECTEUR DE THESE : Dr Ziad MALLAT Signature du cachet de la bibliothèque Président de thèse universitaire - A Laetitia, - A Jeanne la brune, - A mes parents, à mes frères et leur « Kabyle Touch », - A Aberkane, à Akli . 2 Je souhaite remercier tout particulièrement, - Le Professeur Georges Offenstadt pour m’avoir enseigné le goût de la médecine clinique au quotidien, pour m’avoir fait découvrir la réanimation médicale et m’avoir conseillé tout au long de ma formation médicale. - Le Dr Ziad Mallat pour m’avoir accompagné à chaque instant au cours de ma formation scientifique, pour sa patience, ses conseils, ses idées entraînantes et sa passion communicative. - Le Professeur Bernard Levy pour m’avoir conseillé pendant ces années au laboratoire. - Le Professeur Christian Spaulding d’avoir accepté de participer à mon jury de thèse. - Le Dr Alain Tedgui pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et au sein de son équipe, pour m’avoir transmis sa passion pour les sciences. - Stéphane Potteaux pour son amitié et son aide. - Tous les membres de l’unité Inserm U689 (Cath, Ludo, Téni, José, Aurélie, Olivier, Steph 1, Steph 2, Jack, Yves…) pour leur soutien, leur dynamisme et leur bonne humeur constante qui ont rendu toutes ces années de labeur si agréables, - Régine Merval et Bruno Esposito pour leur aide précieuse, - Dr Branka Horvat et Yann Kerdilès pour leur collaboration à ce travail. 3 TABLE DES MATIERES TABLE DES ILLUSTRATIONS ............................................................................................................................... 6 LISTE DES ABREVIATIONS ................................................................................................................................... 7 II - PHYSIOPATHOLOGIE DE L’ATHEROSCLEROSE .................................................................................. 8 1 - PENETRATION DES LIPOPROTEINES DANS L’INTIMA .......................................................................................... 10 2 - ACTIVATION ENDOTHELIALE ET RECRUTEMENT DES MONOCYTES/MACROPHAGES ........................................ 10 3 - ROLE PATHOGENE DES MONOCYTES/MACROPHAGES ........................................................................................ 11 4 - ROLE DES LYMPHOCYTES T CD4+ DANS L’ATHEROSCLEROSE ......................................................................... 12 4.1 - Rôle pathogène des lymphocytes T CD4+................................................................................................ 12 4.2 - La voie Th1 est pro-athérogène ................................................................................................................ 13 4.3 - La voie Th2 est potentiellement pro-athérogène...................................................................................... 14 4.4 - Un sous-type de lymphocytes T protecteurs contre l’athérosclérose ..................................................... 14 4.4.1 - IL-10 et le TGF! sont anti-athérogènes ..............................................................................................................15 4.4.2 - Les lymphocytes T régulateurs (Tregs)................................................................................................................15 4.4.3 - Les Tregs protecteurs contre l’athérosclérose .....................................................................................................16 III - LA NUCLEOPROTEINE DU VIRUS DE LA ROUGEOLE ..................................................................... 17 1 - MODULATION IMMUNO-INFLAMMATOIRE PAR LE VIRUS DE LA ROUGEOLE ..................................................... 17 2 - MODULATION IMMUNO-INFLAMMATOIRE PAR LA NUCLEOPROTEINE DU VIRUS DE LA ROUGEOLE ................ 17 IV – OBJECTIFS DE L’ETUDE ............................................................................................................................. 19 V - MATERIEL ET METHODES........................................................................................................................... 20 1 - SOURIS ................................................................................................................................................................. 20 2 - TRAITEMENT ....................................................................................................................................................... 20 3 - ANALYSE DE L’ATHEROSCLEROSE ..................................................................................................................... 21 3.1 - Dosage des lipides plasmatiques .............................................................................................................. 21 3.2 - Dosage des anticorps circulants. .............................................................................................................. 21 3.3 - Analyses morphométriques........................................................................................................................ 22 3.4 - Analyses immunohistochimiques............................................................................................................... 22 3.5 - Analyses immunologiques ......................................................................................................................... 23 3.5.1 - Les cellules dendritiques .......................................................................................................................................23 3.5.2 - Les lymphocytes T CD4+ .....................................................................................................................................24 3.5.2.1 - Isolation des lymphocytes CD4+ ................................................................................................................24 3.5.2.2 - Isolation des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+..............................................................................25 3.5.2.3 - Co-culture des cellules isolées .....................................................................................................................25 3.5.2.4 - Mesure de la prolifération cellulaire............................................................................................................25 3.5.2.5 - Analyse en Cytométrie de flux.....................................................................................................................26 4 - ANALYSES STATISTIQUES ................................................................................................................................... 27 VI – RESULTATS :.................................................................................................................................................... 28 ETUDE DU DEVELOPPEMENT DES LESIONS CHEZ LES SOURIS « JEUNES » ................................. 28 1 - EFFETS DU TRAITEMENT PAR NP SUR LA TAILLE DES PLAQUES D’ATHEROSCLEROSE..................................... 28 2 - EFFETS DU TRAITEMENT PAR NP SUR LA COMPOSITION DES PLAQUES D’ATHEROSCLEROSE ......................... 28 VII - RESULTATS :................................................................................................................................................... 30 ETUDE DE LA PROGRESSION DES LESIONS CHEZ LES SOURIS « VIEILLES »............................... 30 1 - EFFETS DU TRAITEMENT PAR NP SUR LA TAILLE DES PLAQUES D’ATHEROSCLEROSE..................................... 30 2 - EFFETS DU TRAITEMENT PAR NP SUR LA COMPOSITION DES PLAQUES D’ATHEROSCLEROSE (CF. TABLEAU 1) ................................................................................................................................................................................... 31 VIII - RESULTATS : ANALYSES IMMUNOLOGIQUES................................................................................ 34 1 - EFFET DU TRAITEMENT PAR NP SUR LE PROFIL IMMUNOLOGIQUE DES LYMPHOCYTES CD4+ ........................ 34 2 - EFFET DU TRAITEMENT PAR NP SUR LE PROFIL IMMUNOLOGIQUE DES CELLULES DENDRITIQUES ................. 34 3 - EFFET DU TRAITEMENT PAR NP CHEZ LA SOURIS APOE/RAG2-/- ..................................................................... 35 4 4 – TAUX D’ANTICORPS ANTI-LDL OXYDES DE TYPE IGM CHEZ LES SOURIS JEUNES .......................................... 35 IX - DISCUSSION ...................................................................................................................................................... 38 X - CONCLUSION ..................................................................................................................................................... 43 XI - REFERENCES ................................................................................................................................................... 44 5 TABLE DES ILLUSTRATIONS Illustrations présentes dans l’introduction Illustration 1 : principales étapes de formation de la plaque d’athérosclérose .................................9 Illustration 2 : détection par immunohistochimie des macrophages au sein de la plaque ..............11 Illustration 3 : composition des plaques d’athérosclérose stable ou rompue .................................12 Résultats sous forme de figures Figure 1a : taille des plaques chez les souris jeunes (aorte thoracique) .........................................29 Figure 1b : taille des plaques chez les souris jeunes (sinus aortique) .............................................29 Figure 1c : composition en macrophages des plaques, chez les souris jeunes.................................29 Figure 2a : taille des plaques chez les souris vieilles (aorte thoracique) ........................................32 Figure 2b : taille des plaques chez les souris vieilles (sinus aortique) ............................................32 Figure 2c : composition en macrophages des plaques, chez les souris vieilles ..............................33 Figure 2d : composition en collagène des plaques, chez les souris vieilles ....................................33 Figure 2e : composition en CML des plaques, chez les souris vieilles ..........................................33 Figure 3a : prolifération lymphocytaire T......................................................................................36 Figure 3b : prolifération lymphocytaire T en présence de DC .......................................................36 Figure 4 : production de cytokines par les lymphocytes T ............................................................36 Figure 5 : production de cytokines par les cellules dendritiques ....................................................36 Figure 6 : fonction T régulatrice in vitro ......................................................................................37 Figure 7 : résultats du traitement par NP chez les souris apoE/RAG2-/- .........................................37 Résultats sous forme de tableaux Tableau 1 : Tableau récapitulatif de la composition des plaques chez les souris « vieilles » ..........31 6 LISTE DES ABREVIATIONS LDL Low Density Lipoprotein LDLox LDL oxydé HDL High density Lipoprotein VCAM Vascular Cell Adhesion Molecule IL Interleukine CD Cluster of Differenciation M-CSF Monocyte-Colony Stimulating Factor SRA Scavenger Receptor type A CML Cellule Musculaire Lisse CMH Complexe Majeur d’Histocompatibilité ApoE Apolipoprotéine E RAG Recombinase A Activating Gene SCID Severe Combined Immunodeficiency IFN Interféron AIT Accident Ischémique Transitoire AVC Accident Vasculaire Cérébral AOMI Artériopathie Oblitérante des Membres inférieurs TGF Transforming Growth Factor FOXP-3 forkhead transcription factor 3 CPA Cellule Présentatrice d’Antigène NP Nucléoprotéine DC Cellule Dendritique Treg Lymphocyte T régulateur 7 I - INTRODUCTION Les maladies cardiovasculaires sont aujourd’hui un véritable problème de santé publique puisqu’elles constituent une des premières causes de mortalité dans le monde. Selon l’OMS, 7,2 millions de décès par an dans le monde sont liés à des cardiopathies ischémiques et 4,6 millions de décès à des accidents vasculaires cérébraux (43). L’athérosclérose est la principale étiologie des maladies cardio-vasculaires. Elle provoque des pathologies chroniques comme l’angor d’effort ou la claudication intermittente à la marche et des maladies aigues plus bruyantes et potentiellement mortelles comme l’infarctus du myocarde et l’accident vasculaire cérébral. Il est donc prioritaire de comprendre et d’agir sur les mécanismes physiopathologiques qui participent à la progression de la maladie athéroscléreuse et sur ses complications, comme la fissuration de plaque et la thrombose artérielle consécutive. II - PHYSIOPATHOLOGIE DE L’ATHEROSCLEROSE Les études expérimentales les plus récentes associées aux observations anatomopathologiques faites sur des plaques d’athérosclérose humaines, permettent aujourd’hui d’affirmer que l’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique. Les lésions se développent préférentiellement au niveau de l’intima des artères de gros et moyen calibre (55). La formation de la plaque fait intervenir des cellules vasculaires comme les cellules endothéliales, des cellules inflammatoires de l’immunité naturelle comme les monocytes/macrophages et des cellules de l’immunité adaptative, les lymphocytes T CD4+ (20). 8 Lumière monocyte lymphocyte LDL 4 1 chimiokines Endothélium 3 macrophage Intima CPA 2 LDLox 6 5 Cellule spumeuse CML Illustration 1 : principales étapes de formation de la plaque d’athérosclérose 1 : passage des LDL dans l’intima 2 : oxydation des LDL 3 : activation endothéliale avec expression de molécules d’adhésion et production de chimiokines 4 : adhésion puis diapédèse des monocytes et des lymphocytes circulants 5 : phagocytose des lipides et des débris cellulaires par les macrophages qui deviennent des cellules spumeuses 6 : interactions entre les différentes cellules inflammatoires qui participent à la progression de la plaque 9 1 - Pénétration des lipoprotéines dans l’intima Les toutes premières étapes du processus athéroscléreux sont caractérisées par l’accumulation de lipoprotéines de basse densité (LDL) dans l’espace sous-endothélial ainsi que par le recrutement et la pénétration de monocytes circulants dans l’intima. La chronologie précise de ces évènements est restée longtemps obscure. Toutefois, une étude réalisée sur des aortes de fœtus (portés par des mères normo- ou hypercholestérolémiques) a apporté des éclaircissements à ce sujet. Dans les stries lipidiques, déjà présentes in utero, il est possible d’observer une accumulation de LDL en l’absence de macrophages, mais jamais l’inverse. De plus, la présence de macrophages est toujours associée à celle des LDL oxydées (LDLox), alors que les lésions riches en LDL natives, non modifiées sont exemptes de macrophages. Ce travail histologique descriptif de Napoli et al. a permis d’écrire le scénario des toutes premières étapes de formation de la plaque d’athérosclérose : infiltration lipidique, modifications oxydatives des LDL, puis recrutement des monocytes/macrophages (45). 2 - Activation endothéliale et recrutement des monocytes/macrophages À côté des facteurs chimiques précédemment décrits, il existe des facteurs physiques qui participent à l’activation endothéliale. Pour l’illustrer, on peut citer le fait que les plaques d’athérosclérose se développent préférentiellement au niveau des zones de bifurcations, là où le flux sanguin est turbulent et où les forces de cisaillement sont faibles. Les forces de cisaillement constituent d’ailleurs une information permanente pour les cellules endothéliales et les maintiennent dans un état « non-activé » (7). Toute modification de ce signal mécanique s’accompagne rapidement d’une modification du statut endothélial. Chez l’animal sensible à l’athérosclérose, il a été montré qu’au niveau des zones de bifurcation, bien avant l’apparition des stries lipidiques, les cellules endothéliales ont un phénotype pathologique et expriment NF-"b, un facteur de transcription nucléaire qui commande l’expression de nombreux gènes de l’inflammation (19). Les cellules endothéliales, une fois activées, expriment plusieurs types de chimiokines et de molécules d’adhérence leucocytaires qui permettent aux cellules sanguines de rouler puis d’adhérer à la surface vasculaire. P-sélectine, VCAM-1 et IL-8 sont les plus importantes à ce stade (5, 6). Par la suite, des chimiokines, comme Monocyte Chemokine Protein-1 (MCP-1) (51), produites par les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses, stimulent la migration des cellules inflammatoires vers le sous-endothélium (illustration 1). L’importance et le rôle des protéines précédemment citées ont été mis en évidence par plusieurs études 10 animales qui ont montré que leur blocage pharmacologique ou leur délétion génétique (47) induit une diminution considérable de la taille des lésions d’athérosclérose ainsi qu’une diminution de l’infiltration des monocytes/macrophages. 3 - Rôle pathogène des monocytes/macrophages Le rôle pathogène des monocytes/macrophages dans le développement de la plaque d’athérosclérose est évoqué depuis longtemps car les plaques d’athérosclérose sont très riches en macrophages, surtout aux stades précoces (illustration 2). Les études animales ont confirmé ce point. L’invalidation du gène codant pour M-CSF, un facteur de croissance indispensable à la prolifération et/ou la maturation des monocytes en macrophages, empêche le développement de l’athérosclérose, malgré des taux de cholestérol circulant très élevés (51). Les macrophages, via certains récepteurs « scavengers » (SR-AI, SR-AII, CD36…), phagocytent des LDL oxydées, des phospholipides, des débris cellulaires et deviennent des cellules spumeuses. Ils entretiennent le processus inflammatoire en produisant des cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-12 (qui activent les lymphocytes T CD4+ pathogènes) et participent à déstabiliser la plaque en sécrétant, entre autres, des radicaux libres oxygénés et des métalloprotéases matricielles. Illustration 2 : Détection par immunohistochimie des macrophages (rouge-brun) au sein de la plaque d’athérosclérose (grossissement X10) Ces cellules inflammatoires ont un rôle dans le développement de la plaque mais aussi dans sa vulnérabilité. Cette conclusion résulte des travaux anatomopathologiques réalisés notamment par l’équipe de Virmani qui a comparé la composition des plaques coronaires rompues par rapport à celle de plaques stables prélevées sur des cadavres humains. Elle a montré que les plaques rompues, responsables d’évènements ischémiques, sont caractérisées par une 11 infiltration considérable de cellules inflammatoires et par une diminution des éléments stabilisants comme les cellules musculaires lisses et le collagène (illustration 3) (28). Type cellulaire (%) * * * Illustration 3 : composition de plaques d’athérosclérose stables ou rompues, évaluées en immunohistochimie sur coupes d’artères coronaires humaines post-mortem (Adapté de Kolodgie et al. Am J Pathol 2000). 4 - Rôle des lymphocytes T CD4+ dans l’athérosclérose 4.1 - Rôle pathogène des lymphocytes T CD4+ Il a fallu attendre plusieurs années pour montrer que les lymphocytes T CD4+ ont aussi un rôle pathogène dans l’athérosclérose. Tout d’abord, ils sont présents dans les plaques, surtout au stade précoce où ils représentent 10 à 20 % de la population cellulaire totale. Ensuite, ils sont activés car ils se trouvent fréquemment co-localisés en immunohistochimie avec le Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe II (CMH II). En 1997, deux études explorant le rôle des lymphocytes dans l’athérosclérose ont apporté des résultats contradictoires. Daugherty et al. ont montré que les souris apoE/RAG2-/-, sensibles à l’athérosclérose et déficientes en lymphocytes, sous un régime riche en matières grasses, développaient autant de lésions que les souris apoE-/- contrôles (9). La même année, Dansky et al. ont rapporté que les souris immunodéficientes (ApoE/RAG-/-) développaient deux fois moins de lésions au niveau de la crosse aortique que les souris immunocompétentes, sous un régime normal (8). L’apparente contradiction entre ces résultats peut s’expliquer par les différences de régime et donc par les niveaux d’hypercholestérolémie. Les lymphocytes semblent avoir un rôle dans l’athérosclérose mais uniquement en cas d’hypercholestérolémie modérée. Trois ans plus tard, une étude suédoise a permis de trancher en montrant que l’absence de lymphocytes T et B, obtenue en croisant des animaux déficients pour l’apolipoprotéine E (apoE -/-) avec des souris SCID-/-, induit une diminution de 90% de la taille des lésions au niveau du sinus aortique. De 12 plus, l’injection intraveineuse de lymphocytes CD4+ chez ces animaux apoE/SCID-/- s’est accompagnée d’une augmentation considérable des lésions d’athérosclérose aussi bien au niveau de la crosse de l’aorte que du sinus aortique (61). La réapparition de la maladie artérielle à un niveau quasi identique à celui des souris immunocompétentes, est la démonstration directe du rôle pathogène des lymphocytes T CD4+ dans l’athérogénèse. En plus de leur rôle dans le développement de la maladie, les lymphocytes sont aussi impliqués dans la déstabilisation et la rupture de la plaque comme l’atteste leur accumulation dans les plaques compliquées, essentiellement au niveau des zones de rupture (illustration 3). 4.2 - La voie Th1 est pro-athérogène Les lymphocytes T CD4+ impliqués dans l’athérosclérose sont essentiellement de type Th1. Ils produisent de grandes quantités d’Interféron # (IFN#) et d’IL-2 contrairement aux lymphocytes T de type Th2 qui produisent de l’IL-4, de l’IL-5 et de l’IL-13. L’IFN# est retrouvé en immunohistochimie dans les plaques d’athérosclérose dans les mêmes régions que les cellules T. Le transfert in vivo de lymphocytes T CD4+, réalisé dans le travail précédemment décrit, s’accompagne d’une augmentation considérable des taux plasmatique et splénique d’IFN# (61). In vivo, Gupta a confirmé le rôle pro-athérogène de l’IFN# en montrant que l’inactivation de son récepteur réduit de 60% les lésions aortiques (16) tout en induisant un phénotype lésionnel stable. L’effet pro-athérogène de cette cytokine passe par de nombreuses voies : activation des macrophages et des cellules endothéliales, inhibition de la prolifération des cellules musculaires lisses et inhibition de la production de collagène (55). De nombreuses études ont montré que des cytokines ou des facteurs de transcription nucléaire impliqués dans l’activation et/ou la différenciation des cellules Th1 participent aussi à la progression de l’athérome. La différenciation des lymphocytes T nécessite leur interaction avec des cellules dendritiques, qui sont des cellules présentatrices d’antigène (32). L’IL-12 produite par les cellules dendritiques joue un rôle majeur dans la différenciation Th1 des lymphocytes CD4+ puisque la souris déficiente en IL-12 n’est plus capable d’induire une réponse de type Th1. D’ailleurs, la déficience en IL-12 chez des souris sensibles à l‘athérosclérose (apoE/IL12-/-) s’accompagne d’une diminution des lésions athéromateuses (10). IL-18 est aussi une cytokine pro-athérogène qui stimule la production lymphocytaire d’IFN#. L’injection d’IL-18 recombinante, chez la souris, induit une augmentation de la taille des plaques d’athérosclérose tout en augmentant la production systémique d’IFN#. L’injection 13 d’IL-18 n’a plus effet chez la souris déficiente en IFN# (60). Dans le laboratoire, il a été montré que le blocage in vivo de l’IL-18 par son inhibiteur physiologique l’IL-18BP (Binding Protein) permet une diminution de la taille des lésions chez la souris tout en induisant un phénotype lésionnel stable (36). De plus, l’IL-18 est exprimée dans les plaques athéroscléreuses humaines et son taux au sein des lésions vasculaires (évalué en PCR quantitative) est plus important chez les patients symptomatiques (AIT ou AVC) que chez les patients asymptomatiques (35). A l’étage coronaire enfin, il a été montré sur une cohorte de plus de 1 000 patients que le taux d’IL-18 plasmatique est un facteur pronostique d’évènements cardiovasculaires (3). 4.3 - La voie Th2 est potentiellement pro-athérogène Les lymphocytes de type Th2, producteurs d’IL-4, ont d’abord été considérés comme protecteurs contre le développement de l’athérosclérose. Ces premières conclusions proviennent de travaux explorant la voie humorale dépendante de la voie Th2. Chez la souris, la splénectomie induit une augmentation de la taille des plaques ainsi qu’une diminution des taux d’anticorps anti-LDLox de type IgM (4). De plus, l’immunisation de souris apoE-/- avec des LDLox induit des taux élevés d’anticorps circulants et s’accompagne d’une diminution des plaques d’athérosclérose (11, 12, 46). Ces anticorps « protecteurs » sont produits par des lymphocytes de type B1, eux-mêmes sous le contrôle de l’Il-5, une cytokine de type Th2. Cependant, plusieurs travaux récents remettent en cause l’effet anti-athérogène de la voie Th2. Chez l’animal, lorsque l’on invalide le gène codant pour l’IL-4, une des principales cytokines de la voie Th2, on diminue la taille des plaques au niveau du sinus aortique et au niveau de la crosse aortique (26). De plus, la retransplantation de moelle osseuse déficiente en IL-4, chez la souris déficiente en récepteur au LDL, a confirmé ce résultat (10). Les études épidémiologiques ont ajouté un argument de poids chez l’homme en montrant que le risque cardiovasculaire des patients atteints d’asthme, une maladie de type Th2, est nettement supérieur à celui des patients non asthmatiques (27). Dès lors, la théorie qui oppose la voie Th1 à la voie Th2 comme le Bien et le Mal dans l’athérogénèse est devenue critiquable. 4.4 - Un sous-type de lymphocytes T protecteurs contre l’athérosclérose En l’absence de preuves suffisantes d’une contre-régulation protectrice de Th2 sur Th1 dans l’athérosclérose, nous avons émis l’hypothèse que, dans le contexte de l’athérosclérose, la dysfonction lymphocytaire T est liée à un défaut de régulation par des cellules T régulatrices qui contrôlent leur action en amont (33). Cette théorie est d’autant plus séduisante que la 14 génération et le mode d’action des lymphocytes T régulateurs fait intervenir l’IL-10 et le Transforming Growth Factor ! (TGF!), 2 cytokines clairement identifiées comme antiinflammatoires et anti-athérogènes. 4.4.1 - IL-10 et le TGF! sont anti-athérogènes Mallat et al. ont été les premiers à montrer que la déficience en IL-10 chez la souris aggravait l’athérosclérose avec des plaques plus importantes et beaucoup plus inflammatoires au niveau du sinus aortique (34, 39). Ces travaux ont été confirmés par plusieurs équipes en utilisant différents modèles. Chez les coronariens et chez les patients porteurs de sténoses carotidiennes (22, 57), les taux plasmatiques d’IL-10 sont prédictifs d’évènements cardiovasculaires. Robertson et al. ont créé récemment la souris invalidée à la fois sur le gène codant pour l’apoE et sur le gène codant pour le récepteur au TGF!. Ces souris sont caractérisées par des lésions plus importantes que les animaux contrôles (taille des plaques multipliée par 7 au niveau de l’aorte thoracique, par 3 au niveau du sinus aortique) et plus inflammatoires. Sur le plan immunologique, les taux d’IFN# et d’IL-4 dans les plaques d’athérosclérose et dans la rate sont très augmentés, confirmant le rôle majeur du TGF! dans le contrôle de Th1 et de Th2 (21, 48). Dans le laboratoire, il a été montré, sur deux autres modèles, que le blocage du TGF!, induit une augmentation de la taille des lésions d’athérosclérose avec un phénotype lésionnel plus inflammatoire (13, 38). 4.4.2 - Les lymphocytes T régulateurs (Tregs) Les Tregs ont été étudiés en immunologie, dans le cadre des maladies auto-immunes. Ils participent à l’homéostasie immunitaire et inhibent les lymphocytes T auto-réactifs (49, 50, 58). Ils ont comme points communs une prolifération cellulaire faible en culture et la capacité d’inhiber la prolifération et la production de cytokines des lymphocytes T pathogènes. Dans cette famille, on distingue entre autres : - Les lymphocytes T régulateurs naturels CD4+CD25+, produits dans le thymus au cours de la vie fœtale. Ils expriment de grandes quantités de CD25 à leur surface (CD25 high), le facteur de transcription nucléaire FOXP3 et ne sécrètent que peu de cytokines (49). - Les lymphocytes T régulateurs adaptatifs de type Tr-1 ou Th3. Les Tr-1 produisent de grandes quantités d’IL-10 mais peu d’IL-4 et d’IFN# (15). Les Tr-1 peuvent être générés in vivo en réponse à une stimulation antigénique dans la muqueuse nasale (41, 56). Les 15 lymphocytes de type Th3, producteurs de TGF!, peuvent être générés in vivo en réponse à une stimulation antigénique au niveau de la muqueuse digestive (59). 4.4.3 - Les Tregs protecteurs contre l’athérosclérose Dans le laboratoire, en 2003 Mallat et al. ont apporté la preuve de concept que les Tregs de type Tr-1 peuvent moduler l’inflammation in vivo et limiter la progression de l’athérosclérose. Ils ont montré que l’injection de ces cellules T de type Tr-1, uniquement en présence de leur antigène spécifique, diminue la taille des plaques d’athérosclérose chez la souris apoE-/-, inhibe la réponse inflammatoire Th1 et Th2 et s’accompagne d’une augmentation considérable de la production d’IL-10 par les lymphocytes T spléniques (37). Plus récemment, nous avons identifié le rôle protecteur des lymphocytes T régulateurs naturels CD4+CD25+ contre le développement de l’athérosclérose expérimentale. En utilisant plusieurs modèles murins, nous avons montré que la déplétion en Tregs naturels s’accompagne d’une accélération de la maladie athéroscléreuse et que la reconstitution d’un pool physiologique de ces cellules empêche la maladie. De plus, l’injection de Tregs naturels stabilise les plaques avec des lésions moins riches en cellules inflammatoires (macrophages, lymphocytes T) et plus riches en collagène et en cellules musculaires lisses (1). D’ailleurs, ces travaux commencent à trouver une relevance chez l’homme puisqu’il a été récemment montré que les Tregs naturels sont diminués quantitativement chez les patients coronariens instables par rapport aux patients avec angor stable. De plus, les Tregs isolés de patients coronariens instables sont moins fonctionnels que les Tregs des sujets contrôles car, in vitro, ils sont moins capable d’inhiber la prolifération les lymphocytes T effecteurs pathogènes (42). 16 III - La nucléoprotéine du virus de la rougeole 1 - Modulation immuno-inflammatoire par le virus de la rougeole La rougeole est un virus extrêmement contagieux responsable d’épidémies touchant environ 40 millions d’individus par an dans le monde. Les premiers éléments évoquant ses propriétés immunosuppressives proviennent d’observations épidémiologiques, qui ont rapporté que la mortalité consécutive à l’infection est essentiellement liée à des surinfections bactériennes (14). Chez l’homme, il a ensuite été montré que les enfants infectés ont une diminution de l’hypersensibilité cutanée au 2,4 dinitrochlorobenzene ou encore une anergie après une injection intradermique de tuberculine (54). Dans un autre domaine, il a été rapporté des cas de guérison de maladies immuno-inflammatoires, comme le syndrome néphrotique ou la dermatite atopique, chez des enfants infectés par le virus de la rougeole (31). In vitro, plusieurs publications ont mis en évidence que les lymphocytes circulants, prélevés chez des sujets infectés par ce virus, perdent leur capacité à proliférer en réponse à une stimulation puissante (23). De plus, l’infection par le virus de la rougeole module la production de cytokines par les cellules inflammatoires. Les monocytes de patients africains (Gambie) infectés par le virus de la rougeole produisent moins d’IL-12 que les cellules contrôles. Cet effet existe aussi bien à la phase aigue que 8 mois après l’infection (2). Plus récemment, d’autres travaux fondamentaux ont décrit que l’infection in vitro de cellules dendritiques par le virus de la rougeole diminue la production d’IL-12 (18). Cet effet est d’autant plus intéressant que l’IL-12 produite par les cellules présentatrices d’antigènes est pro-athérogène et qu’elle polarise les lymphocytes CD4+ vers un type Th1. 2 - Modulation immuno-inflammatoire par la nucléoprotéine du virus de la rougeole Horvat et al. ont récemment montré, sur un modèle murin d’hypersensibilité retardée mettant en jeu les lymphocytes CD4+, qu’un traitement préventif par des injections répétées d’une nucléoprotéine (NP) extraite du virus de la rougeole permettait de diminuer l’inflammation (40). En effet, les souris C57BL6, après une injection intra-péritonéale de NP, étaient exposées par voie cutanée à un agent sensibilisant, le dinitrofluorobenzene (DNFB). L’épaississement inflammatoire mesuré au niveau de l’oreille était 3 fois moins important chez les animaux traités par la nucléoprotéine virale. Les lymphocytes T CD4+, isolés de 17 souris sensibilisées et traitées par NP, mis en présence de cellules présentatrices d’antigènes (CPA) et de DNFB, prolifèrent moins in vitro que les lymphocytes extraits de souris traitées par PBS. De plus, les lymphocytes T extraits de souris sensibilisées et traitées par une solution saline, prolifèrent très peu lorsqu’ils sont mis en présence de DNFB et de CPA isolées de souris traitées par NP. Ainsi, la nucléoprotéine NP semble affecter les propriétés à la fois des lymphocytes T CD4+ et des CPA. 18 IV – OBJECTIFS DE L’ETUDE L’athérosclérose étant une maladie inflammatoire et la nucléoprotéine NP une protéine virale aux propriétés immunosuppressives et anti-inflammatoires bloquant la voie Th1, nous avons évalué si le traitement de souris sensibles à l’athérosclérose par cette protéine virale était capable d’influer sur la taille des plaques athéroscléreuses et/ou leur composition en cellules inflammatoires. Des souris apoE-/- « jeunes » (âgées de 12 semaines) et « vieilles » (30 semaines) ont été traitées pendant 12 semaines par des injections intra-péritonéales de nucléoprotéine provenant du virus de la rougeole afin d’évaluer l’effet de ce traitement sur le développement et la progression de l’athérosclérose. Dans le même temps, nous avons analysé le phénotype des cellules immunitaires en étudiant leur prolifération et leur production de cytokines en réponse à différentes stimulations. 19 V - MATERIEL ET METHODES 1 - Souris Nous avons utilisé des souris mâles apoE-/-, de fond génétique C57BL6, fournies par Iffa Credo (Charles River, Lyon, France). Elles se répartissent en un groupe de souris dites « jeunes » âgées de 12 semaines au moment où commence le traitement et un groupe de souris « vieilles » âgées de 30 semaines lorsque débute le traitement. Elles ont été élevées dans une animalerie conventionnelle et nourries avec un régime normal. N’exprimant pas la protéine apoE, elles développent spontanément une hypercholestérolémie sans qu’il soit nécessaire de recourir à un régime riche en matières grasses. Nous avons aussi utilisé des souris apoE/RAG2-/- femelles âgées de 6 semaines qui nous ont été fournies par le Pr Pierre Gourdy (Inserm U589, Toulouse). Ces souris sont déficientes en apolipoprotéine E et sont génétiquement mutées sur le gène codant pour une enzyme (Recombinase A Clivating Gene) indispensable pour créer le répertoire TCR (dans les lymphocytes T) et le répertoire des immunoglobulines (dans les lymphocytes B). Ainsi ces animaux sont sensibles à l’athérosclérose et sont déficientes en lymphocytes T et B. Elles développent des plaques d’athérosclérose lorsqu’elles sont mises sous régime riche en matières grasses (21% lipides, 1,5% cholestérol). 2 - Traitement Les souris « jeunes » ont été réparties en 2 groupes : - Un groupe placebo, constitué de 6 souris, traité par des injections de sérum physiologique ; - Un groupe NP, constitué de 6 souris, traité par des injections de 20µg de nucléoprotéine. Le traitement chez des souris « jeunes » a été répété deux fois. Les souris « vieilles » ont été réparties en 3 groupes : - Un groupe de 5 souris sacrifiées le jour où débute le traitement à l’age de 30 semaines (TO) ; - Un groupe placebo, constitué de 9 souris, traité par des injections de sérum physiologique ; - Un groupe NP, 9 souris, traité par des injections de 20µg de nucléoprotéine. Les injections étaient faites par voie intra-péritonéale après désinfection abdominale par une solution antiseptique (Bétadine). Les injections diluées dans 0,2 mL de sérum physiologique 20 étaient pratiquées toutes les 2 semaines pendant une durée totale de 12 semaines. Les souris « jeunes » ont été sacrifiées à l’âge de 24 semaines et les souris « vieilles » à 42 semaines. La nucléoprotéine recombinante, dérivée du virus de la rougeole, a été produite dans le système baculovirus (Pharmingen). Elle nous a été fournie par Branka Horvat qui dirige le laboratoire d’« Immunobiologie clinique et fondamentale » à Lyon. Enfin des souris sensibles à l’athérosclérose et déficientes en lymphocytes T et B (apoE/RAG2-/-) âgées de 6 semaines (n=7), ont été traitées par une injection intra-péritonéale (NP ou sérum physiologique) tous les 15 jours pendant 6 semaines. Le traitement a été associé à un régime riche en matières grasses et en cholestérol (Western diet). 3 - Analyse de l’athérosclérose Au terme de ces 12 semaines de traitement, les souris ont été anesthésiées à l’isoflurane pour le prélèvement sanguin puis elles ont été sacrifiées par fracture cervicale. Le cœur, l’aorte thoracique, la rate ont été constamment prélevés. 3.1 - Dosage des lipides plasmatiques Le sang a été recueilli au niveau de l’angle interne de l’œil des souris sédatées, mises à jeûn 12 heures auparavant. Après centrifugation, le plasma recueilli a été utilisé pour le dosage du cholestérol total et du HDL-cholestérol. Les dosages ont été réalisés à l’aide d’un kit Infinity Cholestérol (Sigma). 3.2 - Dosage des anticorps circulants. Nous avons dosé les anticorps anti-LDL oxydés de type IgM par la méthode «doublesandwich» ELISA. Les puits ont été tapissés avec des anticorps de capture, fraction F(ab’)2 de souris. Ensuite ils ont été recouverts de LDL, purifiés du plasma de souris apoE-/- et oxydés au cuivre à 37°C pendant 24 heures. Le plasma des souris traitées a été réparti dans chaque puits suivi de 2 lavages au PBS. Enfin, un anticorps anti-souris couplé à une activité phosphatase alcaline a été appliqué. L’ajout du substrat de cette dernière enzyme a déclenché une réaction colorimétrique qui a permis de chiffrer les taux d’anticorps anti-LDL oxydés (spectrophotométrie à 450 nm). 21 3.3 - Analyses morphométriques Après les prélèvements, le foie a été congelé puis conservé à – 80°C. Le cœur et l’aorte thoracique en revanche ont été placés dans un bain de paraformaldéhyde 4 % pendant au moins deux heures puis seul le cœur était transféré dans une solution de PBS-sucrose 30 % (Fluka) pendant la nuit. Le lendemain, le cœur a été inclus dans un gel « tissue-tek » (Sakura), puis cryocongelé à – 80°C. Des coupes sériées de 10 µm d’épaisseur ont été réalisées par la suite, à raison de 16 lames par cœur. Les coupes ont été disposées successivement sur des lames numérotées de façon à ce que chaque lame possède 4 à 5 coupes représentatives de l’ensemble du sinus aortique. Les coupes ont été réalisées au niveau du sinus aortique, au contact des sigmoïdes aortiques. Une lame a été destinée à la détection des dépôts lipidiques par coloration à l’huile rouge (Oil Red, Sigma). Lors de cette coloration, les coupes ont été plongées dans l’huile rouge pendant 10 minutes, rincées dans l’eau et contre-colorées à l’hématoxyline (Réactif RAL) avant d’être montées avec du Fluorep (bioMérieux). Une autre lame a été utilisée pour la détection du collagène par coloration au rouge Sirius (Gurr). Le reste des lames était utilisé pour l’analyse immunohistochimique. L’aorte thoracique a été préparée sous loupe binoculaire avec notamment une excision soigneuse des franges graisseuses sur la face externe du vaisseau puis coupée dans le sens de la longueur. Après coloration à l’huile rouge dans un bain pendant 30 minutes, l’aorte thoracique a été étalée et fixée entre lame et lamelle. La quantification du marquage a été réalisée sous microscopie, avec l’aide d’un logiciel informatique de planimétrie (Histolab). 3.4 - Analyses immunohistochimiques L’immunohistochimie permet l’analyse de la composition cellulaire de la plaque athéroscléreuse : détection des cellules musculaires lisses vasculaires par un anticorps anti-$actine (clone IA4, conjugué à l’alcaline phosphatase, dilution 1/100, Sigma), des macrophages par l’anticorps MOMA-2 (MAB1852, dilution 1/100, Abcys) et des lymphocytes T par un anticorps anti-CD3% (M-20, J148, dilution 1/ 30, Santa Cruz). Les coupes ont d’abord été rincées au PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7,40, Sigma), plongées dans un bain d’ H2O2 3% pendant 5 minutes avant d’être incubées 30 minutes avec un sérum bloquant les sites non spécifiques (même origine que l’anticorps secondaire, dilution 1/10). Nous avons ensuite déposé sur les coupes 100 µL de l’anticorps primaire, une heure 22 durant. Les lames ont été rincées et incubées pendant 1 heure avec l’anticorps secondaire biotinylé correspondant (vector) dans un premier temps, puis avec la peroxydase couplée à l’avidine-biotine (kit ABC de chez Vectastain) dans un second temps. Les marquages ont été finalement révélés par ajout d’un substrat de la peroxydase, l’AEC (3-Amino-9-EthylCarbazole, Sigma). En ce qui concerne l’$-actine, la révélation s’est faite directement par adjonction de NBT/BCIP (Roche), substrat de la phosphatase alcaline. 3.5 - Analyses immunologiques 3.5.1 - Les cellules dendritiques Après le sacrifice, les rates ont été isolées dans des conditions stériles, broyées puis tamisées ; Les splénocytes recueillis ont été mis en suspension dans un milieu de culture (RPMI 1640 Medium With Glutamax-1, Gibco). Le contenu cellulaire a été évalué en utilisant une cellule de Mallassez. Pour isoler les cellules dendritiques, nous avons utilisé un kit MACS (Miltenyi Biotec). Les splénocytes totaux, provenant des rates broyées, ont été homogénéisés dans un milieu de culture (RPMI 1640 Medium With Glutamax-1, Gibco + 10 % SVF + 1 % Pénicilline / Streptomycine + 500 µL Mercaptopurinol (20 mmol/L)). Après la lyse des globules rouges par une solution « Red blood cell lysing » commercialisée par Sigma, les cellules ont été resuspendues dans une solution de PBS/SVF 2 % et comptées à l’aide d’une cellule de Mallassez. Les splénocytes ont été incubés avec un anticorps anti-CD11c couplé à des billes magnétiques puis ont été perfusés dans une colonne, elle-même placée dans un champ magnétique. Les cellules CD11c+, ayant fixé des anticorps marqués, ont été retenues dans la colonne et toutes les autres cellules ne portant pas cet antigène ciblé, ont été recueillies à l’extrémité inférieure de la colonne. Dans un second temps, la colonne a été rincée vigoureusement en dehors du champ magnétique pour recueillir notre population d’intérêt. On parle alors d’isolation positive. Les cellules dendritiques des différents groupes de souris traitées ont été réparties dans des puits de 500 µL contenant chacun 200.103 cellules puis stimulés par LPS (10 µg/puit) et IFN# (100 U/puit). Après 48 heures de stimulation, le surnageant a été recueilli et utilisé pour doser deux cytokines : L’IL-10 et l’IL-12. 23 Pour doser les cytokines, nous avons utilisé une technique de « Double-sandwich » ELISA. Le fond des puits a été recouvert d’un anticorps de « coating » dirigé contre la cytokine d’intérêt (anti-IL10, anti-IL12) et commercialisé par Pharmingen. Après application d’une solution saturante (200 µL), nous avons déposé pendant une heure 100 µL du surnageant provenant du milieu de culture des splénocytes stimulés. Nous avons rincé plusieurs fois pour éliminer les liaisons aspécifiques et nous avons ajouté 100 µL d’anticorps biotinylé spécifique de la cytokine d’intérêt, pendant une heure. Nous avons ajouté ensuite la peroxydase couplée à l’avidine (qui se fixe sur les anticorps ayant reconnu la cytokine spécifique) et enfin le substrat de la peroxydase. La densité optique de chaque puit, lue à 450 nm sur le spectrophotomètre, a été comparée à une gamme de concentration connue et a permis de quantifier la concentration de la cytokine d’interêt dans le surnageant. 3.5.2 - Les lymphocytes T CD4+ 3.5.2.1 - Isolation des lymphocytes CD4+ Pour isoler les lymphocytes T CD4+, nous avons utilisé un kit MACS (Miltenyi Biotec). Les splénocytes totaux, provenant des rates broyées, ont été homogénéisés dans un milieu de culture. Après la lyse des globules rouges par une solution « Red blood cell lysing » commercialisée par Sigma, les cellules ont été resuspendues dans une solution de PBS/SVF 2 % et comptées à l’aide d’une cellule de Mallassez. Les splénocytes ont été, dans un premier temps, mélangés avec un cocktail d’anticorps biotinylés dirigés contre les antigènes de surface des cellules de la rate à l’exception des antigènes présents à la surface des lymphocytes T CD4+ (Anticorps anti-CD8, anti-CD11, anti-CD45R, anti-DX5 et anti-ter119). Dans un second temps, nous avons ajouté un anticorps secondaire anti-biotine couplé à des billes magnétiques ; la solution finale a été perfusée dans une colonne, elle-même placée dans un champ magnétique. Les cellules ayant fixé des anticorps marqués ont été retenues dans la colonne et seules les cellules ne portant aucun des antigènes ciblés, en l’occurrence les lymphocytes T CD4+, ont été recueillies à l’extrémité inférieure de la colonne. On parle cette fois de sélection négative. Pour évaluer l’efficacité de cette méthode d’isolement de cellules, nous avons quantifié par cytométrie en flux le pourcentage de cellules CD4+ dans la population cellulaire totale avant et après la procédure. Le pourcentage de lymphocytes T CD4+ initiale de 25 % environ a atteint plus de 90 % après la procédure. 24 Les lymphocytes T CD4+ ont été comptés avec une cellule de Mallassez et répartis dans des puits contenant chacun 100.103 cellules, 200 µL de milieu de culture. Les cellules ont été stimulées pendant 48 heures par un anticorps « coâté » anti-CD3 (2 !g/ml), et par des cellules dendritiques (20.103/puit). Ensuite, le surnageant a été recueilli afin de doser les cytokines sécrétées selon la méthode de double-ELISA décrite au paragraphe précédent. 3.5.2.2 - Isolation des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+ L’isolation des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+ (Tregs) a été faite à partir des lymphocytes CD4+ purifiés précédemment, par sélection positive sur colonne en utilisant des billes magnétiques (Miltenyi Biotec). Les cellules CD4+ sont incubées avec un anticorps primaire anti-CD25 biotinylé (7D4 BD Pharmingen). Après un lavage avec le tampon PBS, les cellules sont incubées avec des billes anti-biotine. La suspension est filtrée sur une colonne placée dans un champ magnétique permettant de retenir uniquement les Tregs. Les cellules retenues dans la colonne magnétique correspondent aux Tregs CD4+CD25+ et la fraction recueillie à la sortie de la colonne correspond aux cellules effectrices CD4+CD25-. 3.5.2.3 - Co-culture des cellules isolées Les cellules isolées sont cultivées en milieu complet RPMI 1640 dans des plaques de 96 puits à fond plat. Dans chaque puit, une stimulation a été réalisée par ajout d’anticorps agoniste anti-CD3 (1 !g/mL). Les co-cultures ont été systématiquement réalisées en « triplicate ». La prolifération des effecteurs a été tout d’abord étudiée par incubation de 50.103 effecteurs avec 10.103 cellules dendritiques (DC) dans un volume total de 200 !L. De même, les Tregs ont été incubés à une concentration de 50.103 cellules avec 10.103 DC. Le pouvoir régulateur des Tregs a été ensuite évalué en incubant des concentrations décroissantes de Tregs avec un nombre fixe d’effecteurs et de DC. Les concentrations des effecteurs et des DC restaient inchangées, respectivement 50.103 et 10.103 cellules par puits. Les Tregs ont été ajoutés à des concentrations diluées (1/1) 50.103 cellules, (1/2) 25.103 cellules, (1/4) 12,5.103 cellules et (1/8) 6,25.103 cellules. Le pouvoir régulateur, exprimé en pourcentage d’inhibition, correspond à la capacité des Tregs à inhiber la prolifération des effecteurs. 3.5.2.4 - Mesure de la prolifération cellulaire Pour mesurer la prolifération cellulaire, après la période de culture in vitro de 72 heures, nous avons ajouté 10 !L de thymidine tritiée (1 µCi/puit, Amersham) pour une durée de 18 heures. 25 Au terme de cette période, la plaque contenant les lymphocytes a été transférée sur une membrane et l’incorporation cellulaire de thymidine, reflet de la prolifération cellulaire a été révélée par un compteur à scintillation de marque TopCount NXT scintillation counter (Perkin Elmer). 3.5.2.5 - Analyse en Cytométrie de flux L’association de marquages CD4+CD25+Foxp3+ a été réalisée sur la population de splénocytes totaux avec un anticorps anti-CD4 couplé à l’isothiocyanate de fluoresceine (FITC) (clone GK1.5, Miltenyi), un anticorps anti-CD25 biotinylé (clone PC61.5, eBioscience) et un anticorps anti-Foxp3 couplé à la Phycoerythrine (PE) (clone FJK-16s, eBioscience). Marquage membranaire Après une centrifugation de 6 minutes à 1600 tpm (tour par minute), les cellules ont été resuspendues à une concentration de 106 cellules/ml dans du PBS 3% SVF puis réparties dans différents tubes à raison de 100 !l par tube. Un traitement par un anticorps CD16/CD32 (2.4G2 BD Pharmingen), bloquant les récepteurs Fc" non spécifiques, a été effectué pendant 5 minutes à 4°C. Les anticorps CD4 FITC et CD25 biotinylé ont été ajoutés directement dans les tubes correspondants puis incubés 30 minutes à 4°C. Un lavage avec la solution de PBS 3 % SVF suivi d’une centrifugation a permis d’éliminer l’excédent d’anticorps non fixés. Pour le marquage CD25 biotinylé, un marquage secondaire a été effectué avec un anticorps streptavidine phycoerythrine-Cyanine-5 (PE-Cy5), incubé pendant 30 minutes dans l’obscurité à 4°C. L’excès d’anticorps secondaire est éliminé par un lavage. Enfin, pour les tubes de marquage uniquement membranaire, les cellules ont été fixées par une solution tamponnée de paraformaldéhyde à 1 %. Perméabilisation et marquage Foxp3 intracellulaire Le facteur de transcription Foxp3 est un marqueur intracellulaire spécifique des Tregs, sa détection par cytométrie en flux permet de définir précisément la population d’intérêt. Suite aux marquages de surface CD4/CD25, une perméabilisation cellulaire a été effectuée pour détecter le facteur de transcription Foxp3 à l’aide d’un kit de perméabilisation (eBioscience). Les cellules ont été resuspendues dans 1 ml de solution de fixation/peméabilisation et incubées à 4°C pendant 18 heures dans l’obscurité. Deux lavages avec 2 ml de tampon de perméabilisation ont été réalisés avant le blocage des récepteurs Fc" 26 par l’anticorps CD16/CD32. L’incubation avec l’anticorps anti-Foxp3 a été réalisée pendant 30 minutes à 4°C suivis de 2 lavages et enfin d’une suspension dans le tampon de perméabilisation. Les contrôles isotypiques correspondant aux anticorps utilisés ont permis les réglages du cytomètre. 4 - Analyses statistiques Les données ont été exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne. La significativité statistique a été déterminée par un test ANOVA. Une valeur de P inférieure à 0,05 étant considérée comme statistiquement significative. 27 VI – RESULTATS : Etude du développement des lésions chez les souris « jeunes » 1 - Effets du traitement par NP sur la taille des plaques d’athérosclérose Le taux de cholestérol plasmatique et HDL cholestérol est similaire chez les souris traitées par placebo et par NP. Le poids des souris placebo n’est pas différent de celui des souris du groupe NP (p=0,95) ; respectivement 29,5 ± 1,5 g et 29,5 ± 0,5 g. Dans un premier temps, nous avons examiné les aortes thoraciques en évaluant l’étendue des lésions lipidiques, par coloration à l’huile rouge. Nous n’avons pas constaté de différence en ce qui concerne la surface ainsi colorée chez les souris traitées par rapport au groupe placebo (figure 1a). Au niveau du sinus aortique, site de prédilection pour la formation accélérée des plaques, nous avons observé une diminution significative de 50,3 ± 8,3 % (P<0,05) de la taille des lésions mesurées à 58 659 ± 9 762 !m2 dans le groupe traité par NP contre 11 7954 ± 17 973 !m2 dans le groupe placebo (figure 1b). Une deuxième série d’injections a confirmé que le traitement par la nucléoprotéine NP induit une diminution significative de la taille des plaques au niveau du sinus aortique. Les lésions étaient mesurées à 123628 ± 24225 !m2 dans le groupe traité par NP et à 200894 ± 16782 !m2 dans le groupe contrôle (P<0,05). 2 - Effets du traitement par NP sur la composition des plaques d’athérosclérose Les analyses immunohistochimiques de la composition de la plaque d’athérosclérose ont révélé, chez les souris traitées par NP, une réduction de 57,9 ± 7,4 % de l’infiltration des macrophages, marqués avec un anticorps dirigé contre MOMA-2. Cette analyse qualitative a été réalisée au niveau des plaques du sinus aortique (figure 1c). Nous avons, de la même façon, quantifié les lymphocytes présents dans les plaques débutantes en utilisant un anticorps anti-CD3. Les lésions des souris traitées par NP sont caractérisées par une diminution de 75 % (P<0,05) de l’infiltration des lymphocytes T par rapport aux souris contrôles (0,11 ± 0,03 % versus 0,45 ± 0,12 %). Nous n’avons pas quantifié les autres composants de la plaque (collagène, cellules musculaires lisses) puisqu’à ce stade de la maladie, les plaques d’athérosclérose sont composées quasi exclusivement de cellules inflammatoires et de lipides. 28 Figure 1a : taille des plaques (aorte thoracique) Plaque (% aorte) 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 placebo NP Figure 1b : taille des plaques (sinus aortique) 0 0 ,5 Placebo 1 1,5 NP Taille des plaques (µm2) * placebo NP Figure 1c : composition en macrophages Macrophages (%) * placebo NP 29 2 VII - RESULTATS : Etude de la progression des lésions chez les souris « vieilles » 1 - Effets du traitement par NP sur la taille des plaques d’athérosclérose Les poids, taux de cholestérol plasmatique et HDL-cholestérol sont similaires chez les souris traitées par placebo et par NP. Le taux de cholestérol plasmatique est de 6,1 ± 0,6 g/l dans le groupe NP et 6,7 ± 0,7 g/l dans le groupe recevant des injections intra-péritonéales de sérum physiologique. La taille des plaques d’athérosclérose, qu’elle soit au niveau de l’aorte thoracique ou au niveau du sinus aortique, est diminuée dans le groupe traité par NP par rapport au groupe placebo. Les plaques au niveau du sinus aortique ont été mesurées à 349 372 ± 12 256 !m2 dans le groupe NP et à 57 3826 ± 35 907 !m2 dans le groupe placebo (figure 2b). La taille des plaques des souris sacrifiées le jour du début du traitement (T0) est de 311 512 ± 22599 !m2. La taille des plaques de ces souris (âgées de 30 semaines) n’est pas significativement différente des plaques du groupe traité par NP (âgées de 42 semaines) ce qui suggère que le traitement par NP a induit un ralentissement très marqué de la progression de l’athérosclérose au niveau du sinus aortique. Pour mieux illustrer ce propos, nous avons calculé le pourcentage d’augmentation de la taille des plaques entre 30 et 42 semaines. L’augmentation calculée est de 84,2 ± 11,5 % dans le groupe contrôle et seulement de 12,2 ± 3,9 %, soit 6 fois moins, dans le groupe traité par une injection intra-péritonéale de la nucléoprotéine NP chaque 15 jours pendant 12 semaines. Au niveau de l’aorte thoracique, le traitement par NP est aussi associé à une diminution importante de 30 % (P<0,05) de la surface des lésions. En planimétrie, une fois colorées et étalées, les plaques des souris traitées par NP occupent 20,7 ± 1,8 % de la surface totale de l’aorte contre 29,8 ± 2,1 % dans le groupe contrôle (P<0,01) (figure 2a). A T0, la surface des plaques a été mesurée à 14 ± 5,4 %. Le pourcentage d’augmentation des plaques d’athérosclérose au niveau de l’aorte thoracique pendant les 12 semaines de traitement est donc de 110 % dans le groupe placebo et seulement de 50 % dans le groupe NP. 30 2 - Effets du traitement par NP sur la composition des plaques d’athérosclérose (cf. tableau 1) Les analyses immunohistochimiques des plaques d’athérosclérose ont révélé, chez les souris traitées par NP une réduction significative (p<0,05) de 25 % de l’infiltration de macrophages par rapport aux plaques des souris traitées par le placebo (figure 2c). Les lésions des souris traitées par NP ont un taux de cellules musculaires lisses significativement plus élevé (+49 %) (figure 2e) et une accumulation de collagène plus marquée (+32 %) que les souris du groupe placebo (P<0,05) (figure 2d). Enfin, après coloration au Trichrome de Masson, nous avons quantifié les zones acellulaires qui correspondent à l’accumulation des débris cellulaires apoptotiques et des lipides. Dans le groupe traité par NP ce noyau acellulaire est significativement moins grand que dans les plaques des animaux du groupe placebo, respectivement 23,7 ± 2,53 % et 10,71 ± 0,94 % (P<0,05). Tableau 1 : Tableau récapitulatif de la composition des plaques chez les souris « vieilles » Placebo NP Statistiques Macrophages (%) 32,52 ± 1,6 24,13 ± 1,41 P<0,05 Collagène (%) 30,79 ± 3,64 40,72 ± 3,89 P<0,05 CML (%) 3,50 ± 0,69 5,19 ± 0,36 P<0,05 Noyau acellulaire (%) 23,7 ± 2,53 10,71 ± 0,94 P<0,05 31 Figure 2a : taille des plaques (aorte thoracique) Taille des lésions (% de l’aire totale de l’aorte) * placebo T0 Placebo NP NP NP Figure 2b : taille des plaques (sinus aortique) Taille des plaques Sinus (X1000µm2) * * 32 Figure 2c : composition en macrophages Macrophages (%) * placebo NP Figure 2d : composition en collagène Collagène (%) placebo * NP Figure 2e : composition en CML CML (%) * placebo NP 33 VIII - RESULTATS : analyses immunologiques 1 - Effet du traitement par NP sur le profil immunologique des lymphocytes CD4+ Par cytométrie en flux, nous avons mesuré la proportion de lymphocytes T régulateurs naturels CD4+CD25+ dans la rate (données non présentées). Nous n’avons pas mis en évidence de différence de population Tregs entre les groupes NP et contrôles. De plus, les Tregs naturels ont été purifiés à partir de splénocytes totaux et nous avons quantifié leur pourvoir régulateur, exprimé comme leur capacité à inhiber la prolifération de lymphocytes T effecteurs (% d’inhibition). Nous n’avons pas mis en évidence de différence de pouvoir régulateur entre les Tregs naturels des groupes recevant et ceux ne recevant pas les injections intra-péritonéales de NP (figure 6). Les lymphocytes T CD4+ purifiés ont été stimulés in vitro avec un anticorps anti-CD3 soit « coâté » soit soluble. Les lymphocytes T isolés de souris traitées par NP prolifèrent beaucoup moins que les cellules du groupe placebo (42 297 ± 3 239 cpm versus 129 227 ± 3 927 cpm, P<0,001) (figure 3a) et produisent moins d’IFN# (260 ± 26 pg/ml versus 1 610 ± 175 pg/ml, P<0,05). Nous n’avons pas détecté d’IL-10 ni d’IL-4 dans le surnageant des cellules stimulées avec une concentration d’anticorps de 2 µg par ml. Pour se rapprocher des conditions physiologiques, les lymphocytes T ont été ensuite stimulés avec un anticorps anti-CD3, en présence de cellules dendritiques CD11c+ purifiées qui apportent, entre autres, la co-stimulation nécessaire à la réaction immunitaire. Nous avons mis en évidence une diminution de la prolifération des lymphocytes isolés de souris traitées par NP (figure 3b). Les cellules T CD4+ du groupe NP produisent moins d’IFN# (-35 %, P<0,05), moins d’IL-4 (-70 %, P<0,05) et plus d’IL-10 (+30 %, P<0,05) que les cellules T purifiées du groupe placebo (figure 4). 2 - Effet du traitement par NP sur le profil immunologique des cellules dendritiques In vivo, les cellules dendritiques (DC), après digestion intracellulaire, présentent l’antigène au récepteur TCR des lymphocytes T, couplé au CMH de classe II. De façon contemporaine, les DC apportent la co-stimulation par l’intermédiaire de protéines de surface (comme le CD40 ou le CD80/86) et orientent la réponse lymphocytaire. Nous avons étudié ex vivo ces interactions en analysant la manière dont les DC modulent la prolifération et la production de cytokines des lymphocytes CD4+. 34 L’apport de stimulation par les DC induit la prolifération in vitro des lymphocytes T CD4+ en présence d’anti-CD3 soluble. De plus, la production de cytokines est nettement supérieure en présence de DC (8 fois plus pour l’IFN#). De façon intéressante, lorsque les DC isolées de souris traitées par NP sont mises en culture avec des lymphocytes T de souris du groupe PBS, elles induisent le même phénotype que les lymphocytes T isolés de souris traitées par NP. Les DC des souris NP diminuent significativement la prolifération des lymphocytes T du groupe placebo (figure 3b), diminue la production d’IFN#, d’IL-4 et augmentent la production d’IL-10 (figure 4). De façon parallèle, les DC isolées de souris contrôles, lorsqu’elles ont été mises en culture avec des lymphocytes T de souris traitées par NP, orientent leur profil (sécrétion de cytokines et prolifération) vers celui des lymphocytes T du groupe contrôle. Enfin, après stimulation par LPS/IFN#, les DC isolées de souris traitées par NP produisent plus d’IL-10 que les DC du groupe placebo (+330 %, P<0,01) sans différence de production d’IL12 (figure 5). 3 - Effet du traitement par NP chez la souris apoE/RAG2-/Le poids et le taux de cholestérol plasmatique ne sont pas différents entre les 2 groupes de souris. Le cholestérol plasmatique tend à être légèrement plus élevé chez les souris contrôles (13,2 ± 2,7 g/l versus 11,4 ± 1,5 g/l) mais cette différence n’est pas significative. Nous n’avons pas observé de différence, au niveau du sinus aortique, entre les plaques des souris traitées par NP et celles des souris traitées par placebo. Les valeurs respectives étaient 154176 ± 67875 !m2 et 125496 ± 35719 !m2 (P=0,30) (figure 7). 4 – Taux d’anticorps anti-LDL oxydés de type IgM chez les souris jeunes Les taux d’IgM sont légèrement plus élevés dans le groupe traité par NP par rapport au groupe contrôle (P=0,02). Les valeurs de densité optique mesurée par spectrophotométrie, exprimée en médiane (et les quartiles) sont respectivement 0,113 (0,105 – 0,117) et 0,128 (0,113 – 0,154). . 35 Figure 3b : prolifération lymphocytaire T en présence de DC Figure 3a : prolifération lymphocytaire T Prolifération (cpm) Prolifération (cpm) * * * * Prolifération f ration des lymphocytes T CD4+ stimulés par un Prolifération des lymphocytes T CD4+ stimulés pendantt Prolifé anticorps anti-CD3 soluble et des DC du même groupe 72 heures par un anticorps anti-CD3 « côaté » (blanc pour placebo et noir pour NP) ou par des DC croisées (gris) Figure 4 : production de cytokines par les lymphocytes T CD4+ IFN# (X1000pg/ml) IL-10 (pg/ml) * IL-4 (pg/ml) * * * * * * * Production de cytokines par les lymphocytes T CD4+ stimulés par un anticorps anti-CD3 « coâté » et des DC du même groupe (blanc pour placebo et noir pour NP) ou des DC croisées (gris). Le dosage des cytokines dans le surnageant a été réalisé par ELISA Figure 5 : production de cytokines par les cellules dendritiques IL-10(pg/ml) IL-12 (pg/ml) * NS 36 a Production de cytokines par les DC stimulées par LPS/IFN#. Le dosage des cytokines dans le surnageant été réalisé par ELISA Figure 6 : fonction T régulatrice in vitro % Inhibition Co-culture 1/1 1/2 1/4 1/8 Co-culture Tregs et Teffecteurs en présence de DC. Le pouvoir régulateur correspond au pourcentage d’inhibition de la prolifération des Teffecteurs par les Tregs avec concentration décroissante de Tregs (1/1, 1/2, 1/4, 1/8) Figure 7 : résultats du traitement par NP chez les souris apoE/RAG2-/Taille des plaques (X1000!m2) Cholestérol total (g/l) 37 IX - DISCUSSION Les études épidémiologiques et les études anatomopathologiques post-mortem ont mis en évidence l’implication des acteurs de l’inflammation dans la formation et la rupture de la plaque. De façon complémentaire, les études expérimentales sur des modèles animaux ont permis de disséquer les mécanismes physiopathologiques qui aboutissent à la formation de la plaque. La nucléoprotéine NP extraite du virus de la rougeole a montré in vivo et in vitro des propriétés immuno-modulatrices et anti-inflammatoires intéressantes. Branka Horvat et al. ont montré sur 2 modèles d’hypersensibilité cutanée, mettant en jeu les lymphocytes T, que le traitement des souris par cette nucléoprotéine réduit significativement l’inflammation. La nucléoprotéine du virus de la rougeole inhibe soit directement les lymphocytes T CD4+ pathogènes soit indirectement en modulant les cellules dendritiques qui apportent la costimulation indispensable au fonctionnement des cellules T. D’autres travaux ont confirmé que le virus de la rougeole est capable d’inhiber le fonctionnement des cellules présentatrices d’antigènes. Ces effets sont d’autant plus intéressants que les cellules présentatrices d’antigènes, une fois infectées, produisent moins d’IL12, une cytokine pro-athérogène. Nous avons traité des souris sensibles à l’athérosclérose par des injections intra-péritonéales de cette nucléoprotéine recombinante et nous avons évalué son effet sur la taille et la composition des plaques. Le traitement a été réalisé chez des souris jeunes en même temps que s’installe la maladie artérielle et chez des souris plus âgées chez qui les plaques sont déjà présentes, mais continuent de se développer et de s’organiser. Chez les souris « jeunes », le traitement par NP induit une diminution significative de 50 % de la taille des plaques au niveau du sinus aortique mais n’a aucun effet sur les plaques au niveau de l’aorte thoracique. Une des hypothèses pour expliquer un effet modulateur de NP uniquement au niveau du sinus est que la physiopathologie de l’athérosclérose est différente selon le territoire anatomique. Dansky et al. avait montré que la déficience en lymphocytes s’accompagnait d’une diminution des plaques d’athérosclérose au niveau de l’aorte thoracique mais elle n’avait aucun effet à l’étage abdominal (8, 9). Chez l’homme, on sait que le tabagisme est associé à de l’athérosclérose au niveau des membres inférieurs alors que les patients hypertendus ont surtout des plaques au niveau coronaire et au niveau carotidien. Cependant l’explication la plus probable pour expliquer l’absence d’effet au niveau thoracique est que les plaques sont trop petites à ce stade (24 semaines) pour qu’une différence soit identifiable. Chez la souris apoE-/-, les plaques apparaissent dans un premier temps au niveau du sinus aortique puis de 38 façon retardée sur l’aorte thoracique et abdominale (44). D’ailleurs, dès que les plaques sont plus volumineuses, comme c’est le cas chez les souris « vieilles », le traitement par NP a un effet anti-athérogène net au niveau de la crosse aortique. Les souris « vieilles » traitées par NP ont des plaques significativement moins importantes (-30 %, P<0,05) que les souris du groupe placebo. Cette réduction existe aussi bien au niveau du sinus aortique qu’au niveau de l’aorte thoracique. De plus, la taille des plaques d’athérosclérose des souris « vieilles » sacrifiées à 30 semaines (au moment où nous avons débuté les injections) et la taille des lésions des souris du groupe NP sacrifiées 12 semaines plus tard n’est pas statistiquement différente. On peut donc conclure que le traitement par NP est capable d’empêcher le développement des plaques et même de ralentir considérablement la progression de la maladie athéroscléreuse dans ce modèle. En ce qui concerne l’effet du traitement sur la stabilité des lésions, une des limites des modèles murins tient au fait que les souris ne font pas de rupture spontanée de plaque d’athérosclérose. Dès lors, nous ne pouvons pas évaluer l’effet du traitement sur la prévention des événements ischémiques aigus (infarctus ou mortalité). Par contre, plusieurs études anatomopathologiques humaines ont montré qu’il existe un lien étroit entre la composition des plaques et leur stabilité (cf. illustration 3). Les plaques rompues sont riches en macrophages, en lymphocytes T, et pauvres en cellules musculaires lisses et en collagène. Nous avons donc utilisé la composition de la plaque pour évaluer indirectement le risque de rupture. Dans ce travail, nous avons montré que le traitement par NP diminue significativement l‘accumulation de macrophages et de lymphocytes T dans les plaques des souris jeunes. Nous n’avons pas étudié les composants stabilisants de la plaque à ce stade car les plaques débutantes sont faites quasi exclusivement de cellules inflammatoires et de lipides. L’aspect histologique se rapproche de celui des stries lipidiques que l’on retrouve chez l’homme, déjà au stade fœtal (45). Chez les souris âgées, où les plaques sont plus organisées, nous avons montré que le traitement par NP diminue l’accumulation des macrophages et qu’il induit une augmentation de l’infiltration de cellules musculaires lisses et de l’accumulation de collagène. De plus, après une coloration au trichrome de Masson nous avons montré que le traitement par NP induit une diminution des zones acellulaires au sein des plaques, qui correspondent au noyau nécrotique. Cet élément est important à prendre en compte pour la qualité de la plaque d’athérosclérose puisque plusieurs travaux chez l’homme ont montré que la taille du noyau nécrotique est positivement corrélée au risque de rupture (28-30). Autrement dit, plus le noyau nécrotique est grand, plus le risque de rupture et de thrombose 39 artérielle est élevé. Le traitement par la nucléoprotéine induit donc un phénotype lésionnel plus stable. Le virus de la rougeole ayant d’importantes propriétés immuno-modulatrices sur les lymphocytes T, nous avons analysé le profil des cellules T CD4+ purifiés à partir de la rate. La rate est un organe lymphoïde important chez l’adulte, il reflète la réponse immunitaire systémique. De plus, la rate draine le système lymphatique du péritoine, site d’injection de la nucléoprotéine. Pour explorer les lymphocytes T, nous avons étudié ex vivo leur prolifération cellulaire et leur production de cytokines. Après stimulation avec un anticorps anti-CD3 et des cellules dendritiques spléniques purifiées, qui miment la co-stimulation naturelle, les lymphocytes T CD4+ de souris traitées par NP produisent plus d’IL10 (+30%), une cytokine anti-athérogène mais moins d’IFN# et moins d’IL-4, deux cytokines respectivement pro- ou potentiellement pro-athérogènes. Ce profil de sécrétion caractérise l’induction d’une population Treg de type Tr-1. Cette conclusion est appuyée par le fait que les lymphocytes T des souris traitées par NP prolifèrent beaucoup moins que les cellules T contrôles. Par contre, le traitement par NP ne modifie pas la population Treg naturelle. Le pourcentage de CD4+CD25+ n’est pas différent entre les groupes (données non présentées). In vitro, les Tregs naturels isolés de souris traitées par NP inhibent autant la prolifération des T pathogènes que les Tregs de souris contrôles. Le traitement par NP n’a aucun effet sur les souris déficientes en lymphocytes T (apoE/RAG2-/-), ce qui suggère que la nucléoprotéine ne modifie l’évolution de l’athérosclérose qu’en présence de lymphocytes T. Les lymphocytes B, absents également chez la souris apoE/RAG2-/-, ne semblent pas jouer de rôle dans l’athéro-protection induite par NP. En effet, les taux d’anticorps anti-LDL oxydés de type IgM, que produisent les lymphocytes B, bien que discrètement plus élevé dans le groupe de souris « jeunes » traitées par NP, ne sont pas différents chez les souris « vieilles ». De plus cette augmentation est minime et ne peut pas expliquer l’effet anti-athérogène majeur de NP. In vitro, nous avons analysé le profil des cellules dendritiques puisque le virus de la rougeole a la possibilité de moduler la fonction des cellules présentatrices d’antigènes. Les cellules dendritiques CD11c+ isolées de souris traitées par NP lorsqu’elles sont mises en culture avec les lymphocytes T CD4+ des souris contrôles, diminuent la prolifération, augmentent la production d’IL-10 et diminuent la production d’IL-4 et d’IFN#. Ainsi, les cellules dendritiques des souris traitées par NP orientent le profil lymphocytaire T vers un phénotype Tr-1. De plus, in vitro, elles produisent plus d’IL-10, ce qui suggère un phénotype plutôt anti40 inflammatoire, anti-athérogène. Par contre, la modulation fonctionnelle des cellules dendritiques n’est pas suffisante, à elle seule, pour inhiber l’athérosclérose puisque chez les souris apoE/RAG2-/-, qui possèdent des cellules dendritiques, le traitement n’a aucun effet sur la taille des lésions. On peut alors conclure que NP a un effet à la fois sur les lymphocytes T CD4+ et sur les cellules dendritiques mais que la présence des cellules T CD4+ est indispensable pour son action anti-athérogène. Le traitement par NP induit un profil immunitaire systémique de type Tr-1 sans action dirigée contre un antigène précis, en l’occurrence les LDL oxydés de la plaque d’athérosclérose. Le risque est d’induire des effets secondaires systémiques. Cependant, chez les animaux traités par NP, nous n’avons observé ni surmortalité ni infection, suggérant que la modulation immuno-inflammatoire induite est modérée. Cependant, cet élément est à prendre en considération surtout chez les patients immunodéprimés. L’immunosuppression marquée qui est décrite pour le virus de la rougeole passe par la nucléoprotéine NP et aussi par d’autres mécanismes comme la stimulation en surface du CD46 par l’hémagglutinine H virale (25). Dans ce travail, nous avons injecté uniquement la nucléoprotéine, et donc l’immunosuppression est moindre que ce qui a été observé chez l’homme au décours de l’infection par le virus entier. Le traitement par NP empêche le développement des plaques d’athérosclérose. Ce traitement pourrait être envisagé très tôt au cours de la vie. En effet, les études anatomopathologiques, menées notamment par de l’équipe de Stary, ont montré que les stries lipidiques, stade initial de la maladie vasculaire, existent chez environ 50 % des enfants à l’âge de 1 an (52, 53). Ce traitement pourrait aussi être utilisé chez les patients ayant de nombreux facteurs de risque cardiovasculaire. Ceci est valable pour le diabète surtout lorsque l’on sait que la mortalité cardiovasculaire d’un patient diabétique n’ayant aucune maladie cardiaque est aussi élevée que celle d’un patient ayant déjà fait un infarctus du myocarde (20 % versus 19 % à 7 ans). La maladie coronaire du diabétique, qui a quelques particularités physiopathologiques, est plus précoce, plus grave et plus souvent compliquée d’insuffisance cardiaque que la maladie coronaire des non-diabétiques (24). Le traitement par NP modifie la composition de la plaque d’athérosclérose et induit un phénotype lésionnel plus stable. Le traitement pourrait être envisagé chez les patients ayant des lésions d’athérosclérose soit découverte de façon fortuite sur un examen (échographie artérielle, tomodensitométrie…) soit symptomatique, découverte au décours d’une manifestation clinique (AVC, infarctus du myocarde). Le traitement pourrait épaissir la chape 41 fibreuse et limiter in fine soit la survenue soit la récidive d’évènements thrombotiques, cette dernière étant greffée d’une lourde mortalité (17). 42 X - CONCLUSION Le traitement de souris apoE-/- par des injections intra-péritonéales répétées d’une nucléoprotéine recombinante du virus de la rougeole s’accompagne d’une diminution de la taille des plaques aussi bien au niveau du sinus aortique que de l’aorte thoracique. Cet effet existe aussi bien lors de l’initiation que lors de la progression des plaques d’athérosclérose. Le traitement par la nucléoprotéine induit un phénotype lésionnel plus stable quel que soit le stade de développement des lésions. Les plaques sont moins riches en cellules inflammatoires (macrophages, lymphocytes T) et plus riches en éléments stabilisant (cellules musculaires lisses et collagène). Le traitement par la nucléoprotéine modifie le comportement du couple cellule dendritiquelymphocyte T CD4+ et l’oriente vers un profil anti-inflammatoire, anti-athérogène de type Tr1. Ce travail ouvre des perspectives intéressantes chez l’homme à la fois en prévention primaire et en prévention secondaire. 43 XI - REFERENCES 1 AIT-OUFELLA, H, SALOMON, BL, POTTEAUX, S, ROBERTSON, AK, GOURDY, P, ZOLL, J, et al. Natural regulatory t cells control the development of atherosclerosis in mice. Nat Med. 2006: 12: 178-80. 2 ATABANI, SF, BYRNES, AA, JAYE, A, KIDD, IM, MAGNUSEN, AF, WHITTLE, H, et al. Natural measles causes prolonged suppression of interleukin-12 production. J Infect Dis. 2001: 184: 1-9. 3 BLANKENBERG, S, TIRET, L, BICKEL, C, PEETZ, D, CAMBIEN, F, MEYER, J, et al. 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Transfer of cd4(+) t cells aggravates atherosclerosis in immunodeficient apolipoprotein e knockout mice. Circulation. 2000: 102: 2919-22. 47 ANNEE : 2007 NOM ET PRENOM DE L’AUTEUR : AIT-OUFELLA Hafid PRESIDENT DE THESE : Pr Georges OFFENSTADT DIRECTEUR DE THESE : Dr Ziad MALLAT TITRE DE LA THESE : Immunomodulation lymphocytaire de l’athérosclérose expérimentale par la nucléoprotéine du virus de la rougeole L’athérosclérose est une maladie inflammatoire des gros vaisseaux à localisation intimale. L’inflammation et l’immunité dépendante des lymphocytes T favorisent la progression et la déstabilisation des lésions vasculaires, ce qui suggère qu’une modulation de la réponse lymphocytaire pourrait protéger contre l’athérosclérose. Chez l’homme, l’infection par le virus de la rougeole provoque une immunosuppression liée en partie aux propriétés de la nucléoprotéine NP. Chez la souris, la nucléoprotéine NP diminue la réaction d’hypersensibilité cutanée et inhibe la prolifération lymphocytaire. Nous avons émis l’hypothèse que l’administration répétée de cette nucléoprotéine NP chez la souris pouvait modifier l’évolution de l’athérosclérose grâce à ses propriétés immunomodulatrices. Dans un modèle permettant l’étude du développement initial de l’athérosclérose, chez les souris apoE-/« jeunes », les injections de NP induisent une diminution de 50% de la taille des plaques au niveau du sinus aortique (p<0,05) ; dans un modèle de progression des lésions chez les souris apoE-/- « vieilles », les injections de NP s’accompagnent d’une diminution significative de 86 % de la progression des lésions au niveau du sinus aortique et d’une diminution de 60 % au niveau de l’aorte thoracique (p<0,05). De plus, le traitement par NP induit un phénotype lésionnel plus stable avec une infiltration moindre de macrophages et dans les plaques avancées une accumulation plus marquée de collagène et de cellules musculaires lisses. Le traitement par NP diminue la prolifération des lymphocytes CD4+, leur production d’IFN# et d’IL-4 tout en augmentant leur production d’IL-10 en comparaison avec les lymphocytes du groupe placebo. L’induction lymphocytaire de ce phénotype Tr-1 est requise pour la protection contre l’athérosclérose puisque la maladie n’est pas affectée par NP chez les souris apoE/RAG2-/-, déficientes en lymphocytes. MOTS-CLES : - nucléoprotéine, - athérosclérose, - immunologie, - lymphocytes T CD4+, - souris ADRESSE DE l’UFR : 8, rue du Général Sarrail - 94010 CRETEIL 48 49
