microscope électronique

TUTORAT SANTE MONTPELLIERNIMES
METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE
UE2 SPR 2011-2012
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NOTIONS THÉORIQUES
• Un microscope est un système grossissant composé de
deux lentilles convergentes:
– L’objectif, proche de l’objet
– L’oculaire, proche de l’œil.
• L’indice de réfraction définit la capacité d’un milieu
translucide à dévier un rayon lumineux, et est nommé
« n »= c/v.
• Un dioptre est l’interface entre deux milieux
translucides d’indice de réfraction différents.
• Le pouvoir de résolution est la distance minimale qui
doit séparer deux points pour être discernés au travers
d’un système optique.
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GÉNÉRALITÉS
• Un microscope est caractérisé par:
– Son grossissement (ou puissance) qui varie selon les
lentilles utilisées
– Son pouvoir de résolution, qui dépend de la longueur
d’onde du rayonnement utilisé.
• Il existe deux grands types de microscopes:
– Le microscope optique (MO), qui utilise les photons
de trois façons: transmission, réflexion, réémission
– Le microscope électronique (ME), qui utilise les
électrons.
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Le microscope optique
• La puissance = le grossissement
= grossissement oculaire x
grossissement objectif
• Pouvoir de séparation = pouvoir
de résolution = distance min
entre 2 points pour qu’ils soient
distinguables = fonction de la
longueur d’onde du rayon utilisé
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LA TRANSMISSION (MO)
• On parle de transmission quand l’objet translucide est
traversé par la lumière. Les photons interagissent de
deux façons:
– Absorption par l’objet (image nuancée en lumière
monochromatique et colorée et lumière polychromatique)
– Contraste de phase: les photons sont diffractés en
décalage, ce qui provoque une différence d’intensité
lumineuse entre deux points, qui est perçue par l’œil.
L’objet doit être en relief!
• On utilise la transmission avec le microscope à fond
clair, le microscope à contraste de phase, le microscope
confocal.
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LA RÉFLEXION (MO)
• On parle de réflexion quand l’objet est
latéralement éclairé et qu’il réfléchit les
photons au niveau de sa surface, qui est donc
la seule partie visible (on ne voit pas
l’intérieur). L’objet doit être en relief!
• On utilise la réflexion avec le
stéréomicroscope (ou loupe binoculaire ou
microscope chirurgical) et le microscope à
fond noir.
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LA RÉÉMISSION (MO)
• On parle de réémission quand les molécules instables de
l’objet réémettent les photons à une longueur d’onde
différente dans toutes les directions de l’espace.
• On utilise la réémission dans:
– Le microscope à fluorescence: permet de visualiser des
substances fluorescentes ou rendues telles par l’utilisation d’un
fluorochrome. Ceci permet de localiser des éléments dans une
cellule.
– La microscopie bi ou multi photonique: on envoie des rayons de
λ > 800 nm (IR) avec des lasers femtoseconde, pouvant donc
traverser des objets épais. Ceci augmente la pb d’absorption de
pls photons simultanément et donc d’obtenir beaucoup de
fluorescence pour une faible intensité excitatrice.
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FABRICATION DE LAMES
• Pr observer une cellule, il faut inactiver les
enzymes, durcir le tissu et le découper en
« tranches » très fines de manière à ce qu’il
soit translucide (coupes).
• Il y a pls étapes:
– Fixation avec des solutions diluées d’aldéhydes ou
de sels oxygénés de métaux lourds
– Durcissement par congélation, polymérisation ou
inclusion dans de la paraffine..
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FABRICATION DE LAMES
– Découpage en tranches d’une épaisseur de qqs microns
par un microtome et recueil sur lames de verre traitées
chimiquement pour coller la coupe.
– Réhydratation (s’il y a eu une déshydratation préalable)
par immersion dans un solvant organique et des bains
d’alcool de concentrations décroissantes.
– Coloration par:
• Les colorants signalétiques: pr la forme de la cellule et des
organites volumineux (hématoxyline, éosine, bleu de méthylène).
Ils sont basiques (pour les structures acides = basophiles) ou
acides (pour les structures basiques = acidophiles).
• Les colorants cyto/histochimiques colorant une substance de
manière spécifique.
– Observation à sec ou en immersion dans l’huile de cèdre.
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AUTRES EXAMENS
• Les extemporanées sont des coupes issues d’échantillons
congelés au CO2 dans un cryostat et découpés en tranches
de plus de 15 microns pour être colorées et observées
rapidement lors d’un opération chirurgicale (pas de
fixation!). Certaines sont conservées pour étudier l’activité
enzymatique (cyto/histo-enzymologie).
• Les cellules sur frottis sont observées après dépôt sur
lame, dessication et coloration (pas de fixation! en général)
• L’examen de cellules vivantes nécessite un microscope
inversé (la lumière arrive par le bas) et l’utilisation de
colorants non toxiques (=vitaux ex: vert Janus B). On peut
aussi utiliser le microscope à contraste de phase.
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LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
• Les rayons de faible λ étant non incurvables, on
utilise les électrons pour augmenter la
résolution.
• On utilise trois types d’électrons:
– Les primaires sont ceux qui traversent l’objet (MET)
– Les secondaires sont arrachés aux atomes par les
primaires, ont une faible énergie et permettent une
bonne résolution (MEB)
– Les rétrodiffusés sont renvoyés par les noyaux, ont
une forte énergie et ne permettent qu’une faible
résolution (qqs applications du MEB).
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LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
•
Il est formé:
–
-D’un canon à électrons (une anode et
une cathode produisant le flux)
–
-De bobines électromagnétiques
focalisant le flux d’électrons et dont la
variation de puissance est continue
(avantage +++ comparé au MO)
–
-Une autre bobine projette l’image
produite sur un écran fluorescent
pour qu’elle soit visible, et on observe
au travers de hublots teintés de plomb
pour arrêter les rayons X nocifs.
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LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
• Il existe deux types de ME:
– Le MET (à transmission) pour les coupes
– Le MEB (à balayage) qui récupère les électrons secondaires
renvoyés par la surface de l’objet par un collecteur.
• Travail dans le vide
• Coupes réalisées de 50 nm d’épaisseur
• Grilles et non plaques de verre comme support pour
limiter l’interaction avec la matière
• Colorants spécifiques, les métaux lourds, pour
optimiser l’absorption par l’échantillon.
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LE MET
• Il fonctionne comme un MO, mais utilise des électrons.
• La fixation se fait au glutaraldéhyde et est renforcée par
l’acide osmique.
• L’objet est ensuite durci par des résines époxy, bcp plus
solides que la paraffine: araldite, cyanolite ou métacrylate
(polymérisation irréversible).
• On emploie donc des « colorants » particuliers:
– Signalétiques:
– Spécifiques: anticorps fixés à des métaux lourds et spécifiques
d’une structure de la cellule (avant inclusion!).
– Négatifs: colorent tout sauf les particules que l’on souhaite voir
comme les virus ou les protéines.
• On découpe avec un ultra microtome.
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CRYOFRACTURE ET CRYODÉCAPAGE
• Techniques pour visualiser la surface des objets
au MET.
• Refroidissement de l’objet à – 196°C en présence
d’un cryoprotecteur (évite que l’objet ne
s’abîme), puis fracture:
– Dans la cryofracture, on réalise un ombrage
métallique sur la zone de fracture, qui est une zone de
moindre résistance (comme la membrane plasmique)
– Dans le cryodécapage, on réalise une sublimation de
l’eau contenue dans la zone de clivage pour faire
ressortir les objets, puis on réalise un ombrage
métallique (cytosquelette).
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LE MEB
• Il balaye l’objet avec un faisceau d’électrons
primaires qui produisent des électrons
secondaires. Ceux ci sont collectés pour former
une image de la surface de l’objet.
• La fixation et la déshydratation rétractent
l’échantillon, d’ou l’utilisation de CO2 pour
redonner du volume.
• L’objet ne doit ni être inclus, ni être coupé.
• Il faut également faire un ombrage métallique
pour accentuer la libération d’électrons
secondaires.
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COMPARAISON
• Grossissement:
– MET: 500 000
– MEB: 100 000
• Pouvoir séparateur: MET < MEB (le pouvoir de
séparation le meilleur est le plus faible).
• Ces techniques sont complémentaires pour
une étude complète.
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