Puces à ADN (CGH-array) : application pour le diagnostic de

Puces à ADN (CGH-array) : application pour le diagnostic
de déséquilibres cytogénétiques cryptiques
Array-CGH for routine diagnosis of cryptic
chromosomal imbalances
J. Andrieux
Laboratoire de génétique médicale, hôpital Jeanne-de-Flandre, centre hospitalier régional et universitaire,
2, avenue Oscar-Lambret, 59037 Lille cedex, France
Reçu le 10 mars 2008 ; accepté le 16 avril 2008
Disponible sur Internet le 2 juin 2008
Résumé
La cytogénétique permet de détecter des anomalies génomiques quantitatives de 10 à 15 Mb pour la cytogénétique classique et de 3 à 5 Mb pour
la cytogénétique haute-résolution. Ces techniques pangénomiques sont complétées par des techniques plus résolutives, mais ne couvrant pas la
totalité du génome (FISH interstitielle, analyse pantélomérique). La CGH-array (puces ADN) permet une approche à la fois globale et hautement
résolutive. Cette méthode rapide, sensible et automatisable permet de tester par hybridation compétitive un nombre très élevé de régions du
génome. Les puces ADN BACs/PACs et oligonucléotidiques sont utilisées en cytogénétique constitutionnelle, oncohématologique et des tumeurs
solides. Elles permettent une résolution pangénomique de 1 Mb à quelques kilobases pour la détection d’anomalies quantitatives et deviennent
ainsi le « chaînon manquant » entre la cytogénétique et la biologie moléculaire. Malgré les variations polymorphiques du génome (CNV) et sans
remplacer le caryotype, la CGH-array permet la détection d’anomalies infracytogénétiques (cryptiques) et constitue déjà l’examen incontournable
de diagnostic pangénomique en génétique clinique.
#2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Abstract
Cytogenetics allows detection of genomic anomalies between 10 and 15 Mb (classical cytogenetics) and between 3 and 5 Mb (high-resolution
cytogenetics). These pangenomic techniques are associated with more accurate analyses, single probe interstitial FISH and subtelomeric studies.
Array-CGH (aCGH) allows high resolution pangenomic analyses. BAC/PAC and oligonucleotides array-CGH have transformed the field of
genetics and are useful for constitutional, hematological and solid tumors cytogenetics. Array-based comparative pangenomic hybridization
resolutions vary in size (range, several kilobases to 1 Mb). With the more recent improvements, aCGH is becoming the ‘‘missing link’’ between
cytogenetics and molecular diagnostics. Despite copy number variations (CNV) and without replacing karyotype, aCGH detects cryptic
quantitative anomalies anywhere in the genome and becomes day after day more useful.
#2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Mots clés : CGH-array ; BAC/PAC ; Pangénomique ; Oligonucléotides
Keywords: Array-CGH; BAC/PAC; Pangenomic; Oligonucleotides
1. Introduction
L’approche pangénomique traditionnelle est représentée
depuis 1959 par le caryotype et son utilisation en diagnostic qui
a suivi les travaux et publications du Professeur Jérôme
Lejeune.
Les améliorations technologiques ont permis à la
cytogénétique d’être plus performante avec le caryotype
haute-résolution à partir dans les années 1970 et de la
cytogénétique moléculaire depuis le milieu des années
1980. L’hybridation chromosomique utilisant des sondes
http://france.elsevier.com/direct/PATBIO/
Disponible en ligne sur www.sciencedirect.com
Pathologie Biologie 56 (2008) 368–374
Adresse e-mail : [email protected].
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doi:10.1016/j.patbio.2008.04.011

fluorescentes (FISH) s’est particulièrement développée
depuis les années 1990.
L’hybridation génomique comparative (CGH) qui utilise de
l’ADN que l’on hybride sur chromosomes métaphasiques est
apparue quelques années plus tard, mais n’a pas vraiment
permis d’augmenter les performances de l’analyse pangéno-
mique.
La technologie des puces ADN (CGH-array) découle de la
CGH sur chromosomes métaphasiques, son application a
débuté en 1998 [1] et connaît un essor important depuis 2005,
en terme du nombre de centres utilisateurs et de publications
scientifiques.
2. Puces ADN : techniques et niveaux de résolution
Le caryotype standard (400 bandes) permet un niveau de
résolution, c’est-à-dire une marge d’erreur, de 10 à 15 Mb
(millions de paires de bases). Dans les meilleures conditions, le
caryotype haute-résolution (500–550 bandes) permet de
déceler des anomalies d’environ de 3 à 5 Mb selon les régions
du génome et les techniques utilisées (bandes G, bandes R). La
limitation de l’augmentation de la résolution du caryotype est
liée aux techniques de cytogénétique (on peut obtenir des
caryotypes jusqu’à 850 bandes), mais également au temps
d’analyse que leur interprétation nécessiterait.
Alors que les techniques de cytogénétique sont au moins
partiellement automatisables, l’analyse des caryotypes néces-
site toujours l’œil et l’expérience des cytogénéticiens.
La biologie moléculaire permet une analyse au nucléotide
(nt) près, mais cette précision s’applique ponctuellement sur le
génome. Les techniques de FISH (métaphasique et inter-
phasique) qui utilisent actuellement préférentiellement des
sondes bacterial artificial chromosome (BACs) clonées dans
Escherichia coli ou P1 artificial chromosome (PACs) clonées
dans un phage permettent de détecter des remaniements
chromosomiques, surtout des délétions, de moins de 2 Mb car
la taille de ces sondes est comprise entre 100 et 200 kb (milliers
de paires de base), mais seulement si le diagnostic génétique
clinique est performant et ce n’est pas aisé car la variabilité
phénotypique d’un même syndrome microdélétionnel peut être
importante.
Comme technique d’analyse pangénomique, la CGH
métaphasique permet une résolution similaire à celle de la
cytogénétique haute résolution avec comme avantages de
s’affranchir de l’interprétation des niveaux de gris générés par
les techniques de bandes G ou R et de pouvoir s’appliquer à
d’autres secteurs que la cytogénétique sur lymphocytes du sang
circulant (cytogénétique prénatale, oncohématologique et des
tumeurs) car on utilise l’ADN du patient et non pas des
métaphases du patient issues de l’étape de culture cellulaire.
Une nuance sémiologique des termes employés est utile. Avec
la FISH, on utilise une sonde marquée (fragment d’ADN marqué
par un fluorochrome, de taille et de position sur le génome
connues), que l’on hybride sur une cible présente sur une lame de
verre (les cellules du patient ou de l’échantillon à tester : cellules
métaphasiques et noyaux interphasiques). Pour la CGH
métaphasique, on utilise un mélange à quantités égales
d’ADN du patient et de témoin « normal » (marqués par deux
fluorochromes différents) qui prend ici le nomde « sonde » et que
l’on hybride sur la « cible » : des chromosomes en métaphase de
témoin normal. Les ratios de fluorescence sont mesurés à l’aide
de caméras à filtres adaptés et analysés à l’aide de logiciels
permettant ainsi de détecter les variations génomiques quanti-
tatives (délétions, duplications, amplifications, monosomies,
trisomies) présentes dans l’ADN du patient ou de l’échantillon.
Pour la CGH-array, on utilise également un mélange à
quantités égales d’ADN du patient et de témoin marqués par
deux fluorochromes différents, que l’on hybride sur une lame de
verre où sont présents des fragments d’ADN de taille, de
séquence et de position génomique déterminées et connues. Ces
fragments sont positionnés sous forme de spots homogènes en
quantité d’ADN et dont les positions sur la lame de verre
doivent forcément être identifiées au préalable. Une fois
l’hybridation réalisée (Fig. 1), les fluorescences des spots sont
mesurées et analysées par un logiciel.
Selon le nombre et la localisation génomique des fragments
d’ADN prépositionnés (couramment dénommées « sondes »)
sur la lame de verre on obtient une puce ADN qui peut être
pangénomique ou par exemple pansyndromes microdélétion-
nels si les fragments d’ADN couvrent toutes les régions du
génome où des syndromes microdélétionnels ont été décrits.
Grâce aux progrès technologiques très importants réalisés
ces dernières années, sur une même lame de verre de 3000 à
plus d’un million de fragments d’ADN différents peuvent être
spottés sur ces puces ADN haute densité, ce qui donne pour
cette dernière une résolution pangénomique très proche de
Fig. 1. Détail d’une puce ADN Agilent
TM
après hybridation. Ratios de fluorescence mesurés par le logiciel CGH-analytics
TM
et présentés sous forme graphique
(exemple d’une duplication 6p21.2p22.1).
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quelques kilobases. La puce ADN (méthode rapide, sensible et
semi-automatisable) va constituer ainsi le « chaînon
manquant » entre la cytogénétique et la biologie moléculaire
pour la détection de remaniements génomiques quantitatifs. Le
terme de caryotype moléculaire est le plus proche de la réalité et
donc le plus adapté [2,3].
Deux types principaux de puces ADN existent : les puces
BACs/PACs (tailles des sondes : 100 à 200 kb) et les puces
oligonucléotidiques (tailles des sondes : 70 à 20 nt). Ces puces
ADN sont commercialisées, mais sont également élaborées par
quelques centres européens universitaires : Cambridge (San-
ger), Leuven (UKL).
2.1. Puces ADN BACs/PACs
Les puces BACs/PACs pangénomiques, renforcées ou non
dans les régions fréquemment impliquées (hot-spots) dans les
remaniements cytogénétiques donnent un niveau de résolution
proche de 1 Mb pour les puces 3200 à 3500 clones.
Une des difficultés inhérente à l’utilisation de BACs, comme
sonde au niveau de la puce et rencontrée dans les premières
études, a été la détection de nombreux polymorphismes
apparents dont le caractère réellement polymorphique ou
potentiellement pathogène est parfois difficile à déterminer :
10 % des clones utilisés sont dits polymorphiques, à rajouter
aux polymorphismes du génome (CNV).
L’avantage d’avoir une banque de BACs/PACs à disposition
est de pouvoir valider dans la foulée l’anomalie ou le
polymorphisme identifié.
Récemment, des puces BACs/PACs contiguës (Tiling path
arrays: 26 574 clones) ont été élaborées [4] : elles permettent
une résolution de 200 kb en moyenne avec bien sûr un coût
supérieur et des contraintes plus nombreuses qu’avec la 3200 à
3500 clones, les sondes polymorphiques ayant été multipliées
proportionnellement.
2.2. Puces ADN oligonucléotidiques
Les CGH-arrays oligonucléotidiques sont actuellement
commercialisées avec des densités de clone allant de 15 kilo-
sondes à plus d’un million de sondes. Le niveau de résolution
pangénomique est ainsi de 20 à 30 kb sur la totalité du génome,
avec une densification accrue du nombre de sondes dans les
régions codantes du génome [5].
Les puces single nucleotide polymorphisms (SNP) per-
mettent également de détecter des pertes d’hétérozygotie
(LOH) dues à disomies [6].
2.3. Bases de données et bio-informatique
Les moyens informatiques et bio-informatiques sont indis-
pensables et intimement liés à l’évolution des puces ADN. Tant
pour l’analyse des données (puces hautes-densité) que pour
l’interprétation des données : bases de données génome entier
(Ensembl, Cambridge, Royaume-Uni,UCSC Genome Browser,
Santa Cruz, États-Unis), bases de données de polymorphismes
(Database of Genomic Variants, Toronto, Canada).
3. Applications des puces ADN
3.1. Applications des puces ADN en cytogénétique
oncohématologique et cytogénétique des tumeurs
Jusqu’à 2005, la quasi-totalité des applications et des
publications liées à la CGH-array concernaient cytogénétique
oncohématologique et la cytogénétique des tumeurs.
Dans ce domaine, les puces ADN permettent la détection
d’anomalies génomiques quantitatives associées à la progres-
sion tumorale et la réponse au traitement [7]. De nombreuses
et variées pathologies ont été étudiées par CGH-array
(Tableau 1).
Ces anomalies sont souvent secondaires à la pathologie,
mais aident à l’orientation diagnostique et pronostique.
Il existe des spécificités liées à la CGH-array appliquée aux
cancers et aux leucémies :
la clonalité de l’anomalie recherchée : les « mosaïcismes »
sont fréquents. Il coexiste au sein du prélèvement des
populations cellulaires tumorales et normales, ce qui entraîne
des difficultés de diagnostic d’anomalies quantitatives. Alors
qu’en cytogénétique oncohématologique, une ou plusieurs
anomalies ont bien été retrouvées et caractérisées dans un
clone minoritaire par le caryotype, si l’on a moins de 30 %
d’ADN porteur de l’anomalie, il est délicat d’identifier des
remaniements quantitatifs par CGH-array. La culture
cellulaire, étape préalable à l’établissement du caryotype
permet de sélectionner les cellules aptes à se diviser (blastes,
cellules de la myélémie) alors que l’analyse par puce ADN
(total ou même sur cellules triées) entraîne une « pollution »
par de l’ADN normal ;
l’origine du matériel : pour les tumeurs solides, les ADNs
sont parfois extraits après fixation tissulaire anatomopa-
thologique, ce qui génère souvent des pertes de qualité et
Tableau 1
Pathologies oncohématologiques et oncologiques étudiées par CGH-array
Pathologies Publications
Leucémie aiguë myéloïde et myélodysplasie [8–13]
Leucémie aiguë lymphoblastique [14–20]
Leucémie myéloïde chronique [21]
Leucémie lymphoïde chronique [22,23]
Lymphomes [24–29]
Myélome multiple [30,31]
Mésothéliome [32–34]
Cancer du sein [35–42]
Cancer de l’ovaire [43,44]
Cancer colorectal [45–47]
Cancer hépatique [48–50]
Cancer du pancréas [51,52]
Cancer de la vessie [53–55]
Cancer de la prostate [56–58]
Neuroblastome [59–62]
Glioblastome [63–65]
Médulloblastome [66,67]
Cancer de la thyroïde [68–69]
Thymome [70]
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entraîne une moins bonne hybridation sur la puce et des
difficultés d’interprétation ;
l’analyse de séries : pour être pertinente scientifiquement,
l’étude par CGH-array nécessite d’obtenir des séries
homogènes d’ADN de patients pour identifier les anomalies
récurrentes.
Les données retrouvées nécessitent un travail bio-informa-
tique supplémentaire pour faire un tri entre les nombreuses
anomalies détectées pour les relier aux bases de données
existantes (notamment des voies de signalisation : KEGG,
Kyoto, Japon) et pour parfois les associer aux données du
transcriptome qui sont plus délicates d’interprétation.
3.2. Applications des puces ADN en cytogénétique
constitutionnelle
Les premières applications de la CGH-array en cytogéné-
tique constitutionnelle ont été de valider et de borner
« moléculairement » des anomalies diagnostiquées par la
cytogénétique ou la biologie moléculaire pantélomérique.
Actuellement, les puces ADN sont utilisées comme un outil de
screening lorsque le caryotype, l’étude pantélomérique et les
analyses ciblées sont normaux [71–76].
En terme de diagnostic, la CGH-array convient particuliè-
rement bien à la cytogénétique constitutionnelle où l’on
retrouve, plus souvent qu’en cytogénétique oncohématolo-
gique, une anomalie unique, probablement causale de tout ou
partie du phénotype et présente souvent de façon homogène
dans 100 % des cellules.
Plusieurs centres européens utilisent déjà depuis plusieurs
années des puces ADN pour le diagnostic en génétique
constitutionnelle.
Dans les cas de patients présentant un retard psychomoteur/
malformations congénitales, lorsque le résultat de cytogéné-
tique conventionnelle est normal, les approches ciblées de la
cytogénétique moléculaire permettent de déceler en cas de
signes cliniques suffisamment évocateurs des microdélétions
interstitielles récurrentes dans environ 3 % des cas. Le ciblage
des régions télomériques, entrepris à l’origine par la
connaissance d’un important taux de remaniement de ces
régions, permet sans orientation clinique de diagnostiquer 2 à
5 % supplémentaires.
Les examens par puce ADN permettent de déceler une
anomalie dans 6 à 30 % [71,74,76–79,80] selon le type de puce
réalisée, les examens complémentaires de cytogénétique et de
biologie moléculaires réalisés et le critères cliniques retenus.
La CGH-array détecte en moyenne 10 à 20 % d’anomalie chez
des patients présentant retard psychomoteur plus ou moins
malformations congénitales. Il s’agit dans trois quarts des cas
de délétions et dans un quart des cas de duplications.
Les derniers résultats publiés indiquent le réel potentiel de
cette technique et sa puissance concernant la détection de
microremaniements chromosomiques cryptiques (infrac-
ytogénétiques) [79–82]. Les indications cliniques sont très
proches que celles du caryotype haute-résolution et les puces
ADN remplaceront probablement à moyen terme cet examen,
mais ne se substitueront pas au caryotype standard qui restera
l’examen pangénomique de référence et qui permet la
validation par FISH des anomalies détectées en CGH-array
et plus particulièrement les délétions. Un indicateur de
l’accroissement de l’utilisation est l’augmentation des publi-
cations scientifiques concernant l’application de cette tech-
nique au retard mental (Fig. 2).
L’interprétation des variations génomiques qui tient compte
des polymorphismes du génome humain (CNV) n’est pas
abordé dans cet article.
4. Conclusion
La puce ADN (CGH-array) est un bon examen de screening
pangénomique et constitue le « chaînon manquant » entre la
cytogénétique et la biologie moléculaire pour la détection de
remaniements génomiques quantitatifs. Cet examen sensible et
semi-automatisable permet l’établissement du caryotype
moléculaire.
Le choix entre l’utilisation de puces BACs/PACs ou de puces
oligonucléotidiques dépend de la qualité de la fabrication des
lames et du design des sondes, de la reproductibilité de la
technique, de la robustesse de l’outil statistique développé, de
l’interface d’analyse de résultats et du rapport performance
(niveau de résolution)/coût. Selon l’expérience de chaque
centre utilisateur, le choix s’est porté sur tel ou tel type de puce.
Si la CGH-array est de toute évidence supérieure à la
cytogénétique conventionnelle et aux techniques se limitant
aux télomères pour la détection de remaniements génomiques
quantitatifs, elle reste encore d’un coût élevé et nécessite un
appareil d’analyse et un environnement technique onéreux,
ainsi qu’un bon niveau d’expertise.
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