Etude de la réponse immunitaire des porcs français de race

%
&'(
Etude de la réponse immunitaire des porcs français de race
Large White et analyse conjointe du transcriptome des
leucocytes du sang périphérique
Coordination : Claire Rogel-Gaillard
Courriel : [email protected]
IMMOPIG – Etude de la réponse immunitaire des porcs français de race Large White et analyse
conjointe du transcriptome des leucocytes du sang périphérique (2007-2009)
1
1
1
2
3
Claire ROGEL-GAILLARD , Laurence FLORI , Yu GAO , Jean-Pierre BIDANEL , Isabelle OSWALD ,
4
5
6
7
François LEFEVRE , Marcel BOUFFAUD , Yvon BILLON , Marie-José MERCAT
Projet soutenu dans le cadre de l’édition 2006 de l’appel à projets GENANIMAL
Projet cofinancé par BIOPORC
Unités et organismes concernés
1
INRA, UMR1313, Génétique Animale et Biologie Intégrative, équipe INRA CEA de Génétique Immunité Santé (coordination du
projet) ; 2INRA, UMR 1313, Génétique Animale et Biologie Intégrative, équipe Génétique du Porc; 3INRA, UR 66 Unité de
Pharmacologie-Toxicologie (LPT) ; 4INRA, UR 892 Laboratoire de Virologie et Immunologie Moléculaires (VIM) ; 5INRA, UE450,
Unité expérimentale de testage de porcs, Le Rheu ; 6INRA, UE967, Génétique Expérimentale en Productions Animales, le
Magneraud ; 7BIOPORC, La Motte au Vicomte
Mots clefs : génomique, réponse immunitaire, porc, phénotype, transcriptome, résistance aux maladies
Résumé
Depuis plus de 25 ans maintenant, un programme de sélection génétique ciblant des caractères de
production a été poursuivi en France dans l’espèce porcine. Associé à l’application de mesures sanitaires
et médicales strictes, il a permis une nette amélioration des performances zootechniques des animaux.
Cependant, la législation européenne, de plus en plus préoccupée par le bien-être animal et la sécurité
du consommateur, a récemment interdit l’utilisation d’antibiotiques comme facteurs régulateurs de
croissance et tend à réduire de manière générale les mesures prophylactiques médicamenteuses. Dans
ce contexte, l’introduction de critères liés à la santé dans les schémas de sélection et la sélection
d’animaux globalement plus résistants aux maladies infectieuses permettraient de répondre aux
exigences européennes et à celles des filières. La définition et l’utilisation des critères de multi-résistance
aux maladies infectieuses étant complexes, une alternative consiste à utiliser des paramètres de la
réponse immunitaire (RI) mise en place suite à l’exposition à un agent pathogène, comme critères de
sélection. Il est pour cela nécessaire que ces paramètres soient héritables, corrélés avec les caractères
de production et avec certains critères de résistance aux maladies ou de santé.
Le projet IMMOPIG a pour objectif d’étudier et de mieux caractériser la RI innée et adaptative des porcs à
l’aide d’approches génétique et fonctionnelle afin d’évaluer la faisabilité de l’introduction de paramètres
de la RI dans les schémas de sélection. L’approche génétique inclut la mesure de nombreux paramètres
de la RI dans des populations dont la structure familiale permet de calculer leur héritabilité et leurs
corrélations génétiques. L’approche fonctionnelle est basée sur l’analyse du transcriptome des
leucocytes du sang périphérique des animaux testés.
Deux populations de porcs Large White sont inclus dans l’étude: une population en contrôle de
performances dans la station de testage du Rheu (445 animaux, période 2007-2008) et des familles nées
et élevées dans le domaine expérimental du Magneraud (491 animaux, période 2008-2009).
- 123 -
%
&'(
Principaux résultats obtenus et applications envisageables
Animaux et phénotypes
Dans le protocole expérimental mis en place, les animaux sont vaccinés contre Mycoplasma
Hyopneumoniae à 36 jours et un prélèvement sanguin est effectué trois semaines plus tard. Un
hémogramme complété par une analyse des sous-populations sanguines par cytométrie en flux
+
+
(lymphocytes Tαβ CD4 /CD8 , lymphocytes B, lymphocytes Tγδ, monocytes, natural killer) est réalisé le
lendemain des prélèvements. La RI innée est caractérisée par des mesures de phagocytose, le dosage
de cinq cytokines (IL1B, IL6, IL8, TNF, IL12) à partir du surnageant de culture de sang total stimulé ou
non, le dosage de deux protéines sériques de la phase inflammatoire (protéine C réactive, haptoglobine)
et une mesure de l’activité IFNα produite par le sang total ou les leucocytes stimulés ou non par un
antigène viral. La RI adaptative est analysée par le dosage des immunoglobulines (totales et
spécifiques), le dosage de quatre cytokines de régulation (IFNγ, IL2, IL4 et IL10) produites par du sang
total stimulé, ainsi que la quantification de la prolifération cellulaire après activation mitogénique.
L’ensemble des paramètres est enregistré pour chaque animal. L’ARN est extrait à partir de
prélèvements de sang total.
La totalité des animaux du Rheu a été prélevée et phénotypée pour l’ensemble de ces paramètres. La
semence de 29 verrats dont les descendants ont été contrôlés au Rheu en 2007-2008 a été congelée,
afin de produire les 58 familles (croisement de deux femelles par verrat) qui constituent la génération G0
élevée au Magneraud. Ces animaux ont tous été prélevés en 2008-2009 et les mesures des paramètres
de la RI sont presque achevées (dosage de l’IFNα à terminer).
Analyses génétiques
Les analyses génétiques (ASREML) effectuées sur la population du Rheu montrent des héritabilités
modérées à élevées (supérieures à 0.2) pour une partie des caractères étudiés. Les corrélations
phénotypiques entre les paramètres de la RI sont faibles dans l’ensemble excepté entre le nombre de
leucocytes et le nombre de cellules appartenant aux sous-populations leucocytaires (hémogramme). Les
calculs des corrélations génétiques, encore en cours, montrent des corrélations génétiques négatives
entre certains paramètres de la réponse immunitaire et certains caractères de production.
Une sélection divergente sur un petit nombre de paramètres a été initiée sur la population du Magneraud
en se basant sur les premiers résultats obtenus au Rheu. Quatre paramètres immunologiques héritables
et significatifs des diverses composantes de la RI ont été choisis :i) phagocytose (réponse immunitaire
innée), ii) IL2 (réponse immunitaire adaptative à médiation cellulaire de type Th1), iii) IL10 (réponse
immunitaire adaptative à médiation cellulaire de type Th2), iv) IgG spécifiques (réponse immunitaire
adaptative à médiation humorale). En utilisant les valeurs standardisées de ces quatre paramètres, un
index a été calculé. Le classement des animaux selon les valeurs de l’index a permis d’identifier deux
groupes d’animaux de faible et fort index. Dix verrats et 30 truies de chaque groupe ont été choisis en
maximisant le nombre de familles d’origine, de manière à limiter les effets fondateurs pour chaque lignée.
La première génération de sélection sera commencée fin 2009 au Magneraud.
Etudes fonctionnelles
Dans le courant du projet, nous avons produit et validé une puce à ADN adaptée à l’étude de la RI chez
le porc. Cette puce a été conçue afin de pallier l’absence actuelle de puces génériques couvrant
l’ensemble des informations disponibles. Nous avons défini un groupe d’oligonucléotides noté SLA-RI
(3773 sondes pour 3104 gènes) qui spécifie les gènes codant des protéines et les ARN non codants
annotés dans la région du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), ainsi que les gènes hors CMH,
répertoriés comme impliqués dans la RI. Ce set est venu enrichir un set générique de 13K
oligonucléotides (Qiagen-NRSP8-13K). Nous disposons ainsi d’un outil générique spécifiquement enrichi
pour étudier la RI chez le porc (puce SLA-RI/NRSP8-13K produite par le CRB-GADIE). Cette puce a été
validée par l’étude du transcriptome de leucocytes stimulés soit par du LPS, soit par un mélange de
phorbol myristate acetate (PMA) et ionomycine. Les résultats démontrent que les modifications du
transcriptome sont spécifiques à chaque stimulation et l’exploitation des données nous permet d’identifier
assez finement les voies qui sont modifiées. Les résultats obtenus confirment l’intérêt de la puce SLARI/NRSP8-13K pour les études du transcriptome du projet IMMOPIG.
A l’aide de la puce SLA-RI/NRSP8-13K, nous avons commencé l’analyse du transcriptome des cellules
sanguines d’animaux du Rheu divergents pour les cinq phénotypes suivants: nombre de leucocytes,
- 124 -
%
&'(
phagocytose, production d’IL10, d’IL2 et de TNFα. Les prochaines hybridations cibleront les phénotypes
production d’IFNα, taux d’IgG spécifiques, index de stimulation, lymphocytes Tγδ et lymphocytes T
+
+
CD4 /CD8 . Pour la population du Magneraud, nous comparerons le transcriptome sanguin d’animaux de
fort et faible index pour les quatre paramètres choisis pour la sélection divergente. Pour chaque
phénotype, entre 9 et 11 animaux de mesures extrêmes sont comparés. L’analyse des résultats obtenus
pour les phénotypes nombre de leucocytes et phagocytose met en évidence des différentiels
d’expression pour 265 et 254 gènes respectivement et suggère l’existence de profils d’expression
géniques dans le sang qui corrèlent avec les niveaux des paramètres mesurés pour la RI. La signification
biologique des différentiels d’expression est en cours d’analyse et les premiers résultats sont
biologiquement significatifs. Par exemple, dans le cas du paramètre nombre de leucocytes, une partie
des gènes différentiellement exprimés est impliquée dans la RI à médiation cellulaire et les fonctions et le
développement du système hématopoïétique. Les résultats fourniront une description des réseaux de
gènes exprimés dans les cellules sanguines qui viendra compléter les informations sur les phénotypes.
D’une manière plus générale, l’ensemble des analyses contribuera à mieux caractériser la RI des porcs.
Perspectives
Les analyses génétiques de la RI vont être poursuivies sur la population du Magneraud et seront
confrontées à celles obtenues avec les animaux du Rheu. Nous aurons ainsi la possibilité de tester les
interactions entre génotype et environnement. A notre connaissance, il s’agit de la première étude à
grande échelle qui collecte des données aussi nombreuses sur la RI innée et acquise, en incluant un
protocole rigoureux de vaccination.
L’étude du transcriptome d’animaux divergents pour certains paramètres de la RI sera achevée fin 2009.
Le coût de la puce SLA-RI/NRSP8-13K nous permet d’inclure dans le projet l’étude du transcriptome de
200 individus, soit une dizaine d’animaux extrêmes pour une dizaine de paramètres de la RI. Les
animaux du Rheu seront génotypés à l’aide de la puce SNP porcine 50K iselect, en collaboration avec le
programme DELISUS coordonné par Denis Milan (projet Genanimal 2008-2011). Les données attendues
nous permettront de rechercher des locus contrôlant les paramètres de la RI en lien avec les informations
obtenues sur le transcriptome.
Une première génération de sélection divergente sur les quatre paramètres choisis sera démarrée au
Magneraud à l’automne 2009 pour des naissances début 2010. Les animaux divergents produits seront
précieux pour affiner la caractérisation de la RI chez le porc et engager des travaux ciblant la résistance à
certaines maladies encore à définir.
Publications issues des travaux soutenus dans le cadre du projet ANR
Gao Y, Flori L, Stam M, Hugot K, Lefèvre F, Oswald I, Rogel-Gaillard C. The SLA-immune long
oligonucleotide set: a new tool for functional studies of immunity and disease resistance in pig. ISAG
meeting, Amsterdam 20-24 Juillet 2008 (communication orale).
Gao Y, Flori L, Lecardonnel J, Esquerre D, Hu Z, Teillaud A, Lemonnier G, Lefevre F, Oswald IP, RogelGaillard C. Transcriptome analysis of porcine PBMCs after in vitro stimulation by LPS or PMA/Ionomycin
using an expression array targeting the pig immune response (soumis à BMC Genomics).
- 125 -