5-Manipulation de l`ADN

Manipulation des acides nucléiques
(voir chapitre 6 du Voet et Voet)
- les acides nucléiques forment des polymères : ADN et ARN
-ils sont composés de 4 nucléotides: A, C, G et T pour l’ADN
A, C, G et U pour l’ARN
- Propriétés physico-chimiques utilisées pour purifier les acides nucléiques;
- polymères dont la taille varie avec le nombre de nucléotides
- composés d’une forte charge négative
- adoptent une structure en double brins

Figure 1
Structure des acides nucléiques

A. Solubilité et précipitation de l’ADN
- l’ADN est très soluble dans l’eau: - molécule très chargée
- peu de groupements hydrophobes
- Comme pour les protéines, sa solubilité variera avec les conditions salines et/ou la
présence de substances organiques dans l’eau
-la précipitation à l’éthanol est la façon habituelle de précipiter l’ADN pour le
concentrer ou changer son tampon
• cette approche est similaire à la précipitation des protéines avec
des solvants organiques
- la précipitation consiste en l’ajout de 2.5 volumes d’éthanol à une solution
contenant de l’ADN et 0.25M d’acétate de sodium (pour éviter le séparation des
double brins d’ADN)
- la solution est ensuite mise à -20°C pendant au moins 30 minutes et l’ADN est
récupéré par centrifugation à 10,000 rpm pendant 10 minutes à 4°C dans une
microcentrifugeuse
- une certaine quantité de sels sera aussi précipité avec l’ADN. Des lavages
subséquents avec de l’éthanol permettra de les enlever.
- autre solvants organique utilisé pour la précipitation: isopropanol

Extraction de l’ADN au phénol
- méthode de partition de phase dans laquelle les acides nucléiques sont retrouvés
dans la phase aqueuse et les protéines, pour la plupart dénaturées, partitionnent
dans le phénol, la phase plus dense, et à l’interface des deux phases.
¾
¾-
le pH du phénol doit d’abord être ajusté à un pH
autour de 8 (l’ADN est partiellement soluble dans
le phénol acide)
- agiter doucement 1 vol du phénol neutralisé avec 1
vol de la solution contenant de l’ADN et extraire
2 fois
- les traces résiduelles de phénol peuvent être
éliminées par extraction avec du chloroforme
immédiatement après
- le chloroforme est éliminé facilement par après par précipitation avec de l’éthanol
- une centrifugation à faible force (5000xg) produit une séparation des phases et
une interface plus nette
- très fréquemment des protéases, telle que la protéinase K, sont utilisées pour
dégrader les protéines et faciliter leur extraction au phénol
Phase
phénolique
Phase
aqueuse

B. Électrophorèse de l’ADN
- puisque les acides nucléiques sont des molécules chargées (négativement), elles
peuvent migrer dans un gel d’électrophorèse, comme les protéines
-à cause de leur grande taille, les acides nucléiques pénètrent difficilement dans les
gels de polyacrylamide -> ces gels sont utilisés pour la purification ou l’analyse
d’acides nucléiques de quelques centaines de nucléotides seulement
- on utilise habituellement les gels d’agarose
pour purifier et analyser les acides
nucléiques
- ces gels, contenant de 0.5 à 2% d’agarose, permettent de séparer des
fragments d’ADN de quelques centaines à plusieurs milliers de nucléotides
- l’agarose est dissous dans un tampon, puis bouilli. Lorsqu’il refroidit, il polymérise
spontanément (comme du Jell-O) et forme un gel (Figure 2).
-l’ADN est chargé dans les puits du gel et migrera vers l’anode lors de l’électrophorèse
- on utilise un tampon contenant de l’EDTA pour inhiber l’activité des nucléases
qui peuvent être présente dans la solution; le pH du tampon est autour de 8
- comme pour les protéines, la séparation s’effectuera selon la masse moléculaire
de l’ADN, qui dépend de la taille des fragments d’ADN:
- fragment petits migrent plus rapidement que les plus grands