(Microsoft PowerPoint - Molecular Biology 1st Y PH 2012 Pr. N

BIOLOGIE MOLECULAIRE
1ère ANNEE PHARMACIE
2012
Pr. Alami – Ouahabi Naïma
1
PLAN DU COURS
Chapitre.1
Structure des acides nucléiques & relations
structure / fonction.
Chapitre. 2
Expression génétique & systèmes de régulation.
•Transcription & traduction
•Cycle cellulaire & réplication de l’ADN
Chapitre. 3
Systèmes de mutation & de réparation de l’ADN in
vivo.
Chapitre. 4
Biologie moléculaire du cancer
(Proto-oncogènes, oncogènes, apoptose & agents
anti-cancer).
Chapitre. 5
Biologie moléculaire des virus, viroïdes & prions
(Analyse moléculaire & moyens génétique de
diagnostique & de traitement).
Chapitre. 6
Outils, techniques & applications de biologie
moléculaire.
OBJECTIFS DU COURS :
Partie Biologie Moléculaire
Transmettre à l’étudiant :
1. Les bases essentielles de la Biologie Moléculaire.
2. Une compréhension spécifique des mécanismes
moléculaires clef & communs à différent organismes.
3. La capacité d’analyser ces différents processus
moléculaires.
4. La capacité de distinguer les processus
moléculaires ciblés à des fins thérapeutiques.
5. La capacité de sélectionner les outils
moléculaires nécessaires à ce ciblage
thérapeutique.
6. Une compréhension globale de l’importance des
techniques de Biologie moléculaire dans
la pharmacologie, le diagnostique ainsi que la
thérapie présente & future.
Chapitre. 1.
Structure des acides nucléiques
& relations structure / fonction.
Objectifs:
1. Connaître la structure des acides nucléiques;
2. Savoir reconnaître les molécules simples dont ils sont
constitués;
3. Connaître leurs fonctions dans l’expression génétique.
I. Structure des acides nucléiques
Les acides nucléiques ont été isolés initialement des
noyaux des cellules. On peut en distinguer deux grands
types:
•les acides désoxyribonucléiques (ADN): essentiellement
localisés dans le noyau des cellules
•les acides ribonucléiques (ARN): essentiellement
localisés dans le cytoplasme cellulaire.
•Ces molécules biologiques (les acides nucléiques)
contiennent l’information génétique.
•Les acides nucléiques (ADN et ARN) sont des
macromolécules composés de molécules simples et
comportent des sous-unités appelées nucléotides.
•Un nucléotide comporte trois composants:
un ose, une base & de l’acide phosphorique.
1. 1. Ribose, désoxyribose
Bases puriques
Bases pyrimidiques
Nucléosides
Nucléotide AMP
Nucléotide GMP
Nucléotide CMP
Nucléotide UMP
Les Acides Nucléiques
Acide ribonucléique
Hybridation A - T
Hybridation G - C
Les polymères de nucléotides:
La molécule d’ADN est constituée en règle de
deux chaînes (ou brins) de nucléotides.
Les molécules d’ ARN sont le plus souvent sous
forme d’un seul brin
Structure de l’ARN en forme d’ Epingle à cheveux
(hair-pin loops)
Les nucléotides des acides ribonucléiques peuvent quelquefois
s’autohybrider en formant des structures secondaires
Acide désoxyribonucléique
La double hélice
Dans l’espace les deux brin d’ADN antiparallèles &
complémentaire présentent une configuration
hélicoïdale.
Elles s’enroulent autour d’un axe imaginaire pour
constituer une double hélice à rotation droite
(dans les formes A et B de l’ADN)
Sens de lecture d’un acide nucléique.
Par convention,
•on lit toujours un acide nucléique
de l’extrémité 5’ (groupement phosphate)
vers l’extrémité 3’ (OH libre).
•on indique seulement La séquence des bases d’un ADN
(A, T, G ou C), en précisant les extrémités 5’ et 3’.
•Les 4 nucléotides de l’ADN avec les 4 bases (A, T, G ou C),
se combinent en une infinité de séquences de la même
manière que les 7 notes de musique composent une infinité
de symphonies.
La forme B de l’ADN
•La forme biologique la plus importante de l’ADN;
•10 paires de bases par tour de spire;
•Le pas de l’hélice 3,4 nm;
•Le diamètre de l’hélice est de 2,4 nm;
•Les bases puriques et pyrimidiques sont à
l’intérieur de l’hélice
•Les groupements phosphates et les désoxyriboses
sont à l’extérieur;
•Deux types de sillons appelés :
sillon majeur (1,2 nm de large) et sillon mineur
(0,6 nm de large).
La forme Z de l’ADN
•Double hélice à rotation gauche;
•12 paires de bases par tour d’hélice;
•Le pas d’hélice est 4,6 nm;
•Diamètre de l’hélice est plus petit 1,8 nm;
•Les bases sont enchaînées avec une alternance de
conformation;
•Le Z-ADN a été décelé dans des chromosomes de
mammifères;
•Fonction précise mal connue, (régulation structurale de
l’expression génétique).
Propriétés physico-chimiques de l’ADN.
•
•
•
•
•
A la température Tm (de fusion), l’ADN est dénaturé;
La dénaturation est réversible dans certaines
conditions;
Elle entraîne des modifications physico-chimiques:
Augmentation de l’absorption dans l’ultra-violet,
diminution de la viscosité, augmentation de la
densité.
Tm varie selon le pourcentage de bases (G+C) de
l’ADN étudié;
La présence des bases puriques et pyrimidiques
permet aux acides nucléiques (ADN et ARN)
d’absorber dans l’ultra-violet (UV) à 260 nm.
I LA CONFORMATION DES ADN LES
TOPOISOMÈRES.
Les topoisomères sont deux molécules d’ADN qui ont
la même séquence & diffèrent uniquement par le
nombre d’enlacements ( superenroulement ou le
nombre de tours que fait l’un des brins autour de l’autre
brin). Il existe Différents états des topoisomères.
L’ADN peut exister:
à l’état relâché avec une contrainte minimale dans la
molécule. C’est la forme la plus stable de la molécule.
Cependant, l’axe de la double hélice d’ADN peut
s’enrouler sur lui-même en formant un super
enroulement.
Deux formes de superenroulement sont alors possibles:
-Un superenroulement qui correspond à:
une augmentation du nombre d’enroulements dans la même
direction que la rotation de l’hélice B (rotation droite).
On parle de superenroulement positif.
-Un superenroulement de l’ADN autour de son axe dans la direction
opposée au sens des aiguilles d’une montre.
Il y a donc au niveau de l’ADN relâchement de la pression de
torsion. On parle de superenroulement négatif.
Le superenroulement de l’ADN a des conséquences importantes:
- Il permet de le rendre plus compact et diminuer ainsi le volume
occupé dans la cellule.
- Ces modifications du degré d’enroulement de la double hélice
d’ADN influencent les interactions de l’ADN avec d’autres molécules
(protéines qui régulent l’expression génétique).
LES TOPOISOMÉRASES
Les topoisomérases sont des enzymes qui modifient le
nombre d’enlacements. Elles augmentent ou diminuent le
nombre de supertours dans les molécules d’ADN double
brin.
Les topoisomérases de type I: Coupent transitoirement et
ressoudent un seul brin d’ADN double brin. Ils peuvent
agir sur de l’ADN superenroulé positif ou négatif.
Les topoisomérases II : coupent de manière transitoire
les deux brins de l’ADN, puis les ressoudent et agissent
uniquement sur l’ADN superenroulé négatif (exemple:
gyrase bactérienne).
Les topoisomérases I & II permettent de désenrouler
(relacher) l’ADN.
Rôle des topoisomérases
Les deux types de topoisomérases ont une
importance capitale dans la réplication , la
transcription et la recombinaison de l’ADN. chez les
procaryotes et les eucaryotes.
Ces enzymes sont également la cible d’agents
médicamenteux, soit par exemple :
•les agents anti-bactériens de la classe des quinolones
qui inhibent les gyrases bactériennes
•ou les agents anti-cancéreux, (le taxol )qui agissent
en tant que anti topo isomérases I.
Exemple de poison anti topoisomérase I : ts HMG
STRUCTURE DE LA CHROMATINE
Condensation de la chromatine dans les cellules
somatiques
la molécule d’ADN nucléaire est fortement associée à des
protéines pour constituer la chromatine.
Les complexes protéines-ADN sont appelés nucléosomes.
Le nucléosome contient de l’ADN enroulé autour d’un
« core » constitué de 8 protéines appelées histones
2x (H2A H2B, H3 et H4).
Les histones sont des protéines de petit poids moléculaire
(11-14 k Da);
Les histones sont riches en acides aminés basiques (+);
L’histone H1 n’appartient pas au nucléosome, mais permet le
contact entre deux nucléosomes.
L’ enroulements successif de 6 nucléosomes forme des structures
de type solénoïde.
Les solénoïdes forment des domaines (boucles de solénoïdes) de
60 kb (60. 000 pb).
Les boucles de solénoïdes s’enroulent ou s’empilent afin de
former une mini bande chromosomale
Les mini bandes s’empilent pour former un chromosome
Chez l’homme :
•3 109 pb,
•100.000 gènes,
•46 chromosomes
(2 x 23)
Le projet du Génome Humain
le séquençage complet des 3 109 pb en juin 2001
Condensation de la chromatine dans les
spermatides
•la spermiogenèse (maturation de la spermatide en spermatozoïde);
•Changements morphologiques et physiologiques de la spermatide;
•s’accompagnent de changements drastiques au niveau nucléaire;
•Les histones somatiques sont remplacées par des protéines tsHMG
et des protamines;
•Changement de la structure de la chromatine;
•Augmentation de la condensation de l’ADN spermatique;
•Inhibition de l’expression génétique transcription & traduction;
•Autre model de la structure de la chromatine;
•Assure transport sans danger du patrimoine génétique vers l’ovule.
Les travaux de recherche in vitro effectués sur la protéine
tsHMG par N. Alami-Ouahabi & al, ont montré que cette
nouvelle protéine nucléaire est impliquée dans:
•La condensation et superenroulement de l’ADN;
•L’inhibition de la transcription donc de l’expression
génétique & de l’activité de division cellulaire;
•Ces travaux ont également montrés que tsHMG agit
comme agent anti topoisomerase I;
•Pourrait être un potentiel agent anticancer pour les
traitements par Thérapie Génique.
LES TÉLOMÈRES.
Les télomères constituent les extrémités des chromosomes
eucaryotes.
Ils sont formés par des séquences répétitives d’ADN.
A l’extrémité 3’ des chromosomes, on retrouve des copies répétées
de séquences de type TTGGGG (retrouvées chez un protozoaire
cilié: Tétrahymena) ou TTAGGG (retrouvées chez l’Homme).
A l’extrémité 5’, on a les séquences complémentaires riches en
cytosine.
Le problème majeur lors de la réplication de l’ADN est l’élimination
potentielle de l’amorce d’ARN la plus externe ce qui pourrait
entraîner un raccourcissement de l’ADN à chaque cycle de
réplication.
La protection des extrémités des chromosomes des eucaryotes est
assurée par une enzyme spécifique: la télomérase.
TÉLOMÈRASE
La réplication de l’ADN à l’extrémité des chromosomes
eucaryotes fait donc intervenir une enzyme particulière
appelée télomérase.
Cette enzyme ajoute des séquences spécifiques en 3’ d’un brin
d’ADN.
La télomérase va se positionner à l’extrémité 3’ du brin d’ADN.
La télomérase possède une matrice qui lui est propre et qui est
une matrice d’ARN, elle va se fixer à l’extrémité 3’:
(3’ brin parental + télomérase)
Une répétition de motifs: TTGGGG est synthétisée.
Elle constitue le télomère.
Pour synthétiser le brin télomère complémentaire riche en C,
une primase interviend avec synthèse d’une amorce d’ARN par
copie de l’extrémité 3’.
Puis l’ADN polymérase allonge la chaîne à partir de l’amorce d’ARN.
Finalement, une ligase assure la soudure finale.
L’activité des télomérases est très réduite ou nulle dans les cellules
normales en culture. Après plusieurs réplications, les chromosomes
perdent leurs télomères et deviennent instables.
Par contre dans les cellules cancéreuses, l’activité des télomérases
est augmentée.
Les télomères ainsi que les gènes & les activités des télomérases
ont un intérêt primordial dans la recherche des phénomènes
moléculaires de vieillissement, de longévité & d’immortalité
cellulaire.
TERMES CLE EN BIOLOGIE
MOLECULAIRE
I.6. PSEUDOGENES
Certains gènes apparus par duplication au cours de
l’évolution ont subi des mutations génétiques
(substitutions, insertions, délétions, etc...) qui empêchent la
transcription ou la traduction;
Exemple: (codon Stop prématuré)
Il en résulte que même si la transcription conduit à un ARN
messager, celui-ci ne peut être traduit
Ce codon stop prématuré à transformé le gène fonctionnel
pseudo gène non traduit.
en
Au cours de l’évolution des espèces, le génome s’agrandit
continuellement par suite de duplications de gènes et de
transpositions.
Les duplications:
se produisent en tandem, une séquence se trouvant répétée deux
fois dans le génome à la suite de la duplication.
Cette duplication permet à chacune des copies de la séquence
d’évoluer pour son propre compte ce qui augmente les chances de
produire des caractères nouveaux.
Les transpositions:
résultent de l’incorporation d’acides nucléiques synthétisés hors du
génome :
• soit par incorporation du DNA d’un virus,
• soit par transcription reverse d’un RNA de la cellule ou d’un virus,
au moyen d’une reverse-transcriptase qui produit un DNA
complémentaire (cDNA) et d’une transposase qui l’incorpore au
génome de la cellule.
Conversion de gène:
• Les séquences de gènes peuvent être
transformées par échange d’exons complets
(par une transposition à partir d’un autre gène).
• La transposition d’un exon peut ajouter un
domaine nouveau dans la structure d’une protéine
ou restaurer un domaine devenu non fonctionnel
au cours de l’évolution.
Les phénomènes de transformation de gènes en
Pseudo gènes, de transpositions & de coversions de
gènes
Jouent un rôle primordial dans l’évolution, l’adaptation
& la diversité génétique.
effet positif sur l’expression génétique.
Peuvent avoir un effet néfaste sur la régulation de
l’expression génétique.
En effet un transposon peut lors de son mouvement
interrompre un gène codant pour un facteur important
de la régulation du cycle cellulaire ou un facteur
biochimique vital & peut ainsi causer des métastases
ou des pathologies.
LES ACIDES RIBONUCLÉIQUES (OU ARN)
CARACTÉRISTIQUES GÉNÉRALES
Les ARN sont caractérisés par:
-L’ose= ribose:
remplace le 2’-désoxyribose présent dans les ADN.
-Les bases pyrimidiques et puriques rencontrées sont:
A, C, G et U (cette dernière est remplacée par T dans les ADN).
•Une seule chaîne nucléotidique (au lieu de deux dans les ADN).
Cette unique chaîne est plus courte que les chaînes d’ADN.
Les règles d’appariement entre les bases complémentaires
peuvent s’observer dans les ARN.
•Dans certains cas: une même chaîne d’ARN peut s’auto hybrider
où les portions bi caténaire ont un appariement suivant la règle:
A apparié avec U (deux liaisons hydrogène) et C apparié avec G
(trois liaisons hydrogène).
Ainsi les régions appariées donnent des tiges & les régions non
appariées donnent des boucles (structure en cruciforme) .
LES DIFFÉRENTS TYPES D’ARN.
Les cellules contiennent essentiellement quatre types
d’ARN:
- Les ARN ribosomiques (ou rARN).
- Les ARN de transfert (ou tARN).
- Les ARN messagers (ou mARN).
- Les ARN nucléaires de petite taille (ou snRNA)(ou
small nuclear RNA)(snRNA)
Dans la cellule, les rARN sont les plus abondants (au
moins 80% de l’ensemble des ARN de la cellule) et les
snRNA les moins abondants.
LES ARN RIBOSOMIQUES.
Ils constituent les ribosomes;
Les ribosomes sont des organites intra-cellulaires situés dans le
cytoplasme (également dans les mitochondries) et qui sont
l’usine de fabrication des protéines de la cellule.
On peut distinguer les rARN des procaryotes (E. coli) et les rARN
des eucaryotes.
Les rARN des procaryotes (E. coli): constituent les ribosomes
dits 70 S (S = unité de sédimentation ou Svedberg) qui sont
formés de deux sous-unités, une grande sous-unité (50 S) et une
petite sous-unité (30 S).
Chaque sous-unité comporte des protéines dites protéines
ribosomales (ou r-protéines) et des rARN.
Les rARN des eucaryotes.
Chez les eucaryotes, les ribosomes sont plus gros (80 S) avec
également une structure à deux sous-unités (40 S et 60 S).
La sous-unité 60 S contient trois rARN différents (5 S, 5,8 S et
28 S), et la petite sous-unité 40 S ne contient qu’un seul rARN
18 S).
Le nombre de protéines ribosomales à l’intérieur de chaque
sous-unité est plus important que chez les procaryotes.
.
LES ARN DE TRANSFERT (tARN).
•Les tARN sont les vecteurs qui vont transférer les acides aminés
jusqu’à l’usine ribosome où s’effectue la synthèse protéique.
•Structure des tARN.
Les tARN présentent bien entendu la structure générale des ARN.
Mais ils possèdent en plus quelques particularités propres.
•Des bases inhabituelles.Tout d’abord, ils contiennent des
nucléotides inhabituels par les bases qu’ils renferment. Ainsi,
l’hypoxanthine, dont le nucléotide correspondant est l’IMP (I =
inosine monophosphate), mais aussi la thymine ou des bases
méthylées.
•La structure spatiale des tARN. Les chaînes de tARN sont
constituées d’une centaine environ de nucléotides. Surtout, il
existe des zones d’appariement selon la règle de complémentarité
et des zones appelées boucles sans appariement où sont
présentes les bases inhabituelles.
•La forme générale est celle d’un L. En structure spatiale, on
présente souvent les tARN sous forme de trèfle ou un cruciforme.
Les sites importants dans les tARN.
Plusieurs sites sont importants dans les tARN. Tout d’abord:
•leur extrémité 3’-OH. Il existe trois nucléotides caractéristiques -CC-A-3’-OH. C’est par cette extrémité que sera fixé l’acide
aminé qui sera véhiculé par le tARN.
•Puis, l’anticodon qui correspond à un groupe de trois nucléotides
(ou triplet) situé sur une boucle du tARN. Ce triplet présente un rôle
très important puisqu’il doit s’apparier avec le codon correspondant
présent sur l’ARN messager.
Cet appariement entre l’anti-codon et le codon se fait par des
liaisons hydrogène et suivant les règles de complémentarité.
Le codon et l’anti-codon sont disposés de manière antiparalllèle.
LES ARN MESSAGERS (mARN).
Les ARN messagers (ou mARN) constituent le support essentiel de
l’information génétique entre l’ADN et le ribosome où s’effectuera la
synthèse protéique.
Leur durée de vie est très courte à la différence des tARN par
exemple. Chez les bactéries, la durée de vie d’un mARN est de
quelques minutes environ.
Les mARN sont très rapidement synthétisés et dégradés.
Ils sont formés d’une seule chaîne de nucléotides avec les bases
communes aux ARN: A, U, C et G.
Cette chaîne comporte une succession de triplets nucléotidiques.
Chaque triplet nucléotidique constitue un codon spécifique
d’un acide aminé donné.
Il existe naturellement une vingtaine d’acides aminés et
on dénombre 61 codons différents !
Ceci signifie qu’un acide aminé pourra être véhiculé
par plusieurs tARN spécifiques (différent par leur
anticodon).
Enfin, l’extrémité 5’ des tARN comporte un groupement
phosphate.
Les tARN jouent un rôle capital dans la biosynthèse
protéique.
LES PETITS ARN NUCLEAIRES.
Les petits ARN nucléaires (ou snRNA) sont
présents dans le noyau des cellules et sont
impliqués dans certaines étapes de la régulation
post transcriptionnelle (épissage alternatif).
II. Relation entre les structures des acides nucléiques
et leurs fonctions lord de l’expression génétique
•Les différentes structures des acides nucléiques & des protéines
associées à la chromatine ont une grande influence sur la régulation
de l’expression génétique.
•En effet: La structure de la double hélice d’ADN, sa forme A, B ou Z,
sa charge négative et son degré de superenroulement jouent un rôle
Déterminant dans l’accessibilité des gènes au facteurs d’initiation,
D’activation ou d’inhibition de la transcription.
•Donc la structure de l’ADN est déjà en soi un facteur régulateur
de l’expression génétique.
•Les interactions ADN—ADN , ADN—ARN, ADN—Protéines &
Protéines----Protéines sont également des éléments clef de
La régulation de l’expression des gènes.
INFORMATION GENETIQUE
Expression Génétique :
Transcription &Traduction
Réplication & Cycle Cellulaire
Expression Génétique
Définitions :
La double hélice
L’acide désoxyribonucléique (ADN ou DNA), constitué de deux
chaînes de nucléotides monophosphates, liés chacun par une
liaison ester entre son carbone 3’ et le carbone 5’ du nucléotide
suivant.
Ces deux chaînes de nucléotides sont unies entre elles par des
liaisons hydrogènes pour former un hybride en forme de double
hélice dont les deux brins sont : antiparallèles & complémentaires.
Chaque adénine (A) d’un des deux brins est liée par deux liaisons
hydrogène avec une thymine (T) de l’autre brin, et chaque guanine
(G) d’un brin est liée par trois liaisons hydrogène avec une cytosine
(C) de l’autre brin.
De sorte que si on désigne les nucléotides par les lettres A, C, G et T
en fonction des bases azotées qu’ils contiennent, on peut lire sur
cette figure le texte suivant :
AGAGTCGTCTCGAGTCA...
...TCTCAGCAGAGCTCAGT
• Écrire à la suite les lettres A, C, G et T dans l’ordre où on rencontre les
nucléotides sur l’un des brins de l’ADN de l’extrémité 5’ à l’extrémité 3’
aboutit à un texte.
• Le texte ainsi transcrit contient toute l’information nécessaire pour la
synthèse d’une protéine). C’est pourquoi on appelle ce brin d’ADN le brin «
sens ». L’autre brin est le brin complémentaire ou brin « antisens ».
• L’ensemble de l’information génétique transmise par chacun des parents à
un enfant (génome haploïde) est contenue ainsi en 3 x 109 nucléotides.
•Ces 3 x 109 nucléotides d’information génétique constituent
des gènes = séquences codantes = exons = cadres ouvert de lecture (Open
Reading Frames = ORF).
•Ces gènes sont copiés dans le noyau en
Transcription.
tRNA ou rRNA ou mRNA =
•Seuls les mRNA sont traduit dans le cytoplasme en protéines = Traduction.
Gène
•Pour permettre la biosynthèse d’une protéine, il doit y avoir dans la
structure de l’ADN, une séquence de nucléotides qui constitue le
gène de cette protéine.
•Il existe des séquences régulatrices = éléments régulateurs ou
promoteur:
généralement proximal en amont du gène
Le promoteur peut être en aval ou distal du gène et ne devient
proximal que lors de la transcription et ceci via des remaniements
structuraux de la chromatine).
Le promoteur est une séquence non-transcrite et non-traduite.
•Une région génique ou locus peut contenir une suite variable
d’exons (ORFs transcrites et traduites) et d’introns ( sequences
non-codantes)
• L’ensemble des mécanismes qui à partir de la séquence du gène
(ADN) conduisent à la production d’un acide ribonucléique (ARN) est
désigné sous le terme de Transcription
ARNm
proteine == traduction
Transcription & traduction == expression génétique.
Brin sens & Brin antisens
•Tout le DNA n’est pas transcrit seuls les gènes = exons = ORFs Sont
transcrits.
•En plus même si l’ADN est double brin seul un brin est transcrit ou
copié en mRNA.
•Le mRNA est complémentaire & antiparallèle au brin d’ADN transcrit
(nommé: Brin antisens)
•Le mRNA est identique à l’autre brin non transcrit
(nommé: Brin sens).
5’….AGCTTAACGCGTA…. 3’
3’….TCGAATTGCGCAT…. 5’
Brin DNA sens=
non transcrit=informatif.
Brin de DNA
Transcription
5’….AGCUUAACGCGUA…. 3’
antisens=transcrit.
mRNA
1.A. La transcription
• Les nucléotides qui précèdent l’exon contiennent de nombreuses
séquences reconnues par des protéines nucléaires qui permettent
le début (initiation) & la régulation de la transcription. C’est le
promoteur
• On distingue en particulier :
— vers -20 -30 (20 à 30 nucléotides en amont de l’exon 1 en
direction de l’extrémité 5’ du brin sens) une séquence TATATA
appelée « boîte TATA », qui est spécifiquement reconnue par la
protéine TFIID, cofacteur de la RNA-polymérase II ;
— vers -80 une séquence GGCCCATCCAT à la fois « boîte CAT ou
CAAT » et « boîte GC », sur laquelle viennent se fixer d’autres
protéines de la transcription (CTF et Sp-1) ;
— de nombreuses autres séquences sont des sites de fixation des
protéines régulatrices de la transcription. Par exemple, une
séquence TRE (TGACTCA) au début de la troisième ligne de la
sequence, sur laquelle vont se fixer des protéines de la famille AP-1
pour activer la transcription.
Cis- et trans-régulateurs
• Les séquences de nucléotides du promoteur=(facteurs cisrégulateurs), sont reconnues par une classe de protéines
spécifiques=(facteurs trans-régulateurs) dont la structure permet
une liaison avec l’ADN (DNA binding proteins).
• La structure secondaire et tertiaire des DNA binding proteins
comprend
des
domaines
spécifiques
permettant
la
reconnaissance des séquences régulatrices du gène : - domaines
en doigts de zinc/ –structures riches en leucine en forme de «
fermeture Eclair » (Leu zipper)/ – homéodomaines, bHLH = région
basique, hélice a, boucle, hélice a/ - domaines riches en glutamine/
– domaines riches en proline/ - hélices a acides (Asp, Glu).
• Les séquences qui reconnaissent les DNA binding proteins
(facteurs cis-régulateurs=promoteur) ont des effets sur la vitesse
de la transcription: activateurs = (séquences enhancer) ou
inhibiteurs = (sé-quences silencer). Leur liaison avec les protéines
dépend le plus souvent de circonstances physiologiques qui
induisent ou répriment l’expression du gène.
Initiation de la transcription
La RNA polymérase II est l’enzyme de la transcription des gènes
exprimés sous forme de protéines.
• Elle est présente dans tous les noyaux cellulaires. Sa masse
moléculaire est de 500 kilo daltons pour 10 sous-unités.
• La transcription qu’elle catalyse nécessite des ribonucléosides
triphosphates comme substrats (ATP, CTP, GTP et UTP), plusieurs
cofacteurs protéiniques (transcription factors)
L’énergie de la réaction est fournie par l’hydrolyse des liaisons
riches en énergie des nucléosides triphosphates (42 kJ/mol).
Initiation de la transcription
• L’initiation de la transcription sur un promoteur humain implique
plusieurs facteurs de transcription, connus sous les noms de TFIIA,
TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH et TFIIJ en plus de la RNA
polymérase II elle-même.
• Au centre de ce mécanisme initial, il y a l’association de TBP, la
sous-unité reconnaissant l’ADN du facteur TFIID, avec la boîte TATA
du promoteur. L’adjonction successive de TFIIB et de RAP30, petite
sous-unité de TFIIF , sont ensuite nécessaires pour la fixation de la
polymérase et déterminent à la fois le brin transcrit et le sens de la
transcription. A ce complexe ADN-TFIID-TFIIB-RAP30-polymérase II,
s’ajoutent encore successivement la grande sous-unité de TFIIF
(RAP74), TFIIE et TFIIH.
Alors la transcription peut commencer si les ribonucléotides
substrats sont présents.
Le complexe d’initiation de la transcription recouvre une
séquence d’environ 100 nucléotides (100pb avant Nt: +1)
du brin antisens de l’ADN, en provoquant l’ouverture et le
déroulement partiel de la double hélice à cet endroit.
• La transcription commence à environ 22 nucléotides de
la boîte TATA en direction opposée à celle des éléments
GC-CAAT et se poursuit en remontant le brin antisens
=(transcrit), en direction de son extrémité 5’.
• La formation de ce complexe est activée ou inhibée par
les facteurs trans-régulateurs liés aux séquences cisrégulatrices du même promoteur.
Elongation de la transcription
•Chaque nucléoside triphosphate est choisi spécifiquement
pour être complémentaire de la base du brin antisens qui va
lui faire face. La liaison riche en énergie entre le premier
phosphate estérifiant le carbone 5’ du ribose et les deux
autres
phosphates
est
hydrolysée,
libérant
un
pyrophosphate qui sera hydrolysé ensuite par une
pyrophosphatase.
Le phosphate restant est lié par une liaison ester au carbone
3’ OH libre du dernier nucléotide du transcrit en cours de
synthèse.
• La RNA polymérase construit un ARN hybridé avec le
brin antisens de l’ADN, dont la séquence primaire est la
copie du brin sens mais composée de ribonucléotides au lieu
des désoxyribonucléotides et d’uracile à la place des
thymines.
Exon
• Les exons sont des fragments de séquence primaire
d’un gène qui seront recopiés dans la structure
primaire de l’ARN messager, après l’épissage.
• Un exon code le plus souvent pour un domaine
fonctionnel de la protéine ou une partie d’un tel
domaine.
• Au cours de l’évolution le gène peut être modifié par la
substitution, l’insertion ou la délétion d’un exon entier
(conversion de gènes) ce qui modifie, apporte ou retire
à la protéine un domaine fonctionnel en entier.
Exon 1
• Après la fixation de la RNA-polymérase sur la boîte TATA par
l’intermédiaire du facteur TFIID, la transcription va commencer 23
nucléotides au delà de cette boîte.
• A ce point, la séquence du brin sens est 5’AGGCACAGA...3’, celle
du brin antisens est donc 3’TCCGTGTCT...5’ (complémentaire et
antiparallèle).
• En choisissant comme substrats les ribonucléotides
complémentaires de ce brin antisens, la RNA-polymérase va
composer 5’AGGCACAGA...3’ qui sera le début de la séquence de
l’ARN transcrit. Lorsque la polymérase rencontre un A sur le brin
antisens, elle incorpore un nucléotide à Uracile dans le mRNA :
5’ UGGCUCUGU...3’.
• La séquence de l’ARN transcrit recopie donc celle du brin sens de
l’ADN.
• La transcription se poursuit alors tout au long du brin antisens en
incorporant les nucléotides dans l’ARN transcrit.
Fin de la transcription
• Vers la fin du gène la RNA-polymérase rencontre une
séquence 3’-TTATTT-5’ qu’elle reconnaît comme un
signal de fin d’activité. La transcription s’arrête en effet
peu après ce signal qui est transcrit en AAUAAA.
• La RNA-polymérase quitte l’ADN et libère le transcrit
d’ARN qui contient l’information génétique recopiée
pour permettre l’expression du gène sous forme de
protéine.
Modifications du transcrit
• Chapeau = Capping: une enzyme ajoute un nucléotide à Guanine
sur les phosphates du Carbone 5’ du premier nucléotide du transcrit
et transfère des radicaux méthyles sur les premiers nucléotides. Ces
modifications font un début commun à tous les transcrits primaires,
précurseurs des RNA messagers.
• Queue poly-A : une enzyme coupe le transcrit environ 10 à 20
nucléotides au delà de la séquence AAUAAA et synthétise sur le
Carbone 3’ libre du dernier nucléotide du transcrit restant une longue
chaîne de 500 à 2000 nucléotides à Adénine polymérisés.
• Édition : Des enzymes peuvent « éditer » (au sens anglais du terme)
la structure primaire du transcrit en modifiant certaines bases
(exemple : C en U par une cytosine désaminase spécifique
• Excision - épissage : les parties non codantes de la structure
primaire du transcrit sont coupées et les parties codantes ré
assemblées
Les ARN messagers sont détruits par des ribonucléases dans le
cytoplasme. Leur hydrolyse libère des nucléotides qui seront
réemployés à la synthèse de nouveaux acides nucléiques.
• Pour protéger les ARN messagers de ce catabolisme, une
structure particulière dissimule l’extrémité 5’ terminale de ces
ARN aux exonucléases spécifiques de cette partie de l’ARN.
Cette structure est appelée chapeau du messager (cap).
• Au minimum, il y a fixation d’un GMP sur le deuxième phosphate
du nucléoside triphosphate qui se trouve à l’extrémité 5’ du
transcrit. Ce GMP est méthylé sur son azote n°7.
• Si le nucléotide initial comprend une adénine celle-ci peut être
méthylée sur l’azote n°6. Les riboses des nucléotides initiaux
sont quelquefois méthylés sur l’oxygène de la fonction alcool en
2’.
• Le transcrit primaire contient des nucléotides.
• Il a reçu un chapeau (cap), GMP méthylé qui se fixe sur
le phosphate b de l’ATP en 5’ du transcrit primaire.
• Il reçoit une queue poly-A synthétisée en 3’ après la fin
du transcrit.
• les introns excisés seront reconnus par :
— un site donneur GU en 5’ de chaque intron,
— un site receveur AG en 3’ de chaque intron.
• Après cette maturation le transcrit primaire devenu ARN
messager sera transporté vers le cytoplasme pour la
traduction.
Excision - épissage
• Les introns, parties non codantes des gènes des eucaryotes,
sont coupés (excision) de la structure primaire des ARN au
cours de la maturation des messagers.
• Les exons, parties codantes, sont ensuite liés entre eux bout
à bout (épissage), pour établir la séquence primaire de l’ARN
messager.
• L’excision et l’épissage représentent donc l’action
d’enzymes et de ribozymes qui catalysent la coupure de l’ARN
(endoribonucléase) et la fermeture de la brèche (ARN ligase).
• L’épissage peut être alternatif, c’est à dire peut conduire à
plusieurs structures d’ARNm : les ARNm alternatifs ont
chacun en propre certains exons ainsi que des exons en
commun.
Formation du lasso
• L’excision des introns et l’épissage des exons est l’étape la plus importante
de la maturation du transcrit dans le noyau cellulaire.
• Elle fait appel à des facteurs spécifiques : ribonucléoprotéines contenant
des petits ARN (snR-NP), ribozymes (ARN ayant des propriétés catalytiques),
protéines codées par les introns eux-mêmes (maturases)...
• La structure secondaire du transcrit met en contact trois séquences de
l’intron : la séquence du début de l’intron (extrémité 5’ ou site donneur), la
séquence de la fin de l’intron (extrémité 3’ ou site accepteur) et une séquence
riche en pyrimidines (C ou U) contenant un nucléotide à adénine (A du
branchement).
• Le site donneur commence habituellement par un nucléotide à guanine dont
le phosphate est détaché de l’exon précédent pour être transféré sur le
carbone 2’ de l’A du branchement. Le dernier nucléotide du site accepteur,
aussi une guanine, est détaché de l’exon suivant, dont le premier nucléotide
est lié par son phosphate 5’ au carbone 3’ du dernier nucléotide de l’exon
précédent.
• L’intron, libéré sous forme de lasso, est détruit par des nucléases. Le
transcrit perd successivement tous ses introns et les exons épissés
constituent la séquence codante du messager.
RNA Messager
• L’ARN messager comprend plusieurs séquences :
— une séquence 5’ non-codante, qui ne sera pas traduite, qui correspond
à l’exon 1 et à une partie de l’exon 2 dans le gène de l’apoA-II ;
— un codon AUG qui fixe le tARN de la méthionine initiale ;
— des séquences de codons pour incorporer les acides aminés du
signal-peptide et du propeptide;
— la séquence des codons dont les acides aminés formeront la séquence
primaire de la protéine ;
— le codon de terminaison (ici, UGA) ;
— une séquence 3’ non-traduite qui s’achève par la queue poly-A.
• Sur la séquence 5’ non-traduite, va se construire le complexe d’initiation
de la traduction où les ribosomes vont s’assembler successivement pour
commencer la traduction.
La traduction
•Lors de la traduction:
la structure transcrite sur l’ARNm, s’exprime par la
synthèse de protéines dont la séquence traduit en
acides aminés l’information portée par la structure
primaire de l’ADN.
La traduction est faite dans le cytoplasme des cellules :
• soit pour libérer des protéines cytoplasmiques,
• soit pour conduire ces protéines dans les membranes
ou les organites de la cellule (reticulum
endoplasmique, appareil de Golgi, membrane
plasmique, lysosomes, mitochondries, noyau, etc...),
• soit pour excréter ces protéines à travers les
membranes vers l’extérieur de la cellule.
Codon
• La liaison de l’ARN de transfert (ARNt) avec l’ARN messager
(ARNm) porteur de l’information, se fait par complémentarité entre
3 nucléotides de chacun de ces deux ARN.
Les 3 nucléotides de l’ARNm constituent un codon et les 3
nucléotides de l’ARNt un anticodon.
Au cours de la traduction l’anticodon et le codon se lient de
manière antiparallèle, et l’acide aminé porté par l’ARNt est
incorporé à la protéine en cours de synthèse.
• La séquence primaire de l’ARNm est donc traduite par groupes
de 3 nucléotides (codons). Un nucléotide de l’ARNm au cours de la
traduction peut se trouver en position 1, 2 ou 3 dans un codon si le
nombre de nucléotides qui le séparent du codon d’initiation AUG
est ou n’est pas un multiple de 3. Cette position porte le nom de
cadre de lecture.
Code génétique
• La séquence codante est une suite de codons dont
chacun permet d’incorporer spécifiquement un acide
aminé dans la synthèse d’une protéine.
• Le code génétique est le même pour tous les êtres
vivants de la biosphère (universel). Il existe quelques
variations (codons propres à la biosynthèse des protéines
dans les mitochondries).
• Le code génétique comporte 61 codons pour signifier les
20 acides aminés qui participent à la synthèse des
protéines :
chaque acide aminé peut être codé par plusieurs codons
(de un à six) qui diffèrent en général par leur troisième
nucléotide. On dit que le code est dégénéré.
Ribosome eucaryote
• Les
acides ribonucléiques ribosomiaux et les
protéines ont des sites de fixation pour la séquence
du messager,
• Les ARN de transfert portent l’acide aminé à
incorporer (site A) et le peptide en cours de synthèse
(site P), un site catalytique pour former les liaisons
peptidiques, des sites de fixation pour les cofacteurs
protéiques de l’initiation (eIF2, eIF3), de l’élongation et
de la terminaison et des sites de régulation (protéine
S6).
Polyribosomes
•
L’initiation est un phénomène permanent à l’extrémité 5’
d’un ARN messager et les ribosomes se succèdent sur
le même messager à raison d’un tous les 100
nucléotides environ, formant un polyribosome.
• Les polyribosomes présentent un aspect différent
selon la régulation des différentes étapes de la
traduction. Plus l’initiation est active plus les ribosomes
sont nombreux sur le messager. Si l’élongation est
lente, les ribosomes vont mettre plus de temps à lire la
séquence codante. Une activation de la terminaison
dissocie tous les ribosomes du messager.
De nombreux antibiotiques sont capables d’interférer
avec chacune des étapes de la synthèse des protéines
(streptomycine, cycloheximide, puromycine).
ARN de transfert
• Les ARN de transfert constituent le lien chimique nécessaire
entre la structure du codon, reconnu par l’anticodon, et l’acide
aminé spécifique porté par l’ARNt. C’est en quelque sorte le
dictionnaire de la traduction.
• L’anticodon est une séquence de trois nucléotides située à
l’extrémité de la boucle inférieure de l’ARNt, complémentaire et
antiparallèle de la séquence du codon de l’acide aminé correspondant.
• Chaque acide aminé est lié spécifiquement (code génétique) par
une aminoacyl-tRNA-synthétase à l’extrémité 3’ de l’ARNt dont
l’anticodon lui correspond (ARNt chargé).
• Les ribosomes lient les ARNt chargés sur le site A de
l’élongation si leur anticodon s’apparie avec le codon du
messager à cet endroit. L’élongation transfère alors le peptide
sur l’acide aminé nouveau, lui-même porté par l’ARN de transfert.
Sérine tRNA synthétase
Cystéine tRNA synthétase
• Les aminoacide-tRNA-synthétases sont les enzymes qui chargent
les acides aminés libres du cytoplasme sur les ARN de transfert
correspondants. Le coenzyme ATP est hydrolysé en AMP et en
pyrophosphate pour fournir l’énergie nécessaire. La liaison ester
constituée entre l’acide aminé et son ARNt est riche en énergie et
sera hydrolysée au cours de l’étape d’élongation de la traduction.
• Les aminoacide-tRNA-synthétases ont une double spécificité très
étroite pour les deux substrats : l’acide aminé reconnu (ici, la
cystéine) et les ARNt dont les anticodons sont complémentaires
des codons correspondant à cet acide aminé dans le code
génétique. L’exactitude de la traduction repose entièrement sur
cette double spécificité.
• La reconnaissance de l’ARNt se fait par l’anticodon dans certains
cas (l’enzyme ne tenant pas toujours compte de la première base
de l’anticodon, ce qui explique la dégénérescence du code
génétique) ou bien encore par d’autres séquences de l’ARNt
communes aux ARNt synonymes. Certaines aminoacide-tRNAsynthétases sont régulées par phosphorylation.
Initiation de la traduction
L’initiation de la traduction est l’étape limitante de la
traduction.
• Les sous-unités des ribosomes sont dissociées dans le
cytoplasme. Une cascade d’évènements vont former un
complexe d’initiation.
• Le facteur eIF2 (eucaryotic initiation factor 2) est porteur
d’un GDP, coenzyme qu’il vient d’hydrolyser à l’étape
précédente. En présence du facteur eIF2B, un nouveau
GTP est substitué à ce GDP. Le facteur eIF2 ainsi activé,
peut alors lier l’ARNt chargé d’une méthionine dont
l’anticodon est complémentaire du codon d’initiation
(AUG) du messager.
En présence du cofacteur eIF4C, la petite sous-unité va
fixer le facteur eIF3 et le facteur eIF2 activé qui porte
l’ARNt chargé de la méthionine initiale. L’énergie de la
formation de ce complexe a été fournie par l’hydrolyse de
la liaison riche en énergie du GTP porté par le facteur eIF2.
La séquence 5’ non traduite de l’ARN messager est
reconnue par les cofacteurs eIF4A, eIF4B et eIF4F qui s’y
fixent. Grâce à l’hydrolyse d’un ATP pour fournir
l’énergie, le messager est alors transféré sur la petite
sous-unité, en regard du site P, de façon à hybrider les
nucléotides du codon d’initiation avec ceux de
l’anticodon de l’ARNt de la méthionine initiale.
• En présence du dernier cofacteur eIF5, le complexe va
se lier à une grande sous-unité pour constituer un
ribosome fonctionnel. Les cofacteurs d’initiation sont
libérés et la traduction commence.
Le cofacteur eIF2 toujours porteur de son GDP, se libère
pour recommencer un nouveau complexe.
Cadre de lecture
• Le positionnement du messager par rapport à l’ARN de
transfert de la Méthionine initiale détermine le cadre de
lecture de la traduction du messager.
• L’ARN de transfert de la méthionine occupe un des deux
sites de fixation des tRNA sur le ribosome : site P (ou
peptidique, car il contiendra le peptide en cours de
synthèse). Le codon AUG du messager, en s’hybridant
dans le site P avec l’anticodon CAU de l’ARN de transfert
de la méthionine, place le messager de telle sorte que le
codon suivant (N1N2N3) apparaisse dans l’autre site de
fixation : site A (ou acide aminé, car il servira à la fixation
des nouveaux acides aminés incorporés).
• Le nucléotide N1 sera toujours le premier de chaque
codon.
Facteurs d’initiation
La formation du complexe d’initiation fait appel a de nombreux
facteurs qui participent à la structure, à l’activation ou à la
régulation de ce complexe.
• Parmi ces facteurs on reconnaît les deux sous-unités des
ribosomes (Unité L ou 60S et unité S ou 40S), le Met-tARN initiateur,
l’ARN messager et les coenzymes donneurs d’énergie ATP et GTP.
• Les cofacteurs protéiniques de cette étape sont classifiés sur ce
Tableau. Certains participent à l’activation du Met-tARN initiateur
ou à sa liaison avec la sous-unité S, d’autres à la reconnaissance
de l’extrémité 5’ de l’ARN messager ou à sa liaison avec le
complexe d’initiation, d’autres enfin à la liaison finale avec la sousunité L.
• Certains de ces facteurs protéiniques et une au moins des
chaînes protéiniques de la petite sous-unité sont régulées par
phosphorylation ou déphosphorylation sur des Ser ou des Thr.
Elongation
Incorporation d’un acide aminé
• Un ARNt chargé vient se fixer sur le site A libre. Le codon du messager au
fond du site A va se lier complémentairement avec l’anticodon de l’ARNt du
nouvel acide aminé ce qui va permettre l’incorporation de cet acide aminé dans
le peptide en cours de synthèse.
Transfert du peptide
Le ribosome catalyse alors le transfert du peptide situé sur l’ARNt du site P sur
la fonction amine de l’acide aminé de l’ARNt du site A. Il utilise pour cela,
l’énergie de l’hydrolyse de la liaison ester riche en énergie entre le peptide et
l’ARNt du site P.
Translocation des codons
• L’ARNt libre du site peptidique quitte le ribosome.
• Le messager, l’ARNt restant et le peptide en cours de synthèse sont alors
déplacés (translocation) du site A vers le site P, sans qu’il y ait fusion de
l’hybride entre le codon et l’anticodon
Terminaison de la traduction
• Lorsque le site A se trouve en regard d’un codon nonsens annonçant la fin de la traduction, le complexe va
se dissocier du messager en présence d’un dernier
cofacteur eRF.
• Les deux sous-unités du ribosome se dissocient, la
protéine synthétisée est libérée, ainsi que le dernier
ARNt.
Facteurs d’élongation ou de terminaison
• L’élongation ou la terminaison de la protéine naissante font
appel a de nombreux facteurs qui participent aux étapes
successives de la traduction.
• Parmi ces facteurs on reconnaît les ribosomes, les aminoacyltARN activés, l’ARN messager et le coenzyme donneur d’énergie
GTP.
• Les cofacteurs protéiniques de ces étapes sont classifiés sur
Tableau. Certains participent à l’activation des aminoacyl-tARN
ou à leur liaison au site A du ribosome, d’autres à la translocation du tARN porteur du peptide naissant du site A vers le
site P. Le dernier facteur en-gendre la dissociation du ribosome
et la libération de la protéine synthétisée.
Signal-peptide
• Lorsqu’une protéine est synthétisée, sa structure secondaire ou
tertiaire se construit au fur et à mesure de la traduction et elle est libérée
dans le cytoplasme.
• Lorsque cette protéine est destinée à être incorporée dans les
membranes ou les organites de la cellule, la partie codante de l’ARN
messager commence par une séquence de quelques acides aminés qui
sert d’adresse pour l’incorporation de cette protéine dans la membrane.
• Ces peptides orientent la destinée de la protéine : incorporation dans
les membranes (reticulum endoplasmique, appareil de Golgi, membrane
plasmique, lysosomes...), entrée dans les mitochondries, excrétion hors
de la cellule via l’appareil de Golgi, etc...
• Le signal-peptide est un peptide d’adressage situé à l’extrémité NH 2 terminale des protéines à excréter. Parce que sa fonction est de pénétrer
dans la membrane du reticulum endoplasmique, sa structure est riche en
acides aminés hydrophobes (Phe, Leu, Ile, Met, Val).
Polyribosomes liés
• Les polyribosomes qui se forment sur un messager comportant
un signal peptide ont une évolution légèrement différente. La
traduction s’arrête peu après la synthèse du signal-peptide, dès
que celui-ci apparaît hors de la structure du ribosome et se lie avec
la SRP (SRP = Signal Recognition Particle), qui inhibe l’élongation.
• Pour que l’élongation puisse se poursuivre, il faut que la SRP soit
reconnue spécifiquement par un récepteur de la membrane du
reticulum endoplasmique. Dès que cette liaison est établie, le
ribosome est lié par la ribophorine, toujours dans la membrane du
reticulum, près d’une protéine qui ouvre un pore à travers cette
membrane. Le SRP écarté, l’élongation va reprendre.
• Le peptide en cours de synthèse est alors dirigé à
travers cette membrane pour se développer dans la
lumière du reticulum endoplasmique.
• A la face interne de la membrane une
endopeptidase spécifique va couper le signal
peptide et la synthèse se poursuivra jusqu’à la
terminaison. La protéine sera enfin incorporée dans
une membrane ou exportée, à travers l’appareil de
Golgi, vers l’extérieur de la cellule.
• L’adressage des protéines vers les mitochondries
fait appel à un autre type de peptide d’adressage qui
conduit les peptides à traverser la membrane
mitochondriale.
modifications chimiques se produisent après l’incorporation
des acides aminés dans la structure primaire de la protéine
(traduction); on les appelle:
modifications post-traductionnelles.
• On distingue des modifications cotraductionnelles qui se
produisent alors que la traduction se poursuit encore et que le
peptide naissant est encore attaché au ribosome qui l’a
construit, des modifications post-traductionnelles proprement
dites qui ont lieu dans la cellule, dans les organites ou hors de
la cellule.
• On appelle protéine mature la forme chimique définitive que
la protéine montrera au moment où elle remplira sa fonction
dans l’organisme.
Addition de sucres: Glycosylation
La réplication
• Au cours de la vie de la cellule (cycle cellulaire, d’une
division mitotique à la suivante), l’ADN doit être dédoublé
pour que chaque cellule fille reçoive un génome complet
dans son noyau.
• Cette synthèse se produit à la phase S (au milieu du cycle
cellulaire) grâce à l’activité de la DNA-polymérase a.
D’autres DNA-polymérases participent à la réparation de
l’ADN lésé ou à la réplication de l’ADN mitochondrial.
Le cycle cellulaire
• La vie de la cellule se déroule entre deux mitoses. Chez les Mammifères,
cette période dure en moyenne 30 heures bien qu’il y ait des cellules dont la
vie soit très courte ou au contraire très longue.
• Durant ces trente heures la cellule traverse quatre phases :
— la phase G1 où le génome étant diploïde, chaque gène est représenté en
deux exemplaires. La chromatine est accessible aux RNA-polymérases qui
transcrivent les gènes en messagers, qui seront à leur tour traduits. Phase de
préparation à la synthèse d’ADN.
— vers la moitié du cycle commence la réplication de l’ADN : les DNApolymérases vont mettre environ 8 heures (phase S) pour recopier en double
l’ADN de chaque chromosome. Durant cette phase la transcription est
inhibée. Phase de synthèse d’ADN.
— puis la cellule entre en phase G2 où chaque gène est représenté en quatre
exemplaires. La chromatine est à nouveau accessible aux RNA-polymérases
qui recommencent à transcrire. Phase de réparation des mutations.
— enfin survient la mitose, qui donne naissance à deux cellules filles.
Chacune recevra une des copies identiques de l’ADN de chaque
chromosome et chaque gène y sera représenté en deux exemplaires.
DNA polymérase
• Les DNA-polymérases sont des enzymes du noyau
cellulaire qui agissent en phase S du cycle pour doubler
systématiquement l’ensemble du génome diploïde.
• Elles utilisent des désoxyribonucléotides triphosphates
(dATP, dCTP, dGTP et dTTP) et des amorces de RNA
synthétisées par une DNA primase (RNA polymérase
capable de synthétiser un court brin de RNA
complémentaire d’un brin de DNA).
• Elles synthétisent l’ADN nouveau par fragments qui sont
liés entre eux par une DNA-ligase.
• Elles ont aussi une activité exonucléasique, qui leur permet
en particulier d’hydrolyser l’ARN des amorces.
Réplication
• Les DNA-polymérases commencent leur synthèse en de nombreux
points d’initiation de la réplication. La synthèse de DNA commence sur
des amorces de RNA constituées par la DNA-primase.
La réplication se poursuit dans une direction : dans ce sens l’un des
deux brins de l’ADN (brin « avancé ») est parcouru par l’enzyme dans
le sens 3’ -- 5’ ce qui permet la synthèse d’un autre brin dans le sens
5’-- 3’. Les DNA-ligases assurent ensuite la liaison entre les différents
fragments de l’ADN nouveau.
• La synthèse de l’autre brin (brin « retardé ») est plus complexe parce
que l’enzyme parcourt ce brin de 5’ -- 3’. La DNA primase synthétise
des amorces de quelques nucléotides en avant de la zone de réplication,
et la DNA polymérase construit à la suite de petits fragments d’ADN
dans le sens 5---3’. La DNA polymérase hydrolyse en avançant l’amorce
de RNA du fragment précédent (activité exonucléasique).
Les petits fragments seront ensuite reliés entre eux par la DNA-ligase.
LA RÉPLICATION DE L’ADN CHEZ LES PROCARYOTES
Caractéristiques générales.
réplication dite semi-conservatrice. Ceci signifie que sur les deux brins
d’ADN, on a toujours un brin d’ADN qui provient d’un des deux brins de
l’ADN parental et un brin nouvellement formé. A chaque réplication, les deux
brins d’ADN parental se séparent, chacun de ces deux brins sert de matrice
pour la synthèse d’un brin complémentaire.
Les éléments nécessaires à la réplication de l’ADN.
La réplication de l’ADN nécessite:
- Tout d’abord, une matrice d’ADN constituée par un brin parental.
- La présence de nucléotides propres à l’ADN, c’est-à-dire contenant du 2’désoxyribose, des bases A, T, G et C et sous forme de nucléosides triphosphates:
dATP, dTTP, dCTP et dGTP (on écrit souvent pour les dénommer dNTP).
- La présence de nombreux enzymes ( P dna A, Pdna B= hélicase, P SSB
=stabilisateur de sb, Primases, polymérases, exonucléases, ligases & P
Tus=terminaison ).
- La présence de certains ions (cations bivalents: Mg 2+ , ce cation est
indispensable pour la réplication de l’ADN).
Les mécanismes de l’initiation de la réplication
L’unité d’ADN où se produit la réplication est appelée le réplicon. Il
a une origine où est initiée la réplication et une terminaison où est
arrêtée la réplication.
•L’ADN bactérien constitue à lui seul un réplicon. A partir d’un
point d’initiation, la réplication peut progresser soit de manière
unidirectionnelle, soit de manière bidirectionnelle.
•Chez les procaryotes, à partir d’une origine de la réplication (ou
oeil de réplication), la réplication progresse dans les deux sens:
bidirectionnel
•Chez E. coli, l’ADN bicaténaire a une origine unique de la
réplication appelée OriC. Le locus OriC est une séquence de 250 pb:
tandem de trois séquences presque identiques de 13 nucléotides
(séquences de type GATCTNTTNTTTT).
•Au locus OriC, quatre sites de liaison comportant un motif de paires de
bases lient Des copies multiples d’une protéine appelée dnaA ou
protéine d’initiation de la réplication, codée par le gène dnaA.
•Ces liaisons nécessitent de l’ATPet sont indispensable à la
transformation localisée de l’ADN double brin en ADN simple brin.
•Ces complexes vont ensuite fixer 2 ADN hélicases, ou protéine dnaB,
une hélicase pour chacun des brins d’ADN codée par le gène dnaB.
•L’hélicase déroule l’ADN (en présence d’ATP et d’une autre protéine
appelée dnaC) et définit la fourche de réplication.
•Les brins séparés de l’ADN sont stabilisés sous forme simple
brin grâce à la fixation de protéines appelées SSB (pour
« single strand binding »). Ces protéines SSB empêchent les
deux brins d’ADN de se réapparier.
•le complexe primosome entre l’hélicase et une enzyme
primase (ou protéine dnaG) permet la Synthèse des amorce
d’ARN (9-12 nucléotides).
•L’ADN polymérase III s’insère au niveau de la fourche de
réplication et utilise l’amorce d’ARN pour la synthèse de
l’ADN.
•L’ADN polymérase III possède deux sites actifs capables de
synthétiser les nouveaux brins d’ADN au niveau de la
fourche de réplication.
La réplication n’est pas identique entre les deux brins d’ADN.
Pour l’un des brins: la réplication s’effectue de manière
continue, brin avancé, sens 5’à 3’
Pour l’autre brin elle est discontinue, brin retardé, orienté de
manière anti-parallèle 3’ à 5’ synthèse discontinue des
fragments d’OKAZAKI.
le brin matrice du brin retardé forme une boucle autour d’un
des deux sites actifs de l’ADN polymérase III.
intervention de la primase et de l’ADN polymérase III pour la
synthèse du brin retardé d’ADN dans le sens 5’à3’
Après synthèse la boucle est défaite et une nouvelle est
reformée au niveau de l’ouverture de la fourche de réplication.
L’ADN polymérase III utilise l’ADN comme matrice (sens 5’à3’), l’ARN comme
amorce & comporte 7 sous-unités catalytiques. les amorce d’ARN sont
synthétisées par une ARN polymérase ou primase. l’ADN polymérase III allonge
cette amorce d’ARN
L’hydrolyse et le remplacement des amorces d’ARN,
intervention de la RNAse H, l’ADN polymérase I et une DNA-ligase.
Les ADN polymérases I et III impliquées dans la réplication de l’ADN
présentent plusieurs fonctions enzymatiques:
une fonction polymérasique: ajoute un nucléotide à l’extrémité 3’ OH d’un acide
nucléique, une fonction exonucléasique 5’à3’ (activité de réparation de l’ADN) &
une fonction exonucléasique 3’à5’ (l’enzyme vérifie le dernier nucléotide mis en
place).
Terminaison de la réplication.
IL existe au moins 6 sites de terminaison ou sites (ter) de terminaison dans le
génome bactérien. Une protéine spécifique appelée Tus peut se lier aux sites de
terminaison.
Cette liaison arrête la protéine dnaB (hélicase).
LA RÉPLICATION DE L’ADN CHEZ LES EUCARYOTES
•Caractéristiques générales.
La réplication de l’ADN chez les eucaryotes est tout à fait
comparable à la réplication de l’ADN chez les procaryotes.
Elle est généralement bidirectionnelle, elle est discontinue entre les
deux brins d’ADN. Des amorces d’ARN sont nécessaires. Cette
réplication est également complémentaire, antiparallèle et dans le
sens 5’à 3’.
•Caractéristiques particulières.
La réplication se fait en de nombreux points d’initiation. Elle fait
intervenir un nombre d’ADN polymérases plus important que chez
les procaryotes. De nombreuses protéines interviennent comme
facteurs de réplication.
Les changements subis par les nucléosomes au cours de la
réplication de l’ADN eucaryote & la réplication de l’ADN des
extrémités chromosomiques (ou télomères) ont un rôle primordial
dans la régulation du cycle & de la division cellulaire.
Mutations génétiques & systèmes de réparations
LES TYPES DE MUTATION DE L’ADN.
• Les mutations sont définies comme un changement
transmissible dans le matériel génétique.
• Ces mutations peuvent concerner les cellules germinales
ou les cellules somatiques.
• Elles peuvent être spontanées ou consécutives à des
altérations des bases puriques ou pyrimidiques.
• Elles peuvent être provoquées par des dysfonctionnements
au cours de la réplication ou de la réparation de l’ADN.
• On peut classer les mutations selon l’étendue de la lésion
de l’ADN: les macrolésions et les microlésions.
Les macrolésions de l’ADN.
Dans ce groupe, on peut ranger:
- Les délétions (amputations de matériel génétique
d’amplitude variable).
- Les duplications.
- Les amplifications (multiplication de séquences.
- Les fusions de gènes.
- Les inversions (changement d’orientation tête-bêche d’un
segment variable d’ADN).
- Les insertions de séquences d’ADN.
Les microlésions.
Dans ce cadre, on range les mutations ponctuelles de
l’ADN.
délétion, insertion ou substitution, d’un nucléotide par
un autre.
La substitution d’une paire de bases par une autre peut
s’agir
d’une transition ou d’une transversion;
La transition: correspond au remplacement d’une base
purique par une autre base purique ou
une base pyrimidique par une autre base
pyrimidique.
La transversion: correspond au remplacement d’une
base purique est par une pyrimidine ou
d’une pyrimidine par une purine.
substitution non-synonyme:
incorporation d’un acide aminé différent dans la protéine
substitution synonyme
incorporation du même acide aminé dans la protéine
Les substitutions synonymes résultent de la dégénérescence du
code génétique.
Lorsqu’une substitution non-synonyme se produit dans le DNA
(génotype) aboutit à l’incorporation d’un acide aminé
fonctionnellement différent dans la structure primaire d’une
protéine,
il en résulte l’apparition d’un caractère différent (mutation) dans
le phénotype de l’individu.
Toute autre modification entraînant une protéine traduite plus
longue ou plus courte, ou encore un décalage de la lecture
des codons, se traduit par une séquence primaire différente et
donc la plupart du temps une mutation dans le phénotype de
l’individu.
Délétion
délétion, c’est à dire suppression d’un ou de plusieurs nucléotides
Les délétions sont d’importance variable selon le nombre de
nucléotides suprimés:
de 1 ou 2 nucléotides, elles décalent le cadre de lecture
(codons)
de 3 nucléotides, elles aboutissent à la suppression d’un
acide aminé dans la protéine ex-primée
de grande longueur, elles peuvent supprimer l’expression
d’un ou de plusieurs exons, voire d’un gène entier.
Insertion:
Insertion, c’est à dire addition d’un ou de
plusieurs nucléotides.
Les insertions sont d’importance variable selon
leur longueur :
de 1 ou 2 nucléotides, elles décalent le cadre
de lecture (codons)
de 3 nucléotides, elles aboutissent à
l’addition d’un acide aminé dans la protéine
exprimée
de grande longueur, elles peuvent modifier
complètement la traduction des exons
dans les introns ou dans les exons nontraduits, on rencontre souvent de longues
insertions de structure variable qui ont des effet
??? sur l’expression du gène.
LES SYSTÈMES DE SAUVEGARDE ET RÉPARATEURS
DE L’ADN
GÉNÉRALITÉS.
L’ADN est sensible à des agressions soit chimiques soit
physiques. Ces agressions peuvent entraîner la perte
d’une base (purique ou pyrimidique), mais aussi
entraîner la rupture d’un brin ou des deux brins d’ADN.
La gravité des lésions que l’ADN subit en permanence
est liée au fait que cette molécule est unique au sein
d’une cellule et au caractère transmissible de ces
atteintes. Des mécanismes puissants, cependant non
infaillibles sont présents dans la cellule pour déceler et
corriger les lésions de l’ADN.
ORIGINE DES ALTÉRATIONS DE L’ADN.
Les agents physiques.
L’ADN peut être agressé par des agents physiques
comme les rayons X, les rayons gamma, les rayons
ultra-violets (UV). Ces agents physiques sont des
agents mutagènes (mutagènes= qui provoquent des
mutations dans l’ADN) les plus anciennement
connus. Les rayons UV provoquent la formation de
dimères de thymine mais aussi de dimères de
thymine-cytosine. La présence de tels dimères
entraîne un blocage de la réplication de l’ADN et de
la transcription. Sans réparation, leur présence serait
donc léthale pour la cellule.
Les agents chimiques.
L’ADN peut être agressé par un nombre considérable de dérivés
chimiques. Nous citerons plus spécialement:
- Les agents alkylants. Ils entraînent l’addition de groupes alkyles
aux bases (souvent des groupes -CH 3 ). Les agents alkylants sont
utilisés comme médicaments anticancéreux.
- L’acide nitreux (produit dérivé des nitrates ou nitrites présents
dans les produits alimentaires ou dans les engrais). Cet agent
chimique transforme par exemple, par désamination oxydative,
l’adénine en hypoxanthine.
- Certains composés chimiques ressemblent à des bases puriques
ou pyrimidiques. Ils peuvent être incorporés dans l’ADN à la place
des bases normales (cas du bromouracile qui ressemble à la
thymine).
- Enfin, certains agents s’intercalent entre les deux brins d’ADN,
ce sont des agents intercalants. Ils perturbent ainsi la réplication.
C’est le cas du révélateur de l’ADN utilisé dans de nombreux
laboratoires de biologie moléculaire: le bromure d’éthydium ou
B.E.T.
LES TYPES DE DOMMAGES DE L’ADN.
Perte d’une base.
La liaison glycosylique liant dans l’ADN les bases avec le
désoxyribose est relativement labile dans des conditions
physiologiques. A l’intérieur d’une cellule de mammifère,
plusieurs milliers de bases puriques et plusieurs
centaines de bases pyrimidiques sont spontanément
perdues dans le génome d’une cellule haploïde et par
jour. La perte d’une base purique ou pyrimidique crée un
site appelé apurinique ou apyrimidique (ou site AP).
Modification d’une base.
La déamination.
Les groupes -NH 2 des bases peuvent être instables. Ils
sont convertis en groupes cétoniques =C=O. Ainsi, la
cytosine désaminée est transformée en uracile, l’adénine
en hypoxanthine etc...
Les modifications chimiques.
Beaucoup d’agents chimiques peuvent réagir avec les bases des
acides nucléiques. Il peut s’agir des espèces oxygénées réactives
(peroxyde d’hydrogène, radicaux hydroxyles et peroxyles) mais
aussi des radiations ionisantes (rayons X, rayons gamma). Ces
espèces peuvent conduire à des hydroxylations sur les noyaux
des bases (ajout de groupes -OH).
L’alkylation peut être facilement réalisée sur les bases de l’ADN par
addition de groupes méthyles ou alkyles par de très nombreux
agents alkylants ou même par l’action de simples donneurs de
groupes méthyles présents dans la cellule (sous forme de Sadénosylméthionine, par exemple).
L’action des rayons ultra-violets.
La lumière UV est absorbée par les bases des acides nucléiques et
des modifications chimiques peuvent en découler. Les produits les
plus courants fournis par ces réactions photochimiques sont
surtout les dimères thymine-thymine (T-T), suivis des dimères
thymine-cytosine (T-C) et les dimères cytosine-cytosine. Il s’agit de
structures stables entraînant une distorsion considérable de la
structure de l’ADN.
Les erreurs de la réplication.
Nous avons vu qu’au cours de la réplication de l’ADN, les ADN
polymérases présentent une activité exonucléasique 3’ à 5’ qui leur
permet de vérifier si la dernière base introduite correspond bien aux
conditions classiques d’appariement. Cette activité d’édition diminue
considérablement les erreurs possibles. Au cours de la réplication, il a
été estimé que l’ADN polymérase III introduit un nouveau nucléotide
avec un taux d’erreur de 1/100 nucléotide incorporé, mais avec la
fonction d’édition, finalement le taux d’erreur passe à 1/1000
nucléotide incorporé. Cette différence considérable correspond à la
fidélité de la réplication.
Cependant, la probabilité de produire des mauvais appariements ou
des petites insertions ou délétions pendant la réplication est loin d’être
négligeable. Dès lors des mécanismes efficaces de réparation doivent
être mis en oeuvre.
Formation de ponts entre les brins de l’ADN ou entre
des protéines et l’ADN.
Certains agents chimiques (psoralènes par exemple) ou
physiques (UV, radiations ionisantes) peuvent conduire à des
interactions stables (« crosslinks ») entre les deux brins d’ADN.
Des interactions stables peuvent être également observées entre
des protéines et les brins d’ADN.
Les coupures des brins d’ADN.
Les radiations ionisantes peuvent conduire à des coupures d’un
brin d’ADN ou à des cassures des deux brins d’ADN.
LES MECANISMES RÉPARATEURS DE L’ADN.
La possibilité de réversibilité des dommages sur l’ADN.
C’est la possibilité de réparer l’ADN la plus simple, mais
dans bien des cas elle est impossible à réaliser pour des
raisons cinétiques et / ou thermodynamiques. Dans
certains cas, des enzymes spécifiques comme les
photolyases peuvent transformer réversiblement un ADN
lésé avec présence de dimères pyrimidiques en un ADN
normal en absorbant de la lumière. Les photolyases sont
présentes dans les bactéries, les plantes, les
champignons mais elles sont absentes chez les
mammifères.
Correction des erreurs d’appariements.
Beaucoup d’erreurs d’appariements (ou « mismatches ») sont dues à
des erreurs au cours de la réplication de l’ADN. Cependant, des
erreurs d’appariements peuvent être également produites à la suite
d’une désamination de la 5’-méthyl cytosine pour produire de la
thymine qui ne s’apparie pas correctement avec G.
Chez E. coli, la présence d’un mauvais appariement localisé est
décelée par une protéine spécifique appelée protéine MutS.
La protéine MutS reconnaît des erreurs d’appariements mais
aussi des insertions ou des délétions de quelques nucléotides.
Une protéine supplémentaire, la protéine MutL stabilise le
complexe formé entre MutS et la portion d’ADN double brin qui
présente le mauvais appariement.
Ce complexe va activer une protéine MutH qui va couper le
brin nouvellement synthétisé. Il
est remarquable que ce
système de coupure différencie le brin parental et le brin
nouvellement synthétisé par methylation
methylation..
En effet, dans l’ADN d’E. coli, les séquences GATC sont
normalement méthylées. Dans le brin nouvellement synthétisé, la
méthylation n’est pas immédiatement réalisée.
La protéine MutH va couper le brin nouvellement
synthétisé à l’opposé de la séquence GATC méthylée du brin
parental.
Une coopération avec la protéine uvrD (hélicase II) est
nécessaire.
Le brin nouvellement formé est alors partiellement dégradé
et resynthétisé correctement par l’ADN polymérase III.
La soudure finale est assurée par l’ADN ligase.
Les organismes eucaryotes possèdent de nombreux systèmes de
réparation des erreurs d’appariements.
Certains malades atteints d’une forme héréditaire de
cancer du colon (syndrome de Lynch) présentent des
mutations dans les gènes des enzymes de réparation
des erreurs d’appariements
d’appariements..
L’excision-réparation de base.
Ce type de réparation est communément utilisé pour éliminer les
bases incorrectes (comme l’uracile) ou les bases transformées par
des agents alkylants.
Il comprend trois étapes successives:
Tout d’abord, une élimination de la base incorrecte par une
ADN N-glycosylase avec apparition d’un site AP.
Puis, une coupure du brin d’ADN endommagé en 5’ du site
AP, créant ainsi un -OH (3’) adjacent au site AP.
Enfin, l’extension à partir de cet -OH (3’) par une ADN
polymérase est réalisée avec excision du site AP.
La soudure finale est assurée par une ADN
ADN--ligase
ligase..
chez les mammifères et l’Homme, les doublets
nucléotidiques CG peuvent être méthylés au niveau de
la cytosine et que cette méthylation était en relation
directe avec l’inactivation des gènes correspondants.
La désamination des cytosines
aboutit à la formation de la thymine.
méthylées
Une ADN glycosidase particulière reconnaît
spécifiquement le mésappriement TG et élimine T.
Cependant, l’efficacité de ce système est loin
d’être parfaite.
Souvent, les mutations ponctuelles de l’ADN
concernent ces cytosines méthylées, on parle de
points chauds de mutation.
L’excision--réparation de nucléotide.
L’excision
nucléotide.
Bien que l’excision-réparation de base joue un rôle très important
comme processus de réparation de l’ADN, elle ne peut pas suffire à
corriger toutes les erreurs dans l’ADN.
En particulier, la disponibilité des ADN N-glycosylases ne peut pas être
étendue à toutes les altérations possibles des bases de l’ADN.
Un autre mécanisme plus flexible de réparation est impliqué. Ce
mécanisme est appelé excision
excision--réparation de nucléotide. Il est disponible
dans tous les organismes vivants et il implique les étapes suivantes:
Tout d’abord, la reconnaissance du dommage sur l’ADN.
Puis une liaison d’un complexe multi-protéique avec le site
endommagé.
Une double excision du brin endommagé suit avec coupure
plusieurs nucléotides en 5’ et en 3’ de celui-ci.
La lacune présente est comblée par une ADN polymérase.
Une soudure finale est ensuite assurée par une ADN-ligase.
Chez E. coli,
trois protéines, les produits des gènes uvrA, uvrB et uvrC sont
responsables de la reconnaissance du dommage et de la coupure de
l’ADN
Le modèle actuel implique la formation initiale d’un complexe entre
deux protéines uvrA et uvrB et ceci avec hydrolyse d’ATP
Ce complexe se lie avec l’ADN préférentiellement au niveau de la zone
endommagée (dimères de thymine)
Une autre protéine uvrC se lie avec uvrB
ceci entraîne une coupure en 5’ (7 nucléotides avant le dommage) et en
3’ (4 nucléotides après le dommage)
Intervient, la proteine du gène uvrD, qui est une hélicase II, elle déplace
l’oligonucléotide endommagé
l’ADN polymérase I ou l’ADN polymérase II comble la lacune résultante
La soudure finale est assurée par une ADN-ligase.
Un tel système de réparation existe également chez les
cellules eucaryotes.
On connait d’ailleurs chez l’Homme,
des anomalies génétiques du système de réparation par
excision-réparation
responsables
de
maladies
génétiques graves,
la xérodermie pigmentaire (entraînant une sensibilité
accrue aux rayons solaires et une augmentation du
risque de cancers cutanés),
mais aussi le syndrome de Bloom ou la maladie de
Fanconi.
Les recherches thérapeutiques
•
Le petit nombre de malades et le faible débouché commercial qu'offrent les
maladies rares telles que le XP
• Mais depuis quelques années, les recherches se sont multipliées et elles ont
permis de mieux comprendre les mécanismes de la maladie. Evolution des
recherches:
• En 1988: Caractéristiques cliniques génétiques et cellulaires. Développement
d'un test anténatal. Activation des oncogènes dans les tumeurs épithéliales
isolées de malades atteints du XP
• En 1990: Une carence en ADN hélicase serait responsable de certaines formes
de XP et du syndrome de Cockayne. Clonage du gène et de l'ADNc de groupe A
du XP
• En 1996: La thérapie génique envisageable. Une nouvelle technique de
correction génétique des cellules a été mise au point.
• Elle permet, grâce à une construction rétrovirale, de produire des lignées de
fibroblastes de peau de malades au phénotype guéri.
• Cela constitue donc une première étape vers la correction des kératinocytes de
malades et peut-être un jour la production in vitro d'un épithélium
génétiquement corrigé pouvant servir de greffon.
• En 1998: Comment l'absence d'interaction entre une hélicase et son régulateur
est à l'origine d'une maladie génétique.
• En 2001: Reconstruction in vitro de peau de patients atteints de XP
Les réparations post
post--réplicatives.
réplicatives.
Si le système de réparation par excision-resynthèse de l’ADN est
débordé, et surtout si les zones d’ADN à réparer coïncident avec la
présence de fourches de réplication, il est évident que le brin
porteur de la lésion devient impropre à servir de matrice.
Dans de telles conditions, le brin parental contiendra un dimère de
thymine et l’autre brin fils contiendra une lacune, on parle de
lacune post-réplicative. C’est une lésion grave de l’ADN.
Pour traiter de telles lésions, un système de réparation approprié va
être mis en oeuvre. Il s’agit du système des protéines Rec (pour
Recombinaison). Ce système de réparation fait donc intervenir une
recombinaison.
La recombinaison correspond à un échange d’ADN ente deux
segments homologues. Cette correction fera également intervenir
le système de réparation par excision-resynthèse de l’ADN.
Chez E. coli, la production de la protéine de recombinaison appelée
RecA est réduite dans les conditions normales. Ceci est lié à une
répression de la synthèse par un répresseur protéique appelé LexA
(voir contrôle de la transcription).
Le système S.O.S.
Le système S.O.S. a été décrit initialement chez les
bactéries. Il concerne au moins une vingtaine de gènes
dont les produits protéiques sont impliqués dans les
mécanismes de réparation et de recombinaison. Ce
système est remarquable parce qu’il est inductible, c’està-dire mis en oeuvre par l’agression physique ou
chimique.
La protéine de recombinaison RecA joue un rôle central
dans un tel mécanisme de sauvegarde.
La synthèse de cette protéine est normalement réprimée
par une protéine appelée LexA ou répresseur.
Si un besoin important de protéine RecA apparaît, la
répression est levée grâce à une propriété particulière de
la protéine RecA qui est capable de cliver son
répresseur..
répresseur
Biologie moléculaire du cancer
Mécanisme de l’oncogénèse
INTRODUCTION
La survenue dans un organisme d'une tumeur cancéreuse est
liée à l'émergence d'un clone cellulaire échappant aux lois qui
régissent la prolifération et la cohabitation cellulaire normales.
La cellule cancéreuse se caractérise par 2 propriétés
fondamentales :
1/ la capacité de se reproduire au delà des limites fixées par le
renouvellement naturel du tissu auquel elle appartient et
2/ le pouvoir de coloniser des territoires tissulaires
normalement réservés à d'autres catégories cellulaires.
Ces 2 propriétés sont communes à l'ensemble des cellules
d'une même tumeur ce qui suggère que toute la population est
issue d'une seule cellule devenue anormale.
MECANISME DE L'ONCOGENESE
L'ADN = siège des altérations successives
L’origine monoclonale de la population de cellules formant
une tumeur a pu être vérifiée dans de nombreux cas à l'aide
de marqueurs génétiques
L'analyse d'une tumeur maligne indique que toutes les
cellules expriment la même forme et donc que la masse
tumorale correspond à l'expansion d'un clone cellulaire.
L'anomalie responsable de la transformation cancéreuse,
virale ou non, est transmissible par division cellulaire et
consiste en une altération majeure de l'information
génétique, c'est à dire une mutation de l'ADN. Du reste, la
majorité des agents carcinogènes s'avèrent être
également des agents mutagènes.
Mise en évidence des oncogènes
Les "oncogènes" apparaissent comme des homologues de gènes
cellulaires physiologiquement impliqués dans le contrôle des
processus de maturation, de division et de différenciation cellulaire
et dont l'altération ("activation") peut entrainer la transformation
d'une cellule normale en cellule maligne.
La compréhension des mécanismes d'activation des oncogènes
passe par la description des modèles expérimentaux qui ont
permis de les étudier:
•L'intégration virale dans le génome,
•La transfection d'ADN tumoral,
•Anomalies cytogénétiques caractéristiques de certaines tumeurs,
•ADN tumoral muté dans les cas de cancers héréditaires,
•ADN constitutionnel dans des formes familiales de cancers.
Filière virale
Le chef de file des retrovirus tumorigènes est le Virus du
Sarcome de Rous (RSV), virus à ARN, dont l'intégration dans
le génome d' une cellule est possible grâce à la retrotranscriptase, (une enzyme qui permet la transcription de
l'ARN en ADN).
Son pouvoir transformant est entièrement contenu dans le
gène src, dont l'insertion dans le génome de la cellule hôte
peut provoquer la transformation cancéreuse. On en retrouve
un équivalent dans le génome de toutes les cellules normales
de l'hôte et de nombreuses autres espèces.
Cet homologue cellulaire d'un oncogène viral est un gène
cellulaire non transformant ou protooncogéne.
De nombreux retrovirus tumorigènes possèdant des gènes
transformants v-onc homologues de gènes cellulaires
normaux c-onc ont été identifiés.
L'étude systématique des retrovirus capables de transformer
les cellules in vitro a permis d'identifier de nombreux autres
oncogènes viraux correspondant chacun à la version un peu
modifiée d'un ou plusieurs oncogène(s) cellulaire(s).
Leur origine animale ainsi que l'emplacement chromosomique
de leur homologue humain sont connus.
Oncogenes Retroviraux
Les proto oncogènes codent pour des protéines qui jouent un rôle
central dans la stimulation de la division cellulaire. Les oncogènes
d’origine retro virale sont classés en 4 groupes:
1. Facteurs de croissance, (C-sis) & récepteurs de facteurs de
croissance (C fms & CerbB);
2. “GTP-binding proteins”, (C h-ras, C k-ras, C n-ras);
3. “Tyrosine specific protein kinases” (C abl, C fes, C fgr, C fps,
Cros, C src, and C yes);
“ serine/threonine specific protein kinases” (C mil, C mos, C
raf).
4. “ Transcription regulators”(C fos, C jun, C erb A, C myc, C myb,
&Cets).
Les protéines produites par les Proto oncogènes, sont alterées
par des mutations, infections viral, ou agents carcinogénique. Ces
protéines oncogéniques codent pour des protéines modifiées et
sur exprimées qui stimulent une division cellulaire anormale.
La haute conservation de ces protooncogènes dans
toutes les espèces animales étudiées, y compris
l'homme, suggère leur intervention dans des fonctions
primordiales communes à tous les eucaryotes.
lls diffèrent le plus souvent de leur homologue cellulaire
par
des
altérations
minimes
entraînent
des
modifications de leur structure ou de leur fonction qui
semblent suffisants à leur conférer le pouvoir
transformant.
L'activation peut être de type qualitatif Ou de type
quantitatif.
Pouvoir transformant
La technique de transfection de fragments d'ADN extraits de
lignées cellulaires malignes ou de cellules tumorales fraiches à
des cellules fibroblastiques en culture (cellules NIH 3T3)
permet d'identifier des gènes porteurs d'un pouvoir transformant
puisque capables de conférer à ces cellules un phénotype malin.
La première mise en évidence de gènes transformants non viraux
a été réalisée par transfection de petits fragments d'ADN
permettant la transformation maligne.
Les oncogènes ainsi isolés sont nombreux. Le chef de file en est
la famille des gène ras, isolés à partir d'une tumeur spontanée de
la vessie chez l'homme et dont l'activation se fait toujours par une
mutation ponctuelle sur un seul codon. Cette altération conduit à
la production d'une protéine mutée, ne différant de la protéine
native que par un acide aminé, modèle de mutation purement
qualitative.
Filiére cytogénétique
L'amélioration des techniques de cytogénétique a permis de
reconnaître, parmi les très nombreuses anomalies chromosomiques
retrouvées dans différents types de cancers, la spécificité de
certains remaniements non aléatoires.
Les trois types de lésions morphologiques connues sont:
les amplifications géniques, les translocations chromosomiques et
les délétions.
Amplifications de proto-oncogènes
L'amplification correspond à l'accumulation d'un grand nombre de
copies d'un même gène. Son existence est soupçonnée en analyse
cytogénétique sur la présence de régions chromosomiques se
colorant de manière uniforme appelées Homogeneous Staining
Régions (HSR) ou se présentant comme des mini chromosomes
surnuméraires (chromosomes "double minute").
Les techniques de biologie moléculaire ont permis de montrer que
ces anomalies correspondent à une amplification génique, portant
sur certains proto-oncogènes.
Translocations chromosomiques Certaines translocations
provoquent des juxtapositions aberrantes de gènes ou des
fusions de 2 gènes.
juxtapositions aberrantes
une
translocation
chromosomique
interessant
le
chromosome 8 et le chromosome 14.
Il a été démontré que la translocation entraine un échange
de matériel entre la région du proto-oncogène c- myc située
sur le chromosome 8 et une région codant pour des gènes
d'immunoglobulines (Ig). L'activation de c-myc se traduit par
son expression anormale en quantité ou en durée dans le
cycle cellulaire. La translocation survient à l'occasion d'une
erreur de recombinaison génétique au cours des
réarrangements des gènes des Ig.
fusions de 2 gènes
Elle se caractérise par la présence dans 90 % des
cellules tumorales d'une translocation entre les
chromosomes 9 et 22 au cours de laquelle le protooncogène c-abl du chromosome 9 est fusionné avec une
séquence du chromosome 22 toujours retrouvée au
niveau du point de cassure et appelée pour cette raison
"breakpoint cluster region" (bcr); le produit qui résulte de
cette fusion est une protéine anormale qui présente
l'intérêt diagnostique de pouvoir être détectée en
l'absence d'anomalie.
Délétions chromosomiques
Elles ont été mises en évidence dans le cadre de l'étude des cancers
héréditaires où elles ont conduit à la notion d’anti-oncogènes".
La constatation de la perte de la tumorigénicité d'une cellule hybride
obtenue par fusion entre une cellule maligne et une cellule normale,
a conduit à la notion de "gènes suppresseurs" dont l'inactivation
pourrait tout aussi bien être responsable de la croissance tumorale
que l'activation des oncogènes.
Le modèle tumoral choisi pour vérifier leur existence a été le
rétinoblastome, une tumeur maligne dans laquelle on distingue 2
formes cliniquement bien distinctes :
la forme familiale, héréditaire, où s'observent fréquemment des
atteintes occulaires bilatérales et où les cellules tumorales
présentent souvent une délétion sur le bras long du chromosome 13,
et la forme sporadique, plus fréquente, où les atteintes sont le
plus souvent unilatérales.
L'hypothèse émise reposait sur les données cliniques et était basée
sur la nécessité d'une double mutation sur le même chromosome
pour que la prolifération tumorale soit possible.
La première mutation sur le gène en cause, constitutionnelle et
transmissible dans la forme familiale, est acquise dans la forme
sporadique.
Le second évènement mutationnel, acquis dans tous les cas au
niveau de la cellule somatique, entraine l'homozygotie pour le
"gène du rétinoblastome".
Plus récemment, cette hypothèse a été confirmée au niveau
moléculaire et l'apparition d'un rétinoblastome s'avère liée à
l'inactivation des 2 allèles d'un gène récessif normal responsable
du contrôle de la croissance normale des cellules rétiniennes.
Ce gène, dit Rb, localisé sur le chromosome 13 a été identifié et
cloné.
Dans les formes héréditaires de la maladie, la perte
constitutionnelle du premier allèle est due à une mutation ou à une
délétion chromosomique et dans tous les cas la deuxième
mutation est représentée par la perte de l'allèle normal restant.
•Le gène Rb est le chef de file de nombreux autres "anti-oncogènes"
ou "gènes suppresseurs", identifiés dans d'autres tumeurs malignes
et codant pour des protéines qui sont des éléments clés du
"freinage" exercé en permanence par la cellule pour contrôler sa
division, sa maturation et sa différenciation normales.
•Conséquences de l'activation des oncogènes : les protéines
oncogéniques
•Le résultat de l'activation d'un oncogène est la production d'une
protéine dite "oncogénique" qui ressemble à la protéine
normalement codée par le gène cellulaire correspondant mais qui est
anormale. Il peut s'agir d'une altération :
- soit qualitative, liée à une mutation portant sur les séquences
codantes du gène et entraînant l'apparition d'une protéine mutée,
- soit quantitative, liée à une mutation portant sur les séquences
régulatrices non codantes du gène et entraînant la production de
quantités anormales d'une protéine.
•Le résultat de l‘inactivation (délétion) d'un anti-oncogène gène su
presseur de tumeur est la perte d’une protéine qui déclenche
l’apoptose des cellules mutantes qui peuvent donc échapper aux
systèmes de réparation et de control de la division cellulaire.
Les protéines codées par les oncogènes peuvent ainsi être
regroupées en quatre grandes catégories fonctionnelles :
•Les protéines analogues de facteurs de croissance cellulaires.
La protéine codée par l'oncogène sis par exemple, représente un
analogue muté du PDGF (Platelet Derived Growth Factor) et son
pouvoir transformant dépend de la présence du récepteur
correspondant à la surface des cellules.
•Les protéines analogues de récepteurs de facteurs de croissance.
La protéine codée par l'oncogène erb B par exemple, représente un
analogue muté du récepteur cellulaire pour l' EGF (Epidermal
Growth Factor).
La fixation du facteur de croissance correspondant au récepteur
entraîne la transmission d'un signal de division cellulaire par
l'intermédiaire d'une activité protéine kinase.
La protéine oncogénique pourrait possèder la même capacité
fonctionnelle mais répondre différemment aux systèmes de
régulation, ce qui aurait pour effet le détournement des processus
de division cellulaire au profit de la prolifération tumorale.
•Les protéines impliquées dans une activité enzymatique.
Les mieux connues dans cette catégorie sont les protéines
kinases membranaires dont le chef de file est la protéine
oncogénique pp60 src, codée par le gène src du RSV. Elles
exercent un rôle régulateur important dans le fonctionnement
de nombreuses protéines cellulaires, comme les protéines du
cytosquelette ou les protéines impliquées dans le métabolisme
des prostaglandines.
•Les protéines à activité nucléaire.
Les protéines transformantes codées par les gènes c-myc sont
présentes dans le noyau. Elles agissent vraisemblablement au
début du cycle cellulaire, peu avant la duplication, par liaison
directe à l'ADN à un stade très terminal de la cascade.
Les protéines des antioncogènes
•La protéine oncogénique p 105-Rb, codée par le gène
"suppresseur" Rb appartient au système de contrôle de la
prolifération cellulaire. Elle représente par exemple le point
d'impact de l'activité de certains oncogènes comme le E1A,
provenant des adenovirus. La protéine codée par cet oncogène
d'origine virale (adénovirus) agit par formation d'un complexe avec
p 105-Rb qui entraine l'inactivation de celle-ci.
•La protéine p53 a été identifiée comme la protéine cellulaire qui se
couple à l'antigène T, produit transformant du virus simien SV 40.
La protéine p53 peut être considérée comme la « gardienne du
génôme ".
A la suite d'une lésion affectant l'ADN (rayonnement UV, exposition
à un mutagène), elle agit comme un agent décisionnel qui
provoquerait soit l'arrêt de la division cellulaire soit l'apoptose.
L'ensemble de ces phénomènes contribue à la stabilité de
l'intégrité génétique.
Par contre, les cellules tumorales présentant une
mutation de p53 ne sont plus capables d'assurer ce
maintien, la cellule ne recevant plus de signal d'arrêt de
division. Son génome devient moins stable et
susceptible d'accumuler des mutations diverses
permettant l'émergence de clones cellulaires de
malignité accrue.
La p53 normale agit comme le produit d'un gène
suppresseur récessif dans les modèles animaux. Du
reste, le gène en cause est situé sur le chromosome 17,
qui est le siège fréquent de délétions chromosomiques
au cours de pathologies néoplasiques diverses.
Les connaissances actuelles sur la biologie du cancer conduisent
donc à considérer la prolifération maligne comme résultant d'une
succession d'évènements le plus souvent rares et aléatoires dont
l'accumulation permet à une cellule d'échapper au contrôle
génétique, humoral et immunologique exercé en permanence par
l'organisme, et de se diviser de façon autonome, clonale et
anarchique, acquérant au fur et à mesure de sa progression de
nouvelles capacités de prolifération, d'extension, et de résistance
aux tentatives de régulation endogènes et thérapeutiques.
La multiplicité et l'intrication de ces mécanismes constitue la
principale cause d'échec des traitements, qu'ils soient non
spécifiques (cytotoxicité directe) ou plus spécifiques (stimulation
des mécanismes de défense naturels de l'organisme).
le cancer est une maladie de l'ADN et plusieurs mutations sont
nécessaires au niveau du génome d'une cellule normale pour
entraîner sa transformation en cellule maligne.
Le cancer peut donc être considéré comme une maladie génétique à
l'échelon de la cellule somatique.
A l'échelon de la cellule germinale, La prédisposition génétique au
cancer, dépend à la fois de facteurs liés à l'environnement, de
facteurs génétique et des facteurs liés au simple hasard.
La mise en évidence d'une prédisposition génétique au cancer a des
applications pratiques qui peuvent en découler, en matière de
prévention et de dépistage.
Retinoblastome
Origine Moléculaire & Genetique
Perte de fonction du gène “RB”
gène suppresseur de tumeurs
mutation Germinale du gène suppresseur de
tumeurs « RB »
Substitution: C T
chromosome 13
inactivation de son expression
Retinoblastome héréditaire ou sporadique,
Cancer infantile
cause des tumeurs multiples impliquant les
deux yeux,
Ou une tumeur isolé au niveau d’un oeil
Neurofibromatoses
Origine Moléculaire & Genetique
Perte de fonction du gène “NF1”
gène suppresseur de tumeurs
locus du gène: sur le chromosome 17
Le gène NF1 produit:
la Neurofibromine
(une protéine activatrice de la GTPase)
Maladie génétique autosomique & dominante
Cause des neurofibromes multiples
& une prédisposition au tumeurs du système
nerveux
Interaction de la protéine P53 avec la double
hélice d’ADN
gène P53:
localisé sur chromosome 17
Code pour une protéine de 53 kD
« DNA-binding nuclear protein »
« Transcription factor »
Facteur clef de la régulation du cycle
cellulaire
Perte de fonction de P53
Cause des types multiples de cancer
Thérapie Conventionnel du Cancer
Traitements disponibles du cancer :
Radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie & Chirurgie,
Traitements disponibles sont non spécifique aux cellules
cancéreuses & causent donc des effets secondaires importants;
La thérapie conventionnel du cancer fait face à ces limites dans
les cas de progressions incurable des tumeurs & le cancer
généralisé.
Médicaments anticancers
•Médicaments alkylants (Endoxan): perturbent la réplication
& empechent les deux brins d’ADN de s’écarter.
Thérapie Génique du Cancer .
Utilisation des gènes suppresseurs des tumeurs qui
existent Naturellement dans la cellule ou des gènes
d’antitopoisomerases,
Insertion de ces gènes dans des vecteurs de DNA, portant
des promoteurs tissus – spécifique,
La construction génétique recombinante est introduite
dans des cellules cancéreuses,
Permet une expression spécifique de protéines anti
cancéreuses dans des cellules cibles,
Sans effets sur les cellules non carcino génique.
“Gene delivery systems”
“Retroviral vectors delivery”: stratégie de choix pour les essaies
cliniques de thérapie génique:
•Vecteurs retro viraux recombinants & non virulent
•Ces vecteurs portent des gènes anti tumoraux
• Produisent un ARN génomique viral & recombinant
•« Packaging » en virions
• Utilisation de la Reverse transcriptase virale afin de produire de
l’ADN double brin « ds DNA » dans les cellules cibles
• La dsDNA recombinante intègre la chromatine des cellules cibles
• Les cellules cancéreuses transfectés ou transduites expriment le
produit du gène anti tumoral délivré par le vecteur viral recombinant
Moyen efficace de transfert de gènes
Les systèmes Adenoviraux, sont les virus recombinants de transfert
les plus utilisés lors des essais cliniques
“Gene delivery systems”
Il existe des méthodes physique pour transférer un DNA dans
les cellules :
Lipofection
« Ligand DNA conjugates »
« Adenovirus-ligand DNA conjugates »
injection directe de l’ADN
Complexes Liposome-DNA.
Essays de Thérapie géniques du cancer
& des maladies génétiques, infectieuses et métaboliques
Premier transferts de gènes ont été approuvés en 1989 « marker
gene »,
Premier protocole fédéral de thérapie génique a été approuvé en 1990
pour le traitement de l’ (ADA ): Adenosine DeAminase deficiency
(Une déficience héréditaire, recessive qui cause la « Severe Combined
Immunodeficiency Syndrome SCID ».
Actuellement, plusieurs protocoles actifs sont en cours concernant la
thérapie génique des tumeurs et du cancer ainsi que la thérapie
génique de maladies génétiques, métaboliques & infectieuse.
Exemples de protocoles actifs de thérapie génique:
Mélanomes, Neuroblastomes, tumeurs du cerveau, du sein, Colorectal, Ovarien & Renale.
SCID, Gaucher’s disease, Cystic fibrosis, Hypercholesterolemia
AIDS vaccines
“NeoR/Til gene marking”des cellules thérapeutiques
•Nouvelle approche, pour le traitement du cancer lors des essais
cliniques implique: Tumor Infiltrating Lymphocytes TILs.
•Des lymphocytes modifiées génétiquement afin de produire une
protéine anti tumorale « TNF » (Tumor Necrosis Factor).
•Ces lymphocytes modifiées sont re introduites dans l’organisme
du patient cancéreux, elles migrent vers la tumeur, infiltrent les
cellules cancéreuses, produisent le « TNF » & facilitent le
rétrécissement de la tumeur.
•TILs peuvent produire et transférer des cytokines (interleukin
2), qui stimulent le système immunitaire pour attaquer les
cellules cancéreuses.
•Le transfert des TILs, dans les patients soufrant d’un cancer
avancé est actuellement approuvé en tant que protocole de
traitement par génie génétique.
Catégories de thérapies géniques utilisées pour lutter
contre le cancer.
Introduction de gènes suppresseurs de tumeurs dans les cellules
tumorales
Déclencher ou augmenter la réaction immunitaire dans les cellules
cancéreuses:
• Introduction de gènes de cytrokines dans les cellules tumorales
• Réintroduction des cellules génétiquement modifiée chez le patient
Ainsi la production de Cytokine dans les cellules cancéreuses active leur
immunité
Augmenter l’antigenecité des cellules tumorales:
• Introduire le gène de HLA-B7 dans les mélanomes malignes
(via les vecteurs retroviraux , ou via le complexe DNA/Liposome)
• déclencher une forte réponse immunitaire allogénique au site tumoral.
Introduction of “gènes suicide” directement dans les tumeurs:
• Le gène de la thymidine kinase du virus herpes simplex
« HSV-TK gene ».
• Cette kinase virale rend les cellules susceptible à être tuées par
« Ganciclovir ».
•Transfert Préférentiel du gène HSV-TK à la masse tumorale
•éradication Complète de la masse tumorale par l’effet “bystander”
Protéger le système hematopoietique du patient des effets toxique
de la chimiothérapie à haute dose:
• Introduction de gènes de résistance à la chimiothérapie :
Le gène « MDR-1 » code pour une protéine (P glycoprotéine), utilisé
une pompe (a multi drug efflux pump) qui enlève les agents chimiothérapeutique des cellules.
La recherche continue afin de découvrire de nouveaux
gènes & protéines naturels anticancer dans la cellule
Gènes Anti topoisomerases :
• Bloque le déroulement de l’ADN chromosomale
•Inhibition de la transcription & de l’expression génétique
• Mort des cellules cancéreuses.
Naïma Alami-Ouahabi and al:
•Clonage du gène de tsHMG
• Expression de la protéine Recombinante & sa caractérisation
• Facteur nucléaire à activité Anti topoisomerase I : tsHMG.
Biologie moléculaire des Virus, Viroïdes & Prions
Biologie moléculaire des Virus
Agent infectieux à Structure simple; Une particule = Virion
Virion:
•Acide. Nucléique ADN ou ARN (retrovirus)
•Une capside externe, protéique &protectrice
(Ou juste une nucléocapside ou nucléoïde ou core)
•Une enveloppe: protège dans certains cas la nucleocapside
Pouvoir pathogène vira, Nécessitée cellule hôte, Lutte antiviral
•Antiviraux:
-Aciclovir (Zovirax) inhibe la DNA polymerase du virus Herpex
(analogue structural de deoxyguanosine = pseudonucléoside de
synthèse)
-AZT: Azidothymidine inhibe la reverse transcriptase du HIV
(analogue structural de la thymine).
-Interférons: protéines de 17 à 25 kdaltons, synthétisés par les
leukocytes
Lymphocytes T & fibroblastes en réponse aux infections virales.
(Interféron empêche la réplication virale & hydrolyse l’ARNm virale.
Virus de l’hépatite
Types: A, B, C, D, E;
différents structures, modes de contamination & pouvoir pathogène
HBV
•Virus à ADN, génome < 5 kb,
•Génome double brin partiel:
•Brin long (-) antisens = 3,2 kb
•Brin court (+) sens =longeur variable
•Génome circulaire, complémentarité partielle (200nt) à l’extrémité 5’des
deux brins.
•Génome particulier: Gènes chevauchants permettent à un petit génome
3,2 kb de coder pour plusieurs protéines
•Une sequence à 3 cadres ouvert de lecture (ORF): transcrit 3 RNA &
traduit 3 protéines
Gènes codant & protéines de HBV
Gènes codant
P
C (core)
Pré C
Pré S1
Pré S2
S
protéines codée
DNA polymerase
HBc prot de nucléocapside
Hbe derive de HBc
grande prot de l’enveloppe
moyenne prot de l’envelop
courte prot de l’enveloppe
prot Majeur
prots: S1, S2 & S ont activité antigénique de surface HBS (test ELISA)
Région C & S = 1er cadre de leture
Région X = 2ème cadre de lecture
Région P = 3ème cadre de lecture
Réplication de HBV
Réplication sans intégration dans le DNA de la cellule
hôte.
Virus à ADN
Le transcrit RNA 3,5 kb traduit protéines:
polymerase, HBc &Hbe
Le même RNA 3,5 kb donne :
RNA pregénomique qui donne DNA genomique
Par reverse transcriptase.
Détection de HBV:
•Analyse du sang et détection de l’Ag HBs avec l’Ac anti HBs
•Détection de l’ADN virale par PCR « Polymerase Chain Reaction »
Prevention de HBV:
Vaccins:
Protéine Ag = HBs
Péptide synthétique = oligopeptide antigénique de HBs
Vaccins recombinant séparés par Génie génétique:
•Construction génétique: Vecteur, promoteur& gène S
Introduction dans les levures, production de HBs non glycosylée
Vaccin recombinant + immunogénique
•Construction génétique: Vecteur, promoteur sequences pré S2 & S
•Cellules dérivées d’ovaires de hamster chinois (CHO)
•Produit HBs courte & moyenne glycosylé = augmente immunogénécité
Essais de vaccins recombinant vivant = modifier génétiquement
(non virulent).
Virus HCV
Variante détectée grâce à la biologie moléculaire par
séquençage
Virus à ARN monobrin = 10 kb
RNA génomique brin codant (+)
Gènes codent pour protéines structurales
nucléocapside, l’enveloppe & les prots trans membranaires
les gènes qui codent pour la réplicase
Patient présence Ac Anti HCV = détéction tardive
Détection précoce de l’ARN virale Rt PCR
Virus HIV 1
Virus à RNA = Rétrovirus,
RNA donne DNA par la Reverse transcriptase
DNA viral intègre DNA de la cellule hôte C T4 = T CD4+
Gènes codant du HIV 1
3 gènes de structure:
•Gag (prot: interieur de env, majeur de capside & nucléocapside)
•pol (région code pour retrotranscriptase, integrase & protéase)
•Env (Glycoprotéine de l’enveloppe)
6 gènes régulateurs:
•nef ( Negative regulatory factor = latence)
•Tat (Transcription trans activator)
•Rev (Regulatior of expression of virion protéines)
•Vif ( virion infectivity factor = augmente pouvoir infectieux)
•Vpr
•& Vpu ou Vpx
•Reconnaissance & affinité pour les protéines de surface la c hôte
•Injection du RNA viral dans c hôte
•RNA viral donne DNA viral par reverse transcriptase
•Intégration de HIV dans DNA de C Hôte par les bouts LTR
•Latence virale séronégatif
Expression DNA virale
•Dimérisation du RNA viral
•Sortie des particules virales par bourgeonnement
•Poursuite de la maturation des particules virales
•Période de Primoinvasion sujet séropositif
•HIV augmente apoptose T4, augmentation de DNAase
donc de fragmentation de l’ADN
•HIV diminue l’immunité de l’organisme
AIDS = SIDA
•Test ELISA (Enzyme Linked Immuno essay) detecte présence d’Ac anti HIV
•Test de confirmation: Western blot
•Tests tardifs
•Tests precoces : Rt PCR détection RNA viral,
PCR détection DNA viral
Ciblage Moléculaire HIV
Contrer la reconnaissance gp 120 / CD4+
(Analogues moléculaires structuraux de CD4+)
Contrer l’action de la reverse transcriptase
(Analogues structuraux de nucléotides avec perte du 3’ OH
Donc blocage de polymérisation donc de transformation de
RNA viral en DNA viral)
AZT = Azidothymine
DDC = Dideoxycytidine
DDI = Dideoxyinosine
Inhiber l’action des Protéases (maturation des particules
virales) par des inhibiteur: sequinavir, Ritonavir
Bithérapie ( AZT + anti protéases) ou Trithérapie
Viroïdes
•Structure + Simple que le virus
•Une molécule de RNA non protégée par protéines
•Structure en bâtonnet permet de résister aux attaques par nucléases
•2/3 de complémentarité de séquence de l’ARN
•Résponsable de maladie chez les plantes
•Homme??
BIOLOGIE MOLECULAIRE DES PRIONS
PRIONS: agents infectieux « Small proteinaceous infectious particles »
Absence d’acides nucléiques,
Petite protéine,
Atteinte du système nerveux,
Encéphalopathie spongiforme,
Cerveau à aspect spongieux.
Chez animal: Scarpie = tremblante de mouton &
encéphalopathie bovine
Chez l’homme: Kuru (cannibalisme)
Creutzfeld-Jacob (syndrome, 1/ 100 000/an), mutations
200 « Glu-----Lys », 178 « Asp----Asn », répétition d’1 octapeptide.
Gerstmann-straüssler-sheinker, mutations:
102 « Pro----Leu » & 117 «Ala----Val »
Mise en évidence dans le génome mammifère d’ un gène qui code pour
une protéine:
Pr P c = Prion endogène exprimée normalement dans le cerveau,
Gène sur Chromosome 20, avec 2 exons dont un seul (ex: 2) est codant,
Élimination à l’extrémité N-terminale de la protéine d’1 seq signal
(22aa),
Protéine glycosylée PrPc 33-35 cellulaire
Liée à la surface externe des cellules (neurones) par un ancrage GPI =
Glycosyl-phophatdyl-inositol
Entierement dégradable par protéinase K
Protéine Prion infectieux: PrPsc 33-35 qui dérive de PrPc,
PrPsc 33-35: ancrage GPI mais localisation intracellulaire,
Très résistantes aux attaques protéolytiques.
Protéolyse partielle coupe 67 aa & laisse une protéine glycosylée
infcectieuse de 141 aa : PrP27-30.
Transmission de maladie:
10% à 15% hérédité
Contamination: Hormones de croissance (cadavres)
Greffes de cornée
Instruments neurochirurgicaux
Consommation d’abats ou de viandes contaminéés
Hypothèse Prusiner:
Conversion de PrPc ( structure en hélice α )en PrPsc (structure en
Feuillet β) provoquée par: PrPsc.
Formation d’ un hétéro dimère entre PrPc & PrPsc.
Transformation de PrPc en PrPsc.
Accumulation de PrPsc dans les lysosymes qui éclatent & les enzymes
Lysosomales endommagent les cellules nerveuses.
Les prions libérés attaquent d’autres cellules.
OUTILS & TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
OUTILS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
ENZYMES:
VECTEURS:
MATRICE:
SONDES:
Enzymes de restriction
Ligases
Nucléases
polymerases/ Taq polymerase
Séquanases
Phosphatases/kinases
Plasmidiques
Viraux
hybrides
ADN, ARN, Protéines
ADN, ARN, Oligonucléotides, Biopuces
Enzymes de restriction:
Endonucléases d’origine bactérienne, coupent l’ADN à des séquences
de reconnaissance,
Nomenclature:
Exemples:
Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB site reconnu: G / AATTC
Sma I Extraite de Serratia marcescens site reconnu: CCC / GGG
Pst I Extraite de Providencia stuartii site reconnu: CTGCA / G
Type de coupure:
« Cohesive ends » = cos ends
Blunt ends = coupure droite
TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
•CLONAGE
•EXTRACTION ADN, ARN
•DIGESTION DE L’ADN PAR LES ENZYMES DE RESRTICTION
•SEPARATION DE L’ADN & L’ARN SUR GEL D’AGAROSE
•SEPARATION DES PROTEINES SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE
•VISUALISATION DE L’ADN: COLORATION AU BROMURE
D’ETHIDIUM
•TRANSFERT DE L’ADN, L’ARN & LES PROTEINES SUR
MEMBRANES DE NITROCELLULOSE « SOUTHERN, NORTHERN &
WESTERN BLOTS »
•MARQUAGE DES SONDES, HYBRIDATION & AUTORADIOGRAPHIE
•SEQUENÇAGE D’ADN.
•PCR
•ORGANISMES TRANSGENIQUES
•EMPREINTES D’ADN
•RFLPS
•HYBRIDATION IN SITU.
LA PCR EN TEMPS RÉEL
techniques moléculaires de génotypage en temps
réel
La ‘Polymerase Chain Reaction’ PCR :
– un outil crucial en diagnostic moléculaire
– permet une détection sensible et spécifique des
d’acides nucléiques.
cibles
Le suivie en temps réel de la PCR:
– accélération et une simplification considérable
des procédures de laboratoire
– quantification, l’amplification et la détection de
mutations au niveau des séquences cibles.
Le système Light Cycler
 RD
Le système Light Cycler

Le LC* est un appareil fondé sur
le principe de PCR quantitative
en temps réel.
Il permet donc la détection et la
quantification de marqueurs
fluorescents dont l’émission est
directement proportionnelle à la
quantité d’amplicons générés
pendant la réaction de PCR.
Les mesures sont effectuées en
phase exponentielle , plutôt qu’en
point final
Les systèmes de détection :
-les agents se liant à l’ADN
double brin
( exp : SYBR Green I qui est un
fluorophore capable de se lier au
sillon mineur de l’ADN double
brin )et ,
-les sondes fluorescentes
Au début de l’amplification,le mélange réactionnel
contient de l’ADN dénaturé,les amorces et le
fluorophore non lié.
Après
le
couplage
des
amorces,le
fluorophore se lie au double brin,ce qui se
traduit par une augmentation de la
fluorescence.
Pendant l’étape d’élongation, le nombre de
molécules de fluorophores lié à l’ADN
synthétisé augmente , se traduisant par une
augmentation de la fluorescence.
Les sondes fluorescentes :
deux sondes ( Hybridization probes ) :
Méthode de détection est basée sur le principe FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer):
deux sondes oligonucléotidiques linéaires complémentaires à une
séquence cible
•
1ère sonde , dite sonde d’ancrage , bloquée à son extrémité 3’
afin de prévenir son extension durant l’étape d’élongation et
transporte en 3’ un fluorochrome donneur ( fluorescéine )
qui émet une lumière verte à 530 nm lorsque excité par une
source de lumière
•
une deuxième sonde d’hybridation marquée en 5’ avec le LC
Red 640 (fluorochrome accepteur ).
En solution, les deux sondes sont libres et
séparées .
Lorsque,lors de l’étape d’hybridation ,les
deux sondes se fixent à leur séquences
respectives ,…
elles se trouvent très proches l’une de
l’autre , cette proximité permet le transfert
énergétique de la Fluorescéine verte par le
FRET au
fluorochrome accepteur rouge ...
Et provoque son émission rouge détectée
par le spectrofluorimètre .
Pendant l’étape d’élongation, les sondes
retournent de façon indépendante en
solution ce qui supprime la fluorescence
rouge .
Les courbes de fusion :
Chaque produit d’ADN double brin synthétisé à une température de fusion Tm
spécifique définie comme étant la température à laquelle 50 % de l’ADN est
sous forme double brin et 50% sous forme simple brin .
Tm dépend essentiellement de la longueur du fragment d’ADN double brin et de
la teneur en GC de ce fragment (et aussi du degré d’homologie entre les deux
brins d’ADN
Analyse des courbes de fusion utilisant le SYBR Green I :
1/ le SYBR Green I est fluorescent tant qu’il est lié à l’ADN double brin ,
2/ quand la température augmente l’ADN double brin se dissocie , ce qui
entraîne la libération du SYBR Green dans le milieu et une diminution
progressive de la fluorescence ,
3/ lorsque 50% de l’ADN double brin sont dissociés , la fluorescence chute
brutalement , c’est cette température qui correspond à la température de fusion
du produit synthétisé.
La température de fusion est obtenue , en traçant la dérivée première négative
de la fluorescence en fonction de la température : elle correspond au maximum
de la courbe
Analyse des mutations par le LightCycler™ :
• Par analyse des courbes de fusion en utilisant les sondes
d’hybridation(oligonucléotides):
• Les deux sondes sont normalement complémentaires à une
région spécifique au niveau de la séquence amplifiée.
• Si le gène amplifié présente une mutation ponctuelle au
niveau de cette région , on peut avoir un ou plusieurs
mésappariements (mismatches).
• En effet la Tm ne dépend pas uniquement de la longueur et du
contenu en GC, mais aussi du degré d’homologie entre les deux
brins d’ADN.
• Les sondes d’hybridation liés à l’ADN dans un appariement
parfait nécessitent une Tm supérieure pour les séparer que ceux
liées à l’ADN contenant des mésappariements qui le
déstabilisent .
• Le mismatch réduit donc la Tm de l’oligonucléotide,cette
diminution peut être détectée grâce à l’analyse des courbes de
fusion.
On remarque que la cible non mutée (sauvage ) présente une Tm
supérieure à celle des séquences mutées
FISH
FISH
FDA-approved kit for HER-2 testing by FISH and follow the scoring and interpretation
recommended by the manufacturer. In this procedure, the chromosome 17 centromere
is marked with a green florescent signal and HER-2 gene with an orange florescent
signal. A tumor is designated as “positive” for gene amplification if gene-tochromosome (17) ratio is >2.0
Microarrays: Biopuces
La biopuce à ADN est une plaque de verre ou de silicium sur laquelle sont gravées un
grand nombre de microcuvettes.
Sur chacune d’entre elles, on accroche une séquence de bases d’ADN, qui joue le rôle
de sonde et qui est caractéristique d’un gène, d’une mutation ou d’une maladie.
On prélève alors de l’ADN sur le patient et on le verse dans les microcuvettes.
L’ADN-sonde se liera avec l’ADN du prélèvement si et seulement si les séquences sont
complémentaires. On lave ensuite la biopuce.
Pour permettre la lecture du résultat, on a préalablement accroché à l’extrémité de
l’ADN du prélèvement une molécule fluorescente.
Ainsi, dans les microcuvettes où il y a eu appariement, l’ADN du prélèvement est resté
accroché à l’ADN-sonde et est visible à la lumière ultraviolette grâce à la molécule
fluorescente.
Dans les microcuvettes où il n’y a pas eu d’appariement, l’ADN du prélèvement a été
enlevé par le lavage et il n’y a pas de signal lumineux.
Techniques de diagnostique génétique du cancer
FISH
PCR en temp réel
microarrays ou Biopuces
Permettent
• La détection des mutation de marqueurs génétiques de
cancer
• La détection de l'amplification génique de marqueurs de
métastase
• Orientent vers un pronostic plus précis
• Des choix thérapeutiques mieux ciblés
• Une meilleure prise en charge des patients cancereux
• Un diagnostic précoce ou préventif (PCR en temps réel
& microarrays)