récepteurs couplés aux protéin
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Jeudi 16 Février 2012, 17h-20h UE de Biologie et Physiopathologie Moléculaires de la Cellule. (année 2011/2012) SIGNALISATION CELLULAIRE ET VOIES DE TRANSDUCTION: - Principaux récepteurs membranaires n°2 (récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques) B. Payrastre, Inserm U1048, Université Paul Sabatier CHU-Purpan, Toulouse LES DIFFERENT RECEPTEURS AUX SIGNAUX EXTRACELLULAIRES : spécificité des interactions LES RECEPTEURS MEMBRANAIRES - RECEPTEURS A ACTIVITE CATALYTIQUE - TYROSINE KINASE - SERINE/THREONINE KINASE - GUANYLYL CYCLASE - RECEPTEURS CANAUX OU IONOTROPIQUES - RECEPTEURS DE LA FAMILLE DES CYTOKINES - SUPERFAMILLE DES RECEPTEURS DU TNF (récepteurs de mort) - INTEGRINES - RECEPTEURS D’ADHESION - RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G (RCPG) DE LA SEQUENCE A LA STRUCTURE ET LA FONCTION Après le clonage, la bioinformatique donne : - Profil d’hydropathicité - Recherche d'homologies (banque Swiss-Prot) - Alignements de séquences primaires (% identité, homologies) - Identification de domaines et sites fonctionnels : * tyrosine kinase *tyrosine phosphatase *sérine/thréonine kinase *transmembranaire - Prédiction de structures secondaires - Histoire évolutive : analyse des AA conservés (important pour fonction) DU CLONAGE A LA FONCTION - Expression de la protéine par transfection de l’ADNc codant le récepteur dans des cellules eucaryotes via des vecteurs d’expression - Microinjection de l’ARNm - Mutagenèse dirigée, délétions, invalidation (siRNA) - Constructions et expression de récepteurs chimères DU CLONAGE A LA PATHOLOGIE - Identification de mutations, délétions associées à diverses pathologies par diverses techniques (PCR, SSCP, DGGE, identifications de RFLP). LES RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G (RCPG ou 7-TMS) - Le transfert de l’information fait intervenir 3 protéines : 1) Le récepteur (GPCR = 1 % du génome) 2) Une protéine G hétérotrimérique a,b/g qui lie le GTP et l’hydrolyse (Gilman 1987) 3) Un ou des effecteur(s) : - Canal ionique - Enzyme (notion de second messager) DIVERSITE DES RCPG ET DE LEURS LIGANDS - Les ligands sont extrêmement variés: 1) Stimuli sensoriels 2) Neuromédiateurs 3) Hormones peptidiques 4) Protéines 5) Dérivés lipidiques 6) Autres : thrombine (protéase) 7) Récepteurs orphelins STRUCTURE DES RCPG Ji, T. H. J BIOL CHEM,1998, 273, 17299 STRUCTURE SECONDAIRE DES PROTEINES : les hélices a hélice a Cet agencement peut faire apparaître une face plus ou moins hydrophobe Les domaines transmembranaires sont souvent constitués d’une hélice a d’une vingtaine de résidus pour la plupart hydrophobes. La proline n’ayant pas d’H sur son groupe amine déstabilise l’hélice a (elle est rarement présente dans les hélices a). STRUCTURE TERTIAIRE D’UNE PROTEINE EXEMPLE DE STRUCTURE D’UN RECEPTEUR COUPLE A UNE PROTEINES G (GPCR) L’exemple de la rhodopsine : Une molécule de 11-cis-rétinal est associée de manière covalente à un résidu de lysine du TM VII de la rhodopsine, son isomérisation en tout-trans-rétinal, induite par un photon, entraîne l'activation de la rhodopsine. LA STRUCTURE 3D DES 7 HELICES TRANSMEMBRANAIRES DES GPCR EST CONSERVEE Superposition de 5 structures de RCPG Conservation des 7 hélices transmembranaires DIVERSITE DES RCPG ET DE LEURS LIGANDS EFFECTORS LE SIGNAL DES RCPG EST TRANSMI PAR LES SOUS-UNITES a ET b/g METHODE POUR « DE-ORPHELINISER » LES RECEPTEURS SANS LIGANDS CONNUS : «Pharmacologie reverse » Pierce, Premont and Lefkowitz 2002 ~800 RCPGs REGROUPES EN 5 FAMILLES ~700 ~15 ~15 Rôle des RAMPs + famille des récepteurs adhésifs et famille des récepteurs Frizzled et du goût LES PROTEINES G HETEROTRIMERIQUES - Sous-unité a (39 - 52 kDa) : lie le GDP ou le GTP et possède une activité GTPasique : GTP GDP + Pi 17 gènes codent pour les sous-unité a (4 classes: aq, as, ai, a12) - Dimère bg : b = 36 kDa et g = 6-10 kDa 5 gènes pour les sous-unités Gb et 12 pour Gg ACTIVATION DES PROTEINES G HETEROTRIMERIQUES PAR LES RCPG ACTIVATION DES PROTEINES G HETEROTRIMERIQUES PAR LES RCPG, COMPARAISON AVEC L’ACTIVATION DES PROTEINES G MONOMERIQUES Protéine G Hétérotrimériques et RCPG Protéine G Monomériques (Ras) DOMAINES IMPORTANTS POUR LA SPECIFICITE DU COUPLAGE DU RECEPTEUR A UNE PROTEINE G DONNEE - DOMAINES C ET N TERMINAUX DE i3 - SEQUENCE DRY DE i2 DES RCPG DU GROUPE1 - Extrêmité C TERMINALE DU RECEPTEUR ANCRAGE DES PROTEINES G DANS LA MEMBRANE - LE COMPLEXE bg : GROUPEMENT ISOPRENYL : - GERANYL (20 C) - FARNESYL (15 C) fixés SUR UNE CYSTEINE près de l’extrêmité C-terminale de g - LA SOUS- UNITE a : - ACIDE MYRISTIQUE (14 : 0) LIAISON AMIDE AVEC LE NH2 D’UNE GLYCINE DANS LES SOUS-UNITES a DE LA FAMILLE ai. - ACIDE PALMITIQUE (16 : 0) LIAISON thioESTER SUR CYSTEINE, POUR TOUTES LES SOUS- UNITES a SAUF aT DIVERSES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES DES PROTEINES Les modifications chimiques des protéines sont de nature variée : - Ajout de groupements divers : Acétylation (histones), amidation (neuropeptides), biotinylation, carboxylation, hydroxylation, méthylation, sulfatation, phosphorylation - Ajout d’acide gras et de composés lipidiques Glypiation (ancre GPI), isoprénylation, palmitoylation, myristoylation - Ajout de glucides, glycosylation Glycosylation - Ajout de polypeptides Ubiquitination, sumoylation AJOUT D’ACIDE GRAS ET DE COMPOSES LIPIDIQUES SUR LES PROTEINES L’isoprénylation : L'ajout d'un groupement isoprénoïde (farnésyl ou géranylgéranyl) à une protéine se fait sur la cystéine dans une séquence CAAX (C=cystéine, A = AA aliphatique, X = S, M, A ou E) en C-terminal. Farnésyl diphosphate Géranygéranyl diphosphate x L’isoprénylation permet l’ancrage à la membrane de protéines cytosolique telles que les G-protéines (sous-unités b/g). Ex : Ras est farnésylé et ses formes oncogéniques sont aussi palmitoylées (inhibiteurs de Liaison thioether farnésyltransférases). Rque : les statines en bloquant l’HMG-CoA réductase inhibent la synthèse du géranylgéranyl et donc la géranylation des certaines protéines de signalisation (RhoA). Farnésyltransférase AJOUT D’ACIDE GRAS ET DE COMPOSES LIPIDIQUES SUR LES PROTEINES Myristoylation et palmitoylation : La liaison entre une cystéine et un acide gras est une S-acylation (sensible à la réduction). Une liaison ester simple entre un acide gras et une sérine interne (Oacylation) est aussi parfois observée. L'acide myristique peut aussi se retrouver sur une glycine en N-terminal d'une protéine (modification stable couramment retrouvée chez les protéines membranaires virales). Isoprénylation permet l’ancrage à la membrane de protéines cytosolique (sous-unités a des protéines G) et même membranaire (cas de certains GPCR) EFFECTEUR LES PLUS CLASSIQUES DES PROTEINES G HETEROTRIMERIQUES ATP EFFECTEUR LES PLUS CLASSIQUES DES PROTEINES G HETEROTRIMERIQUES LES EFFECTEURS LES SECOND MESSAGERS 1- DES CANAUX IONIQUES : - Les Canaux calciques - as + - ao - Ca2+ - Les Canaux potassiques - as + 2- DES ENZYMES : - Les Adénylcyclases K+ - ao + - as + AMPc -ai - - La Phosphodiestérase du GMPc - aT + - Les Phospholipases C - aQ + - La Phospholipase A2 - a12 + - Les GEFs des Rho GTPases - a12 + GMPc IP3 Ac Arachidonique EFFECTEUR LES PLUS CLASSIQUES DES SOUSUNITES b/g Effecteurs de b/g : - b ARK1 (b-adrenergic receptor kinase) - Phospholipase Cb - Phospholipase A2 - TYPES II ET IV adénylyl cyclases - Tyrosine kinases à domaine PH - Phosphoinositide 3-kinase g - Canaux K+ muscariniques (ACETYLCHOLINE) - Canaux Ca2+ Nature Reviews Molecular Cell Biology 2002, 3; 639-650 EFFECTEUR DE aS : l’adénylyl cyclase ATP LES PROTEINES Gi et Gs DANS LA VOIE D’ACTIVATION DE LA PKA AMPc + PPi EXEMPLE DE MECANISME DE REGULATION CELLULAIRE PAR LA PROTEINE Gs : LA GLYCOGENE PHOSPHORYLASE adrenaline R-b adrénergique Gs Adenylate cyclase AMPc PKA Phosphorylase-kinase Inactive Glycogen Phosphorylase Active Glycogen Phosphorylase Glycogène-phosphorylase Phosphorylase-kinase P-Ser14 Fisher & Krebs 1955 glycogène glucose 1-P (glycogenolyse) L. Johnson, Bioch Soc Trans (2009) EXEMPLE DE L’ACTION DE LA FSH DANS LA GRANULOSA ab FSH PROTEINE Gs as RECEPTEUR PKA C C Adénylyl cyclase as b g + ATP C R R C AMPc R R CREB CREB-P Fisher & Krebs 1955 Transcription + Aromatase Granulosa Synthèse E2 OUTILS POUR ETUDIER LES VOIES Gs et Gi : La choléra toxine et la pertussis toxine Mode d’action des toxines : - ADP-ribosylation de la sous-unité a ADP-ribose + + Nicotinamide NAD Sous-unité a Sous-unité a Leur spécificité : Toxine cholérique : Toxine pertussique : sous-unité sous-unité as ai et ao OUTILS POUR ETUDIER LES VOIES Gs et Gi : La choléra toxine et la pertussis toxine a GDP Toxine Pertussique sur Gi et Go g b PO4-- Toxine cholérique sur as a GTP + b Activation constitutive des voies Gs dépendantes Effecteurs g Inhibition des voies Gi et Go dépendantes ACTIVATION DE LA PROTEINE Gq ET DE LA PLCb b EXEMPLE DU RECEPTEUR DE LA RHODOPSINE : ACTIVE PAR UN PHOTON La rhodopsine (RCPG) est couplée à la transducine (protéine G) qui stimule la phosphodiestérase hydrolysant le GMPc en GMP ce qui permet le blocage du canal ionique responsable de la dépolymérisation de la cellule G protéine = transducine Rque : La rhodopsine s’active en 6 ms, cette stimulation dure 6 min et peut activer ~200Gt/s (amplification) LES PROTEINES RGS : DES REGULATEURS CLE DES PROTEINES G HETEROTRIMERIQUES LES PROTEINES RGS ou « regulator of G protein Signaling » : - Protéines de 25 kDa possédant un domaine homologue de 120 AA (19 gènes différents chez les mammifères). - En interagissant avec une sous-unité a, elles de a x 40-100 fois. stimulent l'activité GTPasique - GAIP, protéine palmitoylée interagit avec Gai3. RGS Inactive RGS Active L. De VRIES et al. 1995 PROTEINES RGS ET CYCLE D’ACTIVATION DES PROTEINES G HETEROTRIMERIQUES ? 40 30 20 10 0 Agonist: 2ème stimulation IP3 production (Fold increase) IP3 production (Fold increase) 1ère stimulation - + 40 30 20 10 0 Agonist: - + DESENSIBILISATION HOMOLOGUE ET « DOWN- REGULATON » C’est la diminution de la réponse biologique à l’agoniste, en fonction du temps. Après une première addition d’un agoniste donné, une deuxième addition de cet agoniste n’active plus le récepteur et ne donne pas de réponse. ARRET DU SIGNAL 1) DECOUPLAGE ENTRE RECEPTEUR ACTIVE ET PROTEINE G : - Phosphorylation du récepteur par une sérine/thréonine de la famille GRK (G PROTEIN RECEPTOR COUPLED PROTEIN KINASE) . Les kinases GRK (7 DIFFERENTES) sont activées par le DIMERE bg. Une fois phosphorylé, le récepteur recrute une protéine de la famille des bARRESTINES. Le récepteur ne peut alors plus se coupler à la protéine G, il est désensibilisé. C’est un mécanisme rapide (secondes-minutes). Rques : - Certains RCPG ne se désensibilisent pas (ex : le récepteur adrénergique a2C). - modèles de souris transgniques confirment le rôle clé des GRK ARRET DU SIGNAL Prot G b - arrestine PKA GRK ARRET DU SIGNAL 2) DIMINUTION DU NOMBRE DE RECEPTEURS A LA MEMBRANE : Par INTERNALISATION et parfois par DIMINUTION DE LA SYNTHESE DU RECEPTEUR et/ou DEGRADATION. MECANISME PLUS LENT. DESENSIBILISATION PUIS INTERNALISATION : rôle des barrestines Ji et al J Biol chem 1998, 273, 17299 MECANISME DE L’ENDOCYTOSE DES RCPGs ET DEVENIR DES RECEPTEURS INTERNALISES Scott et al Med/sci 2004 LES ARRESTINES PEUVENT AUSSI ETRE DES « docking » PROTEINES E. Reiter & RJ. Lefkowitz 2006 Bockaert J. et al Pharmacology and Therapeutics 2004 VERS UNE PLUS GRANDE COMPLEXITE: lES GIP(GPCR interacting proteins) • L’extrêmité C-terminale des RCPGs peut en fait interagir avec un nombre important de protéines (plus de 50) • La plupart possèdent un domaine PDZ • Rôle dans l’adressage, le trafic, la signalisation……. Bockaert J. et al Pharmacology and Therapeutics 2004 DIMERISATION DE CERTAINS RCPGs Existence d’homo ou hétéro dimères entre des RCPG Exemple du récepteur GABA B, récepteur de l’Ac g amino butyrique George S.R. Nat Rev Drug Discov 2002 UNE CARACTERISTIQUE DES RCPGs : L’AMPLIFICATION DU SIGNAL UN RECEPTEUR ACTIVE STIMULE PLUSIEURS CENTAINES DE MOLECULES DE LA PROTEINE G AVANT SA DESENSIBILISATION. C’EST LA PREMIERE PHASE D’AMPLIFICATION. Ex : Rhodopsine s’active en 6 ms, cette stimulation dure 6 min et peut activer ~200Gt/s a UNE GTP A LE TEMPS DE FAIRE SYNTHETISER PLUSIEURS CENTAINES DE MOLECULES DE MESSAGERS SECONDAIRES AVANT QUE LE GTP NE SOIT HYDROLYSE EN GDP. = (DEUXIEME PHASE D’AMPLIFICATION) MUTATIONS RETROUVEES DANS LES RCPGs ET LES PROTEINES G TRIMERIQUES ASSOCIEES A DES PATHOLOGIES MUTATIONS DES RCPGs ET PATHOLOGIES Bockaert,J. Med/Sc 1995 MUTATIONS INHIBITRICES DES RCPGs ET PATHOLOGIES Rhodopsine Autosomique récessive Rétinite pigmentaire R Vasopressine V2 Lié à l’X (16 mutations) Diabète insipide Récepteur au Ca++ Autosomique dominante R GH Autosomique récessive Hyperparathyroïdie néonatale Hypercalcémie Hypocalciurie familiale Nanisme Bockaert,J Med/Sc 1995 MUTATIONS INHIBITRICES DU RECEPTEUR DE LA LH RECEPTEUR DE LA LH Syndromes de résistance à la LH A) Chez l ’homme : pseudo-hermaphrodisme complet avec apparence féminine sans développement mammaire. LH élevée, FSH normale. L’inactivation du récepteur peut aussi être partielle avec insuffisance du développement des organes génitaux externes (micropénis, cryptorchidie bilatérale…). Transmission autosomique récessive. B) Chez la femme : aménorrhée primaire, ovaires kystiques avec présence de follicules primordiaux et antraux. LH élevée mais FSH normale. Absence de follicule préovulatoire et absence de lutéinisation des cellules de la granulosa. MUTATIONS ACTIVATRICES DU RECEPTEUR DE LA LH A) Chez le garçon : Puberté précoce familiale ou testotoxicose mutation position 578, dans le 6 ième TMS. Concentration de testostérone très élevée et concentration de LH prépubère. Transmission autosomique dominante. Récepteur de la LH constitutivement actif. Puberté précoce sporadique à gonadotrophines basses : diverses mutations trouvées dans le le 6 ième TMS. La fonction gonadique adulte semble normale. B) Chez la fille : pas d ’anomalie de fonction? Ni hyperandrogénie ni puberté précoce.(la LH seule ne suffit pas, la FSH est indispensable) MUTATIONS DE Gas ET MALADIES ENDOCRINES - Mutations activatrices : -Tumeurs endocrines -Syndrome de McCune-Albright -Dysplasie fibreuse de l’os (puberté précoce, dysplasie fibreuses des os et taches cutanées) - Mutations inactivatrices : -Osteodystrophie héréditaire de Albright -Pseudohypoparathyroidisme de type IA -Pseudopseudohypoparathyroidisme Ga liée au GTP En rouge : mutations qui empêchent l’hydrolyse du GTP (retrouvées dans des tumeurs endocrines). En bleue : mutations qui inactivent la sous unité a (entrainant un pseudohypoparathyroidism). Rque: souris exprimant une voie Gs constitutivement active dans les ostéoblastes ont un phénotype d’hypertrophie osseuse spectaculaire MUTATIONS INACTIVATRICE DE Gas : Pseudohypoparathyroidie de type IA - Ostéodystrophie de Albright (ossifications ectopiques) plus - Résistance multihormonale, particulièrement à PTH, TSH et gonadotrophines. - Résistance rénale à la PTH : Hypocalcémie, mais pas d ’hypercalciurie comme dans l’hypoparathyroidisme vrai, hyperphosphatémie et PTH élevée. - Très souvent associé à une résistance à TSH. - Hypogonadisme particulièrement chez la femme avec retard de puberté, aménorrhée et/ou infertilité. Mutation inactivatrice de Gsa, hétérozygote Endocrines reviews 2001, 22, 675-705 CAS CLINIQUE : mutation de Gas responsable d’hyper et hypo –fonctionnements endocrines - Mutation A366S - Retrouvée chez des enfants associant 2 maladies génétiques endocriniennes : - Une pseudohypoparathyroïdie de type IA (Gs¯) - Une testotoxicose (Gs-) Comment expliquer ce paradoxe? Effets opposés de la mutation A366S de Gas à 32 °C et à 37 °C !! M. Plantavid m/s 1995, 11,107 Nature 1994, 371, 164-7 EXEMPLE DES RECEPTEURS DE MORT (Inflammation, Nfkb)
