Production d`anticorps spécifiques in vitro par culture de

NELLIE DUMONT
PRODUCTION D'ANTICORPS SPECIFIQUES IN
VITRO PAR CULTURE DE LYMPHOCYTES B
HUMAINS
Mémoire présenté
à la Faculté des Études Supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en microbiologie
pour l'obtention du grade de Maître es sciences (M.Se.)
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE ET DE MICROBIOLOGIE
FACULTÉ DES SCIENCES ET GÉNIE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
FEVRIER 2008
© Nellie Dumont, 2008
Résumé
Les anticorps, piliers de la réponse immunitaire humorale, sont fréquemment utilisés pour
traiter certaines immunodéficiences et maladies autoimmunes.
Des préparations
d'anticorps spécifiques à un antigène sont également administrées à des indivudus, suite à
un contact avec un pathogène. Cependant, nous sommes limités dans leur production ainsi
que dans la variété des spécificités antigéniques puisque leur préparation dépend de la
disponibilité d'individus hyperimmunisés. Ce projet a donc pour objectif de produire des
anticorps spécifiques in vitro en cultivant les lymphocytes B humains isolés du sang de
participants. En stimulant les lymphocytes B humains avec du LPS d'Escherichia coli, la
sécrétion d'anticorps spécifiques et la sécrétion de cytokines ont augmenté. Nous pensons
que ce mécanisme accélère la réponse secondaire lors d'une infection bactérienne.
Nous
avons également tenté de stimuler la prolifération des lymphocytes B humains en
surexprimant le gène AgT, un gène stimulant la croissance cellulaire chez les cellules COS7. Cependant, nous n'avons pas été en mesure d'obtenir obtenir un effet biologique.
ii
Avant-propos
Tout d'abord, je tiens à remercier ma directrice de maîtrise, Renée Bazin, pour m'avoir
accueillie dans son équipe ainsi que pour sa bonne humeur et sa grande disponibilité. Je
remercie également les membres de mon comité aviseur, André Darveau et Sonia Néron,
pour leurs précieux conseils et commentaires.
Je veux remercier tous les étudiants gradués d'Héma-Québec avec qui j'ai passé deux
merveilleuses années pour les moments de décrochage et de fous rires, et plus
particulièrement Éric Aubin et Dominic Paquin Proulx pour leurs discussions interminables
mais toujours pertinentes. Du même coup, je tiens à remercier toute l'équipe de R&D
d'Héma-Québec ainsi qu'Héma-Québec pour le soutien technique et financier.
Je remercie sincèrement ma mère Diane, qui trouve toujours les bons mots pour
m'encourager à continuer mon travail ainsi que mon papa Maurice, mon beau-père Denis et
ma soeur Maude pour leur soutien constant. Finalement, je remercie tous mes amis de
Québec, de Montréal, de Sept-Iles et de Rouyn-Noranda qui m'ont fait passer des moments
inoubliables, chacun de vous partage avec moi une part de mon succès.
Table des matières
Résumé
i
Avant-propos
ii
Table des matières
iii
Liste des tableaux
v
Liste des figures
vi
Liste des abréviations
viii
1 .Introduction
1
1.1 Le système immunitaire
1
1.1.1 Hématopoïèse
1
1.1.2 Réponses immunitaires innée et acquise
2
1.1.3 Réponses à médiation cellulaire et humorale
4
1.2 Production in vivo d'anticorps par les lymphocytes B
4
1.2.1 Maturation du lymphocyte B
4
1.2.2 Activation des lymphocytes B naïfs
5
1.2.3 Différenciation des lymphocytes B activés en cellules effectrices mémoires et
plasmocytaires
7
1.2.4 Rôle des TLR dans l'activation des lymphocytes B
8
1.2.5 Les Anticorps : structure et fonctions
11
1.3 Production in vitro d'anticorps humains
14
1.3.1 Fusion cellulaire
15
1.3.2 Système de culture CD40-CD154
15
1.4 Problématique et objectifs du projet de maîtrise
17
2. Matériel et Méthodes
20
2.1 Isolement des cellules
20
2.1.1 Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique
20
2.1.2 Isolement des lymphocytes B
21
2.2 Culture de lymphocytes B dans le système CD40-CD154
22
2.2.1 Lignée cellulaire L4.5
22
2.2.2 Culture des lymphocytes B
22
2.2.3 Mesure de la prolifération et de la viabilité cellulaire
22
2.3 Dosage des facteurs solubles dans les surnageants de culture de lymphocytes B
23
2.3.1 Dosage des IgG totaux
23
2.3.2 Dosages des IgG spécifiques au tétanos ou à l'hépatite B
24
2.3.4 Évaluation de la polyréactivité des Acs
24
2.3.5 Dosage de l'IL-6 par ELISA
24
2.4 Cytométrie en flux : Évaluation de l'expression des marqueurs de surface
25
2.5 Étude de l'effet du LPS sur l'expression de cytokines par les lymphocytes B humains
26
2.5.1 Préparation de lysats cellulaires
26
2.5.2 Préparation d'ARN et d'ADN complémentaire (ADNc) de lymphocytes B
normaux et de lignées cellulaires
26
2.5.3 PCR quantitatif en temps réel
27
2.5.4 Cytokine arrays
28
2.6 Transfert du gène Antigène Grand T dans les lymphocytes B
28
iv
2.6.1 Construction du vecteur adénoviral AD5/F35 exprimant l'AgT du virus SV40.28
2.6.2 Infection des lymphocytes B avec les constructions virales contenant l'AgT ...29
2.6.3. Détection de l'AgT par immunobuvardage (Western blot)
30
2.6.5 PCR traditionnel et séquençage
31
3. Résultats
32
3.1 Étude de l'effet du LPS sur les lymphocytes B humains
32
3.1.1 Effet de l'ajout de LPS sur la prolifération des lymphocytes B humains
32
3.1.2 Effet de l'ajout de LPS sur la sécrétion d'Acs par les lymphocytes B humains.35
3.1.3 Évaluation de la réactivité des Acs produits suite à l'ajout de LPS dans les
cultures de lymphocytes B humains
38
3.1.4 Évaluation de l'effet du LPS sur les populations de lymphocytes B humains. ...40
3.1.5 Effet de l'ajout de LPS sur la production de cytokines pro-inflammatoires par les
lymphocytes B humains et par des lignées cellulaires de lymphocytes B humains 42
3.1.6 Effet de l'ajout de LPS dans les cultures de lignées cellulaires de lymphocytes B
humains
47
3.2 Effet de l'expression de l'AgT dans les lymphocytes B humains
50
4. Discussion
57
4.1 Étude de l'effet du LPS chez les lymphocytes B humains
57
4.2 Transfert du gène AgT dans les lymphocytes B humains
64
5. Conclusion
67
6. Bibliographie
68
Liste des tableaux
Tableau 3.1 : Effet du LPS sur la sécrétion d'IgG spécifiques à la TT et à l'HBsAg par les
lymphocytes B humains
37
Tableau 3.2 : Effet du LPS sur la sécrétion d'IL-6 dans les surnageants de culture de la
lignée cellulaire RPMI-8226 cultivés en présence de LPS
49
Liste des figures
Figure 1.1 : Schéma de l'hématopoïèse
2
Figure 1.2 : Réponses primaires et secondaires lors d'une infection
3
Figure 1.3 : Les trois signaux essentiels dans l'activation Td d'un lymphocyte B
6
Figure 1.4 : La réaction des centres germinatifs
8
Figure 1.5 : Structure générale d'un Ac
122
Figure 1.6 : Système de culture CD40-CD154
126
Figure 2.1 : Principe d'isolement des lymphocytes B par la technologie Stemsep™
212
Figure 2.2 : Carte génomique du vecteur de transfert contenant le gène AgT et le gène
rapporteur EYFP
29
Figure 3.1 : Effet du LPS sur la prolifération des lymphocytes B humains cultivés dans le
système CD40-CD154
33
Figure 3.2 : Effet du LPS sur la prolifération des lymphocytes B murins cultivés dans le
système CD40-CD154
34
Figure 3.3 : Effet du LPS sur la prolifération des lymphocytes B humains cultivés en
présence de différents ratios L4.5 : lymphocyte B
35
Figure 3.4 : Effet du LPS sur la sécrétion totale d'IgG par les lymphocytes B humains
36
Figure 3.5 : Réactivité des Acs présents dans les surnageants de culture contre différents
Ags
38
Figure 3.6 : Réactivité anti-LPS des Acs produits par les lymphocytes B cultivés en
présence ou en absence de LPS
39
Figure 3.7 : Effet du LPS sur l'expression du TLR4 par les lymphocytes B humains
41
Figure 3.8 : Cinétique de l'augmentation de l'expression de l'ARNm de l'IL-6 par les
lymphocytes B humains cultivés en présence de LPS
43
Figure 3.9 : Cinétique de l'augmentation de l'expression de l'ARNm de l'IL-10 par les
lymphocytes B humains cultivés en présence de LPS
44
vii
Figure 3.10 : Augmentation de la sécrétion d'IL-6 dans les surnageants de culture des
lymphocytes B humains cultivés en présence de LPS
46
Figure 3.11 : Effet du LPS sur l'expression de l'ARNm de l'IL-6 et de l'IL-10 par 8 lignées
cellulaires de lymphocytes B représentant différents stades de différenciation
48
Figure 3.12 : Lymphocytes B humains infectés avec les virus contenant l'AgT
51
Figure 3.13 : Effet des virus AgT sur l'expansion des lymphocytes B
52
Figure 3.14 : Expression relative de l'ARNm de l'AgT dans les lymphocytes B noninfectés, infectés avec les virus AgT ainsi que dans la lignée cellulaire COS-7
53
Figure 3.15 : Amplification de l'AgT dans les lymphocytes B infectés avec les virus AgT et
dans les cellules COS-7
54
Figure 3.16 : Expression de la protéine AgT dans les lymphocytes B infectés avec les virus
AgT et dans les cellules COS-7
56
viii
Liste des abréviations
Acs : Anticorps
ADN : Acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
Ag : Antigène
AgT : Antigène grand T du virus SV40
APC : Allophycocyanin
ARN : Acide ribonucléique
ARNm : ARN messager
BCR : Récepteur antigénique du lymphocyte B (B cell receptor)
BSA : Albumine de sérum bovin (Bovin sérum albumin)
CD : Classe de différenciation
CG : Centre germinatif
CMV : Cytomégalovirus
CPA : Cellule présentatrice d'Ag
CpG : Oligonucléotide cytosine-phosphate-guanine
D.O. : Densité optique
DTT : Dithiothréitol
ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay
EYFP : Enhanced-yellow fluorescent protein
F(ab) : Fragment liant l'Ag
Fc : Fragment crystallisable
FITC : Fluorescéine isothiocyanate
GAPDH : Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogenase
HBsAg : Antigène de surface de l'hépatite B
ix
HPRT : Hypoxanthine-guanine Phosphoribosyltransférase
IFN-Y
: Interféron gamma
Ig : Immunoglobuline
IglV : Immunoglobulines intraveineuses
IL : Interleukine
IMDM : Iscove Modified Dulbecco 's médium
KLH : Hémocyanine de mollusque (Keyhole Limpet Hemocyanin)
LPS : Lipopolysaccharide
Lymphocyte TH : Lymphocyte T auxiliaire (helper T celï)
M-MLV : Transcriptase inverse du virus de la leucémie murine {Moloney Murine
Leukemia virus)
MOI : Multiplicity of infection
NaN3 : Azide de sodium
NK : Natural killer
PBS : Tampon phosphate avec saline (Phosphate huffered saline)
PBMC : Cellules mononucléées du sang périphérique
PCR : Réaction de polymérase en chaîne
PE : Phycoérythrine
PerCP Cy5.5 : Peridine Chlorophylle-a protein complex Cyanine 5.5
PGK : Phosphoglycérate kinase
PRR : Pattern récognition receptor
PVDF : Polyvinylidene fluoride
QPCR : PCR quantitatif en temps réel
SBF : Sérum bovin foetal
SDS-Page : Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SV40 : Simian virus 40
X
TD : Thymo-dépendant
TI : Thymo-indépendant
TLR : Toll-like receptor
TMB : Tétraméthylbenzidine
TNF-a : Tumor necrosis factor alpha
TT : Anatoxine tétanique
1. Introduction
1.1 Le système immunitaire
Le corps humain est constamment exposé à des microorganismes dont certains sont
potentiellement pathogènes. Cependant, il dispose de plusieurs moyens de reconnaître ces
pathogènes et de les éliminer efficacement grâce au système immunitaire. Ce dernier agit à
l'aide d'une variété de mécanismes de défense et repose sur l'action de différentes cellules
et molécules permettant l'élimination des envahisseurs. En combinant plusieurs de ces
mécanismes, le système immunitaire est ainsi capable de générer une réponse diversifiée
permettant la reconnaissance de milliers de structures distinctes.
1.1.1 Hématopoïèse
Toutes les cellules sanguines impliquées dans les différents mécanismes de défense
dérivent des mêmes progéniteurs : les cellules souches hématopoïétiques situées dans la
moelle osseuse.
Ces dernières sont des cellules pluripotentes avec la capacité de se
différencier en tous les types de cellules hématopoïétiques1'2. Sous le contrôle des signaux
de plusieurs cytokines et de facteurs de croissance, elles se différencient d'abord en
précurseurs des deux lignées principales de cellules hématopoïétiques soit les progéniteurs
myéloïdes et lymphoïdes (figure 1.1). Les progéniteurs myéloïdes sont à l'origine des
granulocytes, des macrophages, des cellules dendritiques, des plaquettes et des globules
rouges. Les précurseurs lymphoïdes, pour leur part, sont à l'origine des lymphocytes T, des
lymphocytes B et des cellules NK1'3'4. Les prochaines sections mettront l'emphase sur la
réponse immunitaire impliquant les lymphocytes B ainsi que sur les principales étapes du
développement de ces cellules.
2
Prugeniteur i-rythroitlt-
Érythnicytc
Figure 1.1 : Schéma de l'hématopoïèse
Tiré de Goldsby3
1.1.2 Réponses immunitaires innée et acquise
Dès les premiers instants suivant l'entrée d'un antigène (Ag) dans l'organisme, une
première réponse immunitaire est engagée, appelée immunité innée.
Aussi nommée
immunité naturelle, elle agit comme première ligne de défense empêchant l'établissement
d'une infection1'5. Son effet est rapide et la majorité des microorganismes sont détruits en
quelques heures voire quelques minutes par des mécanismes ne requérant pas une longue
3
période d'induction. De plus, cette immunité implique surtout une réponse non-spécifique
destinée à reconnaître des motifs communs à plusieurs Ags.
Parmi les mécanismes
impliqués, on retrouve la phagocytose ainsi que l'activation du complément suite à
1 ^
l'opsonisation des pathogènes par les anticorps (Acs) naturels ' .
L'immunité innée
englobe également des barrières physiques et chimiques afin d'empêcher l'établissement
d'une infection2.
Par exemple, la peau et les muqueuses sont des barrières physiques
pratiquement infranchissables pour les microorganismes tandis que les larmes et la salive
contiennent des protéines, comme le lysozyme et même les IgA, avec des propriétés anti­
microbiennes2.
Par opposition à l'immunité innée, les mécanismes de l'immunité acquise requièrent une
période d'induction beaucoup plus longue afin de permettre l'activation spécifique des
lymphocytes T et lymphocytes B et l'établissement de la mémoire immunologique.
Normalement, une réponse acquise primaire, qui consiste en l'activation des lymphocytes B
naïfs et leur différenciation en plasmocytes et en lymphocytes B mémoires, apparaît dans
les 4 ou 5 jours suivant l'infection . La mémoire immunologique permet, lors d'un
deuxième contact avec un même antigène, d'activer la réponse secondaire, via les
lymphocytes B et les lymphocytes T mémoires, et de fournir une offensive beaucoup plus
rapide, plus efficace et surtout beaucoup plus spécifique (figure 1.2) " .
§
V:
u
—
_,
c
u
0
I AM
1 An
Temps âpre* l'immunisation
Figure 1.2 : Cinétique des réponses primaires et secondaires lors d'une infection
Tiré de Goldsby3
4
1.1.3 Réponses à médiation cellulaire et humorale
Deux types de réponses peuvent intervenir lors d'une infection : la réponse à médiation
cellulaire et celle à médiation humorale. Les lymphocytes T sont les principaux acteurs de
la réponse à médiation cellulaire. Si un Ag est présenté à un lymphocyte T lorsqu'il
circule dans l'organisme, ce dernier se différencie en cellule effectrice exprimant soit le corécepteur CD4 ou le co-récepteur CD8 selon la fonction du lymphocyte T. Ces cellules
exprimant le CD4 sont aussi appelées lymphocytes T auxiliaires (TH) et participent, entre
autres, à l'activation des lymphocytes B par contact direct et par la sécrétion de cytokines.
Les lymphocytes T exprimant le CD8 sont aussi appelés lymphocytes T cytotoxiques et
participent à l'élimination des pathogènes intracellulaires en détruisant les cellules
infectées3'6.
La réponse à médiation humorale repose sur l'action de molécules solubles, nommées Acs,
menant à la destruction des microorganismes extracellulaires. Les Acs sont sécrétés par les
lymphocytes B différenciés en plasmocytes suite à leur activation par différents signaux qui
seront revus dans les sections suivantes.
1.2 Production in vivo d'anticorps par les lymphocytes B
Afin de devenir des cellules effectrices mémoires et, par la suite, sécrétrices d'Acs de
grande affinité,
les lymphocytes B doivent passer par trois grandes étapes de
développement : 1) la maturation, 2) l'activation et l'expansion de la population, 3) la
différenciation en lymphocytes B mémoires et en plasmocytes ' .
1.2.1 Maturation du lymphocyte B
Plusieurs étapes sont requises afin d'obtenir un lymphocyte B mature capable de lier un Ag
et de sécréter des Acs très spécifiques.
Les premières étapes de différenciation sont
marquées par des réarrangements des gènes du récepteur de surface du lymphocyte B
nommé BCR. Ce BCR est en fait un Ac membranaire exprimé à la surface du lymphocyte
B. Les réarrangements de gènes s'effectuent plus particulièrement dans les portions du
BCR permettant la reconnaissance de l'Ag, soit les portions variables des Acs (voir section
5
1.2.5). Au cours de ces premiers stades de maturation qui ont lieu dans la moelle osseuse,
les lymphocytes B immatures ont besoin d'un contact direct avec les cellules stromales.
Ces cellules leur fournissent des signaux de survie et des facteurs de croissance favorisant
leur développement7'8. Lorsque les réarrangements permettent d'obtenir un BCR
fonctionnel, le lymphocyte B est dit naïf et exprime des BCR d'isotypes IgM et IgD de
façon simultanée (voir section 1.2.5).
1.2.2 Activation des lymphocytes B naïfs
Les lymphocytes B naïfs peuvent être activés de deux façons. La première est l'activation
thymo-indépendante (TI), c'est-à-dire qu'elle se fait sans l'intervention des lymphocytes T.
Les Ags induisant la réponse TI peuvent être divisés en deux sous-classes : les TI-1 et les
TI-2. Leur différence se situe surtout au niveau du type d'Ag impliqué. Les Ags TI-1 sont
des activateurs polyclonaux, comme le lipopolysaccharide (LPS), les peptidoglycans et la
flagelline alors que les Ags TI-2 sont plutôt des polysaccharides avec des séquences très
répétitives. La réponse TI-2 mène à la sécrétion rapide d'Acs majoritairement de type IgM
et généralement peu spécifiques9. De plus, l'activation TI ne mène pas à l'établissement
d'une mémoire immunologique puisque ce mécanisme ne dépend pas de la spécificité
antigénique des lymphocytes B1'3.
Le deuxième type d'activation est thymo-dépendant (TD). Cette réponse dépend du contact
direct du lymphocyte B avec un lymphocyte T et plusieurs signaux sont essentiels à
l'activation du lymphocyte B qui mèneront à sa prolifération et à sa différenciation en
cellules sécrétrices d'Acs très spécifiques (figure 1.3).
Le premier signal est celui fourni
par la liaison du BCR à son Ag spécifique. Une fois ce complexe BCR/Ag formé, il est
internalisé pour ensuite être présenté sous forme peptidique par le complexe majeur
d'histocompatibilité de classe 2 exprimé à la surface du lymphocyte B. Ce dernier migre
ensuite vers les organes lymphoïdes secondaires comme les ganglions lymphatiques, la rate
et les amygdales afin de présenter ces Ags aux lymphocytes TH qui reconnaîtront ce
complexe via leur récepteur de surface. L'interaction lymphocyte B : lymphocyte TH mène
à l'augmentation de l'expression de la molécule CD 154 par le lymphocyte TH qui se lie à
son ligand, le CD40, exprimé constitutivement par le lymphocyte B. Cette liaison CD40-
6
CD154 constitue le deuxième signal essentiel à l'activation du lymphocyte B10. Le
troisième signal essentiel est fourni par les cytokines. Certaines de ces cytokines, comme
l'interleukine (IL)-4 et l'IL-2, sont sécrétées par le lymphocyte TH et sont connues pour
stimuler la prolifération et la différenciation des lymphocytes B . De plus, certaines
cytokines peuvent avoir une action endocrine, c'est-à-dire qu'elles sont sécrétées par le
lymphocyte B et agissent sur lui-même .
naïve
CD40 CD154
Cellule B
activée
Figure 1.3 : Les trois signaux essentiels dans l'activation thymo-dépendante d'un
lymphocyte B
Tiré de Goldsby3
Tous ces signaux d'activation combinés vont mener à une prolifération massive des
lymphocytes B dans les centres germinatifs (CGs) des organes lymphoïdes secondaires qui
sont des endroits favorables à leur prolifération et à leur différenciation. La réaction des
CGs sera décrite plus en détail dans la section suivante.
7
1.2.3 Différenciation des lymphocytes B activés en cellules effectrices mémoires et
plasmocytaires
Les lymphocytes B activés par les signaux essentiels présentés à la section précédente vont
former des CGs dans les organes lymphoïdes secondaires. C'est dans ces CGs que les
événements importants de la différenciation des lymphocytes B ont lieu . Premièrement,
l'affinité du BCR est augmentée par le processus d'hypermutation somatique. Ce
mécanisme introduit des mutations ponctuelles dans les régions variables des chaînes
lourdes et légères des BCR à un taux très élevé13'14. Ces mutations permettent d'obtenir des
BCR et, par conséquent, des Acs sécrétés possédant une affinité
supérieure.
Deuxièmement, les BCR peuvent subir un changement de leur isotype. En effet, des
réarrangements dans la portion constante de la chaîne lourde des Acs permettent de changer
son isotype et, ainsi, de lui conférer des fonctions effectrices distinctes.
Les lymphocytes B qui ont passé par les CGs et qui ont subi les étapes de commutation
isotypique et d'hypermutation somatique vont se différencier en plasmocytes sécréteurs
19
d'Acs spécifiques ou en lymphocytes B mémoires .
Les lymphocytes B mémoires,
représentant 40% des lymphocytes B du sang périphérique, sont de morphologie et de taille
similaires aux lymphocytes B naïfs15. Cependant, leur durée de vie est beaucoup plus
longue soit de quelques semaines à plusieurs années. Ils sont responsables de la mémoire
immunologique du système immunitaire, lui permettant ainsi de répondre plus rapidement
et plus efficacement aux Ags déjà rencontrés.
Les lymphocytes B mémoires sont
également plus aptes à répondre à la présence de l'Ag puisqu'ils expriment une plus grande
quantité de BCR et de molécules de co-stimulation comme le CD40, le CD80 et le CD86,
ce qui facilite leur interaction avec les lymphocytes T. Ils sont également plus sensibles
aux signaux de cytokines comme l'IL-2, l'IL-4 et l'IL-1016. Finalement, on peut les
distinguer des lymphocytes B naïfs par la présence du récepteur CD27 à leur surface17
quoique l'utilisation du CD27 comme marqueur universel des lymphocytes B mémoires ait
récemment été remise en question suite à des travaux menés dans le laboratoire du Dr.
Sonia Néron18 qui ont mis en évidence la présence d'une population de lymphocytes B
mémoires CD27". D'autre part, les travaux de Lanzavecchia et ses collaborateurs suggèrent
que les lymphocytes B mémoires peuvent être activés de façon indépendante de l'Ag. En
8
effet,
il semblerait qu'environ 2% des lymphocytes B mémoires humains se divisent
chaque jour et ce, en absence d'Ag. Ce mécanisme expliquerait en partie le maintien de la
mémoire sérologique, c'est-à-dire le maintien de la concentration sérique d'Acs19.
Les lymphocytes B peuvent également se différencier en plasmocytes, les cellules
spécialisées dans la sécrétion d'Acs. Deux types de plasmocytes sont connus et classés
selon leur durée de vie. Les lymphocytes B activés de façon TI par des Ags polyclonaux et
ne passant pas par la réaction des CGs vont se différencier rapidement en plasmocytes à
courte vie (<10 jours)15. Ces plasmocytes sécrètent surtout des IgM de faible affinité qui
sont responsables de la première défense générale contre les envahisseurs.
Les
lymphocytes B qui ont passé par les CGs se différencient en plasmocytes à longue vie
sécrétant des Acs de très haute affinité et d'isotypes variés et vont se localiser dans la
moelle osseuse (figure 1.4)20. Ces Acs sont responsables de l'élimination des envahisseurs
et du maintien à long terme de la concentration sérique d'Acs21'22. Il est possible de les
différencier des autres populations de lymphocytes B par l'expression du récepteur CD 138.
Plasmocytes à
longue vie
Figure 1.4 : La réaction des centres germinatifs
Tiré de McHeyzer-Williams et al.20
1.2.4 Rôle des TLR dans l'activation des lymphocytes B
Selon Charles Janeway Jr., dont les travaux sont principalement axés sur l'étude des
mécanismes de l'immunité innée, le bon fonctionnement du système immunitaire est basé
9
sur la différenciation entre le soi et le non-soi. L'immunité innée étant la première ligne de
défense du corps contre les infections, elle doit être en mesure de discriminer le soi du nonsoi en plus d'être variée, efficace et rapide5'23. Pour ce faire, l'immunité innée repose sur
l'action de plusieurs familles de récepteurs dont les séquences sont très conservées et qui
sont exprimés de façon ubiquitaire sur les cellules du système immunitaire. Ces récepteurs
sont regroupés sous le nom de PRRs pour «pattem
récognition receptors».
Ils
reconnaissent des séquences particulières au monde microbien et réunissent plusieurs types
de récepteurs différents de par leur structure et leur expression4'23. Parmi les PRRs, la
famille des Toll-like receptors (TLRs) est certainement la plus étudiée. Au total, 11 TLRs
ont été identifiés chez l'humain et chacun reconnaît des composants particuliers de la
surface des envahisseurs microbiens. Par exemple, le TLR2 reconnaît la flagelline alors
que le TLR4 reconnaît le lipopolysaccharide (LPS) faisant partie de la paroi des bactéries à
Gram-négatif.
D'autres TLRs peuvent être exprimés de façon intracellulaire et
reconnaissent des acides nucléiques propres au monde microbien comme le motif CpG
reconnu par le TLR924.
La panoplie d'Ags ainsi que la nature des structures reconnues par les TLRs portaient à
croire, lors de leur découverte, qu'ils avaient un rôle strictement dans l'immunité innée.
Cependant, de plus en plus d'études démontrent que les TLRs pourraient être impliqués
autant dans l'immunité acquise que dans l'immunité innée.
En fait, les TLRs, et
possiblement d'autres molécules de type PRRs, feraient le pont entre les deux types
d'immunité. Par exemple, les mécanismes enclenchés par la liaison des TLRs à différents
motifs antigéniques et la signalisation qui suit, permettent le bon fonctionnement de toute la
réponse immunitaire, autant innée qu'acquise3"5. De plus, certaines études portent à croire
que les TLRs pourraient être directement impliqués dans certains mécanismes de
l'immunité acquise comme, par exemple, l'activation des lymphocytes B naïfs et mémoires
25,26
Dans les années 1970, une équipe de chercheurs démontrait pour la première fois que le
LPS des bactéries à Gram-négatif comme Escherichia coli (E. coli) stimulait la
prolifération des lymphocytes B de souris ainsi que leur production d'Acs in vitro . Avec
la découverte du TLR4 , le récepteur du LPS, et de son expression sur les lymphocytes
B , cette étude effectuée il y a plus de 30 ans, vient appuyer l'idée que les TLRs pourraient
être impliqués dans l'activation des lymphocytes B et, par le fait même, jouer un rôle dans
l'immunité acquise. Par la suite, des études ont démontré le rôle essentiel du TLR4 dans la
réponse au LPS chez les lymphocytes B de souris ainsi que dans la réponse humorale en
général. Par exemple, d'après les travaux de Pasare et Medhzitov, les souris déficientes
pour le TLR4 ont une réponse humorale spécifique affaiblie ce qui démontre que la
stimulation des lymphocytes B de souris via le TLR4 est essentielle à l'obtention d'une
TA
réponse humorale spécifique optimale .
L'effet du LPS via son récepteur, le TLR4, chez les lymphocytes B de souris a été
démontré à maintes reprises et sous plusieurs conditions (autant in vivo qu'm vitro) 9'27'3 ' '.
Cependant, peu de données sont disponibles sur l'effet du LPS chez les lymphocytes B
humains. Cela peut s'expliquer par le fait que les lymphocytes B humains n'expriment que
9S
très faiblement le TLR4 . De plus, selon les résultats obtenus suite aux travaux de Dasari
et ses collaborateurs, seulement 8 à 15% des lymphocytes B humains isolés du sang
périphérique expriment le TLR4, ce qui suggère qu'une sous-population de lymphocytes B
exprime ce récepteur.
Par contre, selon les auteurs, il est possible que, suite à leur
activation, les lymphocytes B humains puissent augmenter cette expression mais aucune
donnée n'a été recueillie jusqu'à maintenant sur cette possibilité .
Si on considère le fait qu'une sous-population de lymphocytes B seulement exprime le
TLR4,
une autre étude, publiée par Lanzavecchia et ses collaborateurs, devient très
intéressante à considérer. Cette étude présente les différences majeures entre l'activation
des lymphocytes B naïfs et des lymphocytes B mémoires ainsi que l'expression et les rôles
différents des TLRs selon la population de lymphocytes B 5. En effet, ils démontrent que
les lymphocytes B naïfs n'expriment pas constitutivement les TLRs mais ont la capacité
d'augmenter l'expression de certains de ces TLRs en présence d'un agoniste alors que les
lymphocytes B mémoires expriment plusieurs TLRs de façon constitutive. Ces résultats
pourraient expliquer pourquoi seulement 8 à 15% des lyB isolés du sang périphérique
expriment le TLR4.
Ces lymphocytes B pourraient être surtout des lymphocytes B
11
mémoires et cela suggère que ces cellules (mémoires) pourraient être plus sensibles à la
présence d'un activateur des TLRs, comme le CpG ou le LPS. De plus, cela conférerait
une fonction importante aux TLRs dans les mécanismes de l'immunité acquise en activant
la réponse secondaire impliquant les lymphocytes B mémoires.
D'autres recherches publiées par le groupe de Lanzavecchia en 2002, montrent que
l'agoniste du TLR9, le CpG, est impliqué dans l'activation TI des lyB humains32. Suite à la
liaison entre le TLR9 et son ligand, les lymphocytes B mémoires se différencient
rapidement en plasmocytes et sécrètent de grande quantités d'Acs ce qui permet de
maintenir la mémoire sérologique d'un individu durant toute sa vie. Ainsi, il est logique de
penser que les lymphocytes B mémoires seraient la population de lymphocytes B la plus
susceptible de répondre suite à la liaison des TLRs à leurs ligands.
Leur étude va
cependant beaucoup plus loin. Elle suggère que les lymphocytes B mémoires du sang
périphérique ont la capacité de s'activer et de se différencier en plasmocytes sans la liaison
'l'y
de leur BCR, c'est-à-dire en absence de leur Ag spécifique .
Les lymphocytes B
mémoires peuvent donc être activés par des activateurs polyclonaux qui se lient
particulièrement aux TLRs. Cette découverte est un indice concernant la possibilité que les
lymphocytes B puissent peut-être répondre au LPS mais d'une façon indépendante de la
présence d'un Ag.
Plus récemment, l'équipe de Lanzavecchia a publié sa vision de l'implication des TLRs
dans l'activation des lymphocytes B26. Selon eux, la signalisation suite à la liaison des
TLRs à la surface des lymphocytes B servirait de 3 e signal essentiel d'activation des
lymphocytes B. L'importance de ce signal rejoindrait celle de la liaison du BCR à son Ag
ainsi que la liaison CD40-CD154 (voir section 1.2.2).
1.2.5 Les Anticorps : structure et fonctions
1.2.5.1 Structure
Les Acs sécrétés par les lymphocytes B sont les molécules effectrices de la réponse
immunitaire humorale en se liant à l'Ag.
Chaque Ac a une spécificité unique ce qui
12
signifie une structure unique dans les régions reconnaissant l'Ag. Cependant, leur structure
générale est semblable. Chaque Ac est composé de deux chaînes lourdes (H) et deux
chaînes légères (L) identiques entre elles . Chaque chaîne légère a un poids moléculaire
d'environ 25 kDa tandis que les chaînes lourdes ont un poids moléculaire variant de 50 à 75
kDa selon l'isotype de l'Ac. Chaque chaîne est séparée en deux régions : une région
constante (C) et une région variable (V). Ce sont les régions V qui sont visées lors des
réarrangements de gènes se produisant dans les premiers stades de développement des
lymphocytes B (voir section 1.2.3) . Les régions constantes d'un même isotype d'Ac sont,
pour leur part, peu variables et très similaires d'un Ac à l'autre. Les Acs ont également
deux régions fonctionnelles soit le fragment Fc et le fragment F(ab). La portion Fc contient
des sites de liaison pour le complément et peut également être reconnue par les récepteurs
Fc exprimés par plusieurs types cellulaires et activer ces cellules. La portion F(ab) est celle
qui se lie à l'Ag et où sont concentrées les régions variables (figure 1.5)14' .
Région
variable
Portion
' F(ab)
Portion Fc
Figure 1.5 : Structure générale d'un Ac
Tiré de Saunders et al4
1.2.5.2 Fonctions
Les Acs contribuent à la défense de l'organisme de trois façons. Premièrement, ils peuvent
se lier à l'Ag et le neutraliser, l'empêchant ainsi d'activer d'autres types cellulaires.
Deuxièmement, ils peuvent recouvrir entièrement l'Ag, un phénomène appelé opsonisation,
et mener à sa phagocytose par les neutrophiles et les macrophages. Finalement, la liaison
13
d'un Ac sur son Ag cible peut mener à l'activation du complément. Le complément induit
une série d'événements conduisant à la destruction de l'Ag ' .
On retrouve cinq classes ou isotypes d'Acs : IgG, IgA, IgM, IgD et IgE. Chaque isotype
est déterminé par la composition de la région constante de la chaîne lourde et confère une
activité biologique et une distribution différentes à chacun. Les IgM sont les premiers Acs
produits lors de l'initiation de la réponse immunitaire et représentent 5 à 10% des Acs
sériques totaux113. En revanche, ils sont plutôt de faible affinité.
Cependant, cela est
compensé par le fait que les IgM sont majoritairement sécrétés sous forme de pentamères.
Comme la structure pentamérique des IgM est relativement grosse, ces Acs se retrouvent
surtout dans le sang et la lymphe et activent, entre autres, le complément lorsque liés à un
Ag.
Les IgG sont très abondants dans le sérum (10-15 mg/ml) et les fluides extracellulaires et
représentent environ 80% des Acs sériques totaux3. Ils ont plusieurs fonctions mais ils sont
principalement impliqués dans l'activation du complément et dans l'opsonisation des Ags.
Quatre sous-classes d'IgG ont été identifiées et chacune de ces sous-classes a des structures
et des fonctions légèrement différentes. Par exemple, les IgG3 sont les plus efficaces pour
activer le complément alors que les IgÛ4 en sont incapables. De plus, la concentration
sérique diffère d'une sous-classe à l'autre.
Les IgA représentent environ 15% des Acs sériques et se divisent en deux sous-classes :
IgAi et IgA213.Leur fonction majeure est la neutralisation des pathogènes. Ils sont sécrétés
régulièrement sous forme de dimères et sont majoritaires dans les muqueuses et les
sécrétions comme les larmes et la salive.
Finalement, les classes d'Acs retrouvés en plus faibles concentrations sériques sont les IgE
(0,3mg/ml) et les IgD (0,03mg/ml)3. Les IgE sont surtout impliqués dans les réponses anti­
parasitaires et jouent un rôle particulièrement dans l'allergie. Leur portion Fc peut être
fixée par les récepteurs Fce exprimés à la surface des mastocytes ce qui amène à leur
dégranulation et à la libération de médiateurs chimiques comme l'histamine et les
prostaglandines qui donnent lieu à une réaction inflammatoire importante . Les IgD sont,
quant à eux, très peu sécrétés. Ils se retrouvent plutôt à la surface des lymphocytes B naïfs
conjointement avec les IgM. Leurs fonctions combinent la liaison à l'Ag et l'induction de
la différenciation des lymphocytes B1.
1.2.5.3 Applications thérapeutiques des Acs
Des préparations thérapeutiques d'Acs sont disponibles sur le marché afin de traiter
différentes maladies du système immunitaire.
Par exemple, les Acs pour injection
intraveineuse (IglV) isolés du plasma de plusieurs milliers d'individus sont utilisés comme
source d'IgG chez des patients souffrant d'immunodéfïciences primaires ou secondaires et
pour le traitement de plusieurs maladies autoimmunes35. Par contre, les mécanismes par
lesquels les IglV produisent des effets anti-inflammatoires dans le traitement de maladies
autoimmunes sont encore très peu caractérisés.
D'autres préparations sont également disponibles mais à titre prophylactique plutôt que
thérapeutique.
C'est le cas des préparations hyperimmunes d'Acs humains.
Ces
préparations sont fabriquées présentement grâce au plasma d'individus hyperimmunisés
contre un Ag d'intérêt. Par exemple, des préparations d'Acs spécifiques sont disponibles
pour prévenir une infection suite à un contact avec l'agent causant la rage, le tétanos,
l'hépatite ou le botulisme où elles sont administrées en même temps que le vaccin. Elles
permettent de donner une première ligne de défense passive contre l'envahisseur. Pour
certaines maladies, l'immunisation passive est le meilleur traitement actuellement
disponible3.
1.3 Production in vitro d'anticorps humains
La préparation d'Acs humains à partir de plasma est toujours exposée à des risques de
pénurie. C'est la raison pour laquelle des techniques de production d'Ac in vitro ont été
développées. Parmi celles-ci, on retrouve la fusion cellulaire entre les lymphocytes B
humains et un partenaire de fusion myéloïde et l'utilisation d'un système de culture in vitro.
15
1.3.1 Fusion cellulaire
En 1975, Kôhler et Milstein ont mis au point la technique encore utilisée de nos jours afin
de produire des Acs monoclonaux in vitro36. Les hybridomes, obtenus suite à la fusion
d'un lymphocyte B avec une cellule de myélome, ont la capacité de proliférer indéfiniment
et de sécréter des Acs de spécificité unique. La technique est grandement utilisée, à des fins
thérapeutiques, pour produire des Acs spécifiques à certaines molécules cibles.
Par
exemple, dans certains cas de lymphome de lymphocyte B, un Ac monoclonal
reconnaissant la molécule CD20 exprimée par les lymphocytes B peut être utilisé . Ce
produit permet d'éliminer les lymphocytes B incluant ceux potentiellement cancéreux. En
maîtrisant cette technique, il est possible de produire des Acs de spécificité très variée selon
la spécificité des lymphocytes B utilisés pour la fusion. Par contre, cette technique est
moins efficace avec des lymphocytes B humains qu'avec des lymphocytes B murins38.
1.3.2 Système de culture CD40-CD154
Les travaux de Jacques Banchereau sur l'activation des lymphocytes B via la molécule
CD40 ont mené au développement d'un système permettant de mimer l'interaction entre un
lymphocyte B et un lymphocyte T et, ainsi, maintenir les lymphocytes B en culture à long
terme39. Ce système a été adapté et amélioré dans nos laboratoires et a mené à la mise au
point du système CD40-CD154.
Une lignée de fibroblastes murins, les L929, a été
transfectée avec l'ADNc du CD 154 murin pour donner naissance à la lignée L4.540. Les
cellules L4.5 expriment constitutivement la molécule CD154 ce qui permet d'activer les
lymphocytes B via leur CD40 et de les maintenir en culture à long terme.
Les cellules L4.5 peuvent être utilisées à différents ratios L4.5 : lymphocyte B afin de
favoriser la prolifération ou la sécrétion d'Acs. Par exemple, un ratio L4.5 : lymphocyte B
de 1 : 3 stimule fortement la prolifération des lymphocytes B en culture. Par contre, un
ratio L4.5 : lymphocyte B plus faible de 1 : 25 permet une plus grande différenciation des
lymphocytes B en plasmocytes et, par le fait même, une plus grande sécrétion d'Acs .
16
Figure 1.6 : Système de culture CD40-CD154
Schéma fourni par Dr Sonia Néron, Héma-Québec
Afin de favoriser la prolifération et la sécrétion des lymphocytes B, le milieu de culture
utilisé est supplémenté de cytokines. Par exemple, l'IL-4 stimule fortement la prolifération
des lymphocytes B et ce, à long terme39. L'IL-4 induit également la commutation de classe
des Acs sécrétés par les lymphocytes B. Pour sa part, l'IL-2 stimule l'activation des
lymphocytes B tandis que PIL-10 stimule fortement la sécrétion d'Acs d'isotype IgG et
IgA ' . La combinaison de ces trois cytokines permet une plus grande sécrétion d'Acs de
différents isotypes.
De plus, les travaux de Fecteau et Néron ont montré que les
lymphocytes B naïfs et mémoires ne se développent pas de la même façon dans le système
CD40-CD15441. En effet, dans les conditions de culture à plus forte stimulation du CD40
(ratio L4.5 : lymphocyte B de 1 : 3 et présence d'IL-4) les lymphocytes B se différencient
rapidement en plasmocytes dans les 5 premiers jours de la culture et sécrètent de grandes
quantités d'Acs. Les lymphocytes B naïfs, pour leur part, se différencient et sécrètent des
Acs à plus long terme soit vers le jour 14 de la culture. Afin de favoriser la prolifération
des lymphocytes B mémoires, le ratio de molécules CD 154 disponibles doit être plus faible
soit un ratio L4.5 : lymphocyte B de 1 : 25 ou environ 1000 molécules de CD154 par
lymphocyte B.
Malgré le fait que ce système permette l'expansion des lymphocytes B humains in vitro, il
y a toujours une limite dans la quantité de cellules obtenues après 2 à 3 semaines de culture,
17
période après laquelle les cellules commencent à afficher une viabilité réduite. En fait, il
n'est présentement pas possible d'obtenir suffisamment de lymphocytes B humains pour
produire les grandes quantités d'Acs nécessaires à la production de préparations
thérapeutiques.
C'est pourquoi d'autres stratégies pour stimuler la prolifération et la
sécrétion des lymphocytes B doivent être envisagées.
1.4 Problématique et objectifs du projet de maîtrise
Le présent projet de maîtrise consiste principalement à développer une façon d'enrichir et
de favoriser la prolifération et la sécrétion des lymphocytes B spécifiques à un Ag. Ainsi,
les préparations hyperimmunes pourraient être fabriquées in vitro et ne dépendraient plus
de la disponibilité d'individus immunisés. De plus, il pourrait être possible de produire des
préparations possédant des variétés de spécificités contre des agents pathogènes pour
lesquels des participants ne pourraient pas être immunisés volontairement.
Plusieurs
avenues ont été envisagées depuis la mise en place de ce projet de recherche afin
d'augmenter la proportion de cellules spécifiques dans les cultures en utilisant le système
CD40-CD154. L'utilisation de la sélection magnétique a déjà permis d'enrichir d'environ
200 fois les lymphocytes B spécifiques à la TT et de plus de 500 fois les lymphocytes B
spécifiques à l'HBsAg. De plus, la culture de ces cellules spécifiques enrichies dans le
système CD40-CD154 a permis d'obtenir une sécrétion d'Ac spécifiques supérieure à la
condition contrôle non enrichie ce qui démontre que les lymphocytes B spécifiques ont la
capacité de survivre in vitro44. Malgré cela, la proportion d'Acs spécifiques au TT ou à
l'HBsAg produits en culture ne dépasse pas 5% des Ac totaux sécrétés et la proportion de
lymphocytes B spécifiques demeure très faible, soit autour de 2-3%. Il est donc évident
qu'il faut trouver une autre façon d'enrichir les lymphocytes B spécifiques afin d'obtenir
des quantités supérieures d'Acs spécifiques.
Le défi se situe au niveau de la proportion de lymphocytes B spécifiques à un Ag
disponible dans le sang périphérique, notre source de lymphocytes B. Cette proportion est
de moins de 0,1% chez une personne non immunisée contre l'Ag d'intérêt et de moins de
1% chez une personne immunisée45. Le défi est donc de débuter avec ces faibles quantités
18
de cellules spécifiques et de trouver une façon de stimuler préférentiellement leur
prolifération en culture et, par la suite, de les pousser à sécréter de grandes quantités d'Acs
très spécifiques. Les objectifs de ce projet mettent l'emphase, bien sûr, sur la sécrétion des
lymphocytes B mais également sur leur prolifération dans l'optique où une plus grande
quantité de cellules spécifiques permettra de produire plus d'Acs spécifiques.
Les avenues envisagées étaient, au départ, nombreuses mais seulement deux de ces avenues
ont été étudiées. La première implique l'effet du LPS sur les lymphocytes B humains
cultivés in vitro. Comme mentionné à la section 1.2.4, les travaux de Pasare et Medhzitov
ont démontré que les souris déficientes pour le TLR4 avaient une réponse humorale
spécifique affaiblie ce qui démontre que la stimulation des lymphocytes B de souris via le
TLR4 est essentielle à l'obtention d'une réponse spécifique optimale30. Également, il
semble possible que les TLRs soient impliqués dans la réponse acquise et dans l'activation
des lymphocytes B (voir section 1.2.4). En combinant ces données, nous pensons donc que
l'ajout de LPS, un agoniste du TLR4, dans les cultures de lymphocytes B pourrait
permettre de stimuler la sécrétion d'Acs spécifiques de façon optimale. Nous avons utilisé
les modèles antigéniques du TT et de l'HBsAg afin d'étudier cette hypothèse.
La deuxième avenue s'inscrit dans le cadre d'une étude effectuée conjointement avec
l'équipe du Dr. Daniel Jung, scientifique à Héma-Québec, et consiste à évaluer l'effet du
transfert de gènes dans les lymphocytes B humains. Plus précisément, nous avons étudié
l'effet du gène antigène grand T (AgT) du virus SV40. Ce gène est impliqué dans
l'initiation de la transcription chez le virus SV4Û et aussi le maintien de la cellule hôte en
phase active du cycle cellulaire46. De plus, les travaux de Pasqualini et ses collaborateurs
ont permis de produire des lymphocytes B de souris capables de proliférer et de sécréter à
très long terme de grandes quantités d'Acs spécifiques à un Ag et ce, en exprimant le gène
AgT dans ces cellules47. Un vecteur adénoviral, Ad5/F35, a donc été utilisé afin d'effectuer
le transfert du gène AgT dans les lymphocytes B humains cultivés in vitro dans le système
CD40-CD154 décrit à la section 1.3.248.
L'hypothèse est que l'AgT permettra aux
lymphocytes B de proliférer en absence de signaux de stimulation (CD 154 et cytokines), un
peu comme les lignées cellulaires de lymphocytes B mais, sans la transformation de leur
19
bagage génétique par fusion cellulaire (hybridomes). Ainsi, le maintien des lymphocytes B
spécifiques en prolifération exponentielle pendant une longue période de temps permettrait
de produire de plus grandes quantités d'Acs spécifiques. Éventuellement, les lymphocytes
B de spécificité désirée pourraient être sélectionnés après leur expansion massive et
immortalisés afin de créer une source permanente d'Acs.
2. Matériel et Méthodes
2.1 Isolement des cellules
2.1.1 Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique
Les cellules mononucléées du sans périphérique (PBMC) provenaient toutes du sang de
participants ayant signé un consentement éclairé. Deux types de prélèvement ont été
utilisés lors de ce projet. Premièrement, le prélèvement classique du sang dans des tubes
héparinés de 10 ml. Deuxièmement, des donneurs de plaquettes par thrombaphérèse ont été
sollicités. Le sang prélevé de ces participants passe dans une chambre de déleucocytation
afin d'éliminer les leucocytes pour ne conserver que les plaquettes. Ces chambres, qui ne
sont pas utilisées pour la préparation clinique de produits sanguins, nous permettent de
récupérer une quantité beaucoup plus élevée de PBMC que la méthode classique de
prélèvement de sang49.
Cependant, à partir de l'arrivée des échantillons de sang au
laboratoire, la méthode d'isolement des PBMC était identique pour les deux types de
prélèvement.
Le sang ou la suspension cellulaire récupérée des chambres de déleucocytation, dilué 1 :1
dans du PBS (Invitrogen, Burlington, Canada) contenant 2g/l de glucose (Sigma, Oakville,
Canada) (PBS-Glucose), était déposé sur un coussin de Ficoll-Paque (GE Heathcare,
Mississauga, Canada) et centrifugé à 500g pendant 30 minutes sans les freins (Beckman
GS-6, Beckman Coulter inc, Mississauga, Canada).
Les PBMC étaient récoltées à
l'interface Ficoll/plasma, lavées dans du PBS-glucose contenant 10% (v/v) d'anticoagulant
citrate-dextrose (Baxter, McGraw, IL) et comptées en présence d'acide acétique 3% afin de
faire éclater les globules rouges pouvant s'être infiltrés dans la suspension de PBMC. La
suspension cellulaire était ensuite centrifugée à 1000g pendant 6 minutes et le culot était
resuspendu dans un milieu de congélation composé d'IMDM (Invitrogen) contenant 10%
de diméthylsulfoxide (Sigma) et 40% de sérum bovin foetal (SBF) (Invitrogen).
21
2.1.2 Isolement des lymphocytes B
La technologie Stemsep™ (StemCell Technologies, Vancouver, Canada) a été utilisée pour
l'isolement des lymphocytes B soit la trousse Human B cell Enrichment Kit. Brièvement,
les PBMC étaient incubées durant 15 minutes à la température de la pièce (TP) avec un
cocktail d'Acs bispécifiques ayant une spécificité pour des Ags présents à la surface des
cellules indésirées ainsi que pour du dextran.
Ensuite, une deuxième incubation de 15
minutes à TP était effectuée en présence d'une solution colloïdale de particules de fer
couplées à du dextran. Cette suspension cellulaire était ensuite passée sur la colonne
aimantée soumise à un champ magnétique pour ne récolter que les lymphocytes B dans la
solution de lavage. Grâce à cette technologie, la pureté des lymphocytes B récoltés était
toujours supérieure à 95%.
Figure 2.1 : Principe d'isolement des lymphocytes B par la technologie Stemsep
Tiré de http://www. stemcell. com/technical/14054 14064-PIS. pdf
Dans ce projet, des lymphocytes B de souris BALB/c femelles de type sauvage âgées de 6 à
8 semaines (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), ont également été utilisés et
isolés de la rate par la technologie StemSep™ en utilisant la trousse Mouse B cell
Enrichment Kit. Le principe d'isolement est le même avec une étape supplémentaire où les
cellules indésirables sont marquées avec un anticorps monoclonal couplé à la biotine.
22
Ensuite, la suspension est incubée avec le complexe tétramérique d'Acs bispécifiques pour
la biotine et le dextran. La suite de la procédure est identique à celle utilisée pour isoler les
lymphocytes B humains.
2.2 Culture de lymphocytes B dans le système CD40-CD154
2.2.1 Lignée cellulaire L4.5
Cette lignée a été obtenue suite à la transfection de l'ADNc de la molécule CD 154 dans des
fibroblastes de souris, les L92940. Les cellules L4.5 ont été cultivées dans du milieu IMDM
supplémenté de 5% de SBF et diluées à tous les 2-3 jours afin de conserver une bonne
confluence des cellules. Avant de les mettre en culture avec les lymphocytes B, les cellules
L4.5 étaient lavées deux fois avec du PBS-Glucose et décollées avec de la trypsine
(Invitrogen) pendant 1 minute à 37°C. La trypsination était arrêtée en ajoutant du milieu
IMDM-5%SBF. Ensuite, les cellules diluées à 2,5xl05 cellules/ml étaient irradiées à 7500
rads avec du Césium137 (GammaCell 1000 Élite, Nordion international, Kanata, Canada).
Les cellules L4.5 étaient ensemencées et incubées au moins 2 heures à 37°C avant l'ajout
des lymphocytes B.
2.2.2 Culture des lymphocytes B
Les lymphocytes B étaient ensemencés avec les cellules L4.5 à un ratio L4.5 : lymphocyte
B de 1 : 25 dans des plaques Primaria 6 puits (BD Biosciences, Mississauga, Canada) et
avec le milieu de base IMDM (Invitrogen) contenant 10% de SBF-ultra faible en IgG
(Invitrogen), 100 U/ml de pénicilline, 100 U/ml de streptomycine, 10 ug/ml d'insuline
humaine, 5 ug/ml de transferrine, 6 ng/ml de sélénium de sodium (Invitrogen), 50 U/ml
d'IL-2, 100 U/ml d'IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) et 50 ng/ml d'IL-10
(Peprotech, Rocky Hill. NJ). Les cellules L4.5 étaient renouvelées à tous les 4-5 jours et la
moitié du milieu de culture était remplacée à tous les 2-3 jours.
2.2.3 Mesure de la prolifération et de la viabilité cellulaire
Au jour choisi pour les analyses, un échantillon de cellules était prélevé et utilisé pour
évaluer le nombre et la viabilité des cellules par la méthode d'exclusion au bleu de Trypan.
Au moment du compte, les cellules étaient diluées dans du bleu de Trypan 0,4%
23
(Invitrogen) et comptées avec l'aide d'un hémacytomètre (Hausser Scientific, Horsham,
PA). Les comptes étaient effectués en triplicata tout en respectant un écart inférieur à 10%
entre les comptes.
2.3 Dosage des facteurs solubles dans les surnageants de culture de
lymphocytes B
2.3.1 Dosage des IgG totaux
La technique ELISA était utilisée pour tous les dosages dans les surnageants de culture de
lymphocytes B. Des plaques à 96 puits Immulon à fond rond (Dynatech Laboratories,
Alexandria, VA) étaient adsorbées avec un anticorps polyclonal de chèvre spécifique à la
région Fc des IgG humains (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) en
solution à 2,5 u.g/ml dans du tampon carbonate 100 raM à pH 9.7 pendant 1 heure à 37°C.
Les plaques étaient lavées 6 fois avec une solution de PBS contenant 0,05% de Tween 20
(PBS-Tw). Les plaques étaient ensuite bloquées avec une solution de PBS contenant 1% de
caséine, 1% de thimérosal et 0,05% de Tween 20 (PBS-Cas-Tw) pendant 1 heure à 37°C.
Une courbe standard, de 0 à 50 ng/ml pour les IgG était effectuée avec des IgG de sérum
calibré (The Binding Site, Birmingham, Royaume-Uni). Les échantillons standards étaient
ajoutés et incubés en même temps que les échantillons testés pendant 1 heure à 37°C. La
présence d'IgG était révélée en ajoutant un anticorps polyclonal de chèvre couplé à la
peroxydase et spécifique pour les molécules entière d'IgG,M,A humaines (Jackson
Immuno Research Laboratories) dilué 1/20 000 dans la solution de PBS-Cas-Tw et en
incubant pendant 1 heure à 37°C. Suite à des lavages, la détection des IgG était effectuée
en ajoutant un substrat de la peroxydase, le tétraméthylbenzidine (TMB), (Scytek
Laboratories, Logan, UT) comme agent chromogène. Après 15-20 minutes, la réaction
était arrêtée par l'ajout d'FL-SC^ IN et les plaques étaient lues avec un lecteur de plaques à
une densité optique de 450nm (MRX 386-4RD, Dynatech Laboratories) avec une référence
à 630nm.
Tous les lavages étaient effectués de la même façon à l'aide d'un laveur de
plaques (Elx-405, Bio-Tek instruments inc, Winooski, VT).
échantillons et la courbe standard était toujours du PBS-Cas-Tw.
Le diluant pour les
24
2.3.2 Dosages des IgG spécifiques au tétanos ou à l'hépatite B
Un ELISA était effectué afin de détecter la présence d'Acs spécifiques à la TT (EMD
Biosciences Inc, San Diego, CA) ou à l'HBsAg (généreusement fourni par le Dr. Alan
Shaw, Merck Research Laboratories, West Point, PA). La technique est la même pour les
deux Ags et est similaire à celle décrite à la section 2.3.1 avec les modifications suivantes.
La TT ou l'HBsAg était adsorbé au fond des plaques à une concentration de 2,5 jag/ml dans
du tampon carbonate 100 mM à pH 9.7. Les solutions bloquantes et diluantes étaient les
mêmes que celles décrites à la section 2.3.1. La révélation était effectuée en utilisant un
anticorps polyclonal de chèvre couplé à la peroxydase et spécifique pour le fragment Fc de
l'IgG humain (Jackson Immuno Research Laboratories). La lecture des résultats étaient
effectuées de façon identique à la section 2.3.1. Cependant, en absence de courbe standard,
les résultats obtenus n'étaient pas exprimés en concentration comme pour les IgG totaux
mais en lecture de D.O. seulement.
2.3.4 Évaluation de la polyréactivité des Acs
Afin de mesurer la polyréactivité des IgG sécrétés par les lymphocytes B et leur réactivité
contre le LPS, un ELISA sur différents Ags a été effectué. Les Ags testés étaient tous
adsorbés au fond des puits à une concentration de 10 u.g/ml dans du tampon carbonate 100
mM à pH 9.7. L'actine (boeuf), la transferrine (boeuf), le KLH (mollusque), le LPS (E.
coli 026 :B6) la fibronectine humaine et le fragment F(ab)'2 des IgG murins et humains
provenaient de la compagnie Sigma tandis que la ferritine humaine et la caséine de boeuf
étaient de la compagnie EMD (EMD Biosciences). Cette fois-ci, la solution bloquante était
du PBS contenant 0,05% de Tween 20 et 5% d'albumine de sérum de boeuf (BSA) alors
que la solution diluante était du PBS contenant 0,05% de Tween 20 et 1% de BSA. Le
reste de la procédure était identique à celle décrite à la section 2.3.1.
2.3.5 Dosage de l'IL-6 par ELISA
La trousse Human IL-6 ELISA Development Kit de la compagnie Peprotech contenant un
tandem d'Acs anti-IL-6 humain ainsi qu'un standard d'IL-6 humain recombinant a été
utilisée.
Le protocole était fourni par le fabricant et a été utilisé avec quelques
modifications50. Brièvement, afin de minimiser le bruit de fond, les solutions bloquantes et
25
diluantes ainsi que le substrat du fabricant ont été remplacées par celles décrites dans la
section 2.3.1.
Les incubations recommandées par le fabricant ont été respectées et
l'incubation avec le substrat était de 20 minutes. Contrairement aux dosages précédents,
des plaques Immulon à 96 puits à fond plat (Dynatech Laboratories) ont été utilisées. Tous
les lavages ont également été effectués avec le laveur de plaques et les résultats lus avec le
lecteur de plaques ELISA à une densité optique de 450nm avec une référence à 630 nm.
2.4 Cytométrie en flux : Évaluation de l'expression des marqueurs de
surface
Au jour déterminé pour l'analyse, les cellules étaient prélevées et lavées dans du PBSGlucose puis centrifugées à 1000g (Beckman GS-6) pendant 6 minutes. Les cellules
étaient resuspendues dans une solution de PBS contenant 1% de SBF et 0,01% de NaN3
puis distribuées dans des tubes de cytométrie de 5 ml (BD Biosciences). Les Acs couplés à
des fluorochromes étaient ajoutés à une concentration de 5 ul d'Ac par million de cellules
et les suspensions étaient incubées sur glace pendant 15 minutes. Ensuite, elles étaient
centrifugées à 500g pendant 5 minutes (Immufuge Dade, Miami, FL) et fixées dans la
paraformaldéhyde 2%. Au moment de l'analyse, les cellules étaient passées dans un
FACSCalibur et le logiciel CellQuest (BD Biosciences) était utilisé pour la collecte des
résultats. L'anti-CD19 couplé à la Peridine Chlorophylle-a protein complex Cyanine 5.5
(PerCP Cy5.5), l'anti-CD27 couplé à la phycoerythrine (PE), l'anti-CD45 couplé à
l'allophycocyanine (APC), l'anti-IgG couplé à la fluorescéine isothiocyanate (FITC), l'antiIgM couplé à l'APC, l'anti-CD138 couplé au PE ainsi que l'anti-CD38 couplé au FITC et à
l'APC provenaient de la compagnie BD Biosciences. Seul l'anti-TLR4 couplé à l'APC
était de la compagnie eBiosciences (eBiosciences, San Diego, CA). Lorsque le complexe
LPS-AlexaFluor 488 de la compagnie Sigma était utilisé, la méthode de marquage des
cellules était identique à celle décrite plus haut.
26
2.5 Etude de l'effet du LPS sur l'expression de cytokines par les
lymphocytes B humains
2.5.1 Préparation de lysats cellulaires
Afin d'évaluer l'effet du LPS sur l'expression de gènes de cytokines et de chimiokines, les
lymphocytes B isolés du sang étaient mis en culture, pendant un temps déterminé selon
l'expérience, en présence de 20 |ag/ml de LPS de E. coli de sérotype 026 :B6 (Sigma). Le
même traitement a été testé sur huit lignées cellulaires de lymphocytes B soit les lignées
DB, Daudi, Pfeiffer, Raji, Ramos, RPMI, SKW6.4 et SupB15, toutes obtenues de
l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA).
Chaque culture de
5
lymphocytes B et chaque lignée étaient ensemencées à 2,5x10 cellules/mL soit dans une
plaque Primaria à 6 puits (lymphocytes B), soit dans un flacon T-25cm2 (lignées
cellulaires). À différents temps après la culture à 37°C et 10% de CO2, les cellules étaient
récoltées, lavées dans du PBS-Glucose puis resuspendues dans 400 ul du tampon de lyse
additionné de P-mercaptoéthanol avant de procéder à l'extraction de l'ARN total. Le
tampon de lyse utilisé provenait de la trousse pour l'extraction de l'ARN de la compagnie
Stratagene (Absolutely RNA Purification Kit, Stratagene, La Jolla, CA). Le lysat était
congelé à -80°C jusqu'à son utilisation et sa transformation en ADNc (voir section 2.5.2).
2.5.2 Préparation d'ARN et d'ADN complémentaire (ADNc) de lymphocytes B
normaux et de lignées cellulaires
Au moment choisi, l'ARN total était extrait des cellules à l'aide de la trousse Absolutely
RNA Purification Kit (Stratagene) puis dosé à l'aide du spectrophotomètre Nanodrop ND1000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) tout en s'assurant que la pureté était
adéquate (rapport A260/A280 >2,00). L'ADN pouvant contaminer le produit était éliminé
lors d'un traitement à l'ADNase exempte d'ARNase (Invitrogen) pendant 15 minutes à TP.
Finalement, de l'ADNc était fabriqué pendant 1 heure à 37°C à partir de 2 ug d'ARN total
à l'aide de la transcriptase inverse recombinante M-MLV (Moloney Murine leukemia
virus) de la compagnie Invitrogen selon les instructions du fabricant.
conservé à -20°C jusqu'à son utilisation.
Le produit était
27
2.5.3 PCR quantitatif en temps réel
Suite à la préparation de l'ADNc à partir d'un extrait d'ARN total tel que décrit à la section
précédente, un PCR quantitatif en temps réel (QPCR) était effectué afin de mesurer le
niveau relatif d'expression de certains gènes. Le QPCR utilise le procédé de la réaction de
polymérase en chaîne (PCR) traditionnel mais en exploitant le potentiel de la molécule
SYBRGreen.
Cette molécule se lie à l'ADN double brin nouvellement formé par la
réaction PCR et émet de la fluorescence sous un rayonnement UV. Ainsi, plus le gène est
exprimé dans l'échantillon au départ, plus le produit d'amplification sera important et plus
il y aura de fluorescence détectée lors de la réaction PCR. Bref, cette technique nous
permet de mesurer quantitativement des niveaux d'expression de gènes dans les cellules et,
ainsi, d'évaluer l'effet des différentes conditions de culture ou des différents traitements
utilisés lors de l'expérimentation.
Dans nos essais sur l'effet du LPS sur les lymphocytes B humains, le mélange réactionnel
RT2 SYBRGreen Master Mix incluant l'enzyme Taq, les nucléotides et la molécule
SYBRGreen provenait de la compagnie SuperArray (SuperArray Bioscience Corporation,
Frederick, MD). Les gènes de contrôles internes utilisés étaient la GAPDH et YHPRT selon
l'expérience. Chaque réaction était effectuée selon les indications des fabricants et les
résultats étaient lus à l'aide d'un thermocycleur en temps réel (Mx3005p, Stratagene) puis
analysés à l'aide du logiciel MxPro (Stratagene). Les niveaux d'expression étaient calculés
en utilisant la méthode comparative AACt51. Deux cytokines étaient étudiées chez les
lymphocytes B normaux et les lignées cellulaires soient 1TL-6 et 1TL-10. Les paires
d'amorces utilisées pour le QPCR provenaient de la compagnie SuperArray. Les amorces
étaient optimisées pour le QPCR ainsi que pour le mélange réactionnel de cette compagnie.
Lors des essais de détection de l'expression de l'AgT suite aux infections avec les virus, le
mélange réactionnel Full Velocity incluant l'enzyme Taq, les nucléotides et la molécule
SYBRGreen provenait de la compagnie Stratagene. Le gène de contrôle interne utilisé était
celui de la GAPDH. Les amorces avec les séquences suivantes ont été utilisées pour la
détection de l'AgT : amorce sens 5'-TTA ATT TGC CCT TGG ACA GG-3' et amorce
antisens 5'-CCT GCA GTG TTT TAG GCA CA-3' qui amplifient un fragment de 200 pb.
28
2.5.4 Cytokine arrays
Afin d'approfondir l'étude de l'effet du LPS sur l'expression de gènes chez les
lymphocytes B, nous avons utilisé la technique de « cytokine arrays » de la compagnie
SuperArray soit les plaques RT2 Profiler PCR array : Human Inflammatory Cytokines and
Receptors. Brièvement, des plaques de 96 puits étaient utilisées afin d'évaluer l'expression
de 84 gènes de cytokines, de chimiokines et de certains de leurs récepteurs impliqués dans
la réaction inflammatoire chez l'humain. Les réactions de QPCR étaient effectuées selon
les indications du fabricant.
2.6 Transfert du gène Antigène Grand T dans les lymphocytes B
2.6.1 Construction du vecteur adénoviral AD5/F35 exprimant l'AgT du virus SV40
La construction du vecteur adénoviral contenant l'AgT a été effectuée par l'équipe du Dr.
Daniel Jung dans nos laboratoires. Le gène AgT a été amplifié à partir d'un culot de
cellules COS-7 (ATCC), des fibroblastes de singe exprimant constitutivement ce gène, et
amplifié par PCR avec des amorces spécifiques aux extrémités codantes et contenant des
sites de restriction pour l'enzyme BglII. Le produit de PCR a ensuite été clone dans le
vecteur pGEM-T easy (Fisher Scientific Company, Ottawa, Canada) et transfecté dans des
cellules E. coli DH5a (QBiogene, Carlsbad, CA).
Les clones d' E. coli positifs pour la
bonne séquence d'AgT ont été clones une seconde fois dans le vecteur pcDNA3.1+
(Invitrogen) contenant le gène de résistance à l'hygromycine et les vecteurs recombinants
ont été insérés par clonage directionnel dans le vecteur pAdenovator-hCMVintron/PGKEYFP (QBiogene) contenant le promoteur humain du virus CMV suivi d'un court intron et
la cassette d'expression du gène de la molécule fluorescente EYFP accompagné de son
propre promoteur PGK.
La transcription du gène AgT était d'abord vérifiée en
transformant des cellules 293A (QBiogene) avec le vecteur pAdenovator-hCMVintronAgT/PGK-EYFP (figure 2.2) et ce, par transformation chimique en utilisant de la
lipofectamine (Invitrogen) et en effectuant un QPCR après 24 à 48 heures d'incubation à
37°C, 10% CO2. Par la suite, ce vecteur était transformé dans des cellules d'E. coli
recombinantes de souche BJ5183 (QBiogene) ayant préalablement été transformées avec
l'ADN du vecteur viral pAdEasy5/35 (QBiogene). Les doubles recombinants obtenus ont
29
été vérifiés par des digestions avec les enzymes Pacl et BstXI. Le plasmide recombinant
était finalement transféré dans des cellules 293A qui permettent la production de nouveaux
virus contenant le gène d'intérêt. Le virus était amplifié par plusieurs étapes d'infection de
cellules 293A jusqu'à l'obtention d'une bonne quantité de virus. Les virus obtenus étaient
ensuite purifiés sur gradient de chlorure de césium puis titrés et congelés à -80°C jusqu'à
leur utilisation.
Ad 5 LITR
Signal d'encapsidat ion
Gène de résistance à la Kanamycine
SV40PolyA
EcoRl(637)
Antigène grand T
Origine de réplication pBR322
Ad5RITR
Intron
EcoRI(2992)
Bars gauche
hCMV promoteur
EcoRI (3823)
EcoRI (4351)
Cassette PGK-EYFP
EcoRI (5194)
pAdenoVator-hCMV-Intron-AgT-PGK-EYFP
Figure 2.2 : Carte génomique du vecteur de transfert contenant le gène AgT et le gène
rapporteur EYFP
2.6.2 Infection des lymphocytes B avec les constructions virales contenant l'AgT
Les lymphocytes B humains cultivés dans le système CD40-CD154 pendant 10 jours
étaient infectés à une MOI de 500 particules virales par lymphocyte B. Les virus étaient
ajoutés directement dans le milieu de culture au jour choisi pour l'infection. À chaque
culture, la prolifération et la viabilité étaient évaluées par des comptes cellulaires au bleu
de trypan. De plus, l'expression du gène AgT était évaluée par QPCR (section 2.5.3) et
l'expression de la protéine AgT était évaluée par Western blot (section 2.6.3)
30
2.6.3. Détection de l'AgT par immunobuvardage (Western blot)
Afin de déterminer l'expression de la protéine AgT dans les lymphocytes B infectés avec
Fadénovirus/AgT, un Western blot était effectué. Tout d'abord, les cellules était lysées
pendant 30 minutes sur glace avec du tampon de lyse RIPA (100 ul/106cellules) contenant
1% de Nonidet P40, 1% de PBS, 0.1% de SDS, 0.5% de sodium déoxycholate en prenant
soin d'ajouter des inhibiteurs de protéases (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma) au mélange,
à raison de 100 ul/ml de lysat. La quantité d'échantillon à déposer sur gel d'acrylamide
était en fonction de la quantité de cellules, soit un volume provenant habituellement de
5xl0 5 cellules. Chaque échantillon de protéines était dénaturé dans un tampon dénaturant
contenant 150 mM de dithiothreitol, chauffé pendant 5 minutes à 95°C, centrifugé puis
déposé sur un gel d'électrophorèse à une concentration de 10% d'acrylamide tel que décrit
c'y
par Laemmli et al
. La migration se faisait durant environ 45 minutes à 200V. Après la
migration, les protéines étaient transférées sur une membrane de Polyvinylidene Fluoride
(PVDF) (Millipore, Billerica, MA) pendant 1 heure avec agitation à l'aide d'un système de
transfert Transblot (Bio-Rad, Mississauga, Canada) dans un tampon méthanol.
La
détection de la protéine AgT par Western blot débutait par un blocage des sites nonspécifiques de la membrane à 4°C pendant une nuit en utilisant une solution de tampon
saline-Tris (10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5) supplémenté de 0,1% de Tween 20
(TTBS) contenant 3% de gélatine de peau de poisson d'eau froide (Sigma) et 3% de BSA.
Le premier Ac, produit chez la souris et spécifique à l'AgT du virus SV40 (Biosciences
Inc.), était dilué à 1/200 dans la solution de blocage et incubé pendant 1 heure à TP avec
agitation.
La membrane était lavée 3 fois pendant 5 minutes avec du TTBS puis le
deuxième Ac, produit chez la chèvre et spécifique pour la région Fc de l'IgG de souris, était
couplé à la peroxydase et dilué 1/15 000 dans la solution de blocage.
L'incubation se
poursuivait pendant 1 heure à TP avec agitation. La membrane était lavée 3 fois pendant 5
minutes avec du TTBS avant de procéder à la révélation avec la solution
chemiluminescente ECL (GE Healthcare). La solution était déposée sur la membrane
pendant une minute puis la membrane enveloppée dans une pellicule de Saran Wrap et
déposée sur un film (GE Healthcare).
31
La même membrane PVDF sur laquelle a été effectué le Western blot de l'AgT était
utilisée pour détecter l'actine.
La membrane contenant les échantillons de protéines
transférées du gel d'électrophorèse était d'abord déshybridée pendant 30 minutes à TP avec
agitation dans un tampon de déshybridation (Restore Western blot Stripping Buffer,
PIERCE, Rockford, IL) afin de déloger les Acs précédemment utilisés lors de la détection
de l'AgT. Ensuite, la membrane était bloquée pendant une heure à TP dans la solution
bloquante également utilisée pour la détection de l'AgT. Le premier Ac, produit chez le
lapin et spécifique pour l'actine humaine (Sigma), était dilué 1/2000 et le deuxième Ac,
produit chez la chèvre et spécifique pour la molécule entière d'IgG de lapin, était couplé à
la peroxydase (Jackson Immuno Research Laboratories) et dilué 1/80 000. Les deux Acs
étaient dilués dans la solution bloquante et incubés pendant 1 heure à TP avec agitation. La
révélation s'effectuait tel que décrit au paragraphe précédent.
2.6.5 PCR traditionnel et séquençage
Afin de vérifier la qualité des amorces de QPCR pour la détection de l'ARNm de l'AgT
dans les lymphocytes B infectés avec les virus, un PCR traditionnel a dû être effectué en
utilisant l'enzyme polymérase Hot Start Phusion selon les indications du fabricant
(Finnzymes, Espoo, Finlande) et les mêmes amorces que celles décrites à la section 2.5.3.
Le produit d'amplification a été séquence par la plate-forme d'analyses moléculaires de
l'Université Laval située au pavillon Charles-Eugène Marchand.
32
3. Résultats
3.1 Etude de l'effet du LPS sur les lymphocytes B humains
Nos premiers essais visant à augmenter la production in vitro d'Acs humains ont fait appel
à l'ajout de LPS dans le but de stimuler les lymphocytes B via leur TLR4. Bien qu'aucun
effet mitogénique n'ait été rapporté pour le LPS sur les lymphocytes B humains,
contrairement aux lymphocytes B de souris, nous avons voulu évaluer l'effet du LPS sur la
prolifération et la sécrétion d'Acs par les lymphocytes B humains, dans le contexte du
système de culture CD40-CD154. Nous avons utilisé le sérotype d'£. coli 026 :B6 puisque
ce dernier était souvent utilisé dans les expériences impliquant les lymphocytes B murins
retrouvées dans la littérature.
3.1.1 Effet de l'ajout de LPS sur la prolifération des lymphocytes B humains
Tout d'abord, nous avons voulu déterminer la bonne concentration de LPS à utiliser dans
les cultures de lymphocytes B humains. Nous avons donc effectué une courbe doseréponse dans le système CD40-CD154 en ajoutant différentes concentrations de LPS allant
de 5 |xg/ml à 25 ug/ml. Après avoir effectué les analyses de la prolifération, de la viabilité
et de la sécrétion d'Acs totaux et spécifiques, nous avons remarqué que la sécrétion d'Acs
spécifiques à la TT et à l'HBsAg était supérieure en présence de 10 et de 20 ug/ml de LPS
(résultats non montrés). Dans la littérature, la majorité des équipes de recherche effectuant
des études sur l'effet du LPS sur des cultures de lymphocytes B murins utilisent une
concentration de 20 ug/ml. En combinant ces deux informations et en considérant que la
viabilité est meilleure à 20 ug/ml par rapport à 25 ug/ml, nous avons utilisé une
concentration de 20 ug/ml de LPS pour la suite des expériences.
Afin de continuer l'étude des effets du LPS sur la prolifération des lymphocytes B humains
cultivés en présence de LPS, les lymphocytes B humains purifiés ont été mis en culture
dans le système CD40-CD154 en présence ou en absence de LPS d'£. coli de sérotype
026 :B6 à une concentration de 20 ug/ml. Les résultats sont présentés à la figure 3.1 et
montrent que l'ajout de LPS ne semble pas stimuler la prolifération des lymphocytes B
33
humains dans le système CD40-CD154. La prolifération des lymphocytes B semble même
être ralentie lorsqu'il y a du LPS dans le milieu de culture.
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10
12
14
16
Temps (jours)
Figure 3.1 : Effet du LPS sur la prolifération des lymphocytes B humains cultivés
dans le système CD40-CD154
Les lymphocytes B humains ont été ensemencés à 2,5x105 cellules/ml puis cultivés pendant 14 jours avec un
ratio L4.5 : lymphocyte B de 1 :25 dans le milieu de culture IMDM additionné de 10% de SBF ainsi que d'
IL-2, d'IL-4 et d'IL-10. Les lymphocytes B ont été cultivés en présence (ligne pleine) ou en absence (ligne
pointillée) de LPS. Cette figure est représentative de 4 expériences effectuées à partir des lymphocytes B
purifiés de 3 participants différents.
Les barres d'erreurs représentent l'écart de 10% entre les comptes
cellulaires effectués en triplicata.
Selon ce résultat, il semble que les lymphocytes B humains seraient en mesure de répondre
au LPS mais de façon différente de ce qui est observé avec les lymphocytes B murins. Par
contre, les études ayant démontré que la prolifération des lymphocytes B murins était
fortement stimulée en présence de LPS avaient été faites dans un système de culture
différent du nôtre. Nous avons donc vérifié si les lymphopcytes B murins pouvaient être
stimulés par le LPS dans notre système de culture CD40-CD154. Des lymphocytes B de
souris isolés de la rate ont donc été mis en culture dans les mêmes conditions que celles
utilisées pour les lymphocytes B humains.
La figure 3.2 montre clairement que les
lymphocytes B murins répondent effectivement
très fortement
au LPS comme
préalablement décrit dans la littérature et ce, dans les conditions de culture utilisées pour les
lymphocytes B humains, avec une stimulation de l'expansion de 2 fois par rapport à la
34
condition en absence de LPS. Ces résultats suggèrent donc que les lymphocytes B humains
répondent différemment au LPS en comparaison avec les lymphocytes B murins.
s
s
S
a
"3
s
o
S
o
Z
Temps (jours)
Figure 3.2 : Effet du LPS sur la prolifération des lymphocytes B murins dans le
système CD40-CD154
Les lymphocytes B murins ont été isolés de la rate d'une souris, purifiés par sélection magnétique,
ensemencés à 2,5xl05 cellules/ml puis cultivés pendant 14 jours en présence d'un ratio L4.5 :lymphocyte B
de 1 :25 dans le milieu de culture IMDM additionné de 10% de SBF ainsi que d'IL-2, d'IL-4 et d'IL-10
humains. Les lymphocytes B ont été cultivés en présence (ligne pleine) ou en absence (ligne pointillée) de
LPS (n=l).
Les barres d'erreurs représentent l'écart de 10% entre les comptes cellulaires effectués en
triplicata.
Les travaux de l'équipe du Dr. Sonia Néron ont montré que la variation du signal CD40
influençait la prolifération et la sécrétion des différentes populations des lymphocytes B
humains. En effet, la quantité de molécules CD 154 disponibles peut changer le niveau
d'activation des lymphocytes B dans le système de culture43. Une plus grande quantité de
CD 154 disponible pour les lymphocytes B les stimule à proliférer massivement alors
qu'une plus faible quantité de CD 154 les stimule à se différencier en plasmocytes et ainsi, à
sécréter de plus grandes quantités d'Acs. Afin de déterminer si la quantité de molécules
CD 154 disponibles pouvait influencer la réponse des lymphocytes B au LPS, nous les
avons cultivés en présence de deux ratios différents de L4.5 : lymphocyte B soit celui
utilisé de routine pour ce projet, le ratio 1 :25, et un ratio plus élevé de cellules L4.5 soit le
ratio 1:3. La figure 3.3 montre qu'il y a effectivement une influence du signal CD154 sur
35
l'expansion des lymphocytes B, c'est-à-dire que les lymphocytes B proliféraient beaucoup
plus en présence d'une plus grande quantité de molécules CD154. Par contre, l'ajout de
LPS n'a pas eu d'effet positif sur la prolifération puisque, autant pour le ratio 1 : 3 que pour
le ratio 1 : 25, aucune stimulation de la prolifération n'a été observée. Il est important de
noter que la prolifération est ralentie en présence de LPS lorsque le ratio 1 : 25 est utilisé ce
qui est en accord avec les résultats obtenus à la figure 3.1. Cependant, on remarque que le
LPS n'influence pas la prolifération des lymphocytes B lorsque le ratio 1 : 3 est utilisé. Il y
a donc une influence de la force du signal CD 154 sur la réponse des lymphocytes B
humains au LPS.
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S
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0
Temps (jours)
Figure 3.3 : Effet du LPS sur la prolifération des lymphocytes B humains cultivés en
présence de différents ratios L4.5 : lymphocyte B
Les lymphocytes B ont été ensemencés à 2,5x105 cellules/ml puis cultivés pendant 14 jours dans le milieu de
culture IMDM additionné de 10% de SBF ainsi que d'IL-2, IL-4 et IL-10. Les lymphocytes B ont été cultivés
avec un ratio de L4.5 : lymphocyte B de 1 :3 (triangles) ou de 1 :25 (carrés) et en présence (symboles pleins)
ou en absence (symboles vides) de LPS (n=l). Les barres d'erreurs représentent l'écart de 10% entre les
comptes cellulaires effectués en triplicata.
3.1.2 Effet de l'ajout de LPS sur la sécrétion d'Acs par les lymphocytes B humains
Chacune des quatre cultures mentionnées à la figure 3.1 a été analysée pour la sécrétion
d'Acs. Les surnageants de culture au jour 10 ont été dosés par ELISA afin de déterminer la
quantité totale d'IgG sécrétés par les lymphocytes B dans les conditions utilisées. La
36
quantité totale a été divisée par le nombre de cellules comptées au jour 10 de la culture. Les
résultats représentatifs de 4 cultures sont montrés à la figure 3.4. La sécrétion totale d'IgG
n'est pas significativement différente en présence (8,2 |xg/106 cellules) ou en absence
(10 ug/lO6 cellules) de LPS, ce qui nous permet de conclure que le LPS n'influence pas la
sécrétion totale d'IgG. Les surnageants des jours 7 et 12 ont également été dosés pour la
sécrétion totale d'IgG, mais aucune différence notable n'a, encore une fois, été remarquée
entre les deux conditions (résultats non montrés).
12
]3
"3
s
U
•a
1m
6
Ml 4
Tl
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a
,
2
o
Temps (jours)
Figure 3.4 : Effet du LPS sur la sécrétion totale d'IgG par les lymphocytes B humains
Les surnageants de culture ont été dosés par ELISA au jour 10 de la culture. Les résultats sont représentatifs
de 4 cultures effectuées à partir des lymphocytes B purifiés de 3 participants différentes. Les lymphocytes B
ont été cultivés en présence ( H ) ou en absence <P ) de LPS.
Les mêmes cultures ont donc ensuite été utilisées afin de détecter les IgG spécifiques à la
TT et à l'HBsAg pouvant avoir été sécrétés par les lymphocytes B bien que ceux-ci n'aient
pas subi le processus de sélection visant à enrichir en cellules ayant cette spécificité. Il est à
noter que les lymphocytes B utilisés pour effectuer ces cultures proviennent de donneurs
qui avaient été sélectionnés pour la présence d'Acs anti-TT ou anti-HBsAg dans leur
plasma. On remarque que la présence de LPS semble influencer la sécrétion d'IgG
spécifiques à ces Ags. En effet, la sécrétion d'IgG spécifique à la TT et à l'HBsAg était
toujours supérieure en présence de LPS par rapport à la condition contrôle sans LPS
37
(tableau 3.1). Ce surprenant résultat s'est répété, avec une augmentation plus ou moins
prononcée, dans les 4 cultures analysées, indépendamment de la nature de l'Ag ce qui
suggère que certains lymphocytes B humains pouvaient effectivement réagir au LPS.
Tableau 3.1 : Effet du LPS sur la sécrétion d'IgG spécifiques à la TT et à l'HBsAg par
les lymphocytes B humains.
D.O. /106 cellules
D.O. /106 cellules
Ratio
(sans LPS)
(avec LPS)
+LPS/-LPS
A-203 (TT)*
0.411
1.59
3.9X
A-208 (TT)
0.041
0.141
3.4X
A-214 (HBsAg)
0.079
2.82
35.7X
A-216 (TT)
0.065
0.727
11.2X
No. de la
culture
Les surnageants de culture de lymphocytes B, cultivés en présence ou en absence de LPS, ont été dosés par
ELISA au jour 10 de la culture. Les valeurs sont données en mesures de densité optique (D.O.) par million de
cellules. * (TT) ou (HBsAg) indique l'Ag utilisé pour la détection en ELISA.
Il est à noter que les résultats des dosages ELISA pour la sécrétion spécifique d'IgG sont
recueillis en valeur de densité optique contrairement aux résultats en concentration (ug
d'IgG) obtenus pour la sécrétion totale d'IgG.
Nous ne sommes pas en mesure de
déterminer une valeur quantitative pour la sécrétion spécifique d'Acs puisque nous
n'avions pas de courbe standard fiable avec laquelle travailler comme pour les IgG totaux.
Cependant, nous pouvons comparer les valeurs obtenues par rapport à un nombre de
cellules fixe ce qui nous permet de conclure que pour 1 million de lymphocytes B, la
sécrétion spécifique est nettement supérieure à la sécrétion totale d'IgG.
38
3.1.3 Évaluation de la réactivité des Acs produits suite à l'ajout de LPS dans les
cultures de lymphocytes B humains
Nos résultats concernant l'augmentation de la sécrétion spécifique d'Acs nous portent à
nous questionner sur la spécificité réelle de ces Acs. Nous savions que les Acs produits
dans un système de culture comme le système CD40-CD154 pouvaient être polyréactifs
puisque les lymphocytes B ne sont pas activés suite à leur rencontre avec un Ag comme
cela se produit in vivo. Dans notre système, les lymphocytes B sont activés via l'abondance
de signal CD40-CD154 et ce, indépendamment de l'Ag. Tous les mécanismes de tolérance
présents dans le système immunitaire normal ne sont pas activés dans notre système de
culture et les lymphocytes B prolifèrent sans la contrainte de spécificité antigénique et ce
phénomène engendre souvent une bonne proportion d'Acs polyréactifs. Nous avons donc
voulu vérifier si les Acs spécifiques que nous avions produits étaient uniquement
spécifiques à la TT et à l'HBsAg.
Pour ce faire, nous avons testé en ELIS A la
polyréactivité des Acs présents dans les surnageants des quatre cultures dont les courbes de
prolifération ont été présentées à la figure 3.1. La réactivité contre huit Ags différents a été
testée et les résultats sont montrés à la figure 3.5.
/
&
^
«v*
tf
.^
4?
Antigènes
Figure 3.5 : Réactivité des Acs présents dans les surnageants de culture contre
différents Ags.
Les surnageants ont été dosés par ELISA au jour 10 de la culture: Les lymphocytes B ont été cultivés en
présence ( ^ ) ou en absence ( f l ) de LPS. Les résultats sont présentés en moyenne des densités optiques
obtenues pour les 4 cultures testées. L'écart-type est de 0,05.
39
Nous pouvons observer qu'il n'y avait pas de différence notable entre les conditions avec et
sans LPS pour les huit Ags testés. En fait, il semblait y avoir toujours un peu plus de
réactivité en présence de LPS, mais pas du même ordre de grandeur que ce qui a été
observé pour la sécrétion spécifique à la TT (en moyenne 6X) et à l'HBsAg (35X). La
réactivité contre la fibronectine était plus grande en présence de LPS (2X). Par contre, en
considérant les grands écart-types, nous pouvons conclure que les Acs présents dans les
surnageants de culture n'étaient que très faiblement polyréactifs, et que l'ajout de LPS n'a
que très peu augmenté la sécrétion d'Acs polyréactifs.
Lorsqu'on mesure la réactivité des Acs produits dans un système de culture suite à l'ajout
d'un additif comme le LPS, il est normal de se demander si les nouveaux Acs formés sont
réactifs contre l'additif en question. Bref, nous avons évalué si les surnageants de culture
contenaient des anti-LPS parmi les spécificités possibles. La figure 3.6 montre que les Acs
produits n'étaient pas plus réactifs contre le LPS lorsque les cultures étaient faites en
présence ou en absence de LPS et ce, autant pour les IgG que pour les IgM produits.
0,9
0,8
0,7
|
0,6
1 0,5
wwws s W W W
ww\w s W W W
WWW\
\\S\N\N
WWWS
\W\W\
Q °' 3
0,2 |
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WWW^sWWW
WW\X\WW\\V
WWWWsWWV
0,1
wwwwwswv
0
wwwwwww
WWNWWWWV
WWWWWWW
Figure 3.6 : Réactivité anti-LPS des Acs produits par les lymphocytes B cultivés en
présence ou en absence de LPS.
Les surnageants utilisés pour cette expérience sont les mêmes que ceux utilisés pour les dosages ELISA des
figures 3.4 et 3.5. Les IgG dans un milieu sans LPS O )
ou avec
LPS fl) ainsi que les IgM dans un milieu
sans LPS (E3) ou avec LPS ( H ) ont été dosés tel que décrit dans la section 2.3.4. L'écart-type est de 0,3.
40
3.1.4 Évaluation de l'effet du LPS sur les populations de lymphocytes B humains
Nous avons analysé l'expression de différents marqueurs de surface importants dans l'étude
des lymphocytes B humains in vitro. Ces marqueurs nous permettent de suivre l'évolution
des lymphocytes B en culture et ainsi définir des populations distinctes comme les
lymphocytes B mémoires exprimant le CD27 et les plasmocytes exprimant le CD138.
Selon les différents traitements et conditions de cultures que nous expérimentons,
l'expression de ces marqueurs pouvait être modifiée.
Ces modifications sont détectables
par cytométrie en flux et nous permettent de tirer des conclusions sur l'effet des additifs
ajoutés ou des conditions de culture utilisées. Dans le cadre de ce projet, les marqueurs
CD19, CD27, CD38, CD138 ainsi que l'IgM et l'IgG membranaires ont été suivis. Le
profil des populations de lymphocytes B était le même en présence ou en absence de LPS
après 5, 9 et 14 jours de culture (résultats non montrés).
Cependant, dans certains cas,
l'expression du TLR4, le récepteur du LPS, a été suivie afin de vérifier si les lymphocytes
B humains pouvaient augmenter l'expression de ce récepteur en présence de LPS.
Effectivement, lors de 2 cultures où ce marqueur a été analysé, son expression augmentait
entre le jour 0 et le jour 14 (figure 3.7).
Une des cultures présentait, au jour 0, une
proportion de cellules doubles positives CD19-TLR4 d'environ 8,5% et cette proportion est
demeurée relativement stable, tout au long de la culture en absence de LPS. Cependant, en
présence de LPS, cette proportion de cellules doubles positives s'est élevée à 31,2% au jour
14. Dans une autre culture effectuée à partir des lymphocytes B d'un participant différent,
le niveau d'expression du TLR4 au jour 0 était d'environ 1,5% et augmentait jusqu'à près
de 6% au jour 5 en présence de LPS alors qu'il restait stable dans la condition contrôle.
Ces derniers résultats démontraient la capacité de certains lymphocytes B humains
d'exprimer à la hausse le TLR4 ce qui suggérait qu'ils pourraient être réceptifs à une
stimulation par le LPS. Par contre, ce résultat ne s'est pas répété dans les nombreuses
autres cultures effectuées et l'analyse des autres marqueurs de surface mentionnés plus haut
n'a pas permis de déterminer la nature de la sous-population de lymphocytes B qui avait
une expression accrue du TLR4. De plus, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que
l'anti-TLR4 utilisé puisse être incapable de reconnaître le récepteur en présence de LPS ce
qui pourrait expliquer la faible augmentation de l'expression du TLR4 par les lymphocytes
B activés en présence de LPS.
41
A)
LPS
Jour 14
10"
101
103
10 2
CD19PerCP-Cy5.5
104
10<
+ LPS
10°
10'
102
103
CD19PerCP-Cy5.5
104
101
Jour 0
10°
10»
101
102
103
CD19PerCP-Cy5.5
1Q4
104-
B)
103
LPS
o
5io2
a.
_i
F
101-
2,21%
R2
S*S
,:R3.v.--
É^Éii
■ *3B
10»10»
Jour 5
101
1Q2
103
CD19PerCP-Cy5.5
103
104
+ LPS
5,96%
^102
100
101
102
103
CD19 PerCP-Cy5.5
104
10'
10"
10"
101
102
103
CD19PerCP-Cy5,5
Figure 3.7 : Effet du LPS sur Pexpression du TLR4 par les lymphocytes B humains
Les lymphocytes B ont été ensemencés à 2,5x105 cellules /ml puis cultivés dans le système CD40-CD154 en
présence d'un ratio L4.5 :lymphocyte B de 1 :25 et des cytokines IL-2, IL-4 et IL-10. Ces résultats sont issus
de cultures différentes effectuées à partir de 2 participants différents. A) La culture A-221 où l'analyse a été
effectuée au jour 14, B) La culture A-225 où l'analyse a été effectuée au jour 5.
42
Les résultats obtenus jusqu'à maintenant nous permettent de conclure que la sécrétion
d'Acs spécifiques à des Ags TD était augmentée et ce, sans qu'il n'y ait de différence au
niveau de la sécrétion totale d'Acs. Cela suggère qu'une petite proportion des lymphocytes
B de la culture répondait favorablement au LPS en sécrétant des Acs.
La première
hypothèse sur l'identité de cette petite population était qu'il s'agissait des lymphocytes B
mémoires puisqu'ils sont responsables de la sécrétion d'Acs très spécifiques. Il est connu,
suite aux travaux de Fecteau et ses collaborateurs, que les lymphocytes B mémoires sont
favorisés dans les conditions utilisées lors de ces expérimentations, soit la présence d'un
signal CD 154 dit faible et une combinaison des trois cytokines IL-2, IL-4 et IL-1043. Les
résultats présentés à la figure 3.3 appuient cette hypothèse, puisqu'on remarque que seule la
culture favorisant les lymphocytes B mémoires (ratio 1:25) ont montré une réponse au LPS.
Afin de vérifier si une sous-population (mémoires?) pouvait lier plus efficacement le LPS
en culture, nous avons effectué des analyses en cytométrie à l'aide de différents marqueurs,
incluant une solution de LPS couplé au fluorochrome AlexaFluor488 aux jours 0, 7 et 14
suivi d'analyses par cytométrie en flux. Cependant, les résultats de ces marquages n'ont
pas été concluants puisque très peu de fluorescence a été détectée lors de ces essais
(résultats non montrés).
3.1.5 Effet de l'ajout de LPS sur la production de cytokines pro-inflammatoires par
les lymphocytes B humains et par des lignées cellulaires de lymphocytes B humains.
Suite aux résultats obtenus sur la sécrétion d'Igs, nous avons tenté de déterminer ce qui
pouvait stimuler certains lymphocytes B à sécréter de plus grandes quantités d'Igs
spécifiques à un Ag en présence de LPS.
L'hypothèse que nous avons explorée plus en
profondeur est celle de la sécrétion de cytokines par les lymphocytes B stimulés au LPS.
En effet, de nombreux articles dans la littérature présentent des résultats démontrant que le
LPS stimule la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires chez les monocytes, les
macrophages et les cellules dendritiques53'54.
Ces types de cellules étant des cellules
présentatrices de l'Ag (CPA), nous avons posé comme hypothèse que les lymphocytes B,
également des CPA, pourraient sécréter des cytokines suite à la liaison du LPS. Ces
43
cytokines pourraient ensuite stimuler préférentiellement la différenciation des lymphocytes
B mémoires et la sécrétion d'Acs spécifiques. Nous avons donc entamé une étude en
QPCR dans le but d'évaluer la capacité des lymphocytes B humains à augmenter
l'expression des gènes de cytokines en présence de LPS. Tout d'abord, nous avons testé
deux cytokines connues soit pour être sécrétées par les lymphoyctes B humains en culture
dans le système CD40-CD1545 soit pour stimuler la sécrétion d'Acs par les lymphocytes
B, c'est-à-dire 1TL-6 et 1TL-10. Les lymphocytes B ont été cultivés pendant 18 heures dans
le système CD40-CD154 en présence de LPS puis analysés à différents temps en QPCR
pour l'expression des gènes de ces deux cytokines. La figure 3.8 montre les résultats
obtenus pour 1TL-6 à partir des lymphocytes B de 5 participants différents.
Comme
contrôle, des lymphocytes B cultivés en absence de LPS et analysés aux mêmes temps ont
été utilisés.
Nous pouvons voir que les lymphocytes B exprimaient, après 4 heures
seulement, environ 2 fois plus d'ARNm d'IL-6 en présence de LPS. Au temps 6 heures,
cette augmentation se situait autour de 2,5 fois en présence de LPS pour revenir, par la
suite, au même niveau qu'au temps 4 heures.
1
2
4
18
Heures
Figure 3.8 : Cinétique de l'augmentation de l'expression de l'ARNm de l'IL-6 par les
lymphocytes B humains cultivés en présence de LPS.
Les lymphocytes B ont été ensemencés à 2,5xl05 cellules/ml puis cultivés dans le milieu IMDM additionné de
10% de SBF ainsi que d'IL-2, IL-4 et IL-10 pendant 18 heures en présence ou en absence de LPS. Aux temps
indiqués, environ 2 millions de cellules étaient prélevées en vue du QPCR. Ces résultats sont représentatifs
de 5 expériences effectuées à partir de lymphocytes B de 5 participants différents et l'expression de l'IL-6 en
présence de LPS était comparée à l'expression basale de l'IL-6 dans les lymphocytes B cultivés en absence de
LPS. L'expérience n'a été répété qu'une fois pour les temps lhr, 2hrs et 18hrs.
44
Par la suite, les mêmes expériences ont été effectuées mais en analysant, cette fois-ci,
l'expression de l'IL-10. Pour ces expériences effectuées à partir des lymphocytes B de 3
participants différents, seuls les temps 4 et 6 heures ont été testés puisque ce sont ces deux
temps d'activation qui semblaient les plus intéressants suite aux résultats avec l'IL-6. La
figure 3.9 montre que le même phénomène se produisait après 6 heures de culture avec le
LPS soit une augmentation de l'expression de l'ARNm de l'IL-10 d'environ 2 fois en
présence de LPS alors qu'aucune augmentation n'était notée après 4 heures de culture avec
le LPS. C'est pour cette raison que les expériences subséquentes ont toutes été effectuées
sur des lymphocytes B cultivés pendant 6 heures en présence ou en absence de LPS.
3,5
o
J
•
2 5
-
■a
.>
2
Js
>-
e
o
1.5
o
4
6
Heures
Figure 3.9 : Cinétique de l'augmentation de l'expression de l'ARNm de l'IL-10 par les
lymphocytes B humains cultivés en présence de LPS.
Les lymphocytes B ont été ensemencés à 2,5x105 cellules/ml puis cultivés dans les conditions décrites à la
figure précédente pendant 4 et 6 heures en présence ou en absence de LPS. Les résultats sont représentatifs
de 3 expériences effectuées à partir des lymphocytes B de 3 participants différents et l'expression de l'IL-10
en présence de LPS était comparée à l'expression basale de l'IL-10 par les lymphocytes B cultivés en absence
de LPS.
Nos résultats suggèrent donc que les lymphocytes B humains pourraient répondre au LPS
par une augmentation de la sécrétion de cytokines, de la même façon que d'autres types de
cellules tels les macrophages, phénomène qui n'a encore jamais été rapporté dans la
littérature. Par contre, certains éléments liés au système de culture auraient pu invalider les
résultats obtenus et ont donc été l'objet d'analyses particulières.
45
Suite à la sélection magnétique des lymphocytes B à partir des PBMC, la pureté est
supérieure à 95% mais n'atteint jamais 100%. Ceci dit, nous nous sommes demandés, en
sachant que les monocytes et les macrophages sont très sensibles au LPS, si l'augmentation
de la sécrétion d'IL-6 et d'ILlO était réellement due aux lymphocytes B ou plutôt
attribuable à quelques monocytes contaminants pouvant s'être glissés dans les cultures.
Afin d'éliminer cette contamination potentielle, nous avons effectué les mêmes traitements
au LPS mais, avant de procéder à l'extraction d'ARN total et au QPCR, nous avons
effectué une sélection magnétique positive en utilisant des microbilles magnétiques
spécifiques pour la molécule CD19, exprimée par tous les lymphocytes B. Ainsi, nous
avons éliminé les quelques cellules potentiellement contaminantes de nos expériences de
QPCR. Après, avoir répété les mêmes expériences de QPCR que précédemment, nous
avons obtenu des résultats identiques sur l'expression de l'IL-6 et de l'IL-10 et ce, pour
plusieurs participants (résultats non montrés).
Nous pouvons donc conclure que
l'augmentation de l'expression de l'IL-6 et de l'IL-10 est réellement attribuable aux
lymphocytes B.
Comme il a été décrit à la section 2, le système CD40-CD154 utilise des cellules L4.5
exprimant constitutivement la molécule CD 154 ce qui permet d'activer les lymphocytes B
via leurs récepteurs CD40. Nous pourrions nous questionner sur l'impact des cellules L4.5
sur l'effet observé avec l'expression de l'IL-6 et de l'IL-10. En effet, il a déjà été démontré
par certains travaux de l'équipe de Sonia Néron que les cellules L4.5 pouvaient interférer
dans ce genre d'études et avaient la capacité de sécréter certaines cytokines comme l'IL450.
Le QPCR étant une technique très sensible, il était possible que les niveaux
d'expression des gènes de cytokines puissent être influencés par la présence de L4.5
répondant positivement au LPS. Bien que les amorces utilisées étaient spécifiques à l'IL-6
et à l'IL-10 humaines alors que les cellules L4.5 sont d'origine murine, il y a toujours une
possibilité de réaction croisée étant donné la forte homologie entre les cytokines humaines
et murines. Afin d'écarter cette possibilité, les cellules L4.5 ont été incubées en présence
de LPS puis analysées pour la sécrétion d'IL-6 et d'IL-10 en QPCR. Les cellules L4.5
n'exprimaient aucune trace de ces deux cytokines dans les conditions étudiées (résultats
46
non montrés). L'augmentation de l'expression de ces deux gènes de cytokines ne pouvait
donc pas provenir des L4.5 présentes dans les cultures de lymphocytes B et qui auraient été
entraînées avec les lymphocytes B lors de la récupération de ces dernières.
Une augmentation de l'expression des gènes de cytokines ne signifie pas automatiquement
que ces gènes seront traduits en protéines et encore moins que ces protéines seront sécrétées
par les lymphocytes B. Afin de confirmer que le LPS pouvait conduire les lymphocytes B
à exprimer des quantités accrues de cytokines, nous avons analysé la sécrétion de l'IL-6
dans les surnageants de culture par ELISA. Les lymphocytes B étaient cultivés dans les
conditions préalablement décrites et ce, pendant 5 jours. Aux jours 3 et 5, des échantillons
de milieu de culture étaient prélevés et dosés par ELISA, tel que décrit à la section 2.3.5,
afin de détecter la présence d'IL-6. La figure 3.10 montre que les lymphocytes B humains
sécrétaient de plus grandes quantités d'IL-6 en présence de LPS. En effet, dans les 3
cultures différentes effectuées, les lymphocytes B ont sécrété environ 1,3 à 2 fois plus d'IL6 en présence de LPS qu'en absence de LPS ce qui reflète l'augmentation de la production
d'ARNm.
1200
1000
U
U
800
jâ
600
**
400
200
r-*—M
^^^^H
i—E—I
a
Temps (jours)
Figure 3.10 : Augmentation de la sécrétion d'IL-6 dans les surnageants de culture des
lymphocytes B humains cultivés en présence de LPS.
Les lymphocytes B humains purifiés ont été ensemencés à 2,5x105 cellules/ml puis cultivés tel que décrit
précédemment pendant 5 jours en présence fl) ou en absence ( O ) de LPS. Les résultats sont représentatifs
de 3 cultures effectuées à partir des lymphocytes B de 3 participants différents préalablement utilisés dans les
expériences de QPCR.
47
La détection de l'IL-6 dans les surnageants de culture nous permet de penser que notre
hypothèse est peut-être la bonne. Ainsi, il est possible que l'effet du LPS sur la sécrétion
d'Acs spécifiques soit causé par l'augmentation de la sécrétion de certaines cytokines dont
l'IL-6. Nous n'avons malheureusement pas pu reprendre les mêmes expériences en ELISA
pour l'IL-10 puisque cette cytokine se retrouvait dans le milieu de culture de base. Nous
aurions ainsi difficilement pu distinguer l'IL-10 présente dans le milieu de base de celle
réellement sécrétée par les lymphocytes B.
Les résultats sur l'augmentation de l'expression des cytokines IL-6 et IL-10 chez les
lymphocytes B humains nous ont motivés à pousser un peu plus loin nos recherches sur
l'action des cytokines dans la réponse au LPS. Nous avons donc tenté de voir si d'autres
cytokines et chimiokines pouvaient être régulées par les lymphocytes B sous l'effet du
LPS.
Pour ce faire, nous avons effectué des expériences utilisant la technologie de
« cytokine arrays » qui permet d'analyser simultanément l'expression de 84 gènes de
cytokines, de chimiokines et de certains de leurs récepteurs. Ainsi, les lymphocytes B ont
été soumis au même traitement que décrit précédemment, soit 6 heures en présence ou en
absence de 20 ng/ml de LPS d'£. coli 026:B6. L'ARN total a été extrait et transformé en
ADNc puis testé en « cytokine arrays ».
Les résultats ne sont cependant pas très
concluants. En effet, les résultats sont très variables selon l'individu testé. À chaque
expérience, des gènes différents étaient légèrement positifs pour l'augmentation de leur
expression.
Même l'expression de l'ARNm de l'IL-10, retrouvé parmi les 84 gènes
analysés, n'était pas toujours amplifiée et l'expression de l'ARNm de l'IL-6 n'a pu être
analysée comme contrôle puisqu'il ne faisait pas partie des 84 gènes inclus dans les tests
(résultats non montrés).
3.1.6 Effet de l'ajout de LPS dans les cultures de lignées cellulaires de lymphocytes B
Afin de poursuivre notre étude sur l'effet du LPS sur les lymphocytes B humains, nous
avons testé plusieurs lignées cellulaires de lymphocytes B pour l'expression de l'IL-6 et de
l'IL-10, la sécrétion d'IL-6 ainsi que la sécrétion d'Acs.
Les lignées sélectionnées
48
représentaient différents stades de différenciation allant du stade pré-B au stade
plasmocytaire. Premièrement, les cellules ont été cultivées pendant 6 heures en présence
ou en absence de LPS puis l'expression de l'IL-6 et de l'IL-10 a été vérifiée en QPCR en
utilisant la même procédure que celle utilisée avec les lymphocytes B humains normaux.
Les résultats sont présentés à la figure 3.11. Ces expériences ont été répétées deux fois et
une seule lignée cellulaire a présenté une augmentation de l'expression de l'ARNm de l'IL6 et de l'IL-10 après 6 heures de culture en présence de LPS soit la lignée plasmocytaire
RPMI-8226. Nous avons calculé que ces cellules exprimaient au moins 9 fois plus d'IL-6
et au moins 14 fois plus d'IL-10 en présence de LPS.
IL-6
IL-10
Figure 3.11 : Effet du LPS sur l'expression de l'ARNm de l'IL-6 et de l'IL-10 par 8
lignées cellulaires de lymphocytes B représentant différents stades de différenciation.
Les cellules SUPB15 ( S ). Raji ( D ), Ramos ( ■ ), Daudi ( Q ), SKW6.4 ( □ ), Pfeiffer ( 0 ) , DB ( ^ ) et
RPMI-8266 ( D
ont été ensemencées à 2,5x105 cellules/ml puis cultivés en présence ou en absence de 20
ug/ml de LPS pendant 6 heures. En absence de LPS, les Ct étaient supérieures à 35 pour toutes les lignées,
suggérant qu'aucune d'entre elles n'exprimaient ces cytokines de façon constitutive.
Tout comme avec les lymphocytes B normaux, le dosage de l'IL-6 dans les surnageants de
culture des lignées cellulaires a été effectué. Les cellules ont été mises en culture pendant
48 heures en présence ou en absence de LPS et un ELISA afin de détecter l'IL-6 après 24 et
48 heures a été effectué sur les surnageants de culture. Le tableau 3.3 montre que la lignée
RPMI-8226 ne sécrétait pas du tout d'IL-6 (0 pg/ml) en absence de stimulation au LPS et
qu'elle a augmenté sa sécrétion d'IL-6 après 24 heures seulement en présence de LPS (723
49
pg/ml). Les autres lignées ont également été testées mais aucune sécrétion de l'IL-6 n'a été
détectée (résultats non montrés), en accord avec les résultats sur l'expression d'ARNm.
Tableau 3.2 : Effet du LPS sur la sécrétion dTL-6 dans les surnageants de culture de
la lignée cellulaire RPMI-8226 cultivés en présence de LPS.
Sécrétion dTL-6 (pg/106 cellules)
24 heures
48 heures
Contrôle sans LPS
0
0
20 ug/ml LPS
723
657
Les cellules RPMI-8226 ont été ensemencés à 2,5x105 cellules/ml puis cultivées pendant 48 heures dans le
milieu RPMI additionné de 10% de SBF et de ImM de sodium pyruvate en absence ou en présence de 20
ug/ml de LPS de E. coli 026 :B6. Les surnageants de culture ont été dosés par ELISA tel que décrit à la
section 2.3.5.
L'expression du TLR4 a également été évaluée sur ces 8 lignées cellulaires de lymphocytes
B. Les cellules étaient incubées en présence de LPS pendant 48 heures et l'expression du
TLR4 était évaluée par cytométrie en flux. Les résultats n'ont montré aucune augmentation
de l'expression du TLR4 sur les 8 lignées testées. En fait, aucune des lignées ne semblait
même exprimer le TLR4 (résultats non montrés).
Par contre, l'anti-TLR4 se liait bien à
une lignée contrôle, soit la lignée monocytaire THP-1.
Pour compléter l'étude de l'effet du LPS sur les lignées cellulaires de lymphocytes B, nous
avons évalué la sécrétion d'IgG et d'IgM par les RPMI-8226 en présence de LPS. Il est
connu que ces cellules ne sécrètent pas d'Acs en conditions habituelles. Cependant, il est
possible que ces cellules puissent être stimulées à sécréter des Acs en présence de LPS
puisqu'elles y répondent en sécrétant des cytokines. Nous avons donc mis en culture les
RPMI-8226 en présence ou en absence de LPS pendant 48 heures et un ELISA a été
effectué avec les surnageants de culture afin de détecter la sécrétion d'Acs de type IgG et
IgM. Les résultats obtenus montrent que les RPMI-8226 ne sécrétaient pas d'Acs de façon
naturelle et la présence de LPS ne les stimulaient pas à en sécréter (résultats non montrés).
50
3.2 Effet de l'expression de l'AgT dans les lymphocytes B humains
Le système de culture CD40-CD154 permet de cultiver les lymphocytes B in vitro de façon
très efficace. Cependant, il est difficile de maintenir les lymphocytes B en bonne condition
pendant plus de 28 jours ce qui pose une limite sur la quantité de cellules produites. Par
conséquent, il est présentement impossible de produire les grandes quantités d'Acs
nécessaires à la production de préparations thérapeutiques. En se basant sur l'étude de
Pasqualini et ses collaborateurs (voir section 1.4), l'expression du gène AgT pourrait
permettre de maintenir les lymphocytes B en culture à très long terme, et ce sans l'ajout de
signaux du CD40 et des cytokines, et produire plus d'Acs in vitro41. Afin de surexprimer le
gène AgT dans les lymphocytes B humains, un vecteur adénoviral de type Ad5/F35
contenant le gène AgT a été construit par l'équipe du Dr. Daniel Jung selon le protocole
brièvement décrit à la section 2.6.148. Nous avons mis en culture les lymphocytes B
humains dans le système CD40-CD154 en présence d'un signal CD 154 fort (ratio L4.5 :
lymphocyte B de 1 : 3) et des cytokines IL-2, IL-4 et IL-10 puis nous avons infecté les
lymphocytes B au jour 10 dans l'optique où l'expression de l'AgT leur permettrait de
poursuivre la culture à plus long terme.
Au jour de l'infection, les lymphocytes B ont été infectés tel que décrit à la section 2.6.2
puis mis en présence d'un signal CD154 fort fourni, cette fois-ci, par les membranes SCM7 afin d'éviter que les virus infectent les cellules L4.5 plutôt que les lymphocytes B . Tout
d'abord, l'efficacité de l'infection a été vérifiée à chaque jour suivant l'infection en
observant la fluorescence émise par l'EYFP à l'aide d'un microscope à fluorescence. Un
exemple de photo prise 96 heures suivant l'infection est présenté à la figure 3.12. On
remarque que les lymphocytes B formaient des amas importants en présence de membranes
exprimant le CD 154 et que la fluorescence était concentrée dans ces amas. Cela suggère
que les lymphocytes B exprimaient au moins l'EYFP lorsqu'ils étaient stimulés via la
molécule CD40.
51
Figure 3.12 : Lymphocytes B humains infectés avec les virus contenant PAgT.
Les lymphocytes B étaient cultivés en présence des membranes exprimant le CD 154.
A) Photo en
microscopie à fond clair montrant les amas de cellules et de membranes SCM-7 exprimant le CD 154. B)
Photo en microscopie à fluorescence des lymphocytes B infectés avec le virus contenant l'AgT. Les photos
ont été prises au jour 4 suivant l'infection. Grossissement : 100X
Par la suite, l'analyse de la prolifération, de la viabilité ainsi que de l'expression de
l'ARNm et de la protéine AgT a été effectuée.
La prolifération et la viabilité ont été
évaluées par des comptes cellulaires aux 2 jours, en utilisant la méthode d'exclusion au
bleu de trypan. La prolifération des lymphocytes B infectés avec les virus AgT ou les virus
contrôles (CTL), contenant uniquement l'EYFP, était toujours comparée à celle des
lymphocytes B non infectés. La figure 3.13 montre que les lymphocytes B infectés avec le
virus CTL ou le virus AgT ne proliféraient pas aussi rapidement que les lymphocytes B
non-infectés contrairement à ce qu'on aurait pu s'attendre en se basant sur les résultats de
Pasqualini dans le système murin. Ainsi, l'AgT ne semblait pas permettre le maintien des
lymphocytes B en culture à très long terme puisque déjà au jour 14 de la culture, la viabilité
des cellules diminuait et ce, dans toutes les conditions effectuées (résultats non montrés).
De plus, nous avons pu constater que les lymphocytes B infectés ou non ne proliféraient
pas du tout en absence de signal CD 154 (résultats non montrés).
52
7.00E+09
S
6.00E+O9
S
o
6
8
10
Temps (jours)
Figure 3.13 : Effet des virus AgT sur l'expansion des lymphocytes B.
Les lymphocytes B ont d'abord été cultivés pendant 10 jours dans le système CD40-CD154 en présence d'un
ratio L4.5 : lymphocyte B de 1 : 3 et du milieu 1MDM 10% SBF supplémenté des cytokines IL-2, IL-4 et IL10. Au jour 10 de la culture, les lymphocytes B ont été divisés en trois parties. Une partie a été infectée avec
le virus contrôle Ai ) contenant uniquement l'EYFP, une autre partie a été infectée avec le virus contenant
l'AgT (A) et une dernière partie non-infectée ^ ) puis cultivée en présence de membranes SCM-7. Les barres
d'erreurs représentent l'écart de 10% entre les comptes cellulaires effectués en triplicata. (n=3)
Cependant, avant de tirer des conclusions sur l'absence d'effet de ce gène, nous devions
effectuer certains contrôles afin de vérifier les niveaux d'expression de l'ARNm ainsi que
de la protéine AgT. Il est possible, bien que le vecteur utilisé permette l'expression de
l'AgT, que les niveaux d'expression ne soient pas suffisants pour permettre un effet
biologique. Nous avons donc comparé les niveaux d'expression dans les lymphocytes B à
ceux observés chez les cellules COS-7. Pour ce faire, un QPCR visant à détecter l'ARNm
de l'AgT a été effectué 24 heures suivant l'infection et la figure 3.14 nous montre que les
lymphocytes B infectés expriment très peu d'ARNm du gène AgT. En comparant avec les
cellules COS-7 exprimant constitutivement l'AgT, on remarque que ces dernières
exprimaient au moins 10 fois plus d'AgT que les lymphocytes B infectés avec le virus AgT.
53
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a
20
•è »
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P
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a.
H
0
Ni
AgT
COS-7
Figure 3.14 : Expression relative de PARNm de l'AgT dans les lymphocytes B noninfectés (Ni), infectés avec les virus AgT ainsi que dans la lignée cellulaire COS-7.
L'expression a été évaluée 24 heures suivant l'infection des lymphocytes B avec les virus AgT.
De plus, les expériences de QPCR ont donné des résultats douteux. L'utilisation de cette
technique très sensible implique que les amorces utilisées pour la détection du gène
d'intérêt soient très spécifiques. Le logiciel MxPro utilisé pour l'analyse et le traitement
des résultats de QPCR permet d'effectuer ce qu'on appelle des courbes de dissociation. À
la fin des 40 cycles du QPCR, un protocole impliquant le chauffage des échantillons à
partir de 55°C jusqu'à 95°C permet de déterminer la qualité de l'amplification en s'assurant
qu'il n'y ait qu'un produit d'amplification.
Brièvement, l'ADN double brin du produit
PCR se dissocie à une température donnée en fonction de la longueur de l'amplicon et de sa
composition (environ 200pb en QPCR). À cette température, une baisse de fluorescence
importante sera notée par l'appareil puisque la molécule SYBRGreen se détache de l'ADN
lorsque redevenu sous forme simple brin.
L'obtention d'une seule température de
dissociation est indicatrice de la fiabilité des valeurs obtenues. Dans la lignée cellulaire
COS-7, les courbes de dissociation étaient très acceptables et indicatrices d'un seul produit
d'amplification. Cependant, dans l'échantillon de lymphocytes B infectés avec les virus
AgT, la courbe de dissociation montrait deux produits d'amplification d'importance égale.
Un de ces produits semblait vraisemblablement être l'AgT mais le deuxième produit
inconnu avait une température de dissociation plus élevée que celle du produit de PCR des
COS-7 et brouillait les cartes lorsque venait le temps de calculer le niveau relatif
54
d'expression de l'AgT entre les COS-7 et les lymphocytes B infectés. De plus, selon les
résultats de QPCR, de l'ARNm de l'AgT était détecté dans les lymphocytes B non-infectés
ce qui est impossible. Cela signifiait qu'il y avait effectivement un problème de réactivité
non-spécifique avec les amorces de QPCR que nous avions. Afin d'éclaircir cette situation,
nous avons procédé à un PCR traditionnel avec les mêmes échantillons et les mêmes
amorces AgT. Compte tenu des résultats de QPCR, nous nous attendions à l'apparition de
plus d'un produit suite au PCR traditionnel. À notre grande surprise, un seul produit bien
défini est apparu sur le gel d'agarose (figure 3.15).
STD
1
2
3
200pb
lOOpb
Figure 3.15 : Amplification de l'AgT dans les lymphocytes B infectés avec les virus
AgT et dans les cellules COS-7.
Les mêmes échantillons que pour le QPCR de la figure 3.14 ont été utilisés pour le PCR traditionnel.
L'enzyme Hot Start Phusion a été utilisé. Les produits d'amplification ont été déposés sur un gel d'agarose
2% et leur taille déterminée avec le marqueur standard « Low Mass DNA ladder » (STD). 1) lymphocytes B
Non-infectés, 2) COS-7, 3) lymphocytes B infectés avec les virus AgT.
Une très faible bande pouvant correspondre à l'AgT était détectée sur le gel dans
l'échantillon provenant des lymphocytes B non-infectés en PCR traditionnel mais rien ne se
comparant à la forte expression détectée en QPCR. Cela indique que les amorces n'étaient
pas appropriées en QPCR. Ainsi, il est difficile de se fier aux résultats de la figure 3.14.
Nous avons donc séquence le produit PCR des lymphocytes B infectés et, après avoir
comparé les séquences obtenues avec celle de l'AgT en utilisant le logiciel BLAST
disponible sur internet, nous avons constaté l'homologie entre le produit exprimé dans les
55
lymphocytes B infectés avec les virus et le gène AgT.
Ainsi, les amorces étaient
spécifiques en PCR traditionnel mais inappropriées en QPCR. Quelques essais ont été
effectués en PCR traditionnel, en faisant varier le nombre de cycles d'amplification (PCR
semi-quantitatif) afin de comparer la quantité d'ARNm dAgT présente chez les
lymphocytes B infectés à celle présente chez les cellules COS-7. Les résultats obtenus
montrent que les lymphocytes B expriment environ 16X moins d'ARNm de l'AgT que les
cellules COS-7 (résultats non montrés).
Nous avons également effectué un Western blot permettant de détecter spécifiquement
l'expression de la protéine AgT dans les lymphocytes B 48 heures et 96 heures suivant
l'infection en utilisant des cellules COS-7 et l'expression d'actine comme contrôle. Des
lymphocytes B des conditions non-infectés, infectés avec les virus contrôle (CTL) et
infectés avec les virus AgT étaient prélevés puis lysés et la présence d'AgT était analysée
(figure 3.16).
Les résultats montrent que la protéine n'était pas exprimée dans les
lymphocytes B non-infectés ou infectés avec les virus contrôle et qu'elle était très
faiblement exprimée 48 heures suivant l'infection des lymphocytes B avec les virus AgT.
Finalement, la protéine était indétectable 96 heures suivant l'infection dans les lymphocytes
B infectés avec le virus AgT. Si on compare l'expression à 48 heures avec celle qu'on
retrouve dans les cellules COS-7, on remarque un énorme différence. En effet, les cellules
COS-7 exprimaient une énorme quantité de la protéine AgT par rapport aux lymphocytes B
infectés avec les virus AgT, ce qui suggère que les lymphocytes B exprimaient très
faiblement la protéine AgT. Afin de pouvoir mieux comparer les niveaux d'expression
entre les lymphocytes B et les COS-7, nous avons analysé les niveaux d'expression de la
protéine P-actine en utilisant la même membrane que pour la protéine AgT. Le niveau
d'expression de cette protéine est indicateur de la quantité de matériel protéique déposé sur
gel. Le niveau de p-actine était un peu plus élevé pour les COS-7 ce qui montre qu'un peu
plus de protéine a été déposé sur le gel (environ 2 fois plus) mais cela n'explique pas la
différence énorme observée pour la protéine AgT. Ces résultats suggèrent que la quantité
de protéine AgT dans les lymphocytes B n'était peut-être pas suffisante pour produire un
effet biologique.
56
STD
1 2
3
4
5
AgT
p-actine
Figure 3.16 : Expression de la protéine AgT dans les lymphocytes B infectés avec les
virus AgT et dans les cellules COS-7.
L'analyse a été effectuée 48 heures et 96 heures suivant l'infection avec les virus AgT. 1) lymphocytes B
non-infectés, 2) lymphocytes B 48 heures après l'infection avec les virus CTL, 3) lymphocytes B 48 heures
après l'infection avec les virus AgT, 4) lymphocytes B 96 heures après l'infection avec les virus AgT, 5)
COS-7.
57
4. Discussion
4.1 Etude de l'effet du LPS chez les lymphocytes B humains cultivés in
vitro
Plusieurs résultats obtenus lors de ce projet ont mis en évidence la possibilité de favoriser la
production d'Acs spécifiques au TT et à l'HBsAg, qui étaient nos Ags cibles. Par contre, il
est fort possible que les conditions utilisées aient permis la production dAcs possédant
beaucoup d'autres spécificités, correspondant à la spécificité des Acs exprimés par les
lymphocytes B mémoires en circulation. Très peu d'études portent sur l'effet du LPS sur
les lymphocytes B humains contrairement aux lymphocytes B murins dont la stimulation de
la prolifération et de la sécrétion par l'ajout de LPS a été démontrée il y a de nombreuses
années27. Au cours de ce projet, nous avons pu observer que le LPS peut avoir un effet sur
les lymphocytes B humains mais que ces derniers ne réagissent pas de la même façon que
les lymphocytes B murins. Tout d'abord, les lymphocytes B humains ne semblent pas
stimulés par le LPS au point d'augmenter leur prolifération. En fait, la prolifération est
plutôt ralentie en présence de LPS et ce, pour plusieurs échantillons différents.
Afin
d'expliquer la différence d'effet du LPS sur les lymphocytes B humains, nous avons
d'abord pensé que notre système de culture, qui donnait des signaux supplémentaires aux
lymphocytes B (CD154, cytokines) pourrait modifier l'effet du LPS. Nous avons donc
mesuré l'effet du LPS sur les lymphocytes B murins, dans le système de culture utilisé pour
les lymphocytes B humains. La culture de lymphocytes B murins effectuée dans le système
CD40-CD154 nous a permis d'observer que le LPS stimule toujours la prolifération de ces
lymphocytes B, contrairement aux résultats obtenus pour les lymphocytes B humains. Le
seul bémol à cet essai est que 1TL-4 humain, contrairement à 1TL-2 par exemple, n'agit pas
sur les lymphocytes B de souris. Cette observation montrait toutefois que la stimulation
des lymphocytes B par le CD40 n'empêche pas les lymphocytes B humains de répondre au
LPS.
La possibilité qu'une seule sous-population peut être sensible au LPS pourrait
expliquer le ralentissement global, et non l'arrêt complet de la prolifération en présence de
LPS. De plus, une diminution de la prolifération est souvent signe d'une augmentation de
58
la différenciation, ce qui semble être le cas ici puisque aucune baisse de la viabilité
cellulaire n'a été observée en ajoutant du LPS.
Suite aux expériences de détection de la sécrétion d'Acs totaux et spécifiques au TT et à
l'HBsAg, nous avons observé que les lymphocytes B sécrètent beaucoup plus d'Acs
spécifiques en présence de LPS mais que la sécrétion totale d'IgG n'est pas affectée. Ces
résultats répétés plusieurs fois suggèrent qu'une sous-population de lymphocytes B était
plus sensible au LPS. Nous avons immédiatement pensé que cette sous-population est les
lymphocytes B mémoires qui se différencient in vivo en plasmocytes sous l'effet de
cytokines ou d'activateurs polyclonaux et sont responsables de la sécrétion d'Acs
spécifiques. Cependant, si ce sont les lymphocytes B mémoires nouvellement différenciés
qui sécrètent de plus grandes quantités d'Acs spécifiques, comme le suggèrent nos
résultats, comment expliquer que la sécrétion totale d'IgG n'augmente pas, puisque la
sécrétion d'IgG est normalement attribuée aux lymphocytes B mémoires. Récemment,
Fecteau et Néron ont montré que, dans le système CD40-CD154, les lymphocytes B naïfs
effectuent la commutation de classe et passent de la sécrétion d'Ac de type IgM à la
sécrétion d'Ac de type IgG, mais que ces lymphocytes B ne sont pas vraiment devenus des
cellules mémoires41. Donc, la majorité des lymphocytes B produisant des IgG dans le
système CD40-CD154 ne sont pas les lymphocytes B mémoires, mais les lymphocytes B
naïfs qui ont subi la commutation de classe et qui ne répondraient pas au LPS,
contrairement aux 'vrais' lymphocytes B mémoires, ce qui explique le niveau stable de
sécrétion des IgG totaux.
Un indice supplémentaire suggérant que les lymphocytes B mémoires pourraient être la
cible du LPS est apparu lors des essais utilisant des ratios différents de L4.5 : lymphocyte B
dans nos cultures. En effet, nos résultats montrent que les lymphocytes B humains cultivés
en présence ou en absence de LPS ne réagissent pas de la même façon lorsque l'on modifie
le ratio L4.5 : lymphocyte B. Selon les travaux de doctorat de Jessie Fecteau, la culture de
lymphocytes B humains en présence d'un ratio L4.5 : lymphocyte B de 1 : 25 favorise la
prolifération des lymphocytes B mémoires et, à l'opposé, un ratio 1 : 3 favorise la
prolifération des lymphocytes B naïfs55. En analysant nos résultats, on ne remarque aucun
effet du LPS sur les lymphocytes B cultivés en présence d'un ratio 1:3. Par contre, les
59
lymphocytes B cultivés en présence d'un ratio 1 : 25 dévoilent une réponse différente en
présence de LPS, c'est-à-dire une baisse de la prolifération, ce qui supporte notre hypothèse
voulant que les lymphocytes B mémoires, favorisés dans ces conditions, pourraient être la
sous-population ciblée par le LPS.
Nous avons tenté de suivre l'évolution des différentes populations (naïves, mémoires,
plasmocytaires) au cours des cultures en présence ou en absence de LPS en suivant
l'expression des différents marqueurs de surface propres à chacune de ces populations.
Nous nous attendions à ce que l'expression du marqueur spécifique des lymphocytes B
mémoires, soit le CD27, et du marqueur spécifique des plasmocytes, soit le CD 138, soit
modulée en présence de LPS. Malheureusement, aucune des expériences de cytométrie
effectuées n'a permis de détecter des différences au niveau de l'expression des marqueurs
de surface des populations de lymphocytes B comme le CD27 ou le CD 138. Il semble
donc possible que le LPS n'induise pas la modulation des marqueurs de surface malgré tous
les indices qui convergent vers l'hypothèse de l'augmentation de la différenciation en
présence de LPS. Dans quelques cultures, nous avons observé l'augmentation de
l'expression du TLR4 par certains lymphocytes B humains.
Par contre, lors des
nombreuses autres cultures, aucune augmentation et même aucune expression de TLR4 n'a
été décelée. Cette absence du TLR4 n'a cependant pas empêché les lymphocytes B de
sécréter plus d'Acs spécifiques en présence de LPS, suggérant l'utilisation d'un autre
récepteur que le TLR4. Cette possibilité est supportée par le résultat de l'analyse en
cytométrie effectuée sur la lignée RPMI-8226, qui répond à l'ajout de LPS mais qui ne
présente pas d'expression du TLR4 à sa surface (résultats non montrés). Le récepteur
RP105 a récemment été mis en évidence et serait un homologue du TLR45 . De plus, le
RP105 est préférentiellement exprimé sur les lymphocytes B humains57, ce qui fait de ce
récepteur un candidat intéressant pour transmettre les signaux du LPS aux lymphocytes B
humains. Une analyse de l'expression de ce récepteur sur les lymphocytes B cultivés dans
le système CD40-CD154 aurait sûrement été intéressante et devrait faire partie de travaux
futurs sur les effets du LPS sur les lymphocytes B humains.
À ce point de notre étude, nous n'étions pas en mesure d'identifier le mécanisme
responsable de l'effet du LPS sur les lymphocytes B.
Plusieurs hypothèses ont été
60
suggérées mais celle de l'intervention de certaines cytokines pro-inflammatoires semblait la
plus plausible.
Sachant que le LPS peut stimuler d'autres types cellulaires humains,
comme par exemple les monocytes et les cellules dendritiques, à sécréter des cytokines proet anti-inflammatoires53'5 , nous avons pensé que le même phénomène pouvait se produire
avec les lymphocytes B humains. En effectuant des analyses en QPCR, nous avons pu
détecter l'augmentation de l'expression d'ARNm de l'IL-6 et de l'IL-10 produite par les
lymphocytes B humains cultivés en présence de LPS ainsi que l'augmentation de la
sécrétion de l'IL-6 dans les surnageants de culture. En regardant les fonctions connues de
ces deux cytokines, on remarque que l'IL-10 stimule la sécrétion d'Acs par les
lymphocytes B humains cultivés in vitro ce qui est une des raisons de l'ajout de cette
cytokine dans notre milieu de culture de base. Encore plus intéressant, l'IL-6 est connue
pour diriger les lymphocytes B humains vers le stade terminal de différenciation en
plasmocytes58"60.
Il a été démontré que l'IL-6, combiné avec l'IL-10, joue un rôle
important dans la différenciation des lymphocytes B mémoires en cellules pré-plasmocytes
dans un système de culture in vitro utilisant la stimulation des lymphocytes B via le
CD4059. Selon les travaux des groupes de Clark et de Duddy, la sécrétion d'IL-6 par les
lymphocytes B cultivés in vitro dépend de la liaison de la molécule CD40 à son ligand ''62.
Ces cytokines, pourraient donc être sécrétées par certains lymphocytes B activés par le
CD40 et le LPS, comme dans le système CD40-CD154, et agiraient sur la population de
lymphocytes B mémoires en stimulant leur différenciation en plasmocytes.
Comme précédemment discuté, des indices suggéraient que la sécrétion d'IL-6 et d'IL-10
était impliquée dans la réponse des lymphocytes B humains au LPS. Par contre, nous ne
savions pas si les lymphocytes B répondant au LPS en augmentant la sécrétion de cytokines
étaient les mêmes que ceux qui utilisaient ces cytokines (sécrétion autocrine) ou s'il
s'agissait d'une population distincte. Afin de tenter de répondre à cette question, nous
avons vérifié l'expression de l'IL-6 et de l'IL-10 dans des lignées cellulaires de
lymphocytes B représentant différents stades de différenciation (de pré-B à plasmocyte).
Seule la lignée plasmocytaire RPMI-8226 a répondu à la présence de LPS par une
augmentation d'expression d'IL-6 et d'IL-10.
Aucune des 7 autres lignées cellulaires
testées n'a répondu à l'ajout de LPS, y compris les lymphocytes B mémoires représentés
par la lignée DB. Ces résultats suggèrent donc que les cellules produisant les cytokines en
61
réponse au LPS ne sont pas les mêmes que celles qui les utilisent. Au cours de notre étude
sur la sécrétion de cytokines par les cellules RPMI-8226, nous avons voulu savoir si elles
pouvaient sécréter des IgG lorsque mis en présence de LPS. Les résultats montrent qu'elles
ne sécrètent pas d'IgG en présence et en absence de LPS. Cependant, il est connu que les
RPMI-8226 n'expriment pas la chaîne lourde des Igs mais seulement la chaîne légère.
Puisque nous avons utilisé des Acs spécifiques à la portion Fc des IgG (voir section 2.3.1),
il est normal de n'avoir détecté aucune sécrétion d'IgG.
En complément avec l'analyse de l'expression des récepteurs du LPS qui s'était avérée peu
concluante, la capacité de liaison au LPS des sous-populations de lymphocytes B humains a
été vérifiée en utilisant un complexe LPS-AlexaFluor 488. Par contre, aucune fluorescence
n'a été remarquée et aucune population ne semble lier préférentiellement le LPS, ce qui est
plutôt étonnant. En effet, il n'est pas logique qu'aucun lymphocyte B ne lie le LPS alors
que nous avons remarqué clairement une réponse des lymphocytes B au LPS (diminution
de la prolifération, augmentation de la sécrétion d'IgG spécifiques et de cytokines), une
augmentation de la sécrétion d'IL-6 et d'IL-10 par la lignée plasmocytaire RPMI-8226,
ainsi qu'une augmentation de l'expression du TLR4 chez certains lymphocytes B. Nos
résultats de stimulation des lignées cellulaires avec du LPS montrent que seules les cellules
d'une lignée au stade plasmocytaire répondait au LPS, suggérant, que la même chose se
produit dans nos cultures de lymphocytes B humains isolés de sang périphérique, c'est-àdire que ce sont les plasmocytes qui lient et répondent au LPS. Puisque ceux-ci sont peu
nombreux dans les cultures, cela pourrait expliquer l'absence de détection de fluorescence
suite à l'ajout du LPS-AlexaFluor 488. Nous pouvons aussi mettre en doute l'efficacité du
complexe LPS-Alexa488 que nous avons utilisé pour les essais. Puisque aucun contrôle
n'a été fait avec des lignées cellulaires connues pour lier le LPS comme les THP-1, une
lignée monocytaire, nous ne pouvons pas conclure sur l'efficacité du complexe. De plus,
ce complexe a été conçu pour étudier les mécanismes d'internalisation du LPS par les
monocytes et les macrophages. Il est donc possible que le protocole de marquage des
cellules pour la cytométrie que nous avons utilisé était inadéquat pour ce type de complexe
et peut-être aussi pour le type de cellules utilisées, soit les lymphocytes B. Finalement,
malgré la détection d'une augmentation de l'expression du TLR4 en cours de culture en
62
présence de LPS, cette augmentation est modeste. Il est ainsi possible que les lymphocytes
B qui expriment ces faibles niveaux de TLR4 ne lient pas suffisamment de LPS pour qu'on
les voit lors des expériences avec le LPS-AlexaFluor 488.
Après maintes réflexions et compte tenu de nos résultats et de ceux recueillis dans la
littérature sur la réponse des lymphocytes B humains au LPS in vitro, nous en sommes
venus à élaborer un mécanisme par lequel le LPS produit un effet sur les lymphocytes B
humains cultivés in vitro. Lorsque stimulés par la présence de LPS, les lymphocytes B au
stade plasmocytaire sécréteraient des cytokines, comme l'IL-6 et l'IL-10, qui stimuleraient
la différenciation terminale des lymphocytes B mémoires avoisinants en nouveaux
plasmocytes sécréteurs. Ces plasmocytes nouvellement différenciés sécréteraient des Acs
contre des Ags auxquels le donneur de lymphocytes B aurait préalablement été exposé.
L'augmentation importante de la sécrétion d'Acs spécifiques à la TT et à l'HBsAg que
nous avons observée en présence de LPS, pourrait être une conséquence de la plus grande
quantité de lymphocytes B spécifiques aux deux Ags parmi la population totale de
lymphocytes B dans le sang, puisque les participants à cette étude étaient tous déjà
immunisés contre l'un ou l'autre de ces Ags. Ainsi, si nous avions effectué un criblage en
ELISA pour la sécrétion d'Acs spécifiques contre d'autres Ags ayant déjà été rencontrés
par le participant, il est fort possible que nous aurions obtenu les mêmes résultats, soit une
augmentation de la sécrétion spécifique à ces Ags.
L'utilité d'un tel mécanisme dans un contexte in vivo peut être envisagée en imaginant
qu'un apport supplémentaire en IL-6 par les lymphocytes B afin de stimuler la
différenciation des lymphocytes B mémoires en cellules sécrétrices d'Acs spécifiques
pourrait aider les monocytes et les macrophages à combattre l'envahisseur. Les monocytes,
les macrophages et les cellules dendritiques, exprimant une grande quantité de TLR4, sont
très sensibles à la présence de LPS et sont les premiers acteurs agissant au début d'une
infection63. Lorsque activés, ces types cellulaires sécrètent beaucoup de cytokines pro­
inflammatoires comme le TNF-a, l'IFN-y mais également de bonnes quantités d'IL-653'54.
La question à se poser est donc : est-ce que l'IL-6 sécrété par les plasmocytes est vraiment
utile dans un contexte d'infection? Les monocytes sécréteurs d'IL-6 sont impliqués très tôt
dans la réponse immunitaire et c'est dans ces premiers instants que l'efficacité et la rapidité
63
de cette réponse se doit d'être la meilleure. La présence d'une bonne concentration d'Acs
sériques est donc primordiale afin de neutraliser le plus d'Ags possible. Ainsi, l'apport
d'une quantité supplémentaire d'IL-6 permettrait d'accélérer l'établissement d'une réponse
immune secondaire en stimulant les lymphocytes B mémoires de toutes les spécificités afin
d'attaquer l'envahisseur sur plusieurs fronts. Ce mécanisme de support a tout récemment
été suggéré par Bishop et ses collaborateurs qui ont montré que les lymphocytes B humains
isolés du sang périphérique répondent à la stimulation par le LPS de la bactérie Francisella
tularensis qui est très différent du LPS tfE.coli (ce LPS n'a pas d'effet mitogénique sur les
lymphocytes B murins) par une augmentation de la sécrétion d'IL-664. Ces résultats
appuient donc les observations faites au cours du présent projet, avec une source de LPS et
un système expérimental complètement différents.
Toute étude utilisant des cellules isolées du sang périphérique de plusieurs individus
comporte toujours sa part de variabilité entre les expériences. Chaque individu ayant des
populations de lymphocytes B un peu différentes, il est normal d'observer des variations
dans les résultats de cultures in vitro. Par contre, cette variabilité entre les résultats pourrait
être amplifiée en utilisant un additif comme le LPS. Il semble, en effet, que chaque
participant réponde de façon différente au LPS. Les travaux de Wurfel et ses collaborateurs
ont montré que certaines personnes répondent fortement au LPS alors que d'autres y
répondent faiblement65. Leur mesure était basée sur la sécrétion d'une dizaine de cytokines
pro- et anti-inflammatoires par les PBMC de 102 individus. Ils ont remarqué une énorme
variabilité dans la sécrétion de cytokines chez ces individus ce qui indique que chaque
personne a un niveau propre de sensibilité au LPS. Cela pourrait expliquer les résultats très
variables d'un participant à l'autre autant dans les analyses de prolifération que de sécrétion
de cytokines. Il est également possible que les différences dans l'expression du TLR4 (ou
du RP105) par les lymphocytes B de certains participants soient en partie responsables de
la variabilité observée dans les résultats de prolifération et de sécrétion d'Acs et de
cytokines.
Afin de pousser un peu plus loin cette étude, les recherches sur les lignées cellulaires
pourraient être poursuivies avec d'autres types de cellules plasmocytaires pour voir si le
même phénomène se produit.
De plus, l'expression des TLRs ou du RP105 sur les
64
plasmocytes ainsi que leur rôle dans l'immunité acquise pourraient être étudiés plus en
profondeur. De nouvelles implications pour les plasmocytes dans la réponse secondaire
pourraient être décelées suite à ces recherches. Il serait également intéressant de travailler
avec des populations triées de lymphocytes B humains (cellules mémoires, plasmocytes)
pour confirmer les hypothèses émises à l'intérieur de ce mémoire et finalement de vérifier
l'expression des récepteurs de l'IL-6 et de l'IL-10 sur les différentes sous-populations de
lymphocytes B cultivés en présence de LPS.
4.2 Transfert du gène AgT dans les lymphocytes B humains
Une seconde avenue poursuivie dans le cadre du présent projet a été d'évaluer l'effet de
l'expression de l'AgT dans les lymphocytes B humains en utilisant un vecteur adénoviral.
Suite aux résultats obtenus après avoir infecté les lymphocytes B humains avec les virus
AgT et ce, à 3 reprises dans 3 cultures différentes, nous n'avons pas été en mesure
d'observer d'effets biologiques sur les lymphocytes B. En effet, la prolifération n'est pas
maintenue à très long terme comme nous l'avions supposé puisque l'AgT intervient dans le
cycle cellulaire pour garder les cellules en phase de prolifération47. Cela peut être dû à
plusieurs facteurs. Premièrement, nous pensions que le moment auquel les lymphocytes B
étaient infectés pouvait être important pour obtenir les résultats escomptés. En fait, nous
pensions que le fait d'infecter les lymphocytes B après une dizaine de jours en culture
pourrait donner des résultats plus intéressants. En effet, cela pourrait donner aux cellules
un deuxième souffle et les maintenir plus longtemps en culture et en bon état. Or, même en
infectant au jour 10 de la culture, la construction du virus AgT que nous avons utilisée lors
de ces expériences ne permet pas de maintenir les lymphocytes B plus longtemps en culture
que l'infection par le virus contrôle ou que les lymphocytes B non-infectés.
Ces résultats négatifs nous ont amené à nous interroger sur la fonctionnalité de la
construction utilisée. Il est peu probable qu'il y ait un effet biologique marqué si le gène
n'est pas efficacement exprimé dans les cellules. Nous avons donc analysé les niveaux
d'expression de l'ARNm et la protéine AgT dans les lymphocytes B et nous avons comparé
ces niveaux à ceux retrouvés dans des cellules immortalisées à l'AgT, soit les cellules
COS-7; Nous avons remarqué que les niveaux d'expression de l'ARNm sont d'au moins 10
65
fois supérieurs dans les COS-7 par rapport aux lymphocytes B infectés avec les virus AgT.
Un problème concernant la détection de l'expression de l'ARNm de l'AgT a également été
décelé. Effectivement, nous nous sommes aperçus que les paires d'amorces utilisées pour
détecter l'AgT en QPCR ne sont pas aussi efficaces que prévues. Les résultats des QPCR
montrent une amplification même dans les lymphocytes B qui n'ont pas été infectés. Il
nous est donc très difficile de se fier aux résultats obtenus et de quantifier un niveau
d'expression si notre échantillon servant de contrôle négatif dénote une amplification
presque égale aux autres échantillons.
Par contre, nous avons constaté que les amorces
sont très efficaces en PCR traditionnel et produisaient un seul amplicon qui correspond à
l'AgT. Grâce à cette technique, nous avons pu estimé que les quantités d'ARNm exprimées
étaient plus faibles dans les lymphocytes B infectés avec les virus AgT que dans les cellules
COS-7 (environ 16 fois plus faibles).
Lorsque nous avons recherché la présence de la protéine AgT, une énorme quantité de
protéine était exprimée chez les COS-7 tandis qu'une quantité à peine détectable était
exprimée dans les lymphocytes B infectés. En comparant ces résultats avec ceux du PCR
semi-quantitatif, on remarque que la quantité de protéine exprimée par les lymphocytes B
infectés ne reflète pas du tout la quantité d'ARNm produite par ces lymphocytes B. En
effet, la différence d'expression de la protéine AgT entre les COS-7 et les lymphocytes B
infectés est énorme alors que la différence d'expression de l'ARNm de l'AgT entre les
deux types cellulaires n'est que de 16X. Ces résultats suggèrent que les lymphocytes B
infectés ont peut-être la capacité d'exprimer une quantité raisonnable de l'ARNm de l'AgT
mais que le problème se situe au niveau de la traduction de cet ARNm en protéine ce qui
n'est évidemment pas le cas pour les cellules COS-7. En analysant de plus près la séquence
du gène AgT utilisée pour la construction du virus, nous nous sommes aperçus qu'il
manque à la séquence une petite portion importante soit la séquence consensus de Kozak.
Cette séquence de 6 nucléotides, située juste avant le codon d'initiation (ATG) de la
traduction, agit comme repère pour le ribosome et permet une meilleure efficacité de la
traduction6 . De plus, nous pensons qu'une région non-codante en 5' de cette séquence
consensus est nécessaire afin de permettre au ribosome, une structure relativement grosse,
de repérer le codon d'initiation. Ainsi, l'absence de la séquence Kozak et d'une région
non-codante en 5' peut expliquer la faible quantité de protéine exprimée chez les
66
lymphocytes B. L'insertion de la séquence Kozak et d'une plus grande région non-codante
en 5' dans la séquence du gène pourrait donner de meilleurs résultats quand à l'expression
protéique de l'AgT et permettre d'observer un effet biologique de ce gène sur les
lymphocytes B humains cultivés in vitro.
5. Conclusion
En conclusion, les travaux réalisés dans le cadre de ce projet ont permis de produire de plus
grandes quantités d'Acs spécifiques et ce, en ajoutant du LPS d' E. coli dans les cultures de
lymphocytes B. Nos résultats suggèrent que la population plasmocytaire activée par la
présence de LPS augmente la sécrétion d'IL-6 et d'IL-10 qui, à leur tour, stimulent la
population de lymphocytes B mémoires spécifiques à un Ag déjà rencontré par l'organisme
à se différencier et à sécréter des Acs spécifiques. De plus, nous avons testé l'efficacité
d'un vecteur adénoviral contenant le gène AgT à permettre la prolifération à long terme des
lymphocytes B. Cependant, nos résultats indiquent un problème au niveau de la traduction
de la protéine AgT par les lymphocytes B. L'ajout d'une séquence non-codante en 5' et de
la séquence Kozak pourrait améliorer l'efficacité de la traduction.
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