Production d`anticorps spécifiques in vitro par culture de

NELLIE DUMONT
PRODUCTION D'ANTICORPS SPECIFIQUES IN
VITRO PAR CULTURE DE LYMPHOCYTES B
HUMAINS
Mémoire présenté
à la Faculté des Études Supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en microbiologie
pour l'obtention du grade de Maître es sciences (M.Se.)
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE ET DE MICROBIOLOGIE
FACULTÉ DES SCIENCES ET GÉNIE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
FEVRIER 2008
© Nellie Dumont, 2008

Résumé
Les anticorps, piliers de la réponse immunitaire humorale, sont fréquemment utilisés pour
traiter certaines immunodéficiences et maladies autoimmunes. Des préparations
d'anticorps spécifiques à un antigène sont également administrées à des indivudus, suite à
un contact avec un pathogène. Cependant, nous sommes limités dans leur production ainsi
que dans la variété des spécificités antigéniques puisque leur préparation dépend de la
disponibilité d'individus hyperimmunisés. Ce projet a donc pour objectif de produire des
anticorps spécifiques in vitro en cultivant les lymphocytes B humains isolés du sang de
participants. En stimulant les lymphocytes B humains avec du LPS d'Escherichia coli, la
sécrétion d'anticorps spécifiques et la sécrétion de cytokines ont augmenté. Nous pensons
que ce mécanisme accélère la réponse secondaire lors d'une infection bactérienne. Nous
avons également tenté de stimuler la prolifération des lymphocytes B humains en
surexprimant le gène AgT, un gène stimulant la croissance cellulaire chez les cellules COS-
7. Cependant, nous n'avons pas été en mesure d'obtenir obtenir un effet biologique.

ii
Avant-propos
Tout d'abord, je tiens à remercier ma directrice de maîtrise, Renée Bazin, pour m'avoir
accueillie dans son équipe ainsi que pour sa bonne humeur et sa grande disponibilité. Je
remercie également les membres de mon comité aviseur, André Darveau et Sonia Néron,
pour leurs précieux conseils et commentaires.
Je veux remercier tous les étudiants gradués d'Héma-Québec avec qui j'ai passé deux
merveilleuses années pour les moments de décrochage et de fous rires, et plus
particulièrement Éric Aubin et Dominic Paquin Proulx pour leurs discussions interminables
mais toujours pertinentes. Du même coup, je tiens à remercier toute l'équipe de R&D
d'Héma-Québec ainsi qu'Héma-Québec pour le soutien technique et financier.
Je remercie sincèrement ma mère Diane, qui trouve toujours les bons mots pour
m'encourager à continuer mon travail ainsi que mon papa Maurice, mon beau-père Denis et
ma soeur Maude pour leur soutien constant. Finalement, je remercie tous mes amis de
Québec, de Montréal, de Sept-Iles et de Rouyn-Noranda qui m'ont fait passer des moments
inoubliables, chacun de vous partage avec moi une part de mon succès.

Table des matières
Résumé i
Avant-propos ii
Table des matières iii
Liste des tableaux v
Liste des figures vi
Liste des abréviations viii
1 .Introduction 1
1.1 Le système immunitaire 1
1.1.1 Hématopoïèse 1
1.1.2 Réponses immunitaires innée et acquise 2
1.1.3 Réponses à médiation cellulaire et humorale 4
1.2 Production in vivo d'anticorps par les lymphocytes B 4
1.2.1 Maturation du lymphocyte B 4
1.2.2 Activation des lymphocytes B naïfs 5
1.2.3 Différenciation des lymphocytes B activés en cellules effectrices mémoires et
plasmocytaires 7
1.2.4 Rôle des TLR dans l'activation des lymphocytes B 8
1.2.5 Les Anticorps : structure et fonctions 11
1.3 Production in vitro d'anticorps humains 14
1.3.1 Fusion cellulaire 15
1.3.2 Système de culture CD40-CD154 15
1.4 Problématique et objectifs du projet de maîtrise 17
2. Matériel et Méthodes 20
2.1 Isolement des cellules 20
2.1.1 Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique 20
2.1.2 Isolement des lymphocytes B 21
2.2 Culture de lymphocytes B dans le système CD40-CD154 22
2.2.1 Lignée cellulaire L4.5 22
2.2.2 Culture des lymphocytes B 22
2.2.3 Mesure de la prolifération et de la viabilité cellulaire 22
2.3 Dosage des facteurs solubles dans les surnageants de culture de lymphocytes B 23
2.3.1 Dosage des IgG totaux 23
2.3.2 Dosages des IgG spécifiques au tétanos ou à l'hépatite B 24
2.3.4 Évaluation de la polyréactivité des Acs 24
2.3.5 Dosage de l'IL-6 par ELISA 24
2.4 Cytométrie en flux : Évaluation de l'expression des marqueurs de surface 25
2.5 Étude de l'effet du LPS sur l'expression de cytokines par les lymphocytes B humains
26
2.5.1 Préparation de lysats cellulaires 26
2.5.2 Préparation d'ARN et d'ADN complémentaire (ADNc) de lymphocytes B
normaux et de lignées cellulaires 26
2.5.3 PCR quantitatif en temps réel 27
2.5.4 Cytokine arrays 28
2.6 Transfert du gène Antigène Grand T dans les lymphocytes B 28

iv
2.6.1 Construction du vecteur adénoviral AD5/F35 exprimant l'AgT du virus SV40.28
2.6.2 Infection des lymphocytes B avec les constructions virales contenant l'AgT ...29
2.6.3. Détection de l'AgT par immunobuvardage (Western blot) 30
2.6.5 PCR traditionnel et séquençage 31
3. Résultats 32
3.1 Étude de l'effet du LPS sur les lymphocytes B humains 32
3.1.1 Effet de l'ajout de LPS sur la prolifération des lymphocytes B humains 32
3.1.2 Effet de l'ajout de LPS sur la sécrétion d'Acs par les lymphocytes B humains.35
3.1.3 Évaluation de la réactivité des Acs produits suite à l'ajout de LPS dans les
cultures de lymphocytes B humains 38
3.1.4 Évaluation de l'effet du LPS sur les populations de lymphocytes B humains. ...40
3.1.5 Effet de l'ajout de LPS sur la production de cytokines pro-inflammatoires par les
lymphocytes B humains et par des lignées cellulaires de lymphocytes B humains 42
3.1.6 Effet de l'ajout de LPS dans les cultures de lignées cellulaires de lymphocytes B
humains 47
3.2 Effet de l'expression de l'AgT dans les lymphocytes B humains 50
4. Discussion 57
4.1 Étude de l'effet du LPS chez les lymphocytes B humains 57
4.2 Transfert du gène AgT dans les lymphocytes B humains 64
5. Conclusion 67
6. Bibliographie 68