10 - AMPCfusion

Parcours génétique
Cours 10
Jeudi 14 janvier 2016
Marion Delous
[e-mail]
RT : Philippine Le Barrois d’Orgeval
RL : Julien Messié
Modèles animaux des maladies génétiques (Zebrafish)
Plan :
I. Généralités
A- Zebrafish : pourquoi un modèle animal ? Pourquoi
utiliser plutôt le zebrafish que la souris ?
B- Génétique du zebrafish
C- Origine et conditions d’hébergement du zebrafish
D- Accouplement du zebrafish
II. « Forward genetics »
A- Mutagénèse chimique (ex : ENU)
1) Crible à grande échelle
2) Crible haploïde
3) Crible diploïde homozygote
(gynogénèse)
4) Clonage positionnel
B- Mutagénèse insertionnelle (rétrovirus, transposon)
III. « Reverse genetics »
A- Morpholino
1) Structure
2) Cage morpholinos
B- TILLING (Targeting Induced Local Lesions in
Genomes) project
C- « Genome editing » TALEN/CRISPR
1) Knock-out: introduction d’une
mutation (aléatoire) dans un site précis du génome
2) Knock-in : insertion d’une
séquence d’intérêt dans un site précis du génôme

IV. Limitations du modèle zebrafish
A- Contribution maternelle
B- Duplication du génôme : exemple du gène Sox9
C- Différences entre les études morpholinos et les
TALEN/CRISPR
V. Modèle zebrafish de la nephronophtise, ciliopathie
rénale
A- Les cils
B- La néphronophtise
Abréviations : AA = acide aminé
Mot du RT
Au début du cours, Michel Vidaud a dit que c’était très probable que les CRISPR
tombent à l’examen, car c’est une avancée majeure.

I. Généralités
A- Zebrafish : pourquoi un modèle animal ? Pourquoi utiliser plutôt le
zebrafish que la souris ?
- Développement embryonnaire externe : on peut suivre (sous microscope)
l’embryogenèse pendant les 24 premières heures puis on observe la formation des
organes, l’organogénèse.
- Embryons optiquement transparents.
- On peut garder les larves pendant 5 à 7 jours dans des boîtes de petri (à partir de 7 jours
on doit mettre les larves dans l’eau.
- Temps de génération court : 3 mois, similaire à celui de la souris.
- Grandes portées : une femelle peut pondre des centaines d’embryons à la fois
- Les embryons et les adultes sont de petite taille (les adultes font de 2 à 3 cm) :
hébergement peu coûteux, on peut faire du high throughput screening (plaque 96 puits)
- Modèle vertébré, ayant l’ensemble des tissus et organes de l’Homme (sauf poumons,
glande mammaire et prostate) + conservation majeure des voies de signalisation.
- Modèles d’études de la régénération.

B- Génétique du zebrafish
- 25 chromosomes : divisé par 2 par rapport à l’homme
- 70% des gènes humains ont un orthologue chez le zebrafish
- 84% des gènes humains responsables de maladie sont représentés chez le
zebrafish
- Séquençage du génome en cours, quasi complet
- Particularité : duplication du génome total : pour un gène humain il peut y avoir 2
gènes (paralogues) chez le zebrafish. La fonction des paralogues peut être redondante
ou complémentaire (expression dans des organes distincts en y assurant une fonction
similaire).
C- Origine et conditions d’hébergement du zebrafish
Origine : Poisson d’eau douce, originaire d’Inde, de la région du Gange : climat tropical de
mousson, eaux calmes des rizières, rivières de basse montagne
Conditions d’hébergement :
- Environnement à 28° (important pour la fécondation)
- Cycle jour/nuit de 14h/10h
- pH = 7.0
- Conductivité 500-800 microsiemens (µS) (une fois que l’animal est adapté à une certaine
conductivité, on la change très peu, ou alors il faut habituer l’animal de façon graduelle à
une nouvelle conductivité)
- Contrôle quotidien de la qualité de l’eau
- Densité des poissons par aquarium (règle éthique de pas plus de 20 poissons par
aquarium de 3.5 L).
- La façon d’euthanasier et de manipuler les poissons est aussi contrôlée.

D- Accouplement du zebrafish
L’accouplement du zebrafish se fait dans des aquariums d’accouplement, en dehors du système.
Comment reconnaître le mâle de la femelle ? La femelle est la plus bombée (à cause des
œufs). Il y a aussi une différence au niveau de la couleur des nageoires : la femelle a une nageoire
dorsale jaune et une nageoire ventrale transparente alors que la mâle va avoir des nageoires
orangées.
Les aquariums possèdent une séparation (séparation du mâle et de la femelle) et un « grillage »
permettant de séparer les adultes des embryons (pour protéger ces embryons qui pourraient
être mangés par leurs propres parents).
Le stimulus de l’accouplement est la lumière.
A partir du moment où ils peuvent s’accoupler, le mâle et la femelle vont commencer à rentrer en
contact : le mâle va chasser la femelle et presser sur son ventre pour qu’elle relargue ses œufs, et
lui va relarguer en même temps son sperme, ce qui va faire une fertilisation externe.
Comme on fait des injections dans les œufs de zebrafish, on veut vraiment pouvoir
contrôler le moment de la ponte. En effet, on fait les injections au stade 1 cellule, stade qui
ne dure que 30 à 40 minutes après la ponte.
Ensuite les œufs sont collectés et triés. Ils sont placés en incubateur jusqu’à 5 jours et demi