CONTRÔLE CONTINU LV203 du 7 Novembre 2006

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CONTRÔLE CONTINU LV203 du 7 Novembre 2006
Durée de l’épreuve 1 heure
Lire attentivement le sujet; toutes les réponses devront être justifiées.
Un ADN plasmidique pBR12 est purifié en vue d'un clonage. Après la purification, cet ADN
pBR12 doit être quantifié. Pour cela, l'absorption à 260 nm est mesurée et on obtient une
DO260nm = 0,9.
Q1 : Calculer la concentration de l'ADN purifié, sachant que la cuve contient un volume de 1 mL
d'une solution obtenue en mélangeant 100 µL de pBR12 et 900 µL H2O.
On admet que DO260 nm = 1 pour une solution d'ADN double brin à une concentration de 50 µg/mL.
Dans la cuve la solution est à une concentration de 45 µg/mL (50 x 0,9).
Mais la solution initiale a été diluée 10 fois donc [ADN initial] = 450 µg/mL
Cet ADN plasmidique est ensuite hydrolysé ou non par une enzyme de restriction puis une
électrophorèse sur gel d'agarose est réalisée, voir figure suivante et sa légende.
1 2 3
Sens de migration
4,5 kpb
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
Légende : Piste 1 : pBR12 avant hydrolyse
Piste 2 : pBR12 hydrolysé par BamH1 (5'G/GATCC3') ; enzyme de restriction à site
unique dans la séquence ADN de pBR12
Piste 3 : Marqueurs de taille (Taille des fragments exprimée en kilo paire de bases).
Q2 : Donner la structure du plasmide pBR12 dans le puits 1, même question pour le puits 2.
Pourquoi observe-t-on une différence de migration ?
Puits 1 : le plasmide pBR12 natif est sous forme double brin circulaire superenroulé
(négativement).
Puits 2 : le plasmide pBR12 est hydrolysé par l'enzyme de restriction BamH I, on obtient
un ADN double brin linéaire. Cette hydrolyse ne donne qu'un fragment car un site de
coupure sur l’ADN plasmidique circulaire.
Migration différente entre les puits 1 et 2 : l'ADN migrant dans le puits 2 est double
brin linéaire. Dans le puits 1, le plasmide pBR12 natif est sous forme double brin
circulaire. L’ADN natif migre plus vite que l’ADN linéaire car le natif est plus
compacté, migration en fonction de la forme.
Q3 : Donner la séquence nucléotidique aux extrémités de l'ADN migrant dans le puits 2. Préciser la
nature de ces extrémités.
5'GATCC-----------------------------G3'
3'G-----------------------------CCTAG5'
Extrémités cohésives 3'rentrées ou 5'sorties.
Q4 : Donner en paires de bases la taille de pBR12.
Il faut comparer la migration de la piste 2, db linéaire avec celle des fragments
linéaires
de la piste 3 . Le fragment de la piste 2 migre à la même distance que le fragment de
3500 pdB du marqueur, donc le plasmide a une taille de 3500 pdB.
Q5 : Sur une représentation détaillée de l’enchaînement de deux nucléotides d’un brin d’ADN « du
site BamH1 » dont les bases seront représentées par les lettres correspondantes, indiquer (à
l’aide d’une flèche) quelle liaison est rompue sous l’action de l’enzyme BamH I.
O
O
P
O-
Liaison ester
phosphate
hydrolysé par
BamH I
G
CH2
5' O
O
H
H 1'
H 3'
H
O
O
P
O-
H
O
G
CH2
5' O
H
H 1'
H 3'
H
O
H
Un fragment d’ADN nommé rpsu dont la séquence est la suivante, est amplifié dans son
intégralité par la méthode d’amplification PCR (Polymerase Chain Reaction).
5’TATAGGATCCATGTAGCATGTCCCCATGGGATATCAAT......//........CCAATGGACTCAGTGAAACATGTAAGGATCCGC 3’
3’ATATCCTAGGTACATCGTACAGGGGTACCCTATAGTTA......//........GGTTACCTGAGTCACTTTGTACATTCCTAGGCG 5’
Q6 : Donner la séquence des amorces de 20 nucléotides nécessaires à cette amplification et
positionner les sur la séquence.
3’ACTTTGTACATTCCTAGGCG 5’
5’TATAGGATCCATGTAGCATG 3’
On veut insérer dans le plasmide digéré par BamH I, la séquence codante contenue dans le fragment
d’ADN rpsu (cette séquence codante est signalée par le codon ATG d’initiation et le codon STOP
TAA soulignés sur la séquence ci-dessus).
Q7 : Donner les étapes d’un protocole et les enzymes utilisées, permettant d'obtenir in vitro, un
plasmide recombinant à partir du pBR12 hydrolysé par BamH I et de l' ADN rpsu amplifié
(plusieurs protocoles sont possibles, n’en détailler qu’un seul). Donner et discuter les produits
obtenus à l’issue de ce protocole.
2 possibilités :
1) - digestion de l' ADN rpsu par BamH I car il existe des sites BamH I aux 2
extrémités de l'ADN rpsu
- déphosphrylation d’un des deux ADN (pBR12 ou rpsu)
- ligation par une ADN ligase (de pBR12 et de l'ADN rpsu
car extrémités cohésives compatibles
ou 2) - action d'une ADN pol I, fragment Kleenow, sur pBR12 digéré. Les
extrémités sont 3'rentrées, donc une synthèse est possible.
Cela aboutit à des extrémités franches.
- déphosphrylation d’un des deux ADN (pBR12 ou rpsu)
- ligation par une ADN ligase des extrémités franches des 2 ADN
Dans tous les cas on obtient les produits ADN suivant :
- Plamide recombinant avec insertion non orientée (une seule est recherchée car
séquence codante)
- recircularisation du plasmide
- recircularisation ou multimérisation du fragment rpsu
L’ADN plasmidique pBR12 purifié et hydrolysé par BamH1 (voir question 1) a été chauffé
30 minutes à 96°C
Q8 : Comment appeler cette expérience ? Décrire les événements qui interviennent au cours de
cette expérience. Quelle est la structure de l'ADN après chauffage ?
Il y a eu dénaturation thermique de l'ADN, avec rupture des liaisons hydrogène entre
les paires de bases complémentaires et séparation du double brin en 2 simples brins.
L'ADN après chauffage est simple brin linéaire.
Une mesure de l'absorption est réalisée après les 30 min à 96°C et donne une DO260 nm = 1,2.
(Rappel avant expérience, la DO260 nm était de 0,9)
Q9 : Nommer le phénomène spectroscopique associé et expliquez-le.
C'est l'effet hyperchrome.
Cet effet est dû à la perte de l'empilement ou stacking des bases. Dans l'ADN natif,
l'empilement des bases, crée une délocalisation du nuage électronique π des bases ce qui
rend les électrons moins excitables par les UV: un échantillon simple brin aura une
absorbance supérieure que le même échantillon double brin .