Tp3 specificite ac

TP 3 : Les anticorps, molécules de l’immunité adaptative
Objectifs : mettre en évidence la spécificité d’un anticorps vis-à-vis d’un antigène.
Matériel envisageable :
- de laboratoire (verrerie, instruments...)
- d'observation (microscope, loupe binoculaire...)
- de mesure et d'expérimentation (balance, chaîne ExAO...)
- informatique et d’acquisition numérique ( Rastop , Anagène…)
Activité 1 : Recherche d’un antigène par la technique d’immunodiffusion (méthode d’Ouchterlony).
Activités et déroulement des activités
Exigences
Étape 1 : Concevoir une stratégie pour résoudre une situation problème (durée maximale : 10 minutes)
La méthode d’Ouchterlony est utilisée pour détecter la présence d’anticorps spécifiques dans un sérum.
1) A l’aide de la fiche annexe, proposer, en complétant la fiche réponse, une démarche
d’investigation permettant de déterminer quel est l’antigène à l’origine de la réponse adaptative de
Mlle Grey.
mise en relation des informations et des connaissances.
Appeler l’examinateur pour vérifier votre proposition et obtenir la suite du sujet.
Étape 2 : Mettre en œuvre un protocole de résolution pour obtenir des résultats exploitables
2) Mettre en œuvre le protocole d'immunodiffusion sur gel, afin de déterminer l’antigène contre
lequel Léonor Grey a développé une réaction immunitaire adaptative.
Manipulation correcte.
Poste de travail rangé en fin d’ expérience.
Appeler l’examinateur pour vérifier le résultat et éventuellement obtenir une aide
(les résultats peuvent ne pas être directement exploitables)
Étape 3 : Présenter les résultats pour les communiquer
3) Indiquer le résultat obtenu sur le document 2 de la fiche réponse.
Lecture correcte des résultats
Appeler l'examinateur pour vérification de votre production
4) Dans chaque cas (formation de l’arc de précipitation ou absence d’arc), réaliser un schéma
Schémas précis et rigoureux.
d’interprétation à l’échelle moléculaire, en utilisant les symboles proposés dans la fiche réponse.
Étape 4 : Exploiter les résultats obtenus pour répondre au problème
5) A partir des résultats obtenus, déterminer quel est l’antigène pour lequel Léonor Grey a déclenché
Démarche explicative cohérente.
une réponse immunitaire adaptative. Quel traitement lui proposer ?
Fiche réponse du TP 3 (Activité 1) : Les anticorps, molécules de l’immunité adaptative
Document 1 : disposition des puits
Document 2 : résultat
Justifier le choix effectué :
Schéma d’interprétation de la formation d’un arc de
précipitation :
Symbolisation de l’anticorps
à utiliser dans les schémas
d’interprétation
Détermination de l’antigène à l’origine de la réponse adaptative de Léonor GREY :
Schéma d’interprétation de l’absence d’arc de précipitation :
Fiche Annexe : Principe de la méthode d’Ouchterlony :
C’est une méthode d’immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans
toutes les directions autour des puits.
Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact, lorsqu’elles ont suffisamment progressé. Cette zone de contact reste invisible
s’il n’y a pas de réaction entre les deux solutions.
Quand la réaction se produit, il se forme un arc de précipitation visible à l’œil nu.
Celui-ci est dû à l’interaction entre de nombreux anticorps et les antigènes spécifiques, entraînant la formation de complexes non solubles
dans le gel (complexes immuns).
Solution contenant le sérum du patient
Solution avec AG testé
Matériel disponible et protocole d'utilisation du matériel
Matériel à disposition :
-
Une boite de Pétri (6 cm de diamètre) avec gélose
Un récipient poubelle
-
Sérum de Léonor (noté SLG)
4 solutions correspondant aux antigènes * :
-
1 solution témoin avec eau distillée : E
- Un emporte pièce et un cure dent
- 1 micropipette et 6 cônes
- Un marqueur indélébile
- Papier noir
Solution d’antigène Borrelia : AGB
Solution de divers antigènes de la gaine de myéline : EG1, EG2, EG3
* les produits utilisés (soude notamment) sont des produits de substitution permettant de modéliser les réactions entre sérum et AG, afin d'éviter les risques liés
à la manipulation de produits biologiques dangereux. Cependant, un risque chimique subsiste puisque la soude provoque des brûlures et lésions oculaires.
PROTOCOLE
1) Utiliser le gabarit de perçage ci-contre pour creuser à l’aide du tube emporte pièce les puits nécessaires dans le gel d’Agar. Ces
puits doivent être uniformément répartis et disposés à égale distance du puits central.
2) Eliminer les disques de gelose avec le cure-dent si nécessaire.
3) Marquer sous la boîte de Pétri la disposition des produits à déposer dans les puits permettant de révéler la réaction de
l’anticorps étudié avec les différents antigènes proposés (utiliser le même ordre que celui précédemment choisi)
4) Remplir les différents puits avec 3 gouttes si la micropipette est rouge (100µL) ou avec tout le contenu du cône si la
micropipette est bleue (50 µL) : Chaque produit devra être prélevé avec un cône propre et réservé à ce produit, puis être
déposé dans les puits sans débordement, ni bulles et sans endommager le gel d’agar.
5) Fermer la boîte.
6) Observer les résultats au bout de 20 minutes sur fond noir et en éclairage rasant.
gabarit de perçage
Activité 2 : Etude de la relation structure-fonction des Anticorps
Activités et déroulement des activités
Exigences
Étape 1 : Concevoir une stratégie pour résoudre une situation problème
1. Proposer une démarche d’investigation visant à déterminer la structure d’un anticorps retrouvé
dans le sérum de Miss GREY.
mise en relation des informations et des connaissances
2. Comment mettre en évidence sa spécificité vis-à-vis de la bactérie Borrelia ?
Étape 2 : Mettre en œuvre un protocole de résolution pour obtenir des résultats exploitables
Utilisation maîtisée des logiciels.
Protocole correctement réalisé.
3. Mettre en œuvre le protocole proposé.
Appeler l’examinateur pour vérifier le résultat et éventuellement obtenir une aide .
Étape 3 : Présenter les résultats pour les communiquer
4. Présenter vos observations sous la forme de votre choix afin de les communiquer.
Rédaction des idées cohérente.
Schématisation pertinente.
Étape 4 : Exploiter les résultats obtenus pour répondre au problème
5. Expliquer l’origine de la spécificité d’un anticorps pour son antigène.
6. Compléter le schéma de l’anticorps afin d’obtenir un complexe antigène-anticorps.
Démarche explicative cohérente.
Matériel disponible et protocole d'utilisation du matériel
PROTOCOLE
1- Mettre en évidence la structure d’une molécule d’anticorps :
o Ouvrir le logiciel Rastop dans le dossier biologie moléculaire présent sur le bureau.
o Ouvrir, dans le dossier rastopvf\data\molecules\IGG-LYS-3D, le fichier IGGTOTAL.
o
S'affiche la molécule d'anticorps anti-borrelia (anti-AGB) complète.
o Colorer les différentes chaînes de la molécule et représenter la molécule en sphères :
Un anticorps est une protéine constituée par 4 chaînes polypeptidiques.
o
Matériel à disposition :
- Pour RASTOP : Fichier IGGTOTAL.PDB et IGG-LYS
situé dans le dossier :
rastopvf\data\molecules\IGG-LYS-3D
- Pour ANAGÈNE : Fichier igg-V531 situé dans le
répertoire sauve.
Repérer les 2 chaines lourdes et 2 chaines légères et légender le document proposé.
2- Utiliser les fonctionnalités du logiciel Anagène afin de comparer les séquences des chaînes lourdes des anticorps anti-AGB et anti-myéline.
o Ouvrir le logiciel Anagène 2 dans C:\programfiles(*86)\anagène2 , puis ouvrir le fichier « igg-V531.thm » dans C:\SVT\prog-SVT\anagene\sauve\
o Sélectionner les deux séquences :
1NLD-chLourde (pour AC anti-myéline) et chaineH_ACY
(pour AC anti-borrelia) ;
o
o
Les traiter en les comparant (alignement avec discontinuité) ;
Repérer l’existence d’une portion à fortes différences et d’une portion relativement identique.
3- Faire de même pour les séquences des chaînes légères :
Utiliser les séquences : 1NLD-chLegere (pour AC anti-myéline) et chaineL_ACY (pour AC anti-borrelia)
Appeler le professeur pour vérifier.
Noter vos constatations
Proposer une hypothèse expliquant la spécificité d’un AC
4- Mettre en évidence les relations antigène-anticorps :
o
Reprendre le logiciel Rastop ;
o
Ouvrir, dans le dossier rastopvf\data\molecules\IGG-LYS-3D, le fichier IGG-LYS
o
S'affiche une portion de l'anticorps anti-borrelia, colorer alors chacune de ses chaînes.
o
Faire apparaître les deux fenêtres juxtaposées ;
o
Repérer les différentes chaînes représentées sur cette portion de molécule et la position de cette portion d’anticorps au sein de la molécule complète.
o
Distinguer spécifiquement la partie variable de la chaîne légère (L) ; pour cela :

Sélectionner cette partie de la molécule :( cf fiche technique)(A l’aide des numéros de l’intervalle des éléments très variables de la chaîne repérés grâce au logiciel Anagène) ;

Les faire apparaître en sphères.
o
Distinguer de même spécifiquement la partie variable de la chaîne lourde (H).
o
Afficher en sphères de couleur distincte la molécule d’antigène
Appeler le professeur pour vérifier.
5- Observer le lien antigène-anticorps :
o
Faire pivoter le complexe anticorps-antigène, afin de l'observer "vue de dessus", antigène vers vous
o
Explorer alors le cœur de ce complexe. ( cf fiche méthode : à l’aide du bouton –front-)