Produire une protéine recombinante Principes et Méthodes de
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Produire une protéine recombinante Principes et Méthodes de Biologie Moléculaire Gabrielle Potocki-Veronese INSA-Laboratoire Biotechnologie-Bioprocédés Toulouse Equipe Ingénierie Enzymatique Moléculaire [email protected] Produire une protéine recombinantes Comment faire ? 1 Disposer de l’ADN codant pour la protéine 2 L’insérer dans un hôte 3 Hôte = usine à production de protéines 4 Extraire la protéine Synthèse des protéines Rappels : transcription Synthèse des protéines Rappels : traduction Synthèse des protéines L’ADN : information génétique Double brin Bases nucléotidiques A,T,G,C Synthèse des protéines L’ARN : intermédiaire entre ADN et protéine Simple brin Bases nucléotidiques A,U,G,C Synthèse des protéines Procaryotes et eucaryotes Eucaryotes Procaryotes (bactéries) Synthèse des protéines Modifications postpost-traductionnelles -stabilité du repliement - adressage - cascades de signalisation - ancrage dans les membranes - solubilité - identité immunologique Synthèse des protéines Modifications postpost-traductionnelles Modification Site Exemple Acétylation K Histones Gamma-carboxylation carbone en position gamma de E prothrombine Amidation G terminale gastrine Biotinylation K pyruvate carboxylase Carboxylation K, D, E Prothrombine Glycosylation O-glycosylation sur S, T et hydroxylysine; Groupes sanguins N-glycosylation sur N Collagène Hydroxylation P, K, D et Y Collagène Prénylation C en C-terminal Ras S-acylation C rhodopsine Myristoylation G en N-terminal NADH-cytochrome b5 Méthylation K, H, R, D, E Actine Phosphorylation Y, S, T MAP kinases Sulfatage Y APP, thyroglobuline Ubiquitination K Histones H2A, H2B (farnesylation, geranylgeranylation) Synthèse des protéines Modifications postpost-traductionnelles Glycosylation Liaison covalente d’un sucre à : - O du groupement OH de Ser, Thr, Hydroxylysine (collagène) - N du groupement amide de Asp Catalysée par des ‘glycoprotéines glycosyltransferases’ ou ‘oligosaccharide protein transferases’ Contribue à la stabilité du repliement, adressage, solubilité, antigénicité… Présente chez toutes les cellules eucaryotes et certaines procaryotes Synthèse des protéines Modifications postpost-traductionnelles -Procaryotes Procaryotes : - Pas ou peu de modifications post-traductionnelles (transcription et traduction simultanées) -Eucaryotes Eucaryotes : - Exportation dans réticulum endoplasmique grâce au peptide signal formation des ponst di-S (milieu oxydant) glycosylation repliement (foldases) - Passage par appareil de Golgi glycosylation - Excrétion ou insertion dans la membrane Choix de l’hôte Bactéries Escherichia coli - Génétique très bien connue -Nombreux outils de clonage commerciaux - Facile à cultiver (fermentation) - Expression élevée (plusieurs grammes / L de protéine recombinante) - Pas de modifications post-traductionnelles (glycosylation) -Faible potentiel de sécrétion Autres bactéries (Bacillus subtilis subtilis,, Streptomyces Streptomyces…) …) - Fort potentiel de sécrétion - Génétique moins connue -Niveaux de production inférieurs Choix de l’hôte Eucaryotes Levures (Saccharomyces cerevisiae cerevisiae,, Pichia pastoris pastoris,, lactis,, Yarrowia lypolytica lypolytica…) …) Kluyveromyces lactis - Modifications post-traductionnelles (glycosylations simples, acylation..) - Outils de clonage commerciaux (S. cerevisiae) -Faciles à cultiver - Bonne expression (plusieurs centaines de mg / L) -Faible potentiel de sécrétion pour les grandes protéines Champignons (Aspergillus niger…) - Excrétion - Modifications post-traductionnelles (certaines non souhaitées) Choix de l’hôte Eucaryotes Cellules de mammifères (cellules Chinese Hamster Ovary, lignées permanentes…) - Production de grosses protéines recombinantes complexes (protéines humaines, anticorps..) - Faible rendement (10 mg/L max) - Coût élevé Insectes (Spodoptera frugiperda frugiperda…) …) - Systèmes de clonage dérivés du Baculovirus - Utilisation industrielle pas encore opérationnelle Clonage d’un gène Principe Organisme donneur Extraction et coupure de l’ADN en fragments contenant de un à plusieurs fragments d’intérêt Vecteur Transporteur d’ADN: fragment d’ADN capable de réplication autonome Insertion individuelle de chaque fragment d’ADN dans une molécule de vecteur Obtention de l’ADN recombinant Nouvelle combinaison de l’ADN donneur (qui peut être de n’importe quel organisme) avec l’ADN d’un vecteur qui peut être d’origine complètement différente Pêche au gène Obtention de l’ADN de l’organisme donneur A partir de l’ADN génomique (chromosomique) (lignées cellulaires, tissus, organismes entiers) Pour un organisme donné, l’ADN génomique est le même quel que soit le type cellulaire Pêche au gène Obtention de l’ADN de l’organisme donneur A partir de l’ARNm : reverse transcription (lignées cellulaires, tissus, organismes entiers) L’ARNm diffère en fonction du type cellulaire Pêche au gène Obtention de la séquence du gène Séquençage de l’ADN : méthode de Sanger • • • ddNTP : analogues structuraux des dNTP. ddNTP : incapables de réaliser une liaison phosphodiester. ADN polymérase incorpore dNTP ou ddNTP. Pêche au gène Séquençage de l’ADN Pêche au gène Séquençage de l’ADN • • • Liaison de l’amorce avec l’ADN à séquencer. La fixation des ddNTP aux brins d’ADN va créer des brins de différentes tailles. Les brins vont migrer sur un gel d’électrophorèse selon leur taille : le plus petit migre le plus vite. Pêche au gène Séquençage de l’ADN Pêche au gène Séquençage de l’ADN Pêche au gène Séquençage de l’ADN Pêche au gène Polymerase Chain Extension (PCR) Quand on a la séquence du gène ou celle d’un gène très homologue ADN Gène d’intérêt ATG 5’ Codon stop 3’ 5’ 3’ Dénaturation 5’ Milieu réactionnel 3’ -ADN polymerase (fidélité TAQ pol : 0.03 %) - amorces -dNTP (dATP, dTTP, dGtp, dCTP) 5’ -MgCl2 -Matrice d’ADN Amorce sens 5’ 3’ 94°C 3’ 5’ Hybridation 55°C n cycles (variable) 3’ 3’ 3’ 5’ Amorce reverse 5’ Amplification 5’ 3’ 3’ 5’ 72°C Température d’hybridation, durée d’amplification, nombre de cycles, concentration en matrice dépendent du % (G+C) et de la longueur du gène Pêche au gène Amplification d’un gène eucaryote Exon 1 Intron Exon 2 PCR : amplification des exons 1 et 2 PCR sans amorce : fusion des 2 exons PCR : amplification du produit de fusion Pêche au gène Limites de la PCR Lorsqu’on utilise des amorces complémentaires de zones consensus de gènes homologues : - Amplification non-spécifique - Séquence pas entière -Obtention de plusieurs gènes homologues - Mutations ponctuelles Clonage d’un gène Obtention de l’ADN recombinant gène d’intérêt Vecteur (plasmide) ADN donneur (ou produit PCR) Coupure (enzyme de restriction) Ligature (ligase) ADN recombinant Clonage d’un gène Enzymes de restriction - Enzymes bactériennes - Reconnaissent des séquences spécifiques sur l’ADN de 4 à 8 paires de bases (pb) - Clivent l’ADN sur les 2 brins au niveau de ces sites (coupure des ponts phosphodiesters) Clonage d’un gène Enzymes de restriction - La plupart des sites de reconnaissance sont des séquences inversées répétées (palindromes) Cas de EcoRI : 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ - Formation de bouts collants ou de bouts francs Clonage d’un gène Séparation des fragments d’ADN - Electrophorèse sur gel d’agarose - Visualisation de l’ADN après incubation dans le BET (agent intercalant) et exposition aux UV Clonage d’un gène Ligature T4 DNA Ligase : lie de façon covalente les extrémités 5’ et 3’ de deux brins d’ADN lorsqu’elles sont complémentaires Clonage d’un gène Vecteurs de clonage Capable de réplication autonome dans une cellule hôte donnée (origine de réplication de type procaryotique et / ou eucaryotique) T4 DNA Ligase : lie de façon Possède un les polylinker (site5’ multiple covalente extrémités et 3’ dede clonage) deux brins d’ADN lorsqu’elles sont complémentaires Supporte l’insertion d’un fragment d’ADN de taille variable Clonage d’un gène Vecteurs de clonage Taille maximum de l’insert Plasmide bactérien Phage λ Cosmide PAC : P1-derived Artificial Chromosome BAC : Bacterial Artificial Chromosome YAC : Yeast Artificial Chromosome 15 kbp 25 kbp 45 kbp 75-95 kbp 100-350 kbp 300-500 kbp Clonage d’un gène Plasmides - Extrachromosomique - Transmis de façon stable - Taille :de 2 à 200 kbp - Nombre de copies variable réplication stricte (1 à 5 copies) réplication relachée (>15) - Gène de résistance à un antibiotique - Promoteur inductible Sites de restriction (polylonker) Promoteur inductible Résistance antibiotique Origine de réplication Clonage d’un gène Promoteurs de transcription inductibles Clonage d’un gène Promoteurs de transcription Clonage d’un gène Clonage : les étapes 1 - Insertion du fragment dans le vecteur 2 - Transformation des cellules hôtes 3 - Amplification des plasmides 4 – Induction de l’expression génique Production de la protéine recombinante Clonage d’un gène Transformation des cellules hôtes Bactéries chimio-compétentes : -Fragilisation de la membrane par traitement chimique -Entrée de l’ADN recombinant par choc thermique 106 - 108 cellules / µg d’ADN Bactéries électro-compétentes : -Electroporation : choc électrique Fragilisation de la membrane et entrée de l’ADN chargé par les pores 1010 cellules / µg d’ADN Clonage de grands fragments Bactériophages Phage M13 Phage λ 2 heures : 4 cycles d’infection 24 = 16 bactéries 1004 = 108 particules phagiques Clonage de grands fragments Banque d’ADN génomique : clonage dans le phage λ Clonage de grands fragments Exemple : recherche du gène amylosaccharase Bactérie d’origine : Neisseria polysaccharea Sucrose Soluble fraction Low-cost agroressource Mondial production : 150 M tons/year EU : 650 € /ton (520 € in 2007) Precipitate Amylosucrase of amylose Clonage de grands fragments Exemple : recherche du gène amylosaccharase Criblage de la banque d’ADN génomique (phage λ) - Infection d’E. coli - Culture d’E. coli sur milieu supplémenté en saccharose - clones AS + : libération de fructose et d’amylose (halo autour de la plage de lyse) - récupération des phages AS+ Clonage de grands fragments Recherche d’un gène à partir d’une banque d’ADN 1 - Fragmentation du grand fragment par enzyme de restriction 2 - Insertion des fragments résultants dans un vecteur de clonage 3 -Transformation d’E. coli 4 - Identification du clone possédant le gène d’intérêt (ex :détection de l’activité enzymatique) 5 - Séquençage de l’insert Sous-clonage Exemple : recherche du gène amylosaccharase Sous clonage du fragment AS+ du phage dans pUC -digestion du fragment de 15 kbp par les enzymes de restriction KpnI et HindIII - ligation des fragments dans pUC - transformation d’E. coli - Etalement sur milieu supplémenté en saccharose - clone AS + : libération de fructose et d’amylose (colonies bleues à la vapeur d’iode) - récupération de l’ADN plasmidique du clone AS+ : insert de 6 kbp - Séquençage : gène de l’amylosaccharase Production de la protéine Extraction des protéines Protéines cytoplasmiques -Sonication ultra-sons -Broyage aux billes/ presse Aminco-French -Lysozyme - Congélation/décongélation Protéines périplasmiques - Choc osmotique Corps d’inclusion (protéines agrégées insolubles) Solubilisation par Guanidine-HCL, urée, SDS Elimination de l’agent de solubilisation Renaturation lente des protéines Séparation/ Séparation/Visualisation des protéines Electrophorèse SDS-PAGE -Coloration directe Bleu de Coomassie Bleu colloïdal Nitrate d’argent Rouge Ponceau kDa 94 67 43 30 20 14 Western-Blot -transfert sur membrane -Hybridation anticorps primaire -Révélation anticorps secondaire Production de la protéine Exemple : expression de l’AS chez E. coli λEMBL3A 15 kbp Promoteur AS pUC19 6 kbp Promoteur AS 5 mM IPTG 8 U/L culture ptrc99A 1.9 kbp ptac 2.5 mM IPTG 1040 U/L culture 1 g/L culture pGEX-6P3 1.9 kbp ptac 1 mM IPTG 50 U/L culture Fusion GST 300 U/L culture 0.4 g / L culture Protéines de fusion Principe Construction du gène codant la protéine de fusion par PCR ou insertion directe du gène dans un vecteur commercial tag site de coupure par une protéase chromatographie d'affinité protéine d'intérêt protéine d'intérêt purifiée protéolyse spécifique Protéines de fusion Les différents systèmes TAG 6 His (polyhistidine) ligand de chromatographie métaux chélatés 0,84 kDa Glutathion S Tranférase (GST) 26 kDa Maltose Binding Protein (MBP) glutathion amylose 40 kDa Calmodulin Binding Peptide (CBP) calmoduline 4 kDa Chitine Binding Domain (CBD) chitine 5 kDa Protéine A IgG Thiorédoxine oxyde de phénylarsine Protéines de fusion Les protéases spécifiques enterokinase Asp-Asp-Asp-Asp-Lys E. coli thrombine Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser facteur Xa Ile-Glu(Asp)-Gly-Arg plasma bovin genenase™ I subtilisine modifiée, B. amyloliquefaciens New England Biolabs Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr PreScission™ protease protéine de fusion protéase 3C de rhinovirus humain et GST Amersham Pharmacia Biotech Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro Protéines de fusion Exemple : Purification de l’AS Purification par chromatographie d’affinité sur résine Glutathione-Sepharose 4B Sonicat GST-AS AS GST AS kDa Site de clivage 94 67 43 30 20.1 14.4 Echelle de temps Du gène à la protéine 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 heures purification ADN electrophorèse extraction des protéines restriction transformation PCR 1 kbp PCR 5 kbp ligature fermentation (synthèse des protéines) synthèse amorces PCR séquençage purification système TAG Expression chez la levure Vecteur navette E. E.coli coli / levure Sélection par résistance à l’antibiotique Sélection par auxotrophie à la leucine Réplication chez E. coli Réplication chez la levure Amplification Extraction Restriction Mutagenese Expression Clonage d’un gène Sélection des plasmides recombinants - sélection sur milieu contenant l’antibiotique (ampicilline) : clones contenant le vecteur ou le vecteur + insert - sélection par l’α l’α-complémentation : clones contenant le vecteur + insert Clonage d’un gène α-complémentation IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside) : sucre induisant la transcription du gène LacZ. X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalactoside) : sucre donnant une coloration bleue s’il est dégradé par LacZ.
