Cours N°7, « Réplication - Département de Biochimie
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Biologie Cellulaire & Biologie Moléculaire III • Réplication IV • Cycle cellulaire Cours n° 7 : Mardi 8 octobre 2013 L3 UE 5.2 2013-2014 Cours 7 BC&BM 2013-2014 186 Avancement du Cours I Introduction II Chromosomes • III Réplication – Contrôle de l’activation des origines • Activation unique • Organisation spatiale • Activation moléculaire des origines • Initiation de la réplication • IV Cycle Cellulaire • V Transcription Cours 7 BC&BM 2013-2014 187 P Chaque origine est activée une fois et une fois au plus contrôle contrôle Non totalement synchronisées, mais toutes les origines activées 7 BC&BM 2013-2014 doivent avoir fonctionné correctementCours 1 seule fois contrôle 145 Chap IV Cycle Cellulaire 188 P 146 Foyers réplicatifs : hypothèse • Les origines sont organisées en foyers (ordre de 1000/ noyau) • Chaque foyer peut contenir de 10 à 100 origines de réplication. • Ces usines à réplication comprennent les protéines nécessaires à l’élongation de la réplication. • Ces foyers peuvent correspondre à des territoires chromatiniens stables. • Chaque foyer est constitué de réplicons (unité de réplication) synchronisés Cours 7 BC&BM 2013-2014 189 P 147 Organisation spatiale des origines et stress réplicatif Stress réplicatif ou DSB activent ATR/Chk1 Kinases de signalisation du système de contrôle de la réplication Inhibition de la réplication Blocage du cycle cellulaire ContrôleCours de 7l’activité des origines BC&BM 2013-2014 190 Licensing : Contrôle moléculaire du réamorçage des origines de réplication 148 • Contrôle du réamorçage des origines pour que la cellule ne puisse réactiver une origine de réplication qu’une seule fois dans un cycle de division cellulaire (Licensing). Cours 7 BC&BM 2013-2014 191 La Régulation de l’initiation de la réplication concerne l’ensemble du Cycle cellulaire Go Cours 7 BC&BM 2013-2014 Différenciation 192 P Contrôle temporel de l’activition des origines : molécules centrales : Hélicases MCM tout au long du cycle cellulaire 149 1 • Fin de phase M et en G1 : dépôt sur les sites « Origine » potentiels de MCM2-7 (hélicase). 1 4 3 2 • En phase S, après activation de l’origine, MCM2-7 ouvre l’ADN. 3 • en G2, dissociation de MCM2-7 des origines inemployées. 2 4 • En G0, Perte de MCM2-7 en cas d’arrêt de prolifération Cours 7 BC&BM 2013-2014 193 150 P DNA replication « licensing » • Etape qui rend compétentes les cellules pour un nouveau cycle de réplication • Compétence perdue lors de l’arrêt prolongé du cycle cellulaire (G0) • Nécessité de rupture de l’enveloppe nucléaire pour lancer une nouvelle réplication • cdc6 permet le recrutement du complexe hélicase MCM sur les origines de réplication. Cours 7 BC&BM 2013-2014 194 P Activation précoce des origines de réplication et modification des histones Phase du cycle 176 HMT5A=SET8=PR-SET7= SETD8 H4K20-Specific Histone Methyltransferase ubiquitinylation SET8 dégradation Cdt1 : chromatin licensing and DNA replication factor 1 Et son co-activateur Cours 7 BC&BM 2013-2014 HBO1 : histone acetyltransferase binding to 195 ORC1 P Chronologie de 151 1 Acétylation H4K20me1 et Reconnaissance de l’origine par le complexe ORC1-6 fonctionnement des origines : 8 ORC : Origin Recognition Complex fixation de ORC1 en transition M/G1 8 étapes 1 Début 2 Recrutement de cdt1 (libéré) cdc6 2 Fin de phase M 3 3 Recrutement MCM2-7 (hélicase) G1 Formation Complexe pré-réplicatif inactif Activation en G1/S Cours 7 BC&BM 2013-2014 196 P 152 Initiation de la réplication 4 • G1/S : Activation : Dpb1-GINS Recrutement cdc45 et MCM10 Formation du 5 • cdc45 fixe composants du réplisome dont Polymérase α Complexe de pré-initiation 4’ • Initiation phosphorylation du complexe par CDK (GINs-cdc45-MCM) induise une hélicase active Transition G1/S Départ de ORC1 6 • En S : inactivation de cdt1 et de cdc6 par phosphorylation catalysée par cdk2 entrainant dégradation, adressage cytoplasmique ou par complexation avec la géminine 7 : phosphorylation de MCM par cdc7 : Cours 7 BC&BM 2013-2014 Inactivation des origines 197 151 P Chronologie de fonctionnement des origines Origin Recognition Complex, Subunit 1 Séquestration de cdt1 Par la géminine 8 Inactivation de ORC1 par cdk1 Fin Fin de phase M G1 Homme : complexes ORC exclus à la métaphase (PMATC) Cours 7 BC&BM 2013-2014 198 153 P Types d’ADN polymérases eucaryotes γ α β δ ε Cours 7 BC&BM 2013-2014 199 Cdc45 recrute Pol α P Initiation de la réplication eucaryote 154 RP-A Sur une origine activée PCNA Cours 7 BC&BM 2013-2014 200 P Nature des origines de réplication eucaryotes 155 Eucaryotes simples : Levures 700/génome ≈10+7 pb Cours 7 BC&BM 2013-2014 201 P Sites auxiliaires des origines de levures, virus Cours 7 BC&BM 2013-2014 156 202 P Adaptabilité des origines de réplication des eucaryotes complexes Méchali M. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010 Oct;11(10):728-38 Cours 7 BC&BM 2013-2014 157 203 Organisation coordonée de transcription et replication chez la souris (ESC) Ci-contre : Organisation des réplicons • 50% des Origines à proximité des promoteurs • Ci-dessous organisation des domaines transcriptionnels : Cours 7 BC&BM 2013-2014 204 Avancement du Cours I Introduction II Chromosomes III Réplication • IV Cycle Cellulaire • V Transcription Cours 7 BC&BM 2013-2014 205 P 160 Régulation du cycle cellulaire • Organisation génomique Histones • Régulation de l’expression PCNA, Orc1 • Phosphorylation/déphosphorylation cdkcyc • Interactions protéine/protéine cdk-cyc, p53, Rb-E2F • Intégration (molécules, complexes) p53 • Epigénétique • miARN Cours 7 BC&BM 2013-2014 206 P Cycle cellulaire : entrée et sortie 137 Inducteurs de prolifération Go Cours 7 BC&BM 2013-2014 Différenciation 207 158 P Technique 5 : Analyse de phase du cycle cellulaire par Cytométrie Cytométrie 1 Incubation des cellules avec un fluorophore (intercalant de l’ADN) 2 Analyse de l’intensité de fluorescence émise par cellule (proportionnelle à la quantité d’ADN) 3 Représentation nombre de cellules en fonction de l’intensité de fluorescence 4 Détermination du pourcentage de cellules en fonction des phases du cycle Cours 7 BC&BM 2013-2014 208 Analyse du cycle cellulaire et synchronisation 159 Quantité d’ADN par cellule 2N 4N Cours 7 BC&BM 2013-2014 209
