Maintient et remodelage de l`information génétique. Comment les

Maintient et remodelage de l’information génétique.
Comment les organismes vivants perpétuent leurs potentiels génétiques ? Pour affronter les
attaques sur leurs génomes ? Pour générer de la diversité ?
Importance de check points sur les mécanismes 3R de l’ADN.
Qu’est ce qu’une ADN polymérase ?
Enzyme qui rajoute des trinucléotides en utilisant une matrice (exception pour la terminale
polymérase qui n’en utilise pas). Copie dans le sens 5’-3’. Pour initier le phénomène, il faut une
amorce en bout de chaine d’ADN.
Si la polymérase rajoute de nombreux trinucléotides, on l’appelle une polymérase processive,
dans le cas contraire, il s’agit d’une polymérase peu processive. Une polymérase qui respectera
correctement les complémentarités A-T et C-G sera une polymérase fidèle. Mais des fois, la
polymérase peut mettre un C en face d’un A etc. Il existe des tests de fidélité. Mais beaucoup de
ces enzymes sont également capable de défaire ce qu’elles ont fait : il s’agit d’une relecture avec
une activité exonucléasique de 3’-5’.
Lorsque les polymérases arrivent face a des dimères de thymines (induits sous rayonnement
UV), elles s’arrêtent, incapables de reconnaitre ces dimères. Mais certaines peuvent baille-passer
le problème : ce sont des polymérases translésionelles (elles sont peu fidèles).
Une ADN polymérase est un complexe enzymatique intervenant dans la réplication de l’ADN
au cours du cycle cellulaire, mais aussi dans des processus de réparation et de recombinaison de
l'ADN. Il existe différentes familles de polymérases qui diffèrent selon leurs séquences en acide
aminé et leurs propriétés catalytiques.
Toutes les ADN polymérases synthétisent l’ADN dans le sens 5'-3' et aucune n’est capable de
commencer une nouvelle chaîne sans amorces. Elles ne peuvent que rajouter des nucléotides à
partir d’une amorce préexistante à l’extrémité 3’-OH. Pour cette raison l’ADN polymérase a
besoin d’une amorce (ou primer), sur laquelle elle pourra ajouter de nouveaux oligonucléotides.
L’amorce peut être formée d’ADN ou d’ARN et est synthétisée par une autre enzyme, appelée
primase. Une enzyme, hélicase, est ensuite requise pour délier le double brin de l’ADN et ainsi
faciliter l’accès des ADN polymérases sur les brins d’ADN, devenu simple brin, et permettre
ainsi la réplication. Les ADN polymérases possèdent une structure très conservée. Elles sont
considérées comme étant des holoenzymes puisqu’elles ont besoin d’un ion magnésium comme
cofacteur pour fonctionner correctement. En absence d’ions magnésium, elles sont appelées
apoenzymes.
Les ADN polymérase ont la capacité de corriger les erreurs dans la formation de brin néoformé.
Lorsqu'une paire de base incorrecte est reconnue, l’ADN polymérase va revenir en arrière grâce
à son activité 3’-5’ exonucléase, va réinsérer la base correcte, et reprendre la réplication.
Expériences de mutagénèse chez E. coli.
Le mutant Pol I a une activité polymérase amoindri mais la bactérie vit très bien => paradoxe.
On a ainsi découvert les différents types de polymérases chez la bactérie.
Cinq ADN polymérases ont été identifiées chez les bactéries:


Pol I : impliquée dans la réparation de l’ADN. Elle possède les deux activités
polymérase 5'→3' et exonucléase 3'→5' (fragment de Klenow), et participe à la synthèse
des fragments d’Okazaki. Elle intervient aussi en fin de réplication pour éliminer les
amorces d'ARN (activité exonucléase 5'-3').
Pol II : impliquée dans la réplication de l'ADN endommagée et possède activité 5'→3' et
une activité a 3'→5' exonucléase.



Pol III : c’est la principale polymérase bactérienne qui intervient dans l'élongation de la
chaîne d'ADN lors de la réplication au niveau du brin avancé et de la synthèse des
fragments d’Okazaki. Elle est constituée de dix sous-unités. On définit une structure
minimale (core enzyme αεθ) comprenant une sous-unité α (activité polymérase), une
sous-unité ε (exonucléase 3'→ 5') et une sous-unité θ de fonction inconnue. Deux cores
(αεθ) et un complexe γ (facteur de chargement) sont maintenus ensemble par
l'intermédiaire d'un connecteur, la protéine t.
Pol IV : ADN polymérase de la famille Y.
Pol V : ADN polymérase de la famille Y.
Pour chacun des brins, il existe une synthèse continue pour l’un, et une discontinue pour l’autre
(avec utilisation des fragments d’Okazaki).
Chez un mutant Pol.1-, comment peut-on obtenir des mutants spécifiques de la réplication ?
On va utiliser des mutants conditionnels (thermosensibles…).
On a ainsi observé 2 types de mutants :
-les mutants Quick Stop (QS) : arrêt immédiat de la réplication de l’ADN avec une
modification de la température.
-les mutants Slow Stop (SS) : arrêt lent de la réplication de l’ADN avec une modification
de la température.
Chez les QS : identification d’un certain nombre de gènes intervenant dans la réplication tels que
Pol III (avec plusieurs sous unités), Pol II… ; et pour les SS, on a identifié des gènes codant pour
des protéines impliquées dans le cycle de réplication.
La polymérase I (Pol I).
Activité polymérasique dans le sens 5’-3’, exonucléasique dans le sens 5’-3’ (la seule qui fait ca)
et donc naturellement aussi exonucléasique dans le sens 3’-5’. Peu processive. % d’erreur très
faible.
La polymérase III (Pol III).
Activité polymérasique dans le sens 5’-3’, exonucléasique dans le sens 3’-5’. Processivité
importante, très dépendante de la sous unité ξ. % d’erreur très faible.
La vitesse de réplication chez E. coli est d’environ 1000 nucléotides/seconde. Le génome d’E.
coli comporte 4Mbases.
Les cœurs de la polymérase sont essentiels au phénomène de polymérisation : sous unités α, ξ, θ.
Si ξ est inactive, le % d’erreur est multiplié par 1000, mais la vitesse reste inchangée.
La primase est importante pour les fragments d’Okazaki. Tandis que l’hélicase sépare les deux
brins d’ADN. La polymérase agit sous forme d’homodimère, chaque dimère étant associée à l’un
des brins. La sous unité β, structure en anneau, homodimère, fait gagner en processivité. Le trou
laissé dans l’anneau du dimère permet le passage du brin d’ADN.
Fragment d’Okasaki est un terme utilisé en biologie, dans l'étude des chromosomes.
Le brin « retardé » est synthétisé par petits fragments (d’environ 10 paires de bases) : les
fragments d’Okasaki.
L’ADN polymérase pour effectuer la synthèse d’ADN nécessite une amorce (petit fragment
d’ADN ou d’ARN). Cette amorce ARN est amenée par l'enzyme ARN Primase qui est une
enzyme ARN polymérase ADN dépendante.
Description: Depiction of DNA replication with replication fork, strands and okazaki-fragments.
a: template strands, b: leading strand, c: lagging strand, d: replication fork, e: primer, f: Okazaki
fragment
Entre les deux, il existe un gros complexe important : le clamp-loader qui pose l’anneau β au bon
endroit (clamp-loader = complexe θ-γ). Codage : le même gène donne deux produits protéiques
différents : τ et τ1. C’est un régulateur de la progression de la fourche. Ce complexe τ est
important pour la fourche de réplication en agissant avec l’hélicase, qui est poussée en amont de
la fourche de réplication.
Le clamp-loader va déplacer une des deux sous unités β qui va, sur le brin simple laissé (car une
des deux polymérases ne peut pas synthétiser de façon continue), synthétiser le fragment
d’Okazaki, puis qui sautera de quelques milliers de bases pour de nouveau synthétiser un
fragment d’Okazaki etc.
La primase est une ARN polymérase qui fabrique de petites amorces de ribonucléotides. La Pol I
prend le relais de la Pol III pour combler le trou entre les fragments d’Okazaki. Pol I prends la
suite de la polymérisation de Pol III, puis avec son activité exonucléasique détruit l’ARN pour
faire de l’ADN. Il faut ensuite rétablir la continuité des brins avec la ligase.
La primase est une enzyme permettant la synthèse de l'amorce d'ARN nécessaire à la synthèse
du brin d'ADN au cours de la réplication de l'ADN. Les ADN polymérases permettant la
réplication de l'ADN ont besoin en effet d'une petite région double-brin pour commencer la
synthèse d'ADN, et cela dans les trois domaines du vivant (Archaea, eucaryotes, Bacteria).
La primase des bactéries est DnaG. Chez les eucaryotes, elle est portée par le complexe ADN
Polymérase α-primase. Chez les Archaea, il existe un homologue à la primase eucaryote, mais
sans équivalent à la sous-unité polymérase α. Il est surprenant de noter que les primases
d'Archaea peuvent également synthétiser de l'ADN in vitro. Il existe également chez les
Archaea un homologue à la protéine DnaG des bactéries.
Initiation de la réplication chez E. coli.
Il existe des séquences de 13 ou 9 paires de bases à l’origine de l’oriC (origine de réplication).
Rentrée en jeu d’une hélicase fabriquant une petite amorce. Phénomène de méthylation pour
synthétiser les brins et éviter une autre réplication successive (la méthylation prend environ 2030min, déterminant ainsi le temps de réplication de l’ADN et donc la division bactérienne).
Les séquences Ter recrutent des protéines tus. Lorsque l’hélicase arrive dans ces séquences Ter,
la protéine tus est absente, et cela permet la transcription. Fixation spécifique de tus. Ces
protéines tus permettent le passage de la Pol qui arrive dans un sens, mais pas dans l’autre (utile
dans le cas ou la fourche de réplication n’arrive pas à la même vitesse [car la réplication du
chromosome bactérien est bidirectionnelle, et la fin de la réplication est variable sur le
chromosome, en fonction de la vitesse des polymérases de chacun des deux cotés]) [La protéine
tus agit comme une véritable diode moléculaire, permettant le passage des Pol dans un sens, mais
pas dans l’autre].
Chez les eucaryotes :
On retrouve des équivalents des mêmes structures (PCNA = équivalent des anneaux β)
[homotrimère de taille identique que l’anneau β qui lui est un dimère]
La polymérase est une ARN-ADN polymérase dépendante. Synthèse de quelques nucléotides et
le reste du complexe prends en charge de l’ADN. Les fragments d’Okazaki sont plus courts que
chez les bactéries. Il existe des centaines d’origine de réplication.
Pour diminuer le petit fragment d’ARN entre les fragments d’Okazaki, on a les RNAses I qui
coupent le petit bout de l’amorce et FEN1 qui dégrade le bout d’ADN par activité
endonucléasique.
Maintient et remodelage de l’information génétique.
Plus l’organisme est simple, moins son ADN comporte de paires de bases. Chez les amphibiens
et les insectes, il y a une grande variabilité de la quantité d’ADN. Certains insectes ont jusqu'à
100x plus d’ADN que d’autres insectes.
E.coli : 4Mbases
Drosophile : 100Mbases
Alors, quelle est l’information contenue dans l’ADN ? Notion de complexité de l’ADN, et non
plus de taille. Certains ADN seront informatifs, d’autres peu informatifs.
Pour déterminer cela, on dénature puis on le fragmente. On va ensuite regarder les propriétés de
renaturation. Un brin peu informatif aura beaucoup de répétitions de nucléotides. Par exemple,
l’ADN ayant un poly-A aura un énorme potentiel de réassociation, contrairement a de l’ADN
informatif => Il y a différente cinétique de renaturation. (Mesurable par absorption de la lumière
UV par les bases : simple brin et double brin n’ont pas la même absorbance.)
C : concentration de l’ADN simple brin au temps t
K : constante de renaturation.
Renaturation : dC/dt= -kC²
On intègre entre t et t0 => C /C 0 = 1 / (1+ k C 0 t)
=>...
=> C 0 t1/2 = 1/t
Résultats :
 L’ADN de E. coli est beaucoup plus informatif que celui des bactériophages M32 et T4.
Chez les eucaryotes, on trouve des degrés de complexité variable dans le génome, avec des
séquences hautement répétées, peu répétées, ou unique. Les gènes se retrouvent majoritairement
dans la zone d’ADN non répétée.
Séquençages des génomes par la méthode de Sanger.
Il faut séquencer x fois les génomes pour éviter les erreurs de séquençage.
Génome de S. cerevisae.
-eucaryote : peu d’intron (3-4% des gènes)
-taille : 12Mbases sur 16 chromosomes.
-codant à 72%
~6200 ORF (CDS) [peu de gènes à introns] [environ 300]
Désormais, on a des techniques de séquençages plus performants
Ex : méthode du shotgun
Séparation des chromosomes -> clonage de grands fragments (YACs, BACs…) -> sous clonage
-> séquençage -> assemblage (1)
Clonage shotgun (plasmides) -> séquençage -> assemblage (2)
Chez l’homme, on utilise des marqueurs CA pour faire le séquençage car les motifs CA sont
répartis uniformément dans tout le génome. On peut faire des relations entre la carte
phénotypique et la carte génétique d’un chromosome. La recombinaison est d’autant plus active
dans les télomères que dans les centromères. La recombinaison est plus active chez la femme
que chez l’homme. Plus le bras du chromosome est long, moins la recombinaison est active
ADN satellite :
-ADN satellite localisé : ADN de faible complexité mais répété de nombreuse fois. Peut
représenter plusieurs % du génome (homme : 5-6% ; rat : >50% ; bœuf : 20%)
-ADN satellite dispersé : trouvé à peu prés n’ importe où dans le génome. On distingue
les microsatellites (<6 bases) des minisatellites (>6 bases)
Les minisatellites : longues séquences répétées de 0.5 à 100 kb de motif unitaire de 5 à 100paires
de bases. Les motifs unitaires sont très variables dans les microsatellites. 90% sont dans les
régions subtélomériques. Ils sont hypervariables en lignée germinale avec des % de mutations
variant de 0,5% à 13% (en principe létal dans un gène). Ils ont une fréquence de duplication
intra-allélique (pour CEB1 et CEB25)
Les microsatellites : courtes séquences d’environ 200 paires de bases, de motif unitaire de 1 à 6
nucléotides. 105 locis microsatellites par génome haploïde humain.
Répétition de mononucléotides (A)n [34%]
Répétition de dinucléotides (CA)n [19%], (GA) [5%]
Conséquences moléculaire de la répétition de (A)n.
Si il y a une modification du nombre de répétition au sein d’un gène, il pourra y avoir une
inhibition de la transcription (cas ou la séquence 5’UTR est touchée), ou cela aboutira a une
protéine tronquée (cas ou c’est dans le gène), mais aussi à un défaut d’épissage (si cela touche
les séquences introniques importantes) ou encore à un ARN instable (cas ou la séquence 3’UTR
est touchée).
Ex : répétition de triplet (présent dans des maladies telles que la chorée de Huntington, ou
encore le syndrome du X fragile) qui aboutissent à des anomalies de protéines. Ces anomalies se
retrouvent donc dans la partie codante du gène.
-les transposons : ADN égoïste avec une partie codante pour une transposase, avec à ses
extrémité les parties nécessaires à sa transposition. Il en existe deux formes : les rétrotransposons
(chez la bactérie, pas chez les eucaryotes) [on transpose avec un support ARN] et les transposons
à ADN.
Chez l’homme, environ 35% du génome correspond à des rétrotransposons (LINE & SINE) et
45% en comptant tous les autres types de transposons.
On a pu montrer que dans certains cas, les rétrotransposons sont devenus de véritables gènes.
Exemple de RAG1 et RAG2, provenant d’un rétrotransposon viral et qui maintenant code pour
des protéines essentielles aux remaniements des gènes des immunoglobulines.
Il ne reste donc que 20-30% codant. De plus, on trouve des duplications segmentales chez
l’homme : les gènes sont très souvent présents en plusieurs exemplaires.
Ces gènes peuvent évoluer de manières différentes, avec possibilités de recombinaisons extraectopiques entrainant des maladies. Il y a aussi le risque au laboratoire lors de l’assemblage de
petits
fragments.
Si on additionne juste les exons, on aboutit à 1,5% du génome.
Comment a-t-on découvert toutes les polymérases
chez les eucaryotes ?
Commenta-t-on découvert toutes les polymérases chez les eucaryotes ?
-par purification de protéines.
-mutations (délicat)
Chez S.cerevisae, on a pu identifier 4 sous unités de la polymérase ξ et leurs gènes. Il y a une
sous unité catalytique et d’autres sous unités en relation avec cette sous unité catalytique mais
aussi avec l’extérieur.
Pour la Pol δ, on a aussi 3 sous unités. Mais on ne sait pas trop qui fait quoi…
Pol δ code pour un gène ayant un certain nombre de régions conservées, des ragions
caractéristiques de l’activité polymérase de 5’ vers 3’. LA délétion d’une sous unité est létale.
Les polymérases se regroupent en grandes familles :
- Famille A : polymérases ressemblant à Pol I
- Famille B : polymérases ressemblant à Pol II
- Famille C : polymérases ressemblant à Pol III
- Famille D : polymérases ressemblant à Pol IV
- Famille Y : polymérases ressemblant à Pol V
2 hypothèses :
- Soit la polymérase est antérieure aux règnes des archaebactéries, bactéries et
eucaryotes.
- Soit il y a eu des transferts d’information.
On remarque en comparant les gènes que les différentes pol-δ, pol-ξ et pol-α ont des séquences
communes, et d’autres qui se sont spécialisées. Pol- ξ a la particularité de tolérer une délétion
partielle de la zone de polymérisation et exonucléase. La région C-ter semble être essentielle
pour ne pas être létal (cependant, avec cette délétion, la cellule n’est pas en forme).
Comment étudier séparément pol-δ et pol-ξ ?
On va modifier les protéines qui doivent tout de même conserver le meilleur de leurs
capacités de polymérisation. On leur attache une signature. Il faudrait que cette caractéristique
singulière soit une erreur spéciale faite par la polymérase pour que l’on puisse la distinguer de la
forme sauvage.
Ensuite, on fera des expériences In-vivo avec pol-δ* - pol-ξ mais aussi avec pol-δ, pol-ξ*. On
fera des alignements de séquences chez les différentes espèces afin de voir les motifs conservés
et afin de faire de la mutagénèse dirigée. En faisant des analogies de séquences d’acides aminés,
mais aussi de structures 3D des protéines, on choisi un site à muter chez la levure (marquée par
une * sur le polycopier).
Imaginons que la signature soit une transversion de bases :
On a donc deux moyens d’obtenir la même chose suivant que l’on touche le brin continu ou
discontinu.
On utilise LacZ avec un bactériophage.
Si la polymérase est mutée, alors LacZ ne sera pas correctement répliqué donc ne sera pas
fonctionnel : après analyse sur milieu contenant du XGal, les bactéries transfectées par le
bactériophage seront blanches. Mais attention, il faut non seulement que la mutation existe mais
aussi qu’elle ait un phénotype (du fait de la redondance du code, une transversion n’aboutira pas
forcement à une protéine mutante avec un phénotype différent du sauvage !)
 Analyse des points chauds sur le gène capable de conférer un phénotype.
Effet mutateur du mutant pol-ξ M644G.
Cette mutation augmente le mésappariement des bases. Entre le WT et le mutant, on a un
grand effet significatif pour les changements T-T (incapacité à détecter ces mésappariements,
dans la forme WT et mutante). Cette mutation ne discrimine pas les mésappariements T-T mais
se débrouille très bien avec touts les autres.
Est-ce que la polymérase a un effet différent sur le brin précoce et muté ?
 On va intégrer cette protéine dans le vivant (levure).
On ne peut donc plus utiliser la β-galactosidase. On utilise alors le gène URA3 comme
marqueur. On intègre URA3 dans le chromosome de la levure avec une Origine de réplication.
En jouant sur le sens du gène, sur la place de l’origine de réplication, on peut déterminer qui est
le brin précoce et le brin tardif.
Dans le cadre #1, on remarque une position mutatrice avec une grosse augmentation du nombre
de T. Puisque la mutation en cause est une mutation caractéristique de la pol-ξ et qui donne des
mésappariements T-T, les résultats ne peuvent s’expliquer que par la pol-ξ qui es responsable du
brin continu.
On fait la même expérience pour la pol-δ : synthèse du brin discontinu. Cependant, la pol-δ est
également capable de faire la synthèse du brin continu quand la pol-ξ est défectueuse.
Translesion synthesis. (TLS)
Il arrive que la polymérase soit face a quelque chose qu’elle ne connait pas (X : site
abasique, dimère de thymines etc.). Avec une polymérase translésionelles, elle va associer
n’importe qu’elle base en face ce site X. En général, ces polymérases translésionnelles sont
mutatrices.
On utilise un plasmide ayant un aminofluorène empêchant la polymérase de répliquer
correctement. (=anomalie volontairement placée) sur un brin, et l’autre brin rallongé de 3
nucléotides (permettant de le reconnaitre après un Southern-Blot).
Pour valider ce modèle, on fait d’abord avec les souches non mutées (sur le Southern-Blot, on
voit bien que les deux brins sont synthétisés de manière coordonnée). Sur la souche mutante, on
voit que les deux brins présentent des anomalies : les fourches de réplications se bloquent au
niveau de la lésion rouge. Face à une lésion de ce genre, Pol III est incapable de passer au
travers. On va commencer à introduire des mutants Pol II et Pol V. on peut déduire que lorsque
Pol III arrive sur une lésion, elle s’arrête puis Pol II et Pol V vont avoir leur activité de
polymérases translésionelles.
Quand la lésion est sur la matrice servant de brin continu, on va avoir une extrusion d’une
longue boucle d’ADN simple brin car l’hélicase elle, continue à avancer. (Le simple brin sera
recouvert de la protéine RecA = système SOS).
Si c’est sur la matrice servant au brin discontinu, le système ne sera pas bloqué mais laissera
derrière lui des brins d’Okazaki non terminés.
Le système SOS :
=système mis en place en cas de stress. Le système fige la division cellulaire tant que le
problème n’est pas résolu. L’acteur principal est RecA. Soumise a des UV, il va y avoir une
transcription / traduction de certains gènes chez la bactérie qui sont en temps normal éteints par
un répresseur : LexA.
En cas de stress, RecA* va aller voir LexA qui s’auto-clive (LexA est une endopeptidase). Cela
va entrainer la transcription de gène : immédiatement pour certains, mais plus tardivement pour
d’autres : il y a des régulations subtiles dans le temps.
Le système SOS sera de nouveau réprimé au bout de 30-40min par retranscription des gènes de
LexA.
Les gènes codés par le système SOS sont des gènes d’arrêt du cycle cellulaire.
Les polymérases translésionelles n’ont pas les capacités de relecture : mutations.
Le gène UmuDC (codant pour pol V) va être transcrit / traduit et sa protéine sera clivée :
l’hétérotrimère umuD/umuD’/umuC va être créé. Ce complexe a des propriétés de
polymérisation. Cet hétérotrimère prends le nom de Pol V.
Sur le graphe, les points blancs représentent les mutants de Pol II. En cas normal, les mutants de
Pol II sont comme les sauvages, et les mutants de Pol V sont beaucoup plus sensibles aux UV.
Le double mutant présente un effet encore plus grave : cela laisse penser que Pol II a quand
même quelque chose à voir avec la réparation.
On regarde ensuite les synthèses d’ADN suite à une irradiation UV.
A t0, on irradie : on met la synthèse d’ADN à l’arrêt (normal car on induit plein de lésions) mais
chez le WT ca redémarre au bout de quelques minutes. Chez le mutant ΔumuDC, ca s’arrête et
ca redémarre plus lentement.
En comparant le WT avec le mutant de la Pol B, on note que Pol B s’effondre et seulement
longtemps après la synthèse d’ADN repart.
Dans les conditions ou la polymérase a été inactivée par la température postérieurement à une
irradiation UV, alors que le Pol III est inactive, il y a une légère synthèse d’ADN faite donc par
Pol II (Pol II est transitoirement capable de faire la synthèse de quelques nucléotides puis
s’arrête).
Pol III arrive sur la lésion X => Re-largage par l’anneau β => Système SOS => initiation
grâce à Pol II du redémarrage de la synthèse d’ADN, sur une courte longueur (dos d’âne sur le
graphique).
=> Réponse courte => Réplication de l’ADN => Lésions persistante => Pol V puis Pol III (3040min pour faire la réparation de la lésion. Si pas de réparation dans ce labs de temps, il faut finir
la réplication (Pol V qui passera au travers coute que coute [effets mutagènes])
Si la Pol II est absente, arrêt de la synthèse pendant 40-50min puis reprise par la Pol V :
passage au travers, puis reprise par Pol III. L’anneau β assure la continuité de la synthèse : les
polymérases s’accrochent à l’anneau. Recrutement selon les besoins de la polymérase voulu.
Système SOS => Gènes exprimés :
-précoces : Pol II
-tardifs (30-40min) : Pol V
-gènes de réparation des nucléotides, des lésions.
Comment identifier les polymérases translésionelles chez les eucaryotes ?
Stratégie 1 : génétique classique. On part phénotype puis on retrouve les gènes. On fait
des croisements, des analyses par ségrégation.
Stratégie 2 : « force brute ». On part de activité et on remonte jusqu’au gène. Purification
à homogénéité à partir de cellules, micro séquençage, oligonucléotides, banque d’ADN
complémentaires, banque d’ADN génomique.
Stratégie 3 : complémentation in vitro. On part gène et on remonte à la protéine.
Stratégie 4 : bioinformatique. On fait des recherches homologies intra ou interspécifique
dans des banques.
Exemple : si on prend UmuC de Pol V, on trouve des ressemblances dans tout le règne
vivant. Famille des DNA polymérases Y.
Région TGI (pour le système immunitaire) => Polymérase endonucléase => endonucléase
coupe. => Polymérase très peu fidèle => (génération de mutants) => grande diversité des
immunoglobulines.
Les polymérases se sont spécialisées pour qu’il n’y a pas de redondance. Un gène est égal à une
polymérase est égal à un phénotype.
Sélectivité de la polymérase (bonnes bases complémentaires)
Proof-Reading.
Il y a ici un haut niveau de sélectivité.
Il existe un troisième processus : MMR qui affute la spécificité : relecture post-réplicationnelle.
Quelques chiffres : 72 000 e-5 erreurs : ½ nucléotides : normal, pas de relecture, prix a payer
pour la synthèse dans seuls nucléotides.
Réparation :
- 10 000 sites abasiques/J/cellules
- 50 000 coupures/jours/cellule
- 600 désaminations/jour/cellule
- 2000 lésions oxydatives/jour/cellule
- 5000 alkylations/jour/cellule.
Classes de lésions.
Déformations majeures de l’ADN :
- Rayonnement ultraviolet, cancérogènes (amines aromatiques, hydrocarbures,
polycycliques, mycotoxines…)
Modification mineure des bases nucléiques :
- Rayonnements ionisants
- Agents alkylants
- Désaminations, dépurinations…
Pontages entre les 2 brins de l’ADN : dimères de thymines
- Mytocyne C
- Agents alkylants biofonctionnels (moutarde à l’azote)
Expériences sur le modèle bactérien :
Comment peut-on trouver des mutants de réparation ?
- En utilisant les UV : les gènes seront appelés UVR-A, UVR-B…
- En utilisant des rayons X : les gènes seront appelés Rad1 etc.
Le paramètre important des expériences sous rayonnement UV était les conditions du jour
(heure, humidité, lumière…) En effet, les chercheurs se sont aperçus qu’avec la même dose
d’UV, a la même distance, pendant le même labs de temps, entrainaient des mutants différentes :
les expériences n’étaient pas reproductibles. La photoréactivation est la réversion de l’allèle
mutant. Les photos activent une enzyme : la photoliase qui permet la rupture des dimères de
thymines : le dimère est retourné, et échangé. Ces enzymes sont très rependues dans le monde
vivant.
Chez les eucaryotes supérieurs, on n’arrivait pas a mettre en évidence cette activité
photoliase. Ces molécules dans ces organismes ne sont plus capables de couper les liaisons
covalentes entre les dimères de thymines. Désormais, elles captent les photons et l’utilisent dans
la perception de la lumière extérieure et jouent un rôle dans le rythme circadien.
Autres cas de réparations.
Réparation d’une base modifiée. Peut se faire de manière simple : l’Oxy-6méthylguanine-méthytransférase : un méthyle est transféré sur un acide aminé de l’enzyme.
C’est la réparation par excision de bases.
Principe : étape 1 : activité spécifique par une glucosylase qui retire la base erronée. Puis ( Il y a
donc présence d’un site abasique) action d’une endonucléase qui enlève la séquence par coupure
simple brin et la re-synthèse est assurée chez l’homme par la pol-β.
Il existe deux variantes :
- On a juste la dégradation d ‘un petit nombre de bases: la re-synthèse se fait par
Pol-β
-
Il y a une dégradation et une re-synthèse sur une plus grande longueur avec le
PCNA et Pol-δ/Pol-ξ (SPR).
La première étape est spécifique de la base modifiée. Le reste est commun aux différents motifs.
Parmi les agents utilisés en chimiothérapie, il y a le TMZ qui est un agent alkylant : il introduit
des méthyles sur l’ADN des cellules tumorales. Mais également sur des cellules saines.
Comment faire pour ne cibler que les cellules tumorales ?
On administre au patient du TMZ. Mais ces motifs seront reconnus par des déméthylases donc
vont être éliminées. De plus, il y a plus de déméthylases dans les cellules tumorales que dans les
cellules saines.
On va utiliser les astuces suivantes :
- On va utiliser un analogue structural qui va saturer la méthyltransférase (qui va
toucher toutes les cellules même non tumorales)
- Fabrication sur un plasmide d’une construction exprimant P140 (forme mutante
de la méthyltransférase) qui ne sera exprimé que dans les cellules non tumorales.
Réparation par exclusion de nucléotides (NER)
Sur le schéma : A = produit du gène UVR-A
B = produit du gène UVR-B
UVR-A et UVR-B s’organisent en hétérotrimère qui va scanner l’ADN jusqu’à trouver une
anomalie stérique de l’hélice (dimère de T-T, site abasique, des produits tels que le benzopyrène,
le psoralène…). La reconnaissance de la lésion provoque le re-largage du dimère A et
déformation de l’ADN qui forme désormais un angle de 120°-130°. La sous unité B recrute alors
UVR-C (ATP-dépendant). UVR-B et UVR-C coupent maintenant en 3’ et l’autre en 5’ (sur la
même chaine bien sûr) ce qui libère un oligonucléotide (~12 nucléotides) toujours apparié mais
n’ayant plus de liaisons covalentes, et qui va être éliminé par UVR-D. L’ADN a donc une région
simple brin de quelques nucléotides. Pour boucher ce trou, les Pol-I ou Pol-II d’E.coli vont
intervenir.
Expérience de Hanawalt sur l’opéron lactose.
Ils y ont introduit une lésion de type T-T. L’endonucléase V du bactériophage T4 est
capable de reconnaitre les dimères de T-T et de les couper. On regarde avec et sans induction par
IPTG. Les constructions comportent des sites de restrictions et on utilise des sondes pour les
deux brins d’ADN afin de pouvoir révéler sur gel.
[Attention : lorsque le brin sera coupé, il y aura deux morceaux mais ils ne sont pas représentés
sur le gel car présents tout en bas.]
-
Sans IPTG
A t=0 on voit que la bande a disparu avec l’endonucléase V. Après t=20min, il y a une
réapparition de la bande.
Si 1 bande : TT persiste, si 2 bandes, TT est coupé.
- Avec IPTG
On a un brin transcrit et l’autre non.
Pour le brin non transcrit : même chose que sans IPTG.
Pour le brin transcrit : la réparation à lieu à 0min mais ne persiste pas.
TCR : réparation couplé à la transcription.
TCR
Face à un problème, la polymérase recule, aidée par le produit du gène Mfd (en N-ter, on note
une forte similitude de séquences avec UV-A). Mfd recrute le NER classique (UVR-A et UVRB). Ce qui est spécifique ici, c'est la première étape qui cible la région sur le brin transcrit.
Chez les eucaryotes, c'est un peu la même chose mais les expériences qui ont été réalisées
sont différentes. Les moyens d'études sont :
- chez la levure (mutants RAD)
- maladies (XP, CS, TTD)
- lignées cellulaires : déficiente dans la réparation d'un certain nombre de dégâts. On va
complémenter ces lignées par des plasmides. On veut corriger le défaut de la lignée
cellulaire.
Xeroderma pigmenum => Cf diapositive.
TTD => Cf diapositive.
Syndrome de Cockayne=> Cf diapositive.
Dans ces trois syndromes, on retrouve des gènes en commun.
 Il y a une diversité phénotypique sur un même gène.
XPA est une molécule qui pilote la première étape de la lésion, elle recrute RPA. Le complexe
recruté a déjà été identifié dans le mécanisme de transcription : c'est TF2H qui va participer à
l'élimination de la lésion. Puis il y a un recrutement de XPG et XPF (ERCC1) : chacun coupe de
son côté. Il y aura plus qu'à resynthétiser le brin.
Chez Escherichia coli.
Il y a une convergence complète : il y a une très grande amélioration du système de
réparation quand il est couplé à la transcription. On recrute également TF2H.
Le mécanisme de XPC fonctionne pour la voie GGR (global genom repear).
Le mécanisme de CSB fonctionne pour la voie TCR (transcription coupling repear).
Les deux voies de la NER.
Cf diapositive.
On fabrique un double brin avec du cisplatine.
On regarde ensuite l'accessibilité de tout ça et la suite des événements lorsque l'anomalie
sera détectée. On regarde à chacune des étapes, sur gel, les coupures qui se font. Il ne faut pas
seulement regarder le nombre de bandes mais aussi leur intensité.
MMR : Methyl Mismatch Repear.
Principe :
On détecte les anomalies consécutives à la réplication.
Chez Escherichia coli : la protéine du gène MutS, agissant sous forme de dimère, signale un
mésappariement, semaine change héros protéine ou puis, échange de conformation et recrute 2
protéines : MutL et MutH. Le complexe va remonter sur l'ADN des deux côtés et faire apparaître
une boucle. Il faut tout à fait un système qui permet de trouver qui était le brin matrice et le brin
néoformé. Chez Escherichia coli, la séquence palindromique GATC permet de savoir qui est qui.
Elle est la cible d'une enzyme : la dam-méthylase qui méthyle l’adénine de la séquence GATC.
Les brins seront alors hémi-méthylés, permettant de reconnaître quel brin a été néoformé.
Lorsque MutS rencontrera cette séquence, elle coupera. Le brin porteur de la lésion sera coupé
par une endonucléase de 5’ vers 3’, appelée Exo VII. Pol III utilisera le 3’OH comme amorce est
resynthétisera le brin, enfin, il y aura action d'une ligase.
La mise en œuvre de ce système n'est pas seulement liée à la réparation des mésappariements. Il
peut y avoir des transferts horizontaux de l'information génétique : de l'ADN va pénétrer dans
une cellule qui, a priori, ne devrait jamais le recevoir. La bactérie a mis en place un système pour
voir s'il s'agit d'un ADN de la famille ou s’il s'agit d'un ADN étranger.
On a alors pensé que c'est le système MMR qui permet la détection de l'ADN étranger du fait
que les ADN des deux espèces se ressemblent mais présentent des variations expliquant les
mésappariements. .
On a pris un mutant MutL, et on a vu que la barrière d'espèces était abaissée et permettait la
formation d'un hybride Escherichia coli- salmonelles.
Chez les cellules eucaryotes pour
Comparaison de séquence est découverte de vrais homologues entre les gènes MutL,
MutS, MutH de la bactérie et chez les eucaryotes. Ces gènes chez les eucaryotes s'appellent
MLH1, MSH1/2… mais pour MutH on n'a pas d'homologue chez les eucaryotes.
Chez les eucaryotes :
- soit il n’y a qu'un seul mésappariement (système MutLα)
- soit il y a 2, 3 ou plusieurs mésappariements (souvent retrouvés où il y a des
répétitions de bases) [système MutLβ].
- On a alors 2 systèmes de reconnaissance de ces erreurs. On peut retrouver la forme
hybride MutLβ/ MutLα.
Chez les eucaryotes, aujourd'hui, on ne connaît pas le mécanisme qui permet de distinguer le brin
néoformées du brin ancien, ni les enzymes endonucléases (MutM chez Escherichia coli). Polδ
chez l'homme viendra resynthétiser le bout qui aura été excisé.
Hereditary non polyposis colon cancer (ou HNPCC)
Essentiellement due à des mutations dans MSH1 et MLH1.
Il existe aussi les cassures double chaîne (DSB repear)
2 systèmes sont mis en oeuvre qui dépend un peu de l'état de la cellule:
- soit on remet bout à bout les extrémités des chromosomes qui ont été séparés par la
cassure double brin, plus facile s’il n’y a qu'un seul chromosome. Il y a pour cela
deux moyens :
o soit on commence par une légère dégradation des brins pour former des
micros homologies permettant la ré- association.
o Soit on fait une synthèse de quelques nucléotides permettant la ré- association.
- Soit on fait intervenir un mécanisme de type recombinaison s'il y a le chromosome
homologue.
D'habitude, la recombinaison homologue se chez qu'en méiose, où les chromosomes homologues
sont appariés via le complexe synaptonémal. Mais, en mitose, le risque de mauvais appariement
est immense car les chromosomes ne sont pas associés. Pour peu que la coupure se fasse dans un
gène répété, toute la recombinaison n'aboutira qu'à une translocation chromosomique pour chez
les mammifères, ce système est très réprimé à cause de ses recombinaisons illégitimes
(recombinaison ectopique) pour réparer ce genre de cassure.
En G2, cette recombinaison est un peu plus favorisé (système HR) alors qu’en G1, c'est le
système de recombinaison non homologue qui est favorisé (NHEJ).
Cf polycopié pour les détails moléculaires.
Où ce système de recombinaison au hasard sera utilisé uniquement de manière normale par le
système NHEJ ou pour les gènes codant pour les immunoglobulines.
Q 70 et Q 80 se fixent aux extrémités, et recrute la DNA-PK. Cela favorise le rapprochement
physique des deux brins qui ont été séparés par la cassure et ensuite il y aura une ligation avec
une perte ou non d'information génétique.
Rad 50 joue un rôle essentiel : sa structure tridimensionnelle la fait ressembler un crochet. Avec
MRE11 et NBS1, il y a la formation du complexe MR qui rapproche des fragments d'ADN. Un
atome de zinc est présent entre les deux crochets des protéines Rad50.
Si on a des mutants :
- Q 70 et Q 80 : on a un recollage très déficient et peu fidèle.
- MRN : faible efficacité mais la réparation est fidèle quand cela se passe.
- Ligase : très faible efficacité de ligature évidemment.
Le système NHEJ est le plus important chez les eucaryotes supérieurs, pour répondre aux lésions
mais aussi pour d'autres mécanismes comme la constitution du répertoire des immunoglobulines.