16ème Rencontre G-RREMI Groupe Régional de Recherche en

16ème Rencontre G-RREMI
Groupe Régional de Recherche en Microbiologie des Interactions
18 Décembre 2014
Communications orales
Laetitia ATTAIECH Equipe « Génétique de la compétence chez les bactéries pathogènes »
CNRS UMR5240, Univ. Lyon 1, LYON
L’augmentation du ratio ori/ter est la cause de l’induction de la compétence par les
antibiotiques ciblant la réplication.
Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) tue près d’un million d'enfants chaque année et
l'émergence de souches multi-résistantes aux antibiotiques constitue une grave menace pour la
santé humaine. S. pneumoniae est une bactérie naturellement transformable, c’est-à-dire
qu’elle peut internaliser de l'ADN exogène et l’intégrer dans son chromosome par
recombinaison homologue. Pour ce faire, elle développe un état physiologique particulier,
génétiquement régulé, appelé « compétence ». De façon frappante, il a été montré qu’un
certain nombre d’antibiotiques induisent, par un/des mécanisme(s) inconnu(s), cet état
physiologique. Ainsi, la compétence pour la transformation génétique permet la propagation
rapide des gènes de résistance aux antibiotiques au sein des populations bactériennes, et ce
phénomène peut être induit par certains antibiotiques eux-mêmes.
Nous avons pu démontrer que les antibiotiques ciblant la réplication de l'ADN induisent une
augmentation du nombre de copies des gènes situés près de l'origine de réplication (oriC). Les
gènes responsables de l’initiation de la compétence sont situés près de oriC et sont
directement affectés par ce phénomène. Nous montrons que ce déséquilibre explique
l’induction de la compétence par ces mêmes molécules. De plus, des analyses
transcriptomiques globales montrent que ces antibiotiques induisent une sur-expression des
gènes proches de l’origine dans d’autres espèces bactériennes. Ceci est une conséquence
directe et intrinsèque du ralentissement/arrêt de la réplication. Nos données suggèrent que
l'évolution a conservé l'emplacement proche de l’origine des gènes importants chez les
bactéries afin de permettre une réponse robuste aux stress réplicatifs sans avoir à maintenir de
systèmes de détection ou de régulation complexes. Ces résultats ont été publiés dans le journal
Cell (Jelle Slager, Morten Kjos, Laetitia Attaiech, Jan-Willem Veening ; Antibiotic-induced
replication stress triggers bacterial competence by increasing gene dosage near the origin ;
Cell. 2014 Apr 10;157(2):395-406. PMID: 24725406).
Cyrille BOTTÉ ApicoLipid Team - Laboratoire Adaptation et Pathogenie des
Microorganismes, La Tronche
Role of the apicoplast in the membrane biogenesis of Apicomplexa parasites: make,
assemble and give.

Apicomplexa is a phylum of obligate intracellular parasites, including pathogens of medical
and veterinary importance that represent a massive social and economic burden, and against,
which there is no current vaccine. Two genera, Plasmodium and Toxoplasma, which are
responsible for malaria and toxoplasmosis in humans, have been the focus of most studies in
this parasite group. Most of these parasite harbours a relict plastid, known as the apicoplast.
Resulting from the secondary endosymbiosis of red algae, this organelle is essential to
parasite survival, and whilst nonphotosynthetic, it shares a number of important biochemical
pathways with the chloroplasts of plants and algae. The apicoplast is believed to play in
central part in parasite lipid synthesis and thus parasite biogenesis through the generation of
unique lipid precursors for membrane biogenesis. Major questions remain unanswered: What
lipids are synthesized by the apicoplast biosynthetic machineries? Are these lipids needed for
the apicoplast biogenesis or are they exported to other membrane compartments? If exported,
what is their fate and how are they trafficked? Our group is involved in addressing some of
these important questions, which will help understand its raison d'etre and identify new
potential drug targets against these major human pathogens.
Alexandre DUPREY* Microbiologie, adaptation et pathogénie UMR5240 CNRS/INSA/
Université Lyon 1
Evolution et spécialisation des régions régulatrices des gènes pel codant les pectate lyases
majeures chez les bactéries phytopathogènes du genre Dickeya.
La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii utilise un arsenal d'enzymes, les principales
étant les pectate lyases (Pels), pour dégrader les parois végétales et ainsi causer la maladie de
la pourriture molle chez une large variété de plantes. Les Pels sont produites en fin de phase
exponentielle de croissance et sont soumises à une régulation complexe. Chez D. dadantii, on
constate des duplications et réarrangements récents d'un groupe de Pels essentiel au pouvoir
pathogène de cette bactérie. Deux membres de ce groupe, PelD et PelE, ont évolué vers des
fonctions opposées : PelE, dont la production dépend fortement des conditions
environnementales, sert d'initiateur de la dégradation des composés pectiques alors que PelD,
produit plus tardivement, est essentiellement induit par les produits de dégradation de la
pectine. Les bases moléculaires de cette spécialisation restaient cependant jusqu'alors
inconnues.
L'étude comparée des régions régulatrices de pelD et pelE a mis en évidence un
ensemble de mécanismes régulateurs communs, complétés par d'autres mécanismes
spécifiques à chaque gène. Sur les deux régions régulatrices, au niveau du site de fixation de
l'ARN polymérase, on trouve un site de fixation pour la protéine CRP, servant d'activateur
principal de l’expression des gènes pel, et deux sites de fixation pour la protéine associée au
nucléoide Fis. Cette dernière réprime l’expression des gènes pel via des compétitions à la fois
avec CRP et l'ARN polymérase. En revanche, la région régulatrice de pelD est la seule à
comporter un second promoteur divergent en amont du promoteur principal. Le promoteur
divergent réprime celui de pelD durant la phase exponentielle de croissance ou durant les
phases précoces de l’infection et contribue ainsi au retard de l'expression de pelD par rapport
à celle de pelE. Chez d'autres bactéries du genre Dickeya, les structures et l'organisation de
ces promoteurs sont remarquablement bien conservés lorsque pelD et pelE sont présents, mais
peu conservés lorsque l'un des deux gènes a été perdu. Ces constats suggèrent une adaptation
de la régulation de la synthèse de ce groupe de Pel en fonction du contexte génique de la
bactérie.

L’analyse fine des séquences régulatrices de ces deux gènes permet ainsi de mieux
comprendre les phénomènes évolutifs qui ont permis aux différentes bactéries du genre
Dickeya de rationaliser l’utilisation des nouveaux facteurs de virulence issus de la duplication.
*Auteurs : Alexandre DUPREY1, Sylvie Reverchon1, William Nasser1
1Microbiologie, adaptation et pathogénie UMR5240 CNRS/INSA/ Université Lyon 1 f‐
69621 villeurbanne
Claire DURMORT Pneumococcus Group, Institut de Biologie Structurale
CNRS(UMR5075)/CEA/UJF, Grenoble
Une nouvelle source d’énergie pour un ABC transporteur impliqué dans la résistance
multi-drogue chez Streptococcus pneumoniae.
La super-famille des ABC transporteurs (ATP binding cassette) est une famille de complexes
membranaires dédiés à l’import et l’export d’une grande variété de composants dans les
cellules. Le transport, réalisé par deux domaines transmembranaires (les perméases), est
énergisé par hydrolyse de l’ATP intracellulaire grâce à l’activité ATPase du domaine NBD
(nucleotide binding domain). Chez Streptococcus pneumoniae, plus de 60 ABC transporteurs
ont été répertoriés dont une vingtaine sont des transporteurs impliqués dans l’export des
xénobiotiques : peptides antimicrobiens, antibiotiques, drogues. PatA PatB fait partie de ces
systèmes d’export conférant au pneumocoque une résistance multi-drogues ce qui pose des
problèmes de résistance des souches pathogènes aux traitements antibiotiques chez les
patients. Pour mieux comprendre ces mécanismes, nous avons réalisé une étude fonctionnelle
et structurale de ce transporteur. PatA/PatB joue un rôle dans l’export des antibiotiques de la
famille des fluoroquinolones et des oxazolidinones (linezolide). La suppression simple ou
simultanée des gènes des deux protéines au sein du pneumocoque lui confère une sensibilité
accrue à la ciprofloxacine et à la norfloxacine ; deux antibiotiques de la famille des
floroquinolones. Seul l’hétérodimère PatA/PatB a une activité d’hydrolyse de l’ATP et de
transport de drogues in vitro; les homodimères PatA ou PatB étant inactifs. De surcroît, nous
venons de découvrir que PatA/PatB hydrolyse préférentiellement le GTP et que l’activité de
transport des drogues s’en trouve augmentée d’un facteur 6 à 8, cela de fonction de la
température. Nous avons vérifié que les concentrations d’ATP et de GTP intracellulaire chez
le pneumocoque sont du même ordre de grandeur (mM), cela prouve que l’activité
d’hydrolyse du GTP n’est pas un artéfact de laboratoire mais possède une relevance
physiologique. Ainsi, nous avons montré pour la première fois qu’un ABC transporteur est
une GTPase ce qui ouvre de nouveaux concepts de fonctionnement pour cette super-famille
de protéine.
Sylvie ELSEN* Pathogénie bactérienne et réponses cellulaires, IRTSV / CEA Grenoble
Un nouveau mécanisme de virulence de la bactérie Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d’infections pulmonaires
aiguës ou chronique graves. Le pouvoir pathogène de cette bactérie Gram-négative est
largement attribué à son système de sécrétion de type III (SST3), véritable aiguille qui injecte
des toxines directement dans les cellules de l’hôte. Notre équipe vient d’identifier un nouveau
mécanisme de virulence chez une souche appelée CLJ1, isolée au CHU de Grenoble d’un
patient décédé d’une pneumonie hémorragique qui a aggravé une insuffisance respiratoire
chronique. Alors qu’elle ne possède pas les toxines les plus connues, ni l’aiguille du SST3,
cette souche est hyper-virulente chez un modèle souris de pneumonie aiguë. Deux clones de
CLJ, CLJ2 et CLJ3, isolés 12 jours après CLJ1 du même patient soumis à une antibiothérapie,
ont perdu leur virulence et ont acquis une haute résistance aux antibiotiques. L’analyse
protéomique des sécrétomes de CLJ1 et CLJ3 par l’équipe Étude de la Dynamique des
Protéomes (EDyP, LBGE CEA-Grenoble) a permis d’identifier une nouvelle cytolysine
appelée Exolysine A (ExlA), sécrétée essentiellement par CLJ1. Cette toxine est responsable
de la mort des cellules infectées en provoquant la désorganisation du squelette d’actine, la
perméabilisation de la membrane externe et la rétraction cellulaire. ExlA est sécrétée grâce à
la protéine ExlB localisée dans la membrane externe de la bactérie. Les deux protéines ExlA
et ExlB, codées par l’opéron exlBA, forment donc un nouveau « two-Partner Secretion (TPS)
system » ou SST5. Des souches de P. aeruginosa associées à des pathologies variées et
collectées dans divers hôpitaux aux Etats-Unis et en Europe possèdent les gènes exlBA et sont
capables de sécréter la toxine ExlA. Il est donc essentiel de comprendre le rôle et la régulation
de ce nouveau mécanisme de virulence, ainsi que de le prendre en compte pour le
développement de nouveaux anti-microbiens visant P. aeruginosa.
*Auteurs : Elsen S, Huber P, Bouillot S, Couté Y, Fournier P, Dubois Y, Timsit JF, Maurin
M, Attrée I. 2014. A type III secretion negative clinical strain of Pseudomonas aeruginosa
employs a two-partner secreted exolysin to induce hemorrhagic pneumonia. Cell Host
Microbe. 15(2):164-76.
Guillaume GOLOVKINE Biology of Cancer and Infection" Team: "Bacterial Pathogenesis
and Cellular Responses" UMR1036 INSERM-CEA-UJF / CNRS ERL5261, iRTSV/CEA-
Grenoble
Real-time imaging of Pseudomonas aeruginosa transmigration across the tissue barriers.
Pseudomonas aeruginosa is a major human opportunistic pathogen and one of the most
important causal agents of nosocomial infections. A critical step of P. aeruginosa acute
infection is the crossing of the epithelial and endothelial barriers. Here, we investigated the
mechanisms involved in these two processes using biochemical and videomicroscopic
approaches.
For the endothelial barrier, the first step is the cleavage of VE-cadherin, an adhesive
intercellular junction protein, by the secreted protease LasB. This is followed by toxin
injection at the basolateral side of the cell, using P. aeruginosa's type III secretion system
(Golovkine et al., Plos Pathog 2014). Toxin injection induces actin cytoskeleton collapse and
massive cell retraction, provoking endothelial barrier breakdown (Huber et al. Cell Mol Life
Sci 2013).
The mechanisms of epithelial barrier crossing remain elusive. Indeed, the apical membrane of
epithelial cells is resistant to Type 3 toxin injection, and E-cadherin is not cleaved by LasB.
To describe the bacterial transmigration in this tissue and to identify the virulence factors
involved in the phenomenon, we established an in vitro model of visualization of epithelial
cell infection in real-time by confocal and TIRF microscopy. We showed that bacteria

transmigrate through intercellular junctions, specifically at cell dividing points, and propagate
radially from these points below the cell monolayer. This invasion requires the coordinated
action of several bacterial virulence factors: Type 3 secretion system, Type 4 pili and
flagellum.
Altogether, our data indicate that the epithelium constitute a good rampart against P.
aeruginosa, while the vascular endothelium is more permissive.
*Auteurs: Golovkine G, Bouillot S, Faudry E, Elsen S, Attrée I and Huber P.
UMR 1036 Equipe Pathogénie Bactérienne et Réponses Cellulaires. CEA-Grenoble.
Anne KERIEL Inserm U1047 - Virulence Bactérienne et Maladies Infectieuses, UFR de
MEDECINE - Site de NIMES
Brucella intracellular life relies on the host protein CD98.
Brucella are intracellular bacterial pathogens that use a type IV secretion system (T4SS) to
escape host defences and create a niche in which they can survive and multiply. Although the
importance of T4SS in establishing the replication niche is clear, little is known about its
interaction with host cell structures. In this study, we identified the eukaryotic protein
CD98hc (also named 4F2hc, SLC3A2 or FRP-1) as a partner for Brucella T4SS subunit
VirB2. This transmembrane glycoprotein is involved in amino-acid transport, modulation of
integrin signalling and cell-to-cell fusion. Knocking-down CD98hc expression demonstrated
that it is essential for Brucella (but not for Salmonella) replication in both HeLa and murine
dermal fibroblasts. CD98hc transiently accumulates around the bacteria during the early
phases of infection and is required for both optimal bacterial uptake and intracellular
multiplication of Brucella. The results presented in this manuscript provide new insights into
the complex interplay between Brucella infection and host pathways.
Cecile MORLOT* Pneumococcus Group Institut de Biologie Structurale
CNRS(UMR5075)/CEA/UJF, Grenoble
The PALM nanostructure of FtsZ along the cell cycle of a pathogenic coccus
Ovoid cocci form a morphological group that includes several human pathogens (enterococci
and streptococci). Their shape results from two modes of cell wall insertion, one allowing
division, and another one allowing limited elongation. Both cell wall synthesis modes rely on
a single cytoskeletal protein, FtsZ, since MreB is absent in ovococcal bacteria. Despite the
central role of FtsZ in these bacteria, very little is known regarding the assembly and
architecture of their Z-ring. In particular, while the comprehension of the in vivo structure of
FtsZ from rod-shaped bacteria has recently beneficiated from superresolution imaging
techniques, such data have never been reported for ovococci, and more generally for cocci.
We have developed the use of PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) in the
ovococcus human pathogen Streptococcus pneumoniae, by engineering a photoactivatable
fluorescent protein which provides better fluorescent properties in the pneumococcus. This
new tool was fused to the endogenous copy of the ftsZ gene and optimization of the PALM
data acquisition process allowed us to determine the first nanostructure of the Z-ring along the
cell cycle of an ovococcus. The pneumococcal Z-ring displays clustered patterns that could be
classified into four main classes and characterized in terms of cluster content and Z-ring
dimensions. Our data show a direct relationship between the axial thickness of the Z-ring and
the advancement of the cell cycle. In addition, we observe in pre-divisional cells double-ring
sub-structures that cannot be detected using conventional microscopy. Based on these new