tp 4.2 : depistage et structure des anticorps

Le système immunitaire réagit à l’infection au VIH en sécrétant des γ globulines. La séropositivité au VIH indique que le
sérum contient des anticorps anti-VIH.
Comment savoir si les anticorps produits, les γ globulines du plasma, sont spécifiques au VIH ou pas ?
Quelle structure de l’anticorps permet cette spécificité au VIH.
Déroulement du TP
Le dépistage d’une séropositivité se fait par la fixation d’anticorps sur des antigènes choisis, suivie d’une coloration
enzymatique du complexe fixé. Test ELISA
Résultats de secours
L’anticorps est une molécule symétrique, possédant 2 sites de fixation d’antigène.
Leur partie variable est complémentaire d’un antigène spécifique. RASTOP
L’anticorps est une protéine, formée d’une séquence d’acides aminés ANAGENE
La comparaison de leur séquence permet d’identifier les parties variables et constantes.
LE COMPTE RENDU SE PRESENTE SOUS LA FORME :
 d’un tableau regroupant les résultats associés au contenu de chaque tube.
 d’un schéma représentant les molécules liées entre elles dans le puits lors d’un résultat positif. Symboles
 d’une phrase courte indiquant l’antigène fixé au fond du puits dans le cas d’une contamination au VIH.
 d’un schéma de structure d’un anticorps, sur lequel sont chiffrées les séquences d’acides aminés des parties
variables et constantes.
T.P. 4.2 : DEPISTAGE ET STRUCTURE DES ANTICORPS

TEST ELISA suivi du TP
Principe :
Le sérum que l’on veut analyser contient des anticorps. Il est versé dans un puits où est fixé l'antigène complémentaire de
l’anticorps (= AC1) recherché : AC1 se fixe sur AG si le sérum contient cet anticorps.
Un lavage permet d'éliminer les anticorps non liés à l’antigène ; seuls restent ceux qui sont liés à AG.
Pour détecter la présence d’AC1 resté dans le puits, on ajoute un anticorps secondaire (AC2) qui se fixe sur la partie
constante de l'AC1. Cet AC2 est couplé à un enzyme capable de réagir avec un substrat et de le colorer.
Cas de la recherche d'anticorps anti-VIH
Dans le cas du test appliqué à la recherche d'une séropositivité, les protéines du VIH sont fixées en tant qu'antigènes
dans le puits. Les individus infectés par le VIH possèdent dans leur sérum des anticorps dirigés contre ces protéines
virales. (Plus précisément contre les « épitopes », c’est-à-dire contre les déterminants antigéniques).
Ces anticorps anti-VIH sont détectés dans les six semaines qui suivent l'infection.
Une autre technique, le Western blot, confirme et détermine si le patient possède des anticorps qui réagissent avec une
ou plusieurs protéines virales.

Matériel : suivi du TP
 une barrette de puits au fond desquels sont fixés des antigènes : AG. (GP120 par exemple)
 des solutions d’anticorps à tester, de taux variable : AC1 (anti-VIH par exemple).
 une solution de traceur AC2 (= association du 2° anticorps et d’un enzyme)
 le réactif d’ELLMAN = substrat de l’enzyme. L’enzyme colore ce substrat (incolore au départ) en bleu.
 une pissette d’eau pure pour le rinçage, des pipettes
PROTOCOLE
1. Placer dans chaque puits 2 gouttes d’une solution à tester. Attention, 1 solution/puits. 1 pipette/solution.
Penser à repérer les puits.
Les solutions à tester sont notées : Témoin, C1, C2, C3, C4, C6, C8, sérum non immunisé
2. Attendre 15 minutes. Puis vider les puits par retournement rapide (pour éviter les mélanges de puits)
Laver 2 fois au tampon PSB (pour enlever les AC1 ainsi que les autres AC non fixés)
3. Ajouter dans chaque puits 2 gouttes de la solution d’anticorps traceurs [AC2 associé à l’enzyme].
4. Attendre 15 minutes. Puis vider les puits par retournement rapide (pour éviter les mélanges de puits)
Laver 2 fois au tampon PSB (pour enlever les AC2 non fixés)
5. Ajouter dans chaque puits 2 gouttes de TMB, substrat de l’enzyme associée à AC2.
6. Laisser agir 2 minutes : regarder le résultat ; le noter.
RESULTATS DE SECOURS suivi du TP

RASTOP suivi du TP
Pour télécharger RASTOP sur son disque dur, utiliser le lien vers le site de l’INRP :
http://www.inrp.fr/Acces/biotic/rastop/html/telechargement.htm
Dans votre ordinateur, préparez un dossier pour
recevoir le logiciel.
Téléchargez la version exécutable
Téléchargez les DLL complémentaires ; il n’est
pas nécessaire de les mettre dans le répertoire de
Windows/système ou WINNT/system32.
Vous pouvez les mettre dans le même dossier
que vous venez d’utiliser pour RASTOP.
Il faut ensuite charger les molécules utiles
Soit précisément en cliquant sur ce lien : http://librairiedemolecules.education.fr/molecule.php?idmol=88
Soit en allant dans l’accueil de la LIBRAIRIE DE MOLECULE : http://librairiedemolecules.education.fr/.
Puis vous suivez le chemin suivant : applications pédagogiques, recherche par entrée du programme, TS obligatoire,
immunologie 2, structure et fonction des anticorps : en savoir plus.
Cliquer sur anticorps anti-GP120, la page suivante s’ouvre.
RASTOP en français
Version 2.01 Exécutable et répertoire d'aide
Version 2.03 Exécutable seulement - (actualisation par C. Duqué)
Version 2.03 Exécutable et répertoire d'aide
Attention :
Sur certaines machines, des Dll supplémentaires (MFC42.DLL, MFC42D.DLL et
MSVCRTD.DLL) peuvent être requises. Les télécharger et les décompacter
dans le répertoire windows/system ou WINNT/system32
Télécharger les DLL de RasTop

Cliquer sur le fichier non
compressé (format pdb)
ANTICORPS ANTI-GP120-VIH
RÉFÉRENCES
Auteurs : Ghiara J.B., Stura E.A., Stanfield R.L., Profy A.T., Wilson I.A.,
Publication : "Crystal structure of principal neutralization." in Science 1994 n°264 pages 82-85 PubMed
Source : PDB Identifiant : 1ACY
CLASSIFICATION : organisme d'origine : souris catégorie :
organique > protide > proteine > structure > enveloppe virale > anticorps anti-gp120-vih
organique > protide > proteine > immunite > immunoglobulines > anticorps anti-gp120-vih
DESCRIPTION
Un fragment Fab d'une molécule d'anticorps anti-glycoprotéine 120 du virus du SIDA.
VISUALISATION EN LIGNE : visualisation rapide , molusc , protein explorer
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