interraction anticorps antigène ( PDF

Groupe 1
BALLIANA Antoine
BRESSE Claire
DEPOUSIER Estelle
ESPRABENS Loïc
LE FLOHIC Swan
MUIRAS Aude
SCHOR Arthur
Etude des interactions anticorps – antigène
et du rôle du macrophage
dans la réponse immunitaire
Expérience 1 :
Etude de la spécificité de l’interaction anticorps – antigène
Un anticorps est-il spécifique à un antigène donné ?
On réalise le test d’Ouchterlony.
Préparation de la gélose :
– 100 mL de PBS + 1,5 g
d’agarose
– Réchauffement au microondes
– Dépôt au fond de boîtes de
Pétri
– Solidification de la couche
de gélose
A l’aide d’un emporte-pièce, on fait les trous dans la gélose.
5 : Eau
1 : Lysozyme 10 mg/mL
Sérum souris immunisée
(anticorps anti – lysozyme)
ou souris non immunisée (pas
d’anticorps anti-lysozyme)
2 : Lysozyme 1 mg/mL
4 : Ovalbumine 1 mg/mL
3 : Ovalbumine 10 mg/mL
On laisse en culture 24 heures dans un milieu humide.
Résultat du test d’Ouchterlony
Arc de précipitation entre le puits central
contenant l’anticorps anti-lysozyme et les puits
1 et 2 contenant du lysozyme.
On n’observe pas d’arc de précipitation car le
sérum de la souris non immunisée ne contient
pas d’anticorps anti-lysozyme.
Conclusion : Un anticorps est spécifique à un antigène donné.
Expérience 2 :
Etude du rôle du macrophage dans la réponse immunitaire
La phagocytose est-elle plus efficace avec ou sans anticorps ?
On prépare deux plaques : la 1ère avec des macrophages et la 2ème avec des cellules CHO.
Billes de latex
+ anticorps
Billes de
Billes de
Billes de latex
latex
latex
+ anticorps sans anticorps
sans
sans
sans
anticorps Macrophages macrophage macrophage
Plaque 1
Billes de latex
+ anticorps
Billes de latex
sans anticorps
Plaque 2
On centrifuge 5 min et on incube 20 min à 37°C.
Cellules CHO
On fait 4 lavages pour chaque puits.
A l’aide d’un microscope (x 40), on compte les billes de latex à l’intérieur des
macrophages pour la 1ère plaque, et à l’intérieur des cellules CHO pour la 2ème plaque.
Macrophages avant l’ajout des billes de latex
Cellules CHO avant l’ajout des billes de latex
Macrophages après l’ajout des billes de latex
Cellules CHO après l’ajout des billes de latex
Avec anticorps
Sans anticorps
Répartition du nombre de billes de latex phagocytées par
macrophage selon la présence ou non d’anticorps
nombre de macrophages
35
30
25
20
avec anticorps
15
sans anticorps
10
5
0
0
1
2
>2
nombre de billes de latex phagocytées
Conclusion : La phagocytose est plus efficace en présence d’anticorps sur
l’antigène.
Expérience 3 :
Etude du rôle du macrophage dans la réponse immunitaire
Les macrophages sont-ils capables de phagocyter des
microorganismes (levures) ?
Marquage des levures avec 2 colorants différents
(un rouge et un vert) :
– On met 2 grains de levure dans de l’eau.
– On prépare des tubes de 1,5 mL et on centrifuge 5 min.
– On chauffe le PBS à 37°C, puis les colorants mélangés
avec le PBS.
– On enlève le surnageant au-dessus des levures.
– On rajoute 100 µL de colorant chauffé.
– On met dans un bain sec 15 min à 37°C.
– On centrifuge 5 min.
– On enlève le surnageant.
– On ajoute 200 µL de milieu de culture.
– On incube 30 min à 37°C.
Afin d’enlever l’excès de colorant, on lave les solutions 2 fois en centrifugeant
5 min avant chaque lavage.
On prépare 2 plaques : la 1ère plaque avec des macrophages et la 2ème avec des
cellules CHO.
Dans chaque plaque :
– Puits 1 : 50 µL de levures colorées en vert
– Puits 2 : 50 µL de levures colorées en rouge
– Puits 3 : 25 µL de chaque type de levures
– Puits 4 : on n’ajoute rien au milieu
On incube 1 heure à 37°C.
On teste l’efficacité de la coloration des levures avec les levures colorées
préparées restantes.
Observation au microscope (x 40)
Marquage rouge
Marquage vert
On compte les levures en lumière blanche et avec la fluorescence.
On obtient une efficacité de 92 % pour les colorations verte et rouge.
On effectue 4 lavages pour chaque puits des 2 plaques.
On observe au microscope (x 40) les levures phagocytées par les macrophages pour
la plaque 1, et par les cellules CHO pour la plaque 2.
Marquage vert
Cellules CHO
Conclusion : Les macrophages sont aussi capables de phagocyter des
microorganismes, ici les levures.
Cinétique de la phagocytose des levures par les macrophages
On prend des photos toutes les 10 min.
t0 sans les levures
10 min
20 min
50 min
40 min
30 min
60 min
On constate que au fur et à mesure, de plus en
plus de levures sont phagocytées par les
macrophages.
Schéma bilan