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EFFETS DES HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUES SUR L’IMMUNITE HUMAINE Pr Lydie SPARFEL Laboratoire de Toxicologie – Faculté de Pharmacie UMR INSERM U1085 ‘IRSET’ Université de RENNES I Séminaire/Webinaire Immunotoxicité : quand les polluants menacent notre immunité Fondation Rovaltain, Valence le 9 avril, 2015 IMMUNOLOGIE = discipline qui étudie les mécanismes de défense de l’organisme contre toute substance étrangère à l’organisme (virus, bactéries, parasites, champignons, cellules tumorales) Rôle dans le maintien de l’intégrité © Inserm, Frédérique Koulikoff Barrières physiques, chimiques, microbiologiques Acteurs cellulaires (lymphocytes T, B, NK, phagocytes (neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques)) et moléculaires (cytokines, complément, anticorps…) Anté-immunité Immunité naturelle, innée ou non spécifique Immunité spécifique, adaptative ou acquise à un antigène particulier Les ORGANES du SYSTÈME IMMUNITAIRE organes primaires lymphoïdes organes secondaires lymphoïdes (ganglions, rate, tissu lymphoïde annexé aux muqueuses) Anneau de Waldeyer ( ganglions, amygdales, végétations) Thymus Moëlle osseuse Tissu lymphoïde associé aux bronches Ganglions lymphatiques Rate Ganglions mésentériques Plaques de Peyer Tractus uro-génital maturation et éducation des lymphocytes concentration des antigènes coopération cellulaire orientation de la réponse immune Les CELLULES du SYSTÈME IMMUNITAIRE progéniteur lymphoïde voies de différentiation cellules souches auto-réplicatives, pluripotentes progéniteur myéloïde (Reya et al., Nature 2001 414, 105-11) Les SYSTEMES de DEFENSE du SYSTÈME IMMUNITAIRE Anté-Immunité : 1ère ligne de défense de l’organisme réponse immédiate pour éviter que le SI ne soit mis à contribution = Barrières physiques, chimiques, microbiologiques (peau, muqueuses des voies respiratoire et uro-génitale, acidité des voies gastro-intestinales…) Pas de ‘mémoire immunologique’ (Parks et al., Nature Rev. Immunol. 2004, 4, 617-29) Si : blessure, brûlure, piqûre, opération chirurgicale, fortes doses de xénobiotiques, chimiothérapie… (Parks et al., Nature Rev. Immunol. 2004, 4, 617-29) 2nde ligne de défense : Immunité Innée, Naturelle ou Non Spécifique Associée à une inflammation Réponse humorale ou cellulaire (Lawrence et al., Nature Rev. Immunol. 2002, 2, 787-795) Composants de l’immunité innée : Existence préalable Action rapide après agression (Dranoff et al., Nature Rev. Cancer 2004, 4, 11-22) Cellules : Mastocytes Phagocytes professionnels (captent et détruisent les éléments étrangers) : granulocytes et macrophages Lymphocytes NK (tuent les cellules infectées ou tumorales..) Cellules présentatrices d’antigène (capturent, apprêtent et présentent l’antigène) : cellules dendritiques et macrophages Molécules : Complément Anticorps Cytokines 3ème ligne de défense : Immunité Adaptative, Spécifique ou Acquise à un antigène particulier Composants: Lymphocytes (Dranoff et al., Nature Rev. Cancer 2004, 4, 11-22) Lymphocytes B : réponse humorale (production d’anticorps) Lymphocytes T : réponse cellulaire (cytotoxicité ou régulation) Reconnaissance spécifique des antigènes par leurs récepteurs BCR ou TCR (O’Hagan Nature Rev. Drug Dis. 2003, 2, 727-35) Th1 Réponse cellulaire (LTc) Différenciation CPA Ag Réponse humorale (Anticorps) Th2 CMH II TCR Activation LT naïf IL-2 Th17 Inflammation, maladies autoimmunes Prolifération Treg Suppression des réponses immunes (Luckheerman Clin. Dev. Immunol.. 2012) Réponses immunes innées et adaptatives dans l’asthme (Holgate Nature Med. 2012, 18, 673-83) IMMUNOTOXICOLOGIE = étude des effets délétères provoqués par l’exposition à un xénobiotique (médicaments, pesticides, produits industriels, polluants, additifs alimentaires, cosmétiques) sur le système immunitaire Mise en évidence des perturbations immunologiques chez l’animal ou l’homme Compréhension des mécanismes en cause Evaluation des risques pour les personnes exposées Connaissances relativement approfondies chez l’animal Méconnaissance profonde chez l’homme => Résultats expérimentaux sont-ils applicables à l’homme ???? 1 - Immunosuppression = inhibition de la réponse immunitaire par des xénobiotiques Beaucoup de données : traitement des transplantés, des maladies auto-immunes Conséquences bien connues - complications infectieuses : susceptibilité ↑ aux infections - tumeurs d’origine virale cancers de la peau et des lèvres lymphomes malins non-hodgkiniens sarcomes de Kaposi cancer du col de l’utérus Paramètres d’évaluation - NFS, poids du thymus, rate - Histologie des organes lymphoïdes - Modifications des populations lymphocytaires - Phagocytose - Activité NK - Synthèse d’anticorps - Prolifération cellulaire Exposition aux dioxines Viktor Yushchenko, 2004 (Expertise collective INSERM) + atrophie thymique chez la souris et le rat 2 - Immunostimulation ou immunoactivation = stimulation du système immunitaire par des xénobiotiques, aboutissant à une manifestation pathologique Lié à l’introduction récente de médicaments immunostimulants Manifestations secondaires : - réactions hyperthermiques (pseudogrippales ou syndrome aigu des cytokines) - aggravation de pathologies immunitaires pré-existantes (réactions allergiques, maladies auto-immunes) Prédictivité des modèles non cliniques = plutôt limitée Exposition aux anticorps anti-CD28 (Hansel et al., Nature Rev. Drug Dis. 2010, 9, 325-38) 3 - Réactions d’hypersensibilité = réponse immunitaire intense et inappropriée de l’organisme contre une substance étrangère à l’organisme 4 classes : immédiate cytotoxique complexes immuns retardée (Bugelski, Nature Rev. Drug Dis. 2005, 4, 59-69) Conséquences cliniques : - anaphylaxie - cutanées (toxidermies, urticaires, eczéma de contact…) - hématologiques (anémies hémolytiques, neutropénies, agranulocytose…) - respiratoires (asthme…) - hépatiques (hépatites immuno-allergiques…) - rénales (glomérulonéphrites, néphrites immuno-allergiques…) Prédictivité : © Inserm Tests cutanés aux pneumallergènes chez un patient atopique souffrant d’asthme allergique aux pollens de graminées. T : témoin négatif, His : témoin positif histamine, Cod : témoin positif codéine, 5G : extrait de pollens de graminées, AR : extrait d’armoise, AM : extrait d’ambroisie, PL : plantain 4 - Auto-Immunité = réponse immunitaire dirigée contre les composants normaux de l’organisme (autoantigènes) Mécanismes : - rupture de tolérance au soi - modification d’auto-antigènes par fixation covalente d’un métabolite réactif Conséquences cliniques : - réactions généralisées (lupus érythémateux disséminé) - réactions spécifiques d’organes anémies hémolytiques thrombopénies hépatites… Diagnostic clinique, immunologique et parfois génétique © Inserm, Loïc Guillevin Lupus érythémateux disséminé (LED), maladie auto-immune chronique. Glomérulonéphrite lupique: dépôts mésangiaux d'IgA. EFFETS DES HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUES SUR L’IMMUNITE HUMAINE Origine des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) : Sources naturelles : Sources anthropiques : Contamination de l’atmosphère, des aliments, de l’eau et des sols Famille de composés organiques très répandus : Nombreux HAPs > 100 Chef de file des HAPs Le benzo(a)pyrène (BaP) Mécanisme moléculaire d’action des Hydrocarbures Aromatiques : Récepteur cytosolique : RAh = récepteur arylhydrocarbon RAh HSP 90 HSP 90 RAh RAh HSP 90 HSP 90 HSP 90 HSP 90 RAh ARNT CYP1 XRE Métabolites électrophiles Mort Cellulaire Cancer gènes cibles Nombreux effets toxiques : Actions cancérogènes bien documentées par des études expérimentales chez l’animal par des enquêtes épidémiologiques chez l’homme Treg Actions immunosuppressives Pathogène HAPs LTc CD8 Survenue de pathologies LTc CD8 LB LTh CD4 HAPs cardiovasculaires et inflammatoires Th17 CPA IMMUNITE CELLULAIRE LB IMMUNITE HUMORALE HAPs CPA Th17 documentées par des expérimentales chez l’animal études Effets des HAPs sur les cellules de l’immunité chez l’homme ? in vitro extraction au Ficoll concentré leucoplaquettaire Plasma cellules mononucléées érytrhocytes et granulocytes adhésion des monocytes récupération du surnageant : fraction enrichie en lymphocytes Equipe ‘Contaminants chimiques, Immunité et Inflammation’ Effets des HAPs sur la différentiation des monocytes humains PHAs cellules dendritiques CD14-, CD1a+ Laupeze et al., J. Immunol. 2002 monocytes humains primaires CD14+, CD1a-, CD83- GM-CSF + IL-4 GM-CSF PHAs macrophages CD14+, CD71+, CD1a- van Grevenynghe et al., J. Immunol. 2004 Effets des HAPs sur le macrophage humain différencié Rôle majeur dans la réponse immune Etude chez différents sujets CYP1 Expression du RAh et des CYPs Présence dans les organes cibles macrophages différenciés (jour 6) monocytes (jour 1) * p < 0,05 100 80 60 * 40 * 20 altérations phénotypiques et fonctionnelles et mort cellulaire par apopotose 4 °C 37 °C 120 Events Cellules adherentes (%) GM-CSF B aP Untreated Témoin BaP BP10M 0 0 1 4 Traitement au BaP (j) 7 FITC-dextran staining van Grevenynghe et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004 Macrophages humains différenciés = cibles des HAPs Rôle du RAh * CYP1A1 - actine [3H]BaP metabolites (cpm x 104/puits) -NF+BaP BaP -NF Témoin 40 35 30 25 20 15 10 5 0 PFT-α 35 30 25 20 15 10 5 0 p53 transactivation *** - PFT-α - cellules + PFT-α + cellules * p < 0,05 --NF --NF - cellules 35 30 25 20 15 10 5 0 +-NF + cellules * Témoin BaP -NF -NF + BaP Van Grevenynghe et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004 Cellules apoptotiques (%) Cellules apoptotiques (%) BaP metabolites (103 cpm/puits) et des métabolites réactifs du BaP 25 20 *** 15 10 5 0 Témoin BaP BaP+PFT-α Sparfel et al., Carcinogenesis, 2006 Macrophages humains différenciés = étude transcriptomique Identification des différentes cellules moléculaires des HAs Etudes transcriptomiques dans des modèles animaux ou des lignées cellulaires immortalisées Peu de travaux sur des cellules humaines normales Aucune étude sur des cultures primaires de macrophages humains Etude du transcriptome de macrophages humains exposés au BaP Témoin BaP 2 µM 8 et 24 hr BaP 2µM 8h BaP 2µM 24h Sur le plan fondamental : Extraction de gènes signatures spécifiques Validation des données transcriptomiques par RT-qPCR Sélection des gènes à 8 et 24 h – BaP 2µM pvalue ≤ 0.01 fold change – 2 800 700 up-régulés down-régulés 600 500 400 36 283 300 200 100 ARNm fold change ( RT-qPCR) 900 827 40 30 ρ = 0.89 p < 0.0001 20 10 0 5 10 15 20 ARNm fold change (microarrays) 60 0 8h 24 h Sparfel et al., Tox. Sci. 2010 Sur le plan Identification de nouveaux gènes cibles des HAs fondamental : O2●- O2 NCF1 : Neutrophil Cytosolic Factor 1 = gène codant pour la sous-unité 3 ** 4 gp91 de la NADPH oxydase * phox rac1 * *** NCF1 ARNm NCF1 ARNm p47phox 3 2 p22 phox p47 p67 phox p40 phox phox 2 1 1 0 Témoin TCDD BeP 0 3MC * p < 0,05 Témoin BaP Si CTR Témoin BaP Si RAh GEL RETARD ChIP Promoteur RAh ARNT Induction RAh-dépendante XRE Pinel-Marie et al., Free Rad. Biol. Med., 2010 * * p < 0,05 18 16 * 160 14 Viability (%) (Mean Fluorescence Intensity) DHE * 20 12 10 8 6 140 120 100 80 60 4 40 2 20 0 0 UNT BaP UNT - PMA BaP SOD + PMA Implication dans les effets immunotoxiques du BaP Pinel-Marie et al., Free Rad. Biol. Med., 2010 SOD/ BaP * UNT BaP Apocynin Apocynin /BaP Sur le plan Identification de nouveaux gènes cibles des HAPs fondamental : FcαRI : Fc alpha Récepteur I IgA * 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 * * * * p < 0,05 5 FCRI ARNm FCRI ARNm - gène codant pour un Récepteur au fragment Fc des IgA - fonctions dans l’immunité anti-infectieuse et inflammation UNT BaP TCDD 3MC BeP GEL RETARD 4 Promoteur 3 2 1 RAh ARNT 0 Témoin BaP UNT BaP Si CTR BaP SiRAh * 300 FCRI expression (%) UNT 200 100 0 Témoin BaP Pinel-Marie et al., Toxicology 2012 Induction RAh-dépendante XRE Sur le plan fondamental : Temps d’exposition Meilleure compréhension des réseaux des gènes impliqués dans l’immunotoxicité des HAPs Fonctions biologiques Nombre de gènes 8h Présentation d’antigène 13 Réponse Immune à médiation cellulaire 14 Réponse Immune à médiation humorale 14 Réponse Inflammatoire 15 Cancer 28 Mort Cellulaire 61 Cancer 108 Maladies Respiratoires 29 Croissance Cellulaire et Prolifération 64 Maladies Immunologiques 26 24 h Sparfel et al., Tox. Sci. 2010 ARN interférence Voie de signalisation siRAh Temps 8 h Meilleure compréhension des réseaux des gènes impliqués dans l’immunotoxicité des HAPs siCTR Sur le plan fondamental : Signalisation RAh RAh p38 RAh 20 Niveaux d’ARNm 15 siCTR Témoin siCTR BaP siRAh Témoin siRAh BaP * * p < 0,05 * 10 5 * * * * * 0 Sparfel et al., Tox. Sci. 2010 ASB2 CXCR5 FUCA1 GPR68 RASAL1 SEMA6B SLC16A6 Sur le plan fondamental : Temps Meilleure compréhension des réseaux des gènes impliqués dans l’immunotoxicité des HAPs PFT-α Voie de signalisation * 30 20 24 h Signalisation p53 10 p53 transactivation 0 GADD45A * 20 Niveaux d’ARNm 15 Témoin BaP PFT-α BaP/PFT-α * p < 0,05 * 10 * * * * * * 5 * * 0 Sparfel et al., Tox. Sci. 2010 ADM CXCR4 DDB2 DUSP1 FDXR FDZ5 FOSB GDF15 SNAI1 STK17A Sur le plan appliqué : Pery et al., Toxicol. Lett., 2010 Identification de marqueurs d’exposition, d’effet au BaP Epidémiologie moléculaire Modélisation de l’exposition et du risque Effets des HAPs sur le lymphocyte humain Rôle majeur dans la réponse immune adaptative Etude chez différents sujets CYP1 Expression du RAh et des CYPs Facilement accessible par simple ponction sanguine Lymphocytes T CD3+ humains purifiés fraction enrichie en lymphocytes (B, T, NK) IgG Tri par sélection négative IgG CD3+ CD3+ Kit 39.26% Dynabeads® 92.47% RAh Altération des réponses de l’immunité adaptative (souris RAh -/-) Rôle essentiel dans la réponse immune Altération de la différentiation des lymphocytes T activés - effets ligands dépendants - effets espèces dépendants Ho et Steinman., Cell. Res.., 2008, 18, 605-608 Chez l’homme, données contradictoires sur la différentiation des Th17 RAh régulateur transcriptionnel des réponses immunes ? Lymphocytes humains : Expression du RAh +++ dans Th17, Treg, - - dans Th1, Th2 Mécanismes contrôlant l’expression du RAh dans le lymphocyte T activé ? Stimulation lymphocytaire Ac ANTI-CD3 TCR/CD3 LT Bille Ac ANTI-CD28 LT LT LT LT LT LT LT LT Lymphocytes T activés Prolifération Et Activation CD28 Caractérisation de l’expression et de la fonction du RAh dans le LT humain activé Lymphocytes humains RAh 30 UNS 20 8 CD3-CD28 - nucleus + 24 72 120 - + AhR AhR * * cytosol CD3/CD28 (h) * HSC70 Actin ARNT 10 0 CD3/CD28 UNS 2 4 8 24 72 CD3/CD28 (h) - + 120 DAPI 7 µm 7 µm AhR mRNA expression (relative) AhR mRNA expression (relative) Induction de l’expression et de la fonctionnalité du RAh 20 15 7 µm 7 µm * 10 Merge 7 µm 7 µm 5 0 IgG control CYP1A1 CYP1B1 AhRR 7 µm 7 µm Prigent et al., Eur. J. Immunol., 2014 Lymphocytes humains RAh Nécessaire à la sécrétion d’IL-22 10 mRNA expression (relative) cytokine concentration (ng/mL) 2 CD3/CD28 – CH-223191 CD3/CD28 + CH-223191 * 5 0 IL-17 * AhR CYP1B1 8 IL-22 concentration (ng/mL) * * * IL-22 concentration (ng/mL) * 15 * 10 5 healthy non-smokers current smokers past smokers normal lung function current smokers past smokers COPD * * 1 0 IL-22 CD3/CD28 + siCTR CD3/CD28 + siAhR CD25 IL-2 IL-17 IL-22 * 6 CD3/CD28 – CH-223191 CD3/CD28 + CH-223191 * 4 * 2 0 nonsmokers current smokers past smokers Prigent et al., Eur. J. Immunol., 2014 Lymphocyte T activé = prêt à répondre à son environnement Analyse de la réponse moléculaire et cellulaire aux HAPs (projet ANSES 2015-2018 avec le soutien de l’ITMO cancer) Etudes transcriptomiques Puces pangénomiques à oligonucléotides (Human 8X60K Agilent®) Etudes des dommages à l’ADN : par le test des comètes par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem lien des cibles géniques avec le risque génotoxique => Amélioration des connaissances => Identification de biomarqueurs cellules immunologiques humaines = modèles de culture primaires intéressants HAPs altérations phénotypiques et fonctionnelles effets sur la différentiation pathologies humaines → identification de nouveaux gènes cibles / nouvelles voies de signalisation => nouvelles informations pour mieux caractériser la voie du RAh et les effets délétères de contaminants environnementaux Equipe 1 « Contaminants Chimiques, Immunité et Inflammation »(CI2) Dir : FARDEL Olivier • • • • • • • • • • • DELAVAL Philippe JOUNEAU Stéphane LECUREUR Valérie LE FERREC Eric SPARFEL Lydie VERNHET Laurent LE VEE Marc MORZADEC Claudie JOUAN Elodie JAGUIN Marie LIAMIN Marie MERCI DE VOTRE ATTENTION
