Photométrie des milieux troubles

Laphotométriedesmilieuxtroubles
Avertissement:cetravailrésulted’unesynthèsededonnéesbibliographiquesetdetravauxd’enseignantsdebiotechnologiequel’inspectiongénéraleremercievivement.
Les solutions hétérogènes telles que les solutions macromoléculaires dispersées (anciennement appelée solutions colloïdales) ou les suspensions de fines
particulesoudecellulesdéveloppentaveclalumièredesinteractionscomplexesquel’œilinterprèteparlavisiond’untrouble.
Dansunmilieutrouble,chaqueparticulesecomportecommeunesourcesecondairedelumière.
Auseind’unmilieutrouble,lalumièresubittroiscatégoriesdephénomènesprincipaux:
- desdiffusionsfonctionsdelaforme,lataille,lacompositiondesparticules;
- desréflexions(phénomènemineurquiseranégligéici)enlienaveclanaturedeleursurface;
- uneabsorptionselonletauxd’opacitédesparticules.
Lerestedelalumièreestsimplementtransmisdansl’axedelalumièreincidente.
Les phénomènes sont bien plus complexes encore mais on considère qu’ils obéissent à la loi de Rayleigh dont l’expression, elle aussi complexe, peut être
simplifiéesous la forme (avec I = intensité de lumière, exprimée en candela (cd) selon le système international, ou en lumen (lm) pour l’unité dérivée du flux
lumineux):
Iincidente=Iabsorbée+Itransmise+Idiffusée
Lesprincipalesméthodesdemesuredesinteractionsentrelalumièreetunmilieutroublesont:
- laTURBIDIMETRIE;
- l’OPACIMETRIE;
- laNEPHELEMETRIEouNEPHELOMETRIE.
Alertesémantique:
Danslesouvragesderéférence,laturbidimétrieestdéfiniecommelamesuredudegrédeturbiditéd'unesuspension,c'est-à-direl'évaluationdelaquantitéde
substancesinsolublesouensuspensiondansunliquide.
L’opacimétrieestdéfiniecommela«mesuredel'opacitéd'unesubstanceparmesuredel’atténuationdurayonnementtransmis.»Onpeututilisermaintenantle
terme«atténuance»(1),notée«D»,pourexprimerlerésultatenopacimétrie(SourceIUPAC(2)GoldBook2012).
Le terme absorbance(3) est réservé à la photométrie d’absorption moléculaire en milieu homogène et transparent, couramment appelée spectrophotométrie
d’absorptionmoléculaire.
Leterme«DO»(densitéoptique)n’aplusd’existenceofficielle:ilestrecommandédeneplusl’utiliserdepuis1996(sourceIUPAC).
Ilsembleraitmêmequeletermeturbidimétriesoittrèsgénérique(mesuredutrouble)etenglobeenfaitlesdifférentestechniques(notammentopacimétrieet
néphélémétrie).
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Afin d’harmoniser les contenus d’enseignement et nuancer ces concepts complexes, les repères du tableau ci-dessous peuvent être apportés aux élèves du cycle
terminalSTL-biotechnologiesetdessectionspost-baccalauréat(CPGE-TB&STS).
Cycleterminal
méthodologie
définition
Appareilde
mesure
Application
Expressiondurésultat
Turbidimétrie
Appréciationvisuelle,
parfoismesurée,dela
concentrationoude
l’épaisseurd’unmilieu
selonsontroubleen
comparaisonàdes
suspensionsétalon.
Lecturevisuelle,
parfoismesurée.
-Préparationde
suspensionmicrobienne
parcomparaisonavec
lesétalonsMacFarland
-Testdeséropositivité
auvirusEbolaparPCR
Enrepèreavecl’étalon
correspondant.
Présenceounond’un
trouble.
Opacimétrie(6)
Mesurelalumière
transmisedansla
mêmedirectionquela
lumièreincidente.
Spectrophotomètreà
unelongueurd’onde
prochede600nmle
plussouvent(7).
Estimationdela
concentrationcellulaire
d’unesuspension
(bactéries,levures,...).
Onutiliseaussileterme
atténuance(D).
Danscertaines
conditions(6)onpeut
appliqueruneloide
proportionnalitédutype:
D=k·CN·l
D:atténuance
k:coefficientde
proportionnalité
l:trajetoptiquedela
lumière(épaisseurdela
cuve)
CN(5):concentrationdes
macromoléculesou
particulesàl’originedu
trouble
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Notionscomplémentaires
post-baccalauréat
Enfonctiondeslaboratoires
d’analyses,lesappellationsdes
méthodologiesutilisantla
photométriedesmilieuxtroubles
peuventêtredifférentes.La
turbidimétrieeffectuéedansles
laboratoiresd'analysesbiologiques
surdesprélèvementsdeliquides
biologiquesestessentiellement
réaliséeavecdesappareilsoptiques
dehauteprécision,reliésàun
ordinateur;ainsi,danslaplupart
desouvragestechniquesmédicaux
lesdeuxtermesturbidimétrieet
néphélémétriesontutilisésdefaçon
équivalente.
Dansdenombreuxd’ouvrages,les
termeopacimétrieouturbidimétrie
sontutiliséssansdistinction:
«mesuredelalumièretransmise
danslemêmesensquelalumière
incidente,àl’aided’unappareil,par
exempleunspectrophotomètre.».
Limitesduconceptd’atténuance(1)
2
Néphélémétrie(8) Techniquedemesure
Néphélémétreou
ou
delalumièrediffusée
néphélomètre.
néphélométrie
parles
macromoléculesou
particulesàl’origine
dutrouble.
Particulièrement
sensible(4)et
présentantune
meilleure
détectabilité(5),elle
estutiliséepourle
dosagedesubstancesà
l’étatdetraces.
Dosagedemoléculesou
departiculesàl’étatde
trace.
- Particulesen
suspensiondansun
gaz,unliquide
(puretédel’eau),
- antigènes,
- anticorps,
- mesurede
concentrationsde
certainesprotéines
sériquespar
immunoprécipitation…
Elles’exprimeleplus
souventenUTN(Unitéde
Turbidité
Néphélométrique),en
anglaisNTU(Nephelometric
TurbidityUnit).
Encoreappeléenéphélectomètrie.
Onmesurelalumièrediffusée,le
plussouventà90°maisc’est
variableselonlacomplexitédes
appareilsdemesure(certains
prenantunemesureplusieurs
anglesdediffusiondifférents).
Onpeutconstruirelamême
définitionquepourl’opacimétrie(cf.
ci-avant):«mesuredutrouble
(turbidité)parmesurededu
rayonnementdiffusé.»
Dansledomainedel’eau,ontrouve
égalementdesFNU(Formazine
NephelometricUnit)ouFTU
(FormazineTurbidityUnit),carla
référence-étalonétaitlaformazine
(substancesynthétique).
D’autresunitésexistent(notamment
auxUSAetenEurope)pourmesure
laturbiditédesboissons(dansle
domainealimentaire).Ellessont
reliéesauxunitésofficiellesde
référence(UTN,FNU).
Letermeatténuanceestmoinsspécifiqueetplutôtemployédanslescasoùladiminutiondelatransmittance(del’intensitétransmise)n’estpasseulement
dueàl’absorptionmaisaussiàd’autresphénomènes(notammentladiffusion,«scattering»enanglais)…;maisatténuanceetabsorbanceontbienlamême
I
définition mathématique ( D = – Log T = Log 0 = A ), et c’est donc strictement la même grandeur qui est rendue par le spectrophotomètre (qui mesure
IT
seulementlefluxtransmisdansl’axeetquilecompareaufluxincidentavantlacuve:lespectrophotomètrenemesurepasvraimentlalumièreabsorbée,il
mesurecequ’ilresteaprèstouslesphénomènesquiontpusepasserdanslacuve,sanspréjugerduphénomènemajoritaireresponsabledel’atténuationde
l’intensitédurayonnementlumineux).
€
Letermeatténuanceaaussiseslimites:ilimpliquejustequelalumièreincidenteest«atténuée»sanspréciserlesmécanismesmisenjeu.
IUPAC:InternationalUnionofPureandAppliedChemistry.
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Letermeabsorbance(A),sansdimensionouexpriméarbitrairementenUA(unitéd’absorbance)esttoujoursutilisable(puisquec’estl’indicationrenduepar
lespectrophotomètre).Maisilestplutôtréservéàl’expressiondelaphotométried’absorptionmoléculairedanslesmilieuxhomogènesisotropes(solutions
vraies,limpides),alorsqueletermeatténuance(D)estréservéauxcasoùilyaaussipriseencomptedeseffetsdediffusion,donctypiquementlecasdes
milieuxtroubles.
Ne pas confondre la sensibilité (capacité à distinguer deux concentrations proches) et la détectabilité (capacité à détecter voire doser des concentrations
faibles).
Pourlesconcentrationsennombre(donclesconcentrationsdecellulesoudeparticules),lesymboleofficiel(IUPAC)estCN(Cmajuscule,Nenindice);alors
quepouruneconcentrationd’uneespèceensolution,lesymboleestuncminuscule.
CONDITIONSETLIMITESD’UTILISATIONDEL’OPACIMÉTRIE:
LetracéD=f(CN)donneunecourbecroissanteàconcavitédirigéeverslebas;pourlesfaiblesconcentrations,lacourbepeutseconfondreavecsatangente:
ilexistealorsunerelationdeproportionnalitédirecteentreDetCN,commedéfiniedansletableauci-avant.
Cette loi de proportionnalité entre l’atténuance D en milieu trouble et la concentration CN n’est pas la loi de Beer-Lambert (réservée à l’absorption
moléculaire).Danscecas,ilestpossibled’utiliserleterme«coefficientd'atténuation»(plutôtqueseulementde«proportionnalité»,quiesttropgénérique,
maisc’estlamêmeidée).Iln'yapasdesymboleofficielrecommandépourlecoefficientd'atténuation(onpeutdoncutiliserunsymboleauchoix,parexemple
unkminuscule...).
Cette proportionnalité entre D et la concentration CN en particules (macromolécules, ou plus souvent cellules microbiennes) s’observe dans certaines
conditionspourunappareildonné:
•
lumièremonochromatique;
•
concentrationfaibleenmicroorganismes(doncau«début»delacourbe);
•
suspensionhomogène(d’oùl’importancedesétapesd’homogénéisation);
•
tailledesparticulesvoisinedelalongueurd'ondedelalumièreincidente.
Deplus,lecoefficientd’atténuation(k)dépenddenombreuxfacteurs:
•
lanaturedelasouche(bacille,coque,levure…):ilestdoncàétablirpourchaquesouche,maisonpeutprendredesvaleursglobales;
•
la nature du milieu de culture: un milieu riche peut permettre la constitution de réserve (glycogène ou PHB) qui changent l'absorbance de la
suspension;
•
laprésenceounond'unespore,vacuoleouautresinclusions;
•
laprésenceounondeciliature:laciliaturepeutavoiruneffettrèsimportantcarellevacontribueràunefortediffusiondelalumière.
L’opacimétrie présente d’autre part des limites, en particulier, la relation linéaire entre D et CN n’est valable que dans une zone limitée de valeurs
d’atténuance,comprisesentre:
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•
un seuil de détection, en dessous duquel les valeurs n’ont pas de valeur significative (ce seuil de détection dépend notamment de l’appareil de
mesure):ainsi,detropfaiblesconcentrationscellulairesneserontpascorrectementdétectéesparlespectrophotomètre;
•
une limite de linéarité, au-delà de laquelle la proportionnalité n’est plus valable: cette limite dépend de la valeur du coefficient d’atténuation, qui
dépendenpartiedelaformedesbactériesétudiées.Eneffet,s’ilyatropdebactéries(concentrationsélevées),lalumièredéviéeunepremièrefoispar
unecellule(etquinedevraitalorspasêtrepriseencomptecarnontransmise),peutêtredéviéeunesecondefoisparuneautrecelluleetêtrealors
transmise(donclavaleurdufluxtransmisneserapas«correcte»).
Ainsi,lazone de linéaritédelarelationdeproportionnalitéestplusoumoinsétendue:ilsuffiraalorsdediluerunéchantillontropconcentrépour
l’amenerdanscettezoneeteffectuerunemesurecorrecte.
Hormisceslimitesdelinéarité,ilexisted’autrescontraintesàprendreencompte:
•
lemilieuutilisédoitêtreliquide,etexemptdeparticulesautresquelesmicroorganismes(doncméthodepeuadaptéeàl’eauderivièreouaulait,ou
encoreàunbroyatd’aliment);
•
le milieu ne doit pas absorber aux longueurs d’onde utilisées: cela peut se compenser par le réglage du zéro de l’appareil sur du milieu stérile, mais
privilégierlessuspensionseneauet/oueffectuerunchoixjudicieuxdelongueurd’onde(voirci-dessous);
•
lemilieudoitcontenirsuffisammentdemicroorganismespourêtredétectés;
•
latechniquenepermetpasdedistinguerlesmicroorganismesvivantsdesmorts:elleévaluelabiomassetotale.
(7)
CHOIXDELALONGUEURD’ONDE(extraitd’undocumentdeJPPerré):
Iln'yaaucunpicdûàlasuspensionbactérienne:sonabsorbancediminuerégulièrementlorsquelalongueurd'ondeaugmente.
Plus la longueur d'onde est élevée, plus le flux transmis est fort et plus l'absorbance est petite (et inversement)... Si on veut augmenter la sensibilité en
opacimétrie(c’est-à-direobteniruneabsorbanceplusgrandepouruneconcentrationdonnée),onpeutdiminuerlalongueurd'ondeutilisée.
Dans le rouge (vers 700-800nm), le flux transmis par une suspension de particules sera plus grand et donc l'absorbance plus petite. Inversement,
l'absorbancedanslebleu(vers400nm)seraplusgrande.L’opacimétrie aura donc une meilleure sensibilité dans le bleu que dans le rouge et donc
aussiunemeilleuredétectabilitédanslebleu.
Cecidit,onn’apassouventdesproblèmesdedétectabilitéaveclessuspensionsbactériennes,etdeplus,lemilieuutilisé(jaunâtre)absorbeaussidanslebas
duvisible(versleviolet):ilnefautdoncpasallerdanslesrégionsspectralesoùlemilieuabsorbe
Ilvautmieuxdanscecasresterverslerouge,entre550et700nm(lesabsorbancesserontd'autantpluspetitesquelalongueurd'ondeaugmente).Deplus
c’estaussicohérentaveclefaitquelatailledesparticulesnedoitpas«dépasser»lalongueurd'ondedesradiationsutilisées(oudumoins,êtredumême
ordredegrandeur).Apartirduspectred'absorptiond'unmilieustérileetceluidumêmemilieuensemencé,onréaliseunchoixleplusjudicieuxpossible.
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€
(8)
NOTIONSFONDAMENTALESSURLANÉPHÉLOMÉTRIE(extraitd’undocumentdeJPPerré):
Ilestfaciled'observerladiffusiond'unrayonnementpardesparticulesensuspension:c'estl'EFFETTYNDALL.SilaconcentrationCenparticulesdansune
suspensionestfaible,lefluxΦ DdurayonnementdiffuséselonunangleθestreliéàlaconcentrationparlaLOIDERAYLEIGH:
ΦD(θ )
1
= K (n,θ ) ⋅ Φ0 ⋅ V ⋅ 4 ⋅ C = k'⋅ C λ0
2
Φ 0
V
fluxdurayonnementincident
volumemoyendesparticules
K(n,θ ) facteurquidépenddeθetdesindicesderéfractiondumilieuetdelaparticule
Onremarqueque:
•
Φ Ddépenddel’angledemesureθ,vialefacteurK.
•
Φ DdépenddeΦ 0:unesourcelumineusepuissantepermettrad’augmenterlasensibilité.
•
Φ Daugmentecommelecarréduvolumedesparticules.
•
Φ Daugmentequandλ 0diminue:ladiffusionestplusimportanteauxfaibleslongueursd’onde.Parexemple,ladiffusionestenviron10foisplusgrande
danslebleuquedanslerouge:(710/400)4=9,9.
En conséquence, pour augmenter la sensibilité en néphélométrie, on pourra utiliser des longueurs d'onde plus petites, mais attention aux
interférencesd'absorption(qu'ilestfacilededécelerentraçantlespectred'absorptiondumilieunonensemencéutilisé).
•
Φ DaugmenteavecC:laproportionnalitéentrecesdeuxtermesexistepourdessuspensionsdeparticuleshomogènes,dontlevolumeetl’indicede
réfractionsontconstants.
Si ces conditions ne sont pas respectées, la proportionnalité risque de ne plus exister, mais le flux diffusé augmentera quand même avec la
concentration.C’estlecasaveclessuspensionsdemicroorganismes.
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