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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
INTRODUCTION
1
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Les Aspergilloses sont des mycoses, dues à des moisissures ubiquitaires, du
genre Aspergillus, qui ne deviennent pathogènes chez l’Homme que si un déficit
des moyens de défense locaux ou généraux apparait.
Les patients atteints d'hémopathie maligne représentent la catégorie «cible»
par excellence, en raison de l'emploi de thérapeutiques fortement et durablement
cytotoxiques pour la moelle. La neutropénie profonde reste le facteur de risque
majeur de cette infection. La corticothérapie au long cours représente le
deuxième grand facteur de risque. Par ailleurs, d'autres facteurs concourent à
l'augmentation de son incidence: l'intensification des régimes de chimiothérapie
pour les tumeurs solides, l'émergence du SIDA avant l'avènement des
thérapeutiques
anti-rétrovirales,
transplantations
d'organes,
le
l'augmentation
développement
de
la
des
pratique
des
thérapeutiques
immunomodulatrices en matière de maladies auto-immunes, les progrès de prise
en charge des malades graves admis en réanimation médicochirurgicale.[1]
L'aspergillose pulmonaire invasive (API) est définie par une invasion
aspergillaire bronchique plus ou moins distale, un envahissement du
parenchyme
pulmonaire
dissémination viscérale
[2]
et/ou
vasculaire
occasionnant
un
risque
de
. Le retard diagnostique est, pour partie, responsable
du pronostic encore très péjoratif de l’API chez les immunodéprimés [3]. Le taux
de mortalité rapporté dans la littérature est supérieur à 40 % ou 50 % chez les
leucémiques en aplasie et peut même dépasser 80 % au cours des allogreffes de
moelle
[4, 5]
. Des progrès récents dans la stratégie diagnostique et thérapeutique
de ces patients ont permis une amélioration du pronostic des API [6, 7].
2
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Cette thèse s’articulera donc selon 2 axes principaux: Une première partie
consacrée à une revue de littérature sur les facteurs de risque, la
physiopathologie, le diagnostic et le traitement thérapeutique de l’API et une
seconde partie présentant l’étude d’un cas clinique de cette pathologie chez une
leucémique qui a été hospitalisée à l’HER en PIIB.
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
PARTIE I:
Données de la littérature
4
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Définition des moisissures
d’intérêt médical
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Au sein du règne des champignons renfermant suivant les auteurs de 65000
à 100000 espèces différentes, les moisissures constituent un ensemble
hétérogène d'environ 20000 espèces.
Les moisissures sont des champignons microscopiques multicellulaires,
ubiquistes, saprophytes et, parfois parasites, à croissance filamenteuse qui
se multiplient par fission. Elles sont caractérisées par:
-La nature chimique de paroi cellulaire, riche en chitine.
-La présence de glycogène, comme substance de réserve.
-L’absence de la chlorophylle.
-La reproduction par spores sexuées ou asexuées; qui sont invisibles à l’œil nu et
peuvent, chez la plupart des espèces, passer en suspension dans l’air. Elles
peuvent également élaborer des substances chimiques susceptibles de demeurer
à l’intérieur des spores, d’être libérées dans les matériaux qu’elles colonisent
(ex.: mycotoxines), ou encore d’être libérées dans l’air ambiant (ex.: composés
organiques volatils).
Au niveau macroscopique elles ont une texture laineuse, poudreuse ou
cotonneuse et elles peuvent être observées à divers endroits, comme sur les
aliments entreposés depuis un certain temps ou dans les lieux humides d’une
habitation, par exemple.
6
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Figure 1: Moisissures [8].
Ces microorganismes eucaryotes appartiennent en majorité à 3 classes:
Zygomycètes, Deutéromycètes et Ascomycètes, Ils regroupent des milliers
d’espèces, dont les principales appartiennent aux genres: Aspergillus,
Penicillium et Fusarium.
Ces dix dernières années, Aspergillus s’est imposé comme le premier
pathogène fongique à transmission aérienne dans les pays développés, avec une
nette augmentation de son incidence. L’émergence de ce pathogène opportuniste
est cohérente avec l’évolution des pratiques médicales. L'organisme responsable
de la majorité des infections aspergillaires est Aspergillus fumigatus.
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Aspergillose pulmonaire
invasive
8
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
I. Historique
C’est MICHELLI, qui a donné, en 1729, le nom d’Aspergillus aux
moisissures qu’il a observé: Ce prêtre italien a trouvé une ressemblance
prononcée entre la tête de la conidie et le goupillon (Aspergillum en latin) dont
on se servait à l’église pour «asperger» l’eau bénite. [9]
En 1809 LINK a introduit le nom d’Aspergillus glaucus pour un
champignon trouvé dans un herbarium, et il a décrit les premières formes
sexuées sous le nom «d’Eurotium herbariorum».
De BARY en 1854 a démontré qu’il s’agit en fait du même champignon.
BENNETT et SLUYTER ont publié respectivement en 1842 et en 1847 les
premiers cas de pneumopathie humaine due à Aspergillus.
La première description anatomo-pathologique des lésions a été faite par
VIRSHOW en 1856 sur une série de quatre autopsies.
En 1890 DIEULAFOY, CHANTE, MESSE et WIDAL décrivaient la
maladie chez les gaveurs de pigeons et les peigneurs de cheveux; elle se traduit
par des pneumopathies d’allure pseudo-tuberculeuse, liées à l’inhalation des
spores d’Aspergillus contenues dans les grains de millet et la farine de seigle
utilisés dans ces professions.
L.RENON en 1890, consacra sa thèse aux différentes manifestations
cliniques de cette affection.
La mise en évidence en 1928 par PASTEUR, VALERY et RADOT
d’anticorps précipitant dans le sérum de sujets présentant une aspergillose
pulmonaire a marqué «l’étape sérologique» de cette maladie.
9
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DEVE publia en 1938 une observation d’Aspergillome qu’il appelle
«mégamycétome intrabronchique», en fait cette observation s’intègre dans le
cadre des Aspergillomes bronchiectasiants, notion développée quelques années
plus tard en 1951 par MONOD, PESLE et SEGRETAIN.
La forme invasive de la maladie fut reconnue en 1951 par ESGHOUGUE;
et la forme allergique ou maladie de HINSON en 1952 par HINSON, MOON et
PLUMMER. [10]
L’aspect immunologique de la maladie n’a été découvert qu’en 1959 par
PEPYS et collaborateurs, qui ont mis en évidence des anticorps précipitants
spécifiques anti-aspergillaires
[11]
. Cette découverte sérologique permit de
multiplier le nombre de cas dépistés y compris les formes cliniques latentes.
A partir des années 60, les publications se sont multipliées et la bibliographie
s’est considérablement enrichie.
En 1973, une classification anatomo-clinique a permis de distinguer trois
entités d’atteinte aspergillaire: l’Aspergillome, l’Aspergillose invasive et
l’Aspergillose broncho-pulmonaire allergique (ABPA).
Sur le plan thérapeutique et un siècle après la découverte du premier cas
d’Aspergillome pulmonaire, GERSTYL, WIDEMAN et NEWMANN ont
réalisé en 1948 avec succès la première résection chirurgicale d’Aspergillome
pulmonaire. [9]
En 1961, DROUHET a montré l’action de l’amphotéricine B dans les
mycoses profondes, son efficacité a été ensuite vérifiée puis largement
confirmée. [12]
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
II. Définition.
L'aspergillose respiratoire réunit toutes les manifestations pathologiques
liées au développement des champignons du genre Aspergillus au niveau de
l'arbre bronchique, du parenchyme pulmonaire ou de la plèvre; il faut également
mentionner une aspergillose des voies respiratoires hautes à manifestations
rhinosinusales. [13, 14, 15, 16, 17,18]
En raison des facteurs locaux broncho-pulmonaires favorisants ou de
déficit immunitaire, les spores peuvent se développer dans l’appareil respiratoire
sous forme filamenteuse. Aspergillus peut ainsi coloniser des cavités
bronchiques
(bronchectasies),
pulmonaires
ou
pleurales
formant
un
aspergillome. La colonisation bronchique peut également se développer de façon
asymptomatique, ou entrainer plus rarement une bronchite aspergillaire. Plus
particulièrement,
chez
les
patients
asthmatiques
ou
porteurs
d’une
mucoviscidose, la persistance d’Aspergillus au niveau trachéobronchique peut
déclencher des réactions d’hypersensibilité de types I, III, voire IV, responsables
d’ABPA ou de granulomatose bronchocentrique. Essentiellement, chez des
patients immunodéprimés, Aspergillus peut être responsable d’infections aiguës,
de pronostic souvent défavorable: API, aspergillose trachéobonchique
nécrosante ou pseudomembraneuse ou subaiguë, voire chronique: aspergillose
pulmonaire chronique nécrosante (APCN). [19, 20, 21, 22, 23, 24, 25]
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Figure 2: Dissémination des conidies d’Aspergillus au niveau de l’arbre
respiratoire [26]
L’API est une pneumonie nécrosante caractérisée par une prolifération
mycélienne aspergillaire intraparenchymateuse et une atteinte invasive de la
vascularisation pulmonaire entraînant des lésions d’infarctus hémorragique. Elle
peut s’étendre à d’autres organes tels que les sinus, le cerveau, la peau, les reins,
le foie, l’œsophage, le cœur et les os.
L’incidence de cette pathologie chez les leucémiques, traités par
chimiothérapie aplasiante ou recevant une greffe de moelle, varie de 5% à 25%.
[4, 5, 27, 28]
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III. Agent pathogène
A. Définition
Aspergillus est un champignon filamenteux, cosmopolite et ubiquitaire. Il
est le plus souvent saprophyte, parfois responsable d’infections opportunistes
puisqu’ils profitent d’une défaillance naturelle ou iatrogène des systèmes de
défense de l’hôte pour l’infecter.
Le mode de reproduction est souvent asexué (multiplication strictement
végétative). Lors de sa croissance, il produit des millions de spores d’un
diamètre de 2 à 3 µm; qui se disséminent par voie aérienne et se présentent dans
l’air à une concentration approximative de 1 à 20 spores par m³, concentration
cependant très variable en fonction des conditions environnementales.
Dans des conditions habituelles nous respirons quotidiennement des spores
aspergillaires, parfois même en grande quantité, éliminées par notre appareil
respiratoire, sans que la moindre pathologie n'en résulte.
B. Taxonomie
Aspergillus est un champignon qui appartient:

Au phylum des Deutéromycètes: «Champignons imparfaits»

A l’ordre des Plectomycètes.

A la classe des Ascomycètes.

A la famille des Aspergillacées.
Ce sont des champignons à filaments mycéliens cloisonnés et hyalins, on
parle alors d’hyalohyphomycétes.
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Près de 300 espèces composent ce genre, parmi lesquelles:
 Aspergillus fumigatus est l’espèce la plus souvent impliquée en
pathologie humaine dans les pays tempérés. Il est responsable de 80 % à 90 %
des maladies aspergillaires en raison de sa thermotolérance.
 Aspergillus flavus représente10 % des cas.
 Aspergillus niger, Aspergillus nidulans et Aspergillus terreus sont plus
rares et représentent 10 % des cas.
C. Structure morphologique et antigénique
1. Structure morphologique
Les Aspergillus sont caractérisés par la présence des filaments (stipes)
perpendiculaires aux hyphes végétatifs. Les stipes se terminent par une vésicule
supportant les cellules de la conidiogénèse: les phialides, à l’intérieur desquelles
naissent des spores ou conidies, qui caractérisent le mode de reproduction
asexuée du champignon. L’ensemble stipe et vésicule constitue le conidiophore,
et l’ensemble vésicule, phialides et conidies forme la tête aspergillaire.
Spores ou conidies
Phialides
Métules
Vésicule
Conidiophore
Figure 3: Schéma simplifié de la tête aspergillaire [ 29]
.
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Les formes sexuées des Aspergillus sont caractérisées par des cléistothèces
arrondis, entourés ou non de cellules «en noisette» ou «hulle-cells» qui sont des
éléments sclérotiaux formés par l'épaississement de la partie terminale des
filaments entourant les cléistothèces. Les asques sphériques situés dans les
cléistothèces contiennent huit ascospores souvent porteuses de deux crêtes
circulaires. La plupart des Aspergillus sont homothalliques et l'on observe
couramment sur le même milieu les formes conidiennes et les formes
ascosporées. [30]
2. Structure antigénique
Les Aspergillus possèdent un grand nombre de molécules antigéniques dont
certaines sont sécrétées dans le milieu de culture, d'autres présentes dans la paroi
du champignon, enfin d'autres sont relarguées par rupture ou autolyse de
l'Aspergillus [31, 32,33]. Des essais de purification et de standardisation des extraits
d'A. fumigatus ont été pratiqués dans un but de diagnostic par l'école
Lilloise. [34, 35]
Les propriétés immunogéniques de deux fractions antigéniques majeures,
support d'activités enzymatiques, chymotrypsique et catalasique, se sont révélées
d'une importance capitale dans le diagnostic des aspergilloses et en particulier
des aspergillomes pulmonaires chez le patient immunocompétent
[36]
. Le
galactomannane isolé de la paroi cellulaire ou des filtrats de culture par
différentes méthodes de purification a été analysé
[37,
38]
. La fraction
galactofuranosyl représente le galactomannane immunodominant d'A. fumigatus.
[39]
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Figure 4: Structure du galactomannane [40]
Le relargage dans le sérum et l'élimination dans les urines de ces fractions
antigéniques ont fait l'objet de travaux spécifiques à visée diagnostique
[41, 42,43]
.
L'existence des polysaccharides α et β (1,3), (1,4) - glucane dans la paroi de la
forme mycélienne d'A. fumigatus a été la cible de nouveaux antifongiques visant
à inhiber les enzymes nécessaires à leur synthèse. [31]
D. Modes de contamination
1. Contamination aéroportée
Il s’agit du mode habituel de contamination par les Aspergillus.
Les conidies aéroportées pénètrent dans l'organisme par inhalation par les
voies respiratoires ou par sédimentation dans les plaies. Elles sont inspirées
généralement par les voies aériennes supérieures et peuvent atteindre les
alvéoles pulmonaires. Chaque individu inhale 2 000 à 5 000 génotypes différents
par mois donnant lieu chez le malade immunodéprimé soit à une colonisation,
soit à une infection
[44, 45]
. Des cas d'infections pré- ou postopératoires de plaie
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
ont été décrits en neurochirurgie, chirurgie cardiaque, ophtalmologie et aussi
dans les services des brûlés. [46]
2. Contamination par des véhicules communs
En dehors de la contamination aéroportée, une contamination par l'eau
[47]
,
ou surtout par les aliments a été décrite : le poivre, le thé, les potages lyophilisés,
les fruits sont particulièrement riches en spores aspergillaires et doivent donc
être proscrits de la nourriture donnée aux patients d'hématologie [48].
3. Contamination par contact
Des observations de contamination par contact ont été rarement rapportées.
Ce moyen est secondaire à l'inoculation directe de la peau lésée par contact avec
des objets riches en spores: pansements, plâtre, mains du personnel. [49]
Il n’existe pas de contamination interhumaine.
E. Épidémiologie
1. Répartition selon les espèces
Plus de 300 espèces appartiennent au genre Aspergillus, mais cinq ou six
seulement sont impliquées couramment en pathologie humaine et vétérinaire. [50]
 A. fumigatus
Elle est retrouvée aussi bien dans les régions chaudes que froides du globe.
Sa bonne tolérance aux températures élevées explique son abondance dans les
composts et autres matières organiques dans lesquelles interviennent des
phénomènes de décomposition avec élévation thermique (silos à grains, foin en
balles, bagasse). [51, 30]
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 A. flavus
Cette espèce est plus fréquente dans les zones tropicales où elle se
développe sur le fruit de l'arachide sur lequel il peut produire des aflatoxines. A.
flavus se trouve dans les sols cultivés, sur les graines de céréales telles que le
maïs ou l’avoine. [52]
 A. niger.
Espèce très commune dans le monde entier, elle se développe sur des
substrats variés. Elle présente un pic de distribution estival en rapport avec son
affinité pour les plantes herbacées. [52]
 A. nidulans
Espèce très répandue, elle est isolée du sol, de l'air et de substrats végétaux. [52]
 A. terreus
Cette espèce tellurique des terres arables des régions chaudes, colonise les
débris végétaux, la paille, le coton, les grains stockés. [52]
2. Réservoir
L’Aspergillus est une moisissure omniprésente dans notre environnement,
ubiquitaire. C’est un phytopathogène qui se développe en saprophyte dans la
terre, sur les plantes et débris végétaux en voie de décomposition. Il est retrouvé
dans l’air, sur le sol et les surfaces (verticales ou horizontales), dans
l’alimentation et même dans l’eau. Les spores peuvent être présentes également
dans les épices, les fleurs séchées, la paille
[53]
, les aiguilles de conifères, les
grains moisis, les foins, dans le terreau des plantes, les fientes de pigeon, de
volailles etc. L’humidité favorise sa survie et son développement.
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
A partir de ces réservoirs, les spores aspergillaires sont disséminées dans
l’atmosphère et peuvent pénétrer à la faveur des courants d’air dans l’habitat et
dans les hôpitaux, y séjourner et proliférer si les conditions sont favorables. [30]
-Les enquêtes aéromycologiques montrent que les Aspergillus représentent
1 à 5 % des isolements de moisissures dans l'atmosphère, loin derrière les
Cladosporium (20 à 30 %), les Alternaria (9 à 18 %), les Penicillium (6 à 8 %).
Cependant, des variations sont notées au cours de la journée ou des saisons. [54]
-Les Aspergillus sont préférentiellement retrouvés dans les denrées
alimentaires (fruits, légumes, pain) et dans la poussière de maison dans les
endroits peu accessibles au nettoyage tels que les caissons de volets roulants, les
rainures de meubles. Mais ils sont également dans les climatiseurs, les
humidificateurs, les solutions liquides, les vêtements.
-Les concentrations moyennes annuelles sont de l'ordre de 1 à 20 unités
formant colonies (CFU)/m3. Cette contamination de base est la résultante
d'échanges entre l'air et les réservoirs de spores. Ainsi, les Aspergillus sont
présents au niveau des grilles d'arrivée d'air conditionné, du matériel de
protection antifeu [55], dans les faux plafonds, les coffrages des volets roulants et
ceci d’autant plus que les services sont situés dans les étages supérieurs des
hôpitaux où les spores sont entraînées par des courants d'air ascensionnels. Mais
ils sont également retrouvés dans les tenues opératoires, les plâtres, les cartons
d'emballage
[48]
. Cette contamination de base peut être largement modifiée. Il
existe une corrélation entre l'élévation de l'aérobiocontamination aspergillaire et
les turbulences d'air, en particulier liée aux travaux. Ceux-ci sont considérés
comme un risque majeur environnemental à l’origine de véritables épidémies à
l’hôpital. [56]
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
IV. Le mécanisme de défense de l’organisme et
physiopathologie
Les moyens de défense de l'organisme contre le champignon aspergillaire
sont de 2 ordres:
-Mécanique: Où le tapis mucociliaire joue un rôle important dans l'élimination
des spores inhalées.
-Cellulaire: 2 types de cellules interviennent à 2 stades évolutifs du
champignon:
 Le macrophage alvéolaire (MA): Il assure la destruction des spores
et évite leur germination, et ce indépendamment des polynucléaires, de
l'activation lymphocytaire et de l'immunité humorale
Figure 5: Macrophages alvéolaires [26]
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Figure 6: Phagocytose des conidies par le MA [26]
L’élimination des spores fongiques passe par une étape préalable de
reconnaissance par les macrophages et les cellules dendritiques présentatrices
d’antigènes qui ont un double rôle de fongicidie et d’activation de la réponse
immunitaire.
La fongicidie: cette reconnaissance semble être sous la dépendance
de certains facteurs du complément (notamment C3) et de récepteurs
lectiniques pour le mannose et le fucose
[57]
. Une altération du tapis
mucociliaire (tabagisme, mucoviscidose) facilite la colonisation en
profondeur de l’arbre trachéobronchique et augmente le pouvoir
d’adhérence des spores. Après la reconnaissance et l’adhérence conidienne,
fait suite l’internalisation active par le macrophage qui est un prérequis à la
fongicidie [58].
21
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Figure 7: Rôle fongicide des MA [26, 167]
L’élimination des spores est donc assurée en permanence par les
macrophages, ce qui explique qu’en dépit d’une inhalation continuelle, la
clairance conidienne assurée par la première barrière de défense du système
immunitaire inné empêche le passage à une forme invasive.
L’activation du système immunitaire, la présence d’Aspergillus
active électivement les récepteurs TLR 2 et 4 à la surface des macrophages
et des cellules dendritiques, ce qui aboutit à la production de cytokines
telles que le tumor necrosis factor α (TNF-α)) et l’interleukine 1- β (IL-1 β)
qui amplifient la réponse inflammatoire. [59]
 Les neutrophiles: Ils endommagent les filaments mycéliens
aspergillaires en provoquant une altération de leur métabolisme et de leur
structure
[60]
. Chez le sujet sain, on ne doit donc pas retrouver de colonisation
aspergillaire puisque l’éradication des spores est un processus continu et en
temps réel, stérilisant la germination. On comprend dès lors que toute inhibition
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
fonctionnelle médullaire importante et durable compromet la capacité à
contrôler la germination des spores et que la neutropénie aura pour conséquence
la prolifération de formes filamenteuses constituant le principal déterminant du
développement de la maladie invasive.
Dans la hiérarchisation des troubles immunitaires, l’altération du tapis
mucociliaire accroît la pénétration et l’adhérence des spores, le déficit
macrophagique permet la colonisation par les formes filamenteuses qui doit être
étroitement régulée par les PNN et les lymphocytes. Tout déficit qualitatif et/ou
quantitatif de ces derniers altère la barrière défensive protégeant du stade
invasif.
La corticothérapie diminue significativement l'inhibition de la germination
des spores car elle:
Altère significativement la fonction phagocytaire des macrophages, des
monocytes [61, 62] en stabilisant leurs membranes lysosomiales.
Diminue l’activation des PNN. [63]
Diminue la transcription de plusieurs cytokines telles que le TNF-α, l’IL-1
et IL-6 fondamentales pour la genèse d’une réponse inflammatoire systémique
adaptée à un stimulus infectieux. [64]
Les médicaments cytotoxiques quant à eux ont un effet délétère sur les
macrophages et peuvent détruire les cellules de la lignée granulocytaire.
Il faut bien noter que l'immunité humorale intervient peu dans la défense
anti-aspergillaire.
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Figure 8: Schéma récapitulatif du mécanisme physiopathologique de l’API [65]
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
V. Pouvoir pathogène
Parmi les principaux éléments qui participent au pouvoir pathogène de ces
champignons, on retrouve:
-La petite taille des spores (2 à 3 µm de diamètre pour A. fumigatus) leur
donnant la possibilité d’atteindre les alvéoles pulmonaires
Figure 9: Spores d’Aspergillus [167]
- La thermotolérance permettant leur développement chez leur hôte à 37°C
(jusqu’à 55°C pour A. fumigatus)
- L'aptitude des spores à filamenter n'est pas à négliger et constitue une
entrave à la phagocytose.
- Le tropisme vasculaire (en particulier pour les Aspergillus et les
mucorales),
- La résistance des Aspergillus à des milieux fortement chargés en sels
(osmophilie) et la capacité à survivre dans des milieux secs (xérophilie) ou
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
faiblement oxygénés (microaérophilie) permettent à ces champignons de
s'adapter très facilement au parasitisme.
- L'adhérence de ces micro-organismes aux tissus de l'hôte définitif
constitue une étape essentielle dans le développement des infections
aspergillaires. Ainsi, A. fumigatus se lie spécifiquement aux protéines des
membranes basales: fibrinogène, laminine, complément, fibronectine, albumine,
collagène
[66, 67, 68, 69, 70]
. Il existe une complémentarité entre les sites de liaison
situés au niveau des conidies, et plus particulièrement des aspérités des conidies
échinulées nommées adhésines et les récepteurs des protéines de l'hôte appelés
ligands. Aucune adhésine n'a été purifiée actuellement mais il semble que
chacune se lie à une protéine unique de l'hôte
[71]
. Il existerait 1200 sites de
liaison par conidie.
- La sécrétion d'enzymes: Plusieurs études ont suggéré le rôle possible des
enzymes, en particulier des protéases, dans la pathogénie de l'aspergillose
[72]
.
L'action protéolytique interviendrait après l'adhésion des conidies aux ligands.
Parmi les protéases sécrétées par A. fumigatus, une exoprotéase de 33 kDa
apparaît capable de dégrader le fibrinogène, la laminine, le collagène et
l'élastine. Les Aspergillus produisent également une sérine protéase, une
aspartylprotéase, une métalloprotéase
[72, 73]
et des phospholipases dont le rôle
n'est pas encore déterminé. Autres enzymes sécrétées par l’Aspergillus
fumigatus comme les catalases peuvent contrecarrer la réponse phagocytaire de
l'hôte.
L'étude moléculaire de ces enzymes et la construction par génétique réverse
de mutants a permis d'étudier leur rôle au cours de l'infection.
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
- La production des toxines: A. fumigatus produit des métabolites
secondaires toxiques dont le mieux étudié est la gliotoxine. Ce composé très
actif possède un pouvoir d'immunosuppression en réduisant la phagocytose des
macrophages et des polynucléaires
[74]
. L'acide phtioïque, produit en petite
quantité par un nombre restreint de souches, pourrait contribuer à la formation
de granulome
[4]
. Une hémolysine thermolabile est présente dans les extraits
cytoplasmiques comme dans le filtrat de culture d'A. fumigatus. [75]
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
VI. Facteurs de risque
L’étude de ces facteurs a permis de définir des malades à haut risque,
nécessitant une surveillance régulière, et pour lesquels des méthodes de
prévention sont recommandées. [76]
A. Facteurs intrinsèques (liées à l’Homme)
1. Facteurs généraux
 La neutropénie
Le risque infectieux est directement lié à la profondeur et à la durée de la
neutropénie qui est souvent induite par la chimiothérapie, il devient majeur
en-dessous de 500 PNN/mm3. [77]
L’infection respiratoire constitue, en période de neutropénie, une urgence
absolue et représente, dans ce contexte, la principale cause de mortalité par
infection (1 décès sur 2 en période d'aplasie est dû à une pneumopathie). [78]
Ces infections sont en général moins graves au cours des chimiothérapies
pour tumeurs solides, où la toxicité médullaire n'est pas le but recherché, qu'au
cours des aplasies en hématologie où la neutropénie peut être extrême et
prolongée. [79]
 La corticothérapie:
Elle a, d’une part, un effet neutropéniant direct (toxicité médullaire), mais
également un effet délétère sur le tapis bronchique muco-ciliaire. En effet, de
fortes doses de cortisone inhibent l'action des macrophages en supprimant leur
accumulation au niveau du site infectieux, en stabilisant la membrane des
28
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
lyposomes empêchant la formation du phagolyposome
[80]
. Dans ces conditions,
les spores ne peuvent être détruites, même si elles sont internalisées dans le
macrophage. Majeur en cas de GVH, ce facteur de risque intervient également
chez les greffés d'organe en cas de rejet et en particulier chez les transplantés
hépatiques et pulmonaires.
Il existe une relation étroite entre la dose de corticostéroïdes et l'incidence
de l'API
[81]
. Actuellement, des doses de corticostéroïdes moindres depuis
l'introduction de la ciclosporine et du tacrolimus ont permis de diminuer
l'incidence des API en post-transplantation. [82]
 Le déficit héréditaire en NADPH oxydase granulocytaire et
macrophagique
Ce déficit explique la survenue d’API au cours de la granulomatose
septique chronique. [83]
Figure 10: Rôle des corticostéroïdes et du déficit en NADPH oxydase dans la
germination des spores d’Aspergillus [26]
29
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
 L’API peut survenir chez les patients atteints de SIDA lors
de la période prolongée de granulopénie post thérapeutique
[84]
ou du fait d’un
déficit qualitatif ou quantitatif en macrophages.
 Les
immunodépression
infections
transitoire,
virales
seraient
responsables
virus
souvent
incriminés
les
cytomégalovirus et le virus influenzae
[85]
d’une
sont
le
. Le virus semble agir à différents
niveaux: il est capable d’altérer l’épithélium de l’arbre trachéobronchique, de
diminuer la réponse chimiotactique des neutrophiles et des macrophages et
d’entraver la fonction des lymphocytes T. [86, 87]
 L’API s’observe plus rarement chez les patients peu
immunodéprimés, les facteurs de risque présumés sont alors l’alcoolisme, le
diabète, l’insuffisance rénale, une maladie de système ou la corticothérapie
prolongée. (tableau 1)
2. Facteurs Locaux
L’arbre trachéobronchique peut être colonisé par l’aspergillus:
 Suite à la perte d’intégrité des épithéliums cutanés ou muqueux,
notamment l’altération du tapis muco-ciliaire.
 Suite à la présence des cavités préformées, des séquelles de
tuberculose, de fibrose pulmonaire, des lésions tumorales bronchiques, de
la mucoviscidose, etc.
 Chez les antécédents de broncho-pneumopathie chronique
obstructive (BPCO).
30
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
La pneumopathie excavée à pyocyanique et à staphylocoque auréus font
parfois le lit de l’infection aspergillaire.
Facteurs généraux
Facteurs locaux
Alcoolisme
BPCO
Diabète
Tabagisme
Insuffisance rénale
Antécédent de tuberculose
Maladie de système
Fibrose pulmonaire
Corticothérapie prolongée Radiothérapie médiastino-pulmonaire
à faible dose
Mucoviscidose
Cancer broncho-pulmonaire
Une infection récente ou en cours à Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Mycoplasmia pneumoniae ou à des
infections virales (cytomégalovirus, virus influenzae)
Tableau1: Facteurs de risque d’API chez les patients peu ou pas
immunodéprimés [88]
B. Facteurs extrinsèques (ou Facteurs Environnementaux)
Une élévation de l'aérobiocontamination a pu être reliée à une colonisation
des voies aérodigestives supérieures et à la survenue de cas d'aspergillose
[89]
.
Ainsi, plusieurs études ont montré une relation significative entre la
contamination fongique de l'air et des surfaces des secteurs non protégés des
services d'hématologie et la survenue de cas d'aspergillose nosocomiale
[90]
.
31
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Cette situation apparaît encore plus nette en cas de travaux dans une unité de
soin proche de secteurs de malades à risque, en particulier en cas de travaux
intervenant sur les gîtes aspergillaires
[89]
. Mais lors de la survenue de cas
groupés d'API, les isolats avaient des génotypes différents, ne permettant pas de
parler de souche commune responsable d'épidémie
[88]
. Il n'existe pas de profils
génétiques propres aux isolats issus de patients par rapport à ceux de
l'environnement.
Tout isolat d'A. fumigatus est donc potentiellement pathogène
[44, 91]
. La
majorité des infections aspergillaires sont dues à un seul génotype d'A.
fumigatus; exceptionnellement, deux génotypes différents ou plus ont pu être
isolés de patients. En revanche, les patients présentant un aspergillome ou les
malades mucoviscidosiques colonisés par A. fumigatus présentent souvent
plusieurs génotypes dans leurs isolats. [92]
Actuellement, la meilleure prévention de l'API est la protection des patients
sous flux laminaire dans des pièces équipées de filtration HEPA (high efficiency
particulate air).
32
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
VII. Diagnostic
A. Diagnostic clinique
Dans les mycoses profondes, y compris l’API les signes cliniques ne sont
généralement pas spécifiques.
Le tableau clinique est celui d'une pneumopathie aiguë infectieuse souvent
bilatérale, résistante à une antibiothérapie à large spectre
[4, 93]
. Elle survient en
moyenne vers le 15ème au 20ème jour de la granulopénie, chez des sujets
porteurs d'hémopathie et traités par chimiothérapie agressive [94] :
La fièvre supérieure à 38,5°C est quasi constante, mais peut
manquer les premiers jours. La persistance ou la recrudescence de la fièvre
chez
un
malade
leucopénique
sous
corticothérapie
malgré
une
antibiothérapie à large spectre, doit faire suspecter une infection fongique.
La toux, parfois accompagnée d'une expectoration difficile.
La dyspnée, fréquente et dépendante de l’extension des lésions.
L’auscultation pulmonaire, pauvre révélant des râles bronchiques
ou plus rarement un foyer de râles crépitants voire un syndrome pleural.
L’asthénie et l’anorexie sont également présentes.
Les signes cliniques les plus évocateurs sont:
Les douleurs thoraciques localisées ou diffuses, souvent de type
pleural, augmentées par la toux et l'inspiration profonde. Elles s'observent dans
66% des cas.
33
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Les hémoptysies parfois massives, surviennent à un stade plus
tardif, elles marquent l’invasion parenchymateuse et l’érosion vasculaire.
Initialement localisée au poumon, l'infection dissémine rapidement
conduisant dans 20% à 30% des cas à l'aspergillose polyviscérale
[95]
. La
dissémination au niveau des sinus de la face constitue pour certains un élément
de diagnostic d'API. [96]
Ces signes ne sont pas spécifiques et peuvent être rencontrés dans de
nombreuses autres affections broncho-pulmonaires. La fièvre supérieure à
38,5°C et ne répondant pas à une antibiothérapie à large spectre, est l’élément le
plus important et doit faire évoquer le diagnostic surtout s’il existe des facteurs
de risque associés.
34
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
B. Diagnostic radiologique
Une
des
avancées
majeures
est
l’utilisation
précoce
de
la
tomodensitométrie pulmonaire. En effet, dans le diagnostic précoce d'API, la
tomodensitométrie présente une sensibilité très supérieure à la radiographie
thoracique standard, peu contributive dans les premiers jours voire les premières
semaines alors que le scanner est déjà démonstratif. [97]
1. Radiographie pulmonaire
Les signes radiologiques de l'API ne sont pas spécifiques
peuvent être uniques, multifocales, voire bilatérales
[99]
[98]
. Les lésions
, elles apparaissent sous
forme de condensations alvéolaires avec ou sans bronchogramme aérien,
d’opacités nodulaires multiples. Une participation pleurale peut être associée. Ce
n’est qu’à la troisième semaine de l’évolution fongique que les signes gagnent
en spécificité sous forme d’une image nodulaire ou d’une condensation avec un
croissant gazeux très évocateur.
2. Tomodensitométrie (TDM)
Dans la situation du neutropénique, il semble que le scanner thoracique soit
un outil essentiel au diagnostic des API
[5, 6, 100, 101, 102, 103 et 104]
. Il permet de
dépister précocement des lésions évocatrices d’API à un stade où la radiographie
pulmonaire n’objective souvent aucune anomalie patente.
35
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Deux signes scanographiques ont été identifiés en tant qu'indicateurs de
l'API; ce sont le signe du halo et le signe du croissant gazeux. Le premier signe
se caractérise par une spécificité de près de 100% en période de neutropénie
alors que le deuxième est d’une spécificité de 65% lors de la sortie d’aplasie. [6]
a. Le signe du halo «CT halo sign»
Dans la phase précoce de la maladie, la recherche du signe du halo par la
TDM est essentielle. Ce signe est décrit comme un flou périlésionnel en verre
dépoli situé à la périphérie d'une lésion (souvent nodulaire) et il représente une
zone hémorragique périphérique [105]. Si ce signe est hautement évocateur d'API
chez un patient en neutropénie profonde
[5, 100-104]
, sa valeur est probablement
moins forte chez des patients immunodéprimés non neutropéniques (allogreffe
de
moelle,
transplantations
d'organes)
et
a
fortiori
chez
des
non
immunodéprimés. [106, 107]
Verre dépoli
péri-lésionnel
Figure 11: Scanners thoraciques avec signe du halo typique au cours d'une API
(A, B) [111]
36
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
b. Le signe du croissant gazeux «air-crescent sign»
D’abord décrit sur les radiographies thoraciques standards
[108]
, ce signe est
mieux visible sur le scanner en haute résolution. Il correspond à une zone de
densité aérique de la forme d’un croissant ou circonférentielle au sein d’un
nodule ou d’une condensation alvéolaire. Il sépare un séquestre de la paroi du
nodule ou de la condensation. [109]
Cavitation
Figure 12: Scanners thoraciques avec signe du croissant gazeux typique au
cours d'une API (A, B). [111]
Le signe du croissant gazeux (cavitation) apparaît lors de la réparation de la
neutropénie. La résorption de la zone nécrotique envahie par les hyphes
d’Aspergillus, par les neutrophiles et leucocytes conduit à une détersion du
parenchyme pulmonaire. Le risque d'hémoptysie est maximal à cette période
(lésions proches des gros vaisseaux pulmonaires)
[110]
. Ce signe n'est pas
37
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
pathognomonique de l’aspergillose, cependant en cas de leucémie aiguë, il est
hautement suggestif de maladie fongique.
C. Diagnostic mycologique
Le diagnostic mycologique comprend quatre étapes importantes:
1) Le prélèvement
2) L’examen direct des échantillons médicaux (à l'état frais, après
coloration ou non, ou après préparation: éclaircissement ou coloration)
3) La culture sur les milieux appropriés
4) L’identification macroscopique et microscopique de champignons
isolés
1. Prélèvement
Le type et la qualité du prélèvement mycologique sont particulièrement
importants. Une souche isolée d’un site habituellement stérile avec un aspect
clinique évocateur d’infection aura plus de valeur que si elle est isolée d’un site
pouvant être colonisé (crachat, LBA, sinus).
Les prélèvements biopsiques: ce sont des prélèvements qui
permettent le diagnostic de certitude. En pratique, ils sont difficiles à réaliser
chez les patients immunodéprimés
[112]
. Il peut s’agir d’une ponction–biopsie
transthoracique à l’aiguille, une ponction-aspiration transpariétale ou une
biopsie pulmonaire chirurgicale.
Les expectorations recueillies après lavage de la bouche par
une solution iodée diluée, au décours d’une kinésithérapie de drainage
bronchique. Ces prélèvements sont renouvelés plusieurs jours de suite car la
38
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
contamination externe est toujours possible. La poussée itérative d’une même
espèce d’Aspergillus permet d’identifier son caractère pathogène, la négativité
de l’examen des crachats ne serait éliminer le diagnostic.
Les hémocultures ne sont presque jamais positives. [113]
Parmi les examens invasifs, il y a la fibroscopie bronchique avec lavage
broncho-alvéolaire «LBA», dont la positivité pour Aspergillus (examen direct ou
culture) constitue un élément très en faveur du diagnostic d'API, surtout si elle
est combinée à une image évocatrice au scanner. La sensibilité de cet examen
reste inférieure à 50 % [5, 100, 114].
La présence de l'antigène aspergillaire sur le surnageant du LBA est un
argument supplémentaire au diagnostic [100, 114, 115]. Plus récemment, des résultats
préliminaires encourageants ont été rapportés quant aux performances
diagnostiques de la PCR (polymerase chain reaction) aspergillaire sur LBA et
dans le sérum. Cette fibroscopie bronchique; permet encore de faire un brossage
endobronchique, biopsie pulmonaire transbronchique et une aspiration des
sécrétions bronchiques.
Il y a d’autres prélèvements qui peuvent être effectués pour le diagnostic mycologique
tels que le liquide pleural, le sang et les urines
2. Examen direct
Il est effectué sous microscopie optique, entre lame et lamelle, en ajoutant
une goutte de bleu lactique à une goutte ou à un fragment du prélèvement.
L’aspect évocateur le plus souvent observé est celui de filaments ou
conidiophores septés et enchevêtrés, associés ou non à des spores. La présence
de spores ou phialospores sans filaments n’a aucune signification, car elles
39
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
peuvent provenir d’une souillure atmosphérique. La présence de têtes
aspergillaires ou têtes conidiennes a une grande valeur diagnostique, elles
peuvent se voir lorsqu’il s’agit de lésions aérées (Atteinte d’une grosse bronche).
Rappelant que l’aspect des filaments seuls n’est pas obligatoirement synonyme
d’Aspergillose.
Bien que l’examen direct soit simple et rapide, il faut attendre la culture
pour confirmer le diagnostic. Cependant il faut prévenir le clinicien, afin de
débuter un traitement antifongique, le pronostic étant très défavorable chez les
immunodéprimés.
3. Culture
La culture constitue l’étape essentielle du diagnostic mycologique.
L’Aspergillus pousse facilement en quelques jours sur les milieux acides et
en aérobie. Le produit de prélèvement doit être immédiatement mis sur un
milieu approprié, type Sabouraud-chloramphénicol sans actidione qui inhiberait
la poussée du champignon. Le milieu de CZAPECK est utile pour les repiquages
et l’identification précise de l’espèce. L’ensemencement est fait en surface, 3
tubes au moins sont incubés à 27°C et 37°C pour différencier les Aspergillus
pathogènes poussant bien à 37°C de ceux qui auraient souillé le prélèvement.
L’Aspergillus pousse rapidement en 24 h à 48 h, mais il est impératif de
garder les tubes 15 jours pour les sécrétions recueillies par aspiration bronchique
ou par LBA; en effet un prélèvement peu riche en Aspergillus peut pousser
lentement et ne donner une colonie identifiable qu’en une dizaine de jours. La
croissance d’un Aspergillus à partir d’un prélèvement de LBA ou de liquide de
40
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
fibro-aspiration a beaucoup plus de valeur que la poussée à partir
d’expectoration.
4. Identification de l’espèce. (Tableaux d’identification)
a. Aspect macroscopique
Il est basé sur l’étude du temps de pousse, l’aspect et la couleur
Macroscopique
Aspergillus
fumigatus
temps
de pousse
Aspect
coloration
Taille moyenne
en 10 jours
rapide
en 2 à 3 jours
broussailleux
Poudreux
duveteux
Vert bleuté
6 cm
brun
noir
Aspergillus
niger
lente
poudreux
duveteux
entièrement
noir
2 cm
Aspergillus
nidulans
rapide
velouté
épais
vert cresson
5 cm
Marron
Aspergillus
flavus
plus lente
en 3 à 5 jours
granuleux
jaune verdâtre
1 cm
Tableau 2: Caractères macroscopiques différentiels des
principales espèces d’Aspergillus.
41
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Figure 13: A.fumigatus sur milieu Sabouraud-chloramphénicol. Photo prise au
laboratoire de Parasitologie & de Mycologie Médicale -HER-.
Figure 14: A.niger sur milieu Sabouraud-chloramphénicol. Photo prise au
laboratoire de Parasitologie & de Mycologie Médicale -HER-.
42
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Figure 15: A.nidulans sur milieu Sabouraud-chloramphénicol. Photo prise au
laboratoire de Parasitologie & de Mycologie Médicale-HER-.
Figure 16: A.flavus sur milieu Sabouraud-chloramphénicol. Photo prise au
laboratoire de Parasitologie & de Mycologie Médicale-HER-.
43
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
b. Aspect microscopique
Microscopique
Conidiophore
Tête aspergillaire
Couleur
Structure
longueur
vésicule
e
Phialides
et Métules (±)
conidies
Aspergillus
fumigatus
incolore
lisse
court
<300µm
simple
ronflement
20 à 30 µm /
5 à 10 µm
en massue
occupe 2/3
de la vésicule
de 7 à 10 µm
1 rangée serrée
disposée
parallèlement à
l’axe du
conidiophore
finement
échinulées
sphériques
globuleuses
2 à 3 µm
brunes
Aspergillus
niger
Incolore
ou
brun
lisse
paroi
épaisse
Long
1 à 3 mm/
15 à 25
µm
sphérique
volumineuse
50 à 75 µm
bisériée :
1 rangée de
Métules
1 rangée de
phialides
globuleuses
rugueuses
verruqueuses
3,5 à 5 µm
brunes
Aspergillus
nidulans
brun
isse
sinueux
court
60 à 130
µm
hémisphérique
8 à 12 µm
brune
1 rangée
occupe
1/2 ou 2/3
de la vésicule
globuleuses
rugueuses
échinulées
3,5 à 5 µm
verte.
Aspergillus
flavus
incolore
lisse
long
1000 µm
sphérique
35 à 45 µm
radiée
1 rangée
disposition
radiaire
échinulées
rondes
ou piriformes
3 à 6 µm
Tableau 3: Caractères microscopiques différentiels des principales espèces
d’Aspergillus.
44
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Figure 17: A.fumigatus à l’examen microscopique. Photo prise au laboratoire de
Parasitologie & de Mycologie Médicale-HER-
Figure 18: A.niger à l’examen microscopique. Photo prise au laboratoire de
Parasitologie & de Mycologie Médicale-HER-
45
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Figure 19: A.nidulans à l’examen microscopique. Photo prise au laboratoire de
Parasitologie & de Mycologie Médicale -HER-
Figure 20: A.flavus à l’examen microscopique. Photo prise au laboratoire de
Parasitologie & de Mycologie Médicale-HER-
46
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
D. Diagnostic immunologique
1. La détection des anticorps circulants
Chez l'immunodéprimé, la sérologie aspergillaire a peu d'intérêt
[4, 78]
car la
capacité de produire des anticorps est presque nulle ou très retardée; néanmoins
elle peut se positiver secondairement en cas d’évolution favorable sous
traitement et constitue parfois un argument de diagnostic rétrospectif d’API.
Les techniques utilisées pour la détection des anticorps sont:
 Réactions de précipitation en gélose
Parmi les méthodes de recherche d'anticorps précipitants, l'électrosynérèse
s'avère la technique la plus sensible et la plus rapide (2 à 4 heures). Le passage
d'un courant électrique dans le support accélère la rencontre des réactifs. La
rencontre Ag/AC est matérialisée par un arc dit de précipitation qui peut être
objectivé par une coloration. Lorsque l'antigène révélé est un enzyme, son
activité enzymatique qui est conservée, peut être mise en évidence: activité
catalasique ou chymotrypsique, en ajoutant le substrat adéquat.
Figure 21: Mise en évidence d’arcs de précipitation lors d’une électrosynérèse
positive [116]
47
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Alors La positivité du test prend en compte le nombre et l’activité
enzymatique (catalasique ou chymotrypsique) des arcs précipitants.
 Réactions d'immunofluorescence
C’est la méthode indirecte, actuellement, la plus utilisée, elle met en jeu un
sérum anti-globulines humaines ou animales marqué à l'isothiocyanate de
fluorescéine.
 Autres techniques
D'autres méthodes, utilisant aussi des réactifs marqués (enzymoimmunologie de type ELISA, radio-immunologie) ont maintenant fait leur
preuve et offrent un choix de techniques performantes.
La sensibilité et la spécificité de ces techniques sont en général bonnes,
mais toujours dépendantes de la qualité des antigènes utilisés.
L’absence de réponse humorale au cours de diverses immunodépressions
rend l’interprétation des résultats délicate dans le diagnostic d’API.
2. Les antigènes circulants
Chez les neutropéniques ou les greffés de moelle, la détection de l'antigène
aspergillaire (galactomannane) dans le sérum est évocatrice du diagnostic
d'aspergillose pulmonaire invasive. [5,117]
De nombreuses techniques de détection du GM ont été utilisées et en
particulier l'agglutination de particules de latex sensibilisées, recouvertes d'un
anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement le galactomannane. La
réaction après dissociation des immuns complexes et destruction des protéines,
met en contact le liquide supposé contenir l'antigène et les billes de latex seront
48
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
agglutinées en quelques minutes en cas de réaction positive. Mais la sensibilité
des tests proposés (10–15ng/ml) est trop faible pour être utile en clinique aux
stades précoces de l'infection.
Il y a un autre test rapide et surtout plus sensible que le test d’agglutination
au latex c’est le test ELISA introduit par Stynen et ses collaborateurs
[43]
et qui
utilise un Ac monoclonal de rat EB-A2, qui est actuellement commercialisé
(Platellia®Aspergillus, BioRad).
Figure 22: Principe du test au latex et test ELISA. [118]
Au cours des hémopathies à risque élevé d’aspergillose (leucémies aiguës
et allogreffe de moelle), la sensibilité de ce test est de 50 % à 80 % et sa
spécificité est supérieure à 80 %
[119]
. Pour être optimale, la recherche de
49
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
l’antigénémie doit se faire de façon systématique et répétée pendant la période à
risque.
Les facteurs qui influencent les performances du test sont multiples
Parmi ceux-ci, la présence d'une neutropénie a récemment été avancée
[118]
[119]
.
. Plus
le patient est neutropénique, plus le taux de GM est élevé au cours d'une API.
Cela est à rapprocher des résultats d'une méta-analyse récente qui montre que les
performances du test sont meilleures en hématologie, où le facteur de risque
majeur d'API est la neutropénie, que dans le cadre des transplantations
d'organes, au cours desquelles la neutropénie est souvent modérée et de courte
durée
[117]
. L'emploi du test dans d'autres populations que les patients
d'hématologie doit tenir compte de ces limitations (Tableau 4).
Sur un plan individuel, de nombreux facteurs peuvent expliquer que la
détection de GM soit négative lors d'une authentique aspergillose. Le GM
relargué dans la circulation peut être indétectable si le champignon ne peut
croître dans un foyer infarci ou si le foyer est circonscrit sans contact avec le
courant sanguin comme au cours de granulomatoses chroniques
[120]
. Quand la
détection de GM est positive, l'évolution du taux va de paire, en général, avec
l'évolution clinique: une augmentation étant associée à un mauvais pronostic.
[121]
La principale limitation du test est le fort taux de fausses positivités. Celleci varie de 5 % chez l'adulte à 83 % chez les nouveau-nés
[119]
. Une première
explication est la translocation intestinale de GM contenu dans les aliments ou
les boissons. En effet, le GM est très largement répandu dans l'environnement.
L'absorption intestinale ne surviendrait cependant que chez les patients dont
l'intégrité du tube digestif serait compromise.
50
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Certains antigènes bactériens, en particulier ceux de Bifidobacterium
bifidum particulièrement fréquent chez les nouveau-nés, sont aussi reconnus par
l'anticorps monoclonal EB-A2
d'antibiotiques,
en
particulier
[122]
. La détection de GM dans des lots
l'association
piperacilline-tazobactam,
est
également source d'une grande confusion d'autant plus que la contamination,
probablement due à l'utilisation de Penicillium sp. Pour la synthèse de
l'antibiotique, est variable d'un lot à l'autre au sein de la même spécialité.
Lorsqu'une telle contamination est suspectée, le GM disparaît en général deux à
trois jours après l'arrêt de l'antibiotique incriminé [123].
En raison de résultats négatifs en début d'évolution de l'API, ou variables
en fonction du caractère invasif ou non, l'implantation du test ne se conçoit que
dans une stratégie de suivi. Les patients à risque incluent les leucémies aiguës
myéloblastiques, les myélodysplasies et les allogreffes de moelle, soit pendant la
neutropénie initiale, soit au cours de la maladie du greffon contre l'hôte. Le test
GM est donc utilisé en routine dans de nombreux services d'hématologie sur une
base de deux tests par semaine. Le seuil actuel pour rendre un résultat positif est
un ratio de 0,5 par rapport à un témoin de 1ng/ml. En raison du fort taux de
fausse positivité, deux GM positifs sur deux prélèvements différents sont
nécessaires pour retenir le GM comme critère microbiologique dans les
définitions d’API. [124]
D'autres groupes de malades peuvent bénéficier de cette surveillance
comme les transplantés de foie ou de poumons. Cette stratégie ne se conçoit que
si l'incidence dans la population ciblée dépasse 5 %. [119]
Le GM peut aussi être recherché ponctuellement dans d'autres liquides
biologiques. En dehors des urines où le taux de faux positifs est trop élevé pour
51
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
que le test soit conseillé, certains utilisent le test Platellia ®Aspergillus pour la
recherche de GM dans le LCR, le liquide pleural, le liquide de LBA. Bien que
non validé par le fabricant dans ces indications, ces recherches peuvent être
utiles ponctuellement sachant que la positivité dans ces liquides s'accompagne
généralement d'une positivité dans le sérum.
La production de GM n'est pas l'apanage des Aspergillus sp. Elle existe
chez
Penicillium marneffei,
Cryptococcus neoformans
[125]
Histoplasma capsulatum
et
même
. Plus qu'un désavantage, cela permet d'évoquer
d'autres pathologies en fonction du contexte clinique. Ponctuellement en Europe,
le test GM peut être utilisé pour suivre l'évolution des infections à P. marneffei
chez les patients sidéens. [126]
Facteurs épidémiologiques
Populations de patients étudiés
Stratégies d'échantillonnage
Prévalence de l'infection
Définition d'un patient infecté
Définition d'un résultat positif
Seuil de positivité
Expérience technique du laboratoire
Site de l'infection
Maladie sous-jacente
Degré d'immunodépression
Facteurs biologiques
Environnement immédiat de la lésion aspergillaire
(pH, O2…)
Intensité de la neutropénie et de la corticothérapie
Espèce fongique causale
Structure du GM secrété
Fonctions rénales et hépatiques
Conservation des échantillons
Prétraitement des échantillons avant analyse
Traitement antifongique
Tableau 4: Les facteurs influençant les performances du test galactomannane.
[119]
52
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
E. Amplification d’ADN d’Aspergillus
La difficulté de standardisation des méthodes de recherche d’acide
désoxyribonucléique(ADN) aspergillaire (dans le sang ou les sécrétions) par
PCR simple ou en temps réel fait que cette méthode n’est pas encore utilisée en
routine. [114]
F. Anatomopathologie
Il utilise les colorations habituelles: PAS (acide périodique de schiff) et
l’imprégnation argentique de Gomori-Grocott, il met en évidence des filaments
septés de 2 à 5 μm de diamètre avec des branchements à angle aigu mais il ne
permet pas de différencier les différentes espèces aspergillaires
Figure 23: Colorations de base utilisées en anatomopathologie pour identifier
des filaments mycéliens: (A) PAS (B) imprégnation argentique [127]
53
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
IX. Critères de diagnostic de l’API
Des critères moins spécifiques associant des données cliniques, biologiques
et d’imagerie sont le plus souvent employés. A l’initiative de l’EORTC
(European Organization for Research and Treatment of Cancer) et du NIAID
(National Institute of Allergy and Infectious Diseases), un consensus
international vient de proposer une classification des mycoses invasives en trois
catégories: prouvée, probable et possible. [124, 128]
L’Aspergillose invasive prouvée: elle se définit par la présence d’un
critère histologique (existence de champignons filamenteux au sein d’une
lésion tissulaire) ou d’une culture positive à partir d’un site stérile.
L’Aspergillose invasive probable: elle se définit par l’existence d’un
terrain à risque et un critère clinique/radiologique majeur de localisation
viscérale ou deux mineurs et un critère microbiologique.
L’Aspergillose invasive possible: elle se définit par l’existence d’un
terrain à risque et un critère clinique/radiologique majeur de localisation
viscérale (ou deux mineurs) ou un critère microbiologique.
Il existe trois groupes d’arguments:
 Les facteurs d’hôtes
 Les facteurs microbiologiques
 Les facteurs cliniques et radiologiques
 Les facteurs liés à l’hôte
 La neutropénie (<500 neutrophiles/mm3>10 jours)
54
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
 La fièvre persistante>96 h: elle est réfractaire à un traitement antibiotique à
large spectre approprié chez des patients à haut risque.
 La
température
corporelle>38°C
associée
à
un
traitement
immunosuppresseur en cours ou dans les 30 jours précédents
 Les signes cliniques évoquant une réaction de greffon contre l’hôte qui peut
être sévère ou chronique extensive.
 L’utilisation prolongée (>3 semaines) de corticoïdes dans les 60 jours
précédents.
 Facteurs microbiologiques
 La culture positive à partir des expectorations ou de liquide de lavage
bronchoalvéolaire.
 Examen direct ou culture positive à partir de l’aspiration de sinus.
 Examen direct de moisissure à partir des expectorations ou de LBA.
 Présence d’antigènes aspergillaires dans au moins deux prélèvements
sanguins.
 Présence d’antigènes dans le sang et/ou le LCR.
 Présence d’éléments fongiques à l’examen direct à partir de milieux stériles.
 Facteurs clinique/Radiologiques
 Les critères majeurs sont: l’image scanographique montrant un signe du halo,
ou un signe du croissant gazeux ou une cavité sans zone de consolidation (en
l’absence d’infection par Mycobacterium, Legionella, Nocardia)
 Les critères mineurs sont: le symptôme d’infection respiratoire basse (toux,
douleur thoracique, hémoptysie, dyspnée), le frottement pleural et
l’épanchement pleural.
55
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Type de critères
Critères
-Neutropénie <500 PNN/mm³, pendant plus de 10jours.
-Fièvre pendant plus de 96h, sous une antibiothérapie
Critères liés à l’hôte
Critères cliniques et radiologiques
à large
spectre.
-Température supérieure à 38 C et neutropénie pendant plus
de 10jours au cours de 60 derniers jours Ou traitement
immunosuppresseur durant les 30 derniers jours
ou
antécédent
d’aspergillose
invasive
ou
sida
-Maladie
de
greffon
contre
l’hôte.
-Corticothérapie pendant plus de 3 semaines dans les 60
derniers jours.
- Nouvel infiltrat, avec signe du halo, croissant gazeux ou
cavité au sein d’une condensation
-Toux, douleur, hémoptysie, dyspnée frottement pleural
Infiltrat radiologique non majeur, épanchement pleural
Majeurs
Mineurs
-Culture positive (crachats, liquide de lavage broncho
alvéolaire ou tissus).
-Cytologie(ou examen direct) positive sur crachats ou liquide
de lavage bronchoalvéolaire.
-Antigénémie aspergillaire positive dans le liquide de lavage
broncho alvéolaire ou sur au moins 2 sérums.
Critères microbiologiques
Tableau 5: Critères retenus pour la classification des API. [124]
Type d’infection
Résultats
Infection
invasive
à
champignons Filaments mycéliens en histologie /cytologie et
filamenteux prouvée (seul le deuxième lésions tissulaires (histologie ou imagerie) Ou
critère permet l’identification de genre et le Culture positive à partir d’un prélèvement tissulaire
diagnostic d’aspergillose)
ou liquide prélevé stérilement
Aspergillose invasive probable
Aspergillose invasive possible
Au moins un critère lié à l’hôte et
Au moins 1 critère microbiologique et
1 critère clinique majeur ou 2 mineurs
Au moins un critère lié à l’hôtee t
Au moins 1 critère microbiologique ou
1 critère clinique majeur ou 2 mineurs
Tableau 6: Classification des API. [124]
56
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
X. Traitement
A. Amphotéricine B (Fungizone®): fongicide
Jusqu’à la fin des années 1990, le traitement reposait sur l’amphotéricine B
désoxycholate. Il s’agit d’un polyène qui agit sur l'ergostérol fongique,
augmentant la perméabilité de la membrane cellulaire, il n'est pas absorbable par
voie digestive ce qui limite leur utilisation par voie intraveineuse. Son efficacité
chez les immunodéprimés, varie de 20% à 40% selon les séries et nécessite des
posologies de 1 à 1,5 mg/kg/j induisant une toxicité rénale importante. [4, 5, 114]
La vectorisation de l’amphotéricine B en suspension lipidique (Abelcet®)
ou liposomale (Ambisome®) améliore la tolérance générale et rénale, et permet
d’augmenter la posologie (de 3 à 5 mg/kg/j) et probablement l’index
thérapeutique. [5, 114, 129, 130]
B. Itraconazole (Sporanox®): fongistatique
L'itraconazole est un triazolé inhibant la biosynthèse de l'ergostérol par
action au niveau de la C-14 alpha déméthylase. Il est disponible par voie orale
sous forme de gélule ou de suspension. Sa demi-vie longue autorise une seule
prise à la dose journalière de 200 à 400 mg/j immédiatement après un repas
132, 133]
[131,
. Des problèmes de biodisponibilité, de tolérance (digestive ou hépatique)
et des interactions médicamenteuses avec le système du cytochrome P450, font
que l’itraconazole reste peu employé dans le traitement de l’API. [5, 114]
57
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
C. Voriconazole (Vfend®): fongicide
Le voriconazole a démontré une action significativement supérieure à
l’AmB désoxycholate dans le traitement de l’aspergillose (53 % versus 32 %)
avec deux atouts: une meilleure tolérance globale et la possibilité de relais per
os [7]. Il est devenu le traitement de référence de l’API en première intention. La
posologie est de deux fois 4 mg/kg/j après une dose de charge de deux fois 6
mg/kg le premier jour. La biodisponibilité de la forme orale est excellente et les
effets adverses limités en dehors des troubles visuels réversibles. Néanmoins, le
voriconazole interagit aussi avec le cytochrome P450. [5]
D. Caspofungine(Cancidas®): fongistatique.
Il inhibe la synthèse du bêta (1,3)-D-glucane, composant essentiel de la
paroi cellulaire du champignon. C'est un produit hydrosoluble disponible par
voie IV à la posologie de 70mg le 1er jour, puis de 50mg/j [134, 135, 136]. Dans l’API
de l’immunodéprimé, son efficacité après échec ou intolérance d’une première
ligne antifongique est de l’ordre de 50 %, ce qui est comparable à l’efficacité de
l’Ambisome®. [137]
58
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Figure 24: Arbre décisionnel. Traitement médicamenteux des API probables ou
confirmées [138].
59
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
XI. Prophylaxie
L’hospitalisation en milieu protégé par des systèmes de filtration d’air
(HEPA) associée au renforcement des mesures d’hygiène pourrait diminuer le
risque aspergillaire chez les patients à risque [139]. Néanmoins, il n’y a pas encore
de consensus sur le sujet. [5, 114]
La prophylaxie primaire de l’API par un antifongique a longtemps été
débattue. Il a récemment été observé que le posaconazole à une posologie de
600 mg/j (en trois prises) réduisait le risque d’infections fongiques (notamment
aspergillaires) au cours du traitement de leucémies aiguës myéloblastiques
(LAM) ou chez des patients allogreffés de moelle en période de maladie du
greffon contre l’hôte. [140, 141]
60
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
PARTIE II :
Cas clinique
61
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
I. Matériel et méthodes:
A. Matériel
Présentation du cas clinique
Il s’agit d’une patiente âgée de 13 ans suivie pour leucémie aiguë myéloïde,
hospitalisée en février 2007 et décédée après un mois et demi de son admission.
La patiente était traitée par une chimiothérapie anticancéreuse étalée sur 20
jours à base de prédnisone ; vincristine, daunorubicine, méthotrexate et
aracytine.
Après deux semaines de sa chimiothérapie, la patiente a présenté un
syndrome hémorragique, infectieux et anémique.
Dès la survenue d’une fièvre élevée (40°C), une antibiothérapie empirique
associant une bétalactamine et un aminoside a été alors initiée après la
réalisation des prélèvements microbiologiques. Cette antibiothérapie était
modifiée ultérieurement en fonction des données microbiologiques. La
persistance de la fièvre au-delà du troisième jour du début du traitement
antibiotique ou sa réapparition après une période d’apyrexie, nous a fait
rechercher systématiquement une infection fongique chez la patiente. En plus de
la fièvre élevée, elle a présenté autres signes cliniques comme la toux,
l’hémoptysie et les douleurs thoraciques évoquant l’API.
L’examen radiologique standard chez la patiente, a révélé un syndrome
interstitiel mais elle n’a pas bénéficié d’un scanner thoracique. L’hémogramme
a montré une neutropénie sévère.
62
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
B. Méthodes:
La démarche diagnostique de l’API chez la patiente
L’Aspergillus est une moisissure ubiquitaire, poser le diagnostic d’API
revient à déterminer le rôle pathogène de ce champignon, qui n’évolue dans
l’organisme humain qu’à la faveur d’une modification locale ou régionale du
terrain de l’hôte
Le diagnostic biologique doit donc permettre de répondre à 3 questions:
(1) Est-ce qu’il s’agit d’une véritable infection ?
(2) Est-ce qu’il s’agit d’une colonisation ?
(3) Es -ce qu’il s’agit d’une contamination au moment du prélèvement ou au
niveau du laboratoire ?
63
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Diagnostic biologique
Prélèvements
Examen direct
Sang
Cultures
Détection
antigénique
Bouillon
d’enrichissement
BH
Sérum
LBA
Coloration
Sabouraud+ATB
(Incubation à
37°C)
Recherche de
galactomannane/
technique ELISA
Figure25: Démarche diagnostique de l’API chez la patiente
64
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
1. Prélèvements
La patiente a bénéficié des prélèvements suivants:
Nature des prélèvements Conditionnement
Analyses effectuées
Sang
Premier tube: Centrifugation et
(Quatre Sur tube EDTA
prélèvements successifs à
culture
de
la
raison de deux tubes par
leucocytaire
prélèvement)
Sabouraud–chloramphénicol
sur
couche
milieu
de
Deuxième tube: Centrifugation
et ensemencement de la couche
leucocytaire
sur
bouillon
d’enrichissement
puis
repiquage, après 48h, sur milieu
de Sabouraud–chloramphénicol
Sérum
(Deux Tube sec
Antigénémie aspergillaire
prélèvements successifs)
LBA
Flacon stérile
Examen direct et culture sur
milieu
Sabouraud-
chloramphénicol
Tableau 7: Les prélèvements réalisés chez la patiente-au Laboratoire de
Parasitologie & de Mycologie Médicale -HER-
65
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Des conditions strictes d’asepsie sont recommandées au laboratoire, pour
ne pas contaminer les prélèvements par des spores environnementales.
2. Diagnostic mycologique
La patiente a bénéficié d’un examen mycologique complet avec un examen
direct et des cultures sur milieu Sabouraud.
a. Examen direct
L’examen direct était réalisé en mettant quelques gouttes de LBA entre
lame et lamelle. L’observation microscopique est effectuée à l’objectif 10 puis
40.
Il est considéré positif en cas de présence de spores ou de filaments
mycéliens ou têtes aspergillaires.
b. Cultures
La culture est une étape indispensable pour l’identification du genre et de
l’espèce.
Le milieu de culture utilisé doit fournir les éléments indispensables à la
croissance de l’Aspergillus. Le milieu adopté pour cette étude est le milieu de
Sabouraud gélosé. Il est additionné de chloramphénicol afin d’éviter la
contamination bactérienne. Ce milieu préalablement stérilisé à 120°C pendant
20 min.
Les prélèvements sanguins étaient traités de la façon suivante: après
centrifugation, la couche leucocytaire a été ensemencée sur plusieurs milieux
Sabouraud -chloramphénicol pour le premier tube, le deuxième est ensemencé
sur un milieu liquide d’enrichissement appelé milieu cœur-cervelle ou Brain
66
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Heart (BH). Après 48 heures, ce bouillon d’enrichissement est repiqué sur
plusieurs milieux Sabouraud-chloramphénicol puis mis à l’étuve à 37°C. Des
lectures régulières on été réalisées dans les 15 jours ayant suivi les prélèvements
avant de conclure à un résultat négatif.
Les prélèvements LBA étaient, aussi, ensemencés sur milieu Sabouraud–
chloramphénicol et mis à l’étuve à 37°C.
En se basant sur l’aspect macroscopique et microscopique on identifie
l’espèce responsable de l’infection.
Identification macroscopique est basée sur l’étude de :
- L’aspect ;
- La couleur ;
- Le relief, etc.
Identification microscopique :
On prélève une ou plusieurs parties de la culture et on passe à la lecture au
microscope optique à l’objectif 10 pour visualiser le meilleur champ de lecture
et déterminer la longueur des hyphes, et à l’objectif 40 qui permet de préciser les
éléments d’identification et déduire l’espèce fongique. Parfois, nous étions
obligés de passer à l’immersion pour plus de détails.
Les caractères importants à identifier au microscope sont le conidiophore et
la morphologie de la tête aspergillaire.
67
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
3. Diagnostic immunologique
Donne des résultats plus précoces que les techniques mycologiques
(examen direct et cultures).
L’antigénémie aspergillaire repose sur l’identification dans le sérum d’un
antigène aspergillaire circulant: galactomannane «GM» qui est un constituant,
polysaccharidique important de la paroi du champignon. Il est très immunogène,
thermostable et résiste à l'action des protéases. Ces caractéristiques permettent
sa détection par un test immunologique après traitement protéolytique ou
thermique. Ce traitement
permet
de libérer
le galactomannane des
immunocomplexes et de réduire les faux positifs. Il présente le désavantage
d’être rapidement éliminé de la circulation par le fois et le rein, conduisant alors
à une concentration sérique basse, pouvant tomber sous le seuil de détection.
La recherche de cet antigène aspergillaire est effectuée sur sérum en
utilisant la technique immunoenzymatique ELISA dont le principe est basé sur
l’utilisation d’un anticorps monoclonal dirigé contre le galactomannane (Platelia
Aspergillus®).
La patiente a bénéficié de plusieurs recherches d’antigène.
68
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
II. Résultats
L’ensemble des données cliniques, mycologiques et radiologiques est
essentiel pour porter le diagnostic car Aspergillus étant ubiquitaire, sa mise en
évidence dans des prélèvements même profonds, n’implique pas forcément sa
responsabilité.
Le diagnostic d’API a été évoqué chez la patiente qui a présenté un
syndrome hémorragique, infectieux et anémique après deux semaines de sa
chimiothérapie. Elle a été mise sous antibiothérapie à large spectre mais
l’évolution n’était pas favorable et la fièvre persistait et l’hémogramme a montré
une neutropénie sévère (60 éléments/mm3)
La radiographie du thorax a montré un syndrome interstitiel. Sur le plan
clinique, la patiente a présenté une toux hémoptysique avec des douleurs
thoraciques.
La recherche mycologique sur les quatre prélèvements sanguins (sur tube
EDTA) a révélé la présence des filaments mycéliens dichotomiques à angle aigu
en faveur d’Aspergillus au niveau du bouillon d’enrichissement BH du troisième
prélèvement (figure 26).
69
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Figure 26: Filaments mycéliens dichotomiques à angle aigu isolés au
niveau de bouillon d’enrichissement BH. Photo prise au Laboratoire de
Parasitologie & de Mycologie Médicale -HERLa culture sur milieu de Sabouraud-chloramphénicol de la couche
leucocytaire des prélèvements sanguins sur EDTA identifie l’espèce Aspergillus
flavus.
70
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
A
B
Figure 27: A. flavus sur milieu Sabouraud-chloramphénicol. Photos prises au
Laboratoire de Parasitologie & de Mycologie Médicale -HER-. (A) recto:
surface poudreuse, irrégulière, granuleuse et de couleur verte. (B) revers:
incolore à blanc rosé.
71
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
L’examen direct du lavage broncho-alvéolaire (LBA) a mis en évidence des
têtes aspergillaires (figure 28). Par contre les cultures de LBA sont revenues
négatives.
Figure 28: Tête aspergillaire isolée au niveau du LBA. Photo prise
au Laboratoire de Parasitologie & de Mycologie Médicale -HER-.
La recherche des antigènes aspergillaires sur deux sérums par technique
ELISA double sandwich (Platelia Aspergillus®) était positive.
72
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Résultats
Q
Examen
mycologique
Sang
Examen
immunologique
Hémogramme
Syndrome
interstitiel
Neutropénie
sévère
Sérum
LBA
Bouillon
d’enrichissement
Examen direct
Positif
Positive
Culture
Examen
radiologique
Recherche des
galactomannanes.
Positive
Culture
Positive
Négative
Figure 29: Résultats obtenus par le Laboratoire de Parasitologie
& de Mycologie Médicale –HER-
73
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Les critères de diagnostic de l’API chez la patiente
Facteurs liés à la
patiente
Facteurs cliniques
/radiologiques
Culture à partir du
sang (site stérile):
Neutropénie (PNN
<60éléments/mm³)
Fièvre (40°C):
persistante après 3 j et
réfractaire à un ttt ATB
à large spectre
Facteurs
microbiologiques
Positive
Critères mineurs
(Toux, hémoptysie et
douleurs thoraciques)
Examen direct à partir
de LBA:
Positif
Figure 30: Critères de diagnostic de l’API chez la patiente
74
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Puisque les hémocultures (site stérile) réalisées chez la patiente sont
revenues positives, nous avons retenu un diagnostic d’API prouvée. L’examen
anatomopathologique n’a été réalisé vu l’altération de l’état général de la
patiente. L’Amphotéricine B est alors débutée mais la patiente est décédée après
sept jours de début de traitement antifongique.
75
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
V. Discussion
L’aspergillose pulmonaire invasive est une des plus sévères complications
infectieuses de l’immunodéprimé
[142]
. C'est une prolifération parenchymateuse
d’un champignon ubiquitaire du genre Aspergillus.
Parmi 180 espèces d’Aspergillus, seules quelque unes sont pathogènes pour
l’Homme: A. fumigatus, A. flavus, A. niger, A. nidulans, A. terreus du fait de la
dimension de leurs spores, 2 à 3 μm, de leur thermotolérance, de leur virulence
[19]
.
L’Aspergillus est le premier agent fongique responsable des infections
broncho-pulmonaires et l’API occupe la deuxième place après les septicémies à
Candida chez les leucémiques, en particulier dans les leucémies aiguës
myéloïdes. [143]
Le mécanisme physiopathologique de cette infection est particulier. Les
spores aspergillaires inhalées vont se développer au niveau bronchique sous
forme filamenteuse. Les filaments vont être responsables d’une nécrose
bronchique, de l’envahissement du parenchyme contigu avec un tropisme pour
l’artère pulmonaire adjacente. Les filaments vont entraîner une thrombose
artérielle et un infarctus pulmonaire, puis disséminer dans le parenchyme ou par
voie hématogène vers d’autres organes : peau, os, cerveau, coeur, etc.
Ce sont essentiellement les chimiothérapies lourdes réalisées dans le
traitement d’induction ou de consolidation des leucémies aiguës qui favorisent la
survenue d’API dans les services d’hématologie
[143, 144]
. La chimiothérapie
anticancéreuse prédispose, de façon très générale, aux infections par diminution
76
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
de la bactéricidie, de la phagocytose et du chimiotactisme des polynucléaires. La
neutropénie induite par la chimiothérapie constitue par sa profondeur et sa durée
le principal facteur de risque de l’API, le facteur le mieux documenté est la
durée de neutropénie
[142]
, particulièrement inférieure à 500 élément/mm3. Le
risque de survenue d’API est estimé de 5 à 8 % selon les séries
[6, 145]
. Il est
d’environ 1 % par jour de neutropénie pendant les trois premières semaines puis
il augmente jusqu’à 4 % par jour au-delà d’un mois. [143]
La durée de la neutropénie était de 23 jours chez notre patiente et elle était
inférieure à 60 éléments/mm3 lors de la survenue de l’API.
La chimiothérapie entraîne aussi une altération du tapis mucociliaire qui
constitue un facteur mécanique de défense contre l’infection aspergillaire
puisqu’il permet l’épuration des spores. [60, 143]
La corticothérapie est également un facteur majeur, surtout si elle est
prolongée durant plus de 3 semaines
[124, 144, 146]
. Les corticoïdes sont à l’origine
d’une atteinte de la fonction phagocytaire, qui constitue la première ligne de
défense antifongique, et d’une immunodépression cellulaire
[53, 144, 147]
. Par
ailleurs, les corticoïdes diminuent la transcription de plusieurs cytokines telles
que le TNF-α, l’IL-1 et l’IL-6 fondamentales pour la genèse d’une réponse
inflammatoire systémique adaptée à un stimulus infectieux
[146]
. Ils constituent
un facteur de risque majeur de pneumocystose et, à fortes doses, exposent à la
survenue d’aspergillose, de nocardiose, voire d’anguillulose maligne.
Selon une étude prospective d’Augustin et al
[148]
ayant concerné 33
patients sous corticothérapie au long cours (> 30 jours) présentant un infiltrat
pulmonaire ne cédant pas à une antibiothérapie conventionnelle a démontré
77
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
qu’Aspergillus fumigatus était le pathogène le plus fréquemment mis en
évidence sur les prélèvements endobronchiques dirigés. L’API peut survenir
aussi chez des patients présentant comme seul facteur de risque une
corticothérapie systémique [149].
Notre patiente a reçu une corticothérapie à base de prédnisone pendant 3
semaines.
Le portage nasal d’Aspergillus
[150]
favorisent aussi la survenue de l’API
et les antécédents d’aspergillose
[151]
. L’environnement joue un rôle
important dans la survenue d’épidémie d’API, en particulier lorsque sont
réalisés dans les hôpitaux des travaux de construction, de rénovation ou de
démolition
[152]
. La concentration moyenne de 0 à 100 CFU/m3 peut augmenter
brusquement (10 000 CFU/m3) du fait de turbulence d’air occasionnée par ces
travaux et représenter un risque pour les patients immunodéprimés [143].
Notre malade était hospitalisée dans une atmosphère non protégée par des
systèmes de filtration d’air où des travaux de construction ont été réalisés
pendant cette période. Ces systèmes de filtration d’air permettent de retenir
jusqu’à 99 % des spores aspergillaires. [153]
Sur le plan clinique, l’atteinte pulmonaire est quasi constante et les signes
cliniques d’API ne sont pas spécifiques. La fièvre est surtout évocatrice si elle
persiste malgré une antibiothérapie à large spectre depuis plus de 96 heures. Le
diagnostic doit particulièrement être évoqué si la toux s’accompagne
d’expectoration hémoptoique. La dyspnée est un signe souvent tardif ou
témoignant de lésions étendues
[154]
, elle est en rapport avec l’extension des
lésions parenchymateuses. [143]
78
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Les signes les plus évocateurs sont les hémoptysies et les douleurs
thoraciques, ces deux signes ont été retrouvés chez notre patiente qui a présenté
aussi un syndrome interstitiel révélé par la radiologie. En outre elle a gardé un
état fibrille jusqu'à son décès. Le délai moyen entre le premier signe clinique
(hormis la fièvre) ou radiologique et le diagnostic était de 25 jours.
Radiologiquement, en cas d’aspergillose, les lésions pulmonaires se
caractérisaient par leur évolutivité dans le temps, leur type interstitiel diffus
micronodulaire avec parfois des atélectasies et un épanchement pleural
[53]
. La
plupart des études récentes reconnaissent le peu d’intérêt de la radiographie
standard qui ne se positive que tardivement par rapport aux signes cliniques.
[142, 143]
.
Les radiographies thoraciques standard peuvent montrer, au début, des
opacités
nodulaires,
uniques
ou
multiples,
à
bord
flou.
Il peut également exister des images de miliaire et un épanchement pleural.
Secondairement, les lésions vont s’excaver
[154]
. Il est nécessaire de répéter les
clichés pulmonaires chez tout sujet neutropénique présentant une fièvre
inexpliquée.
La radiographie thoracique est pathologique dans plus de 70 % des cas au
stade d’aspergillose cérébrale, avec des lésions très hétérogènes, non spécifiques
mais pouvant aiguiller le diagnostic. [25]
La TDM thoracique est d’un apport considérable dans le diagnostic de
l’API chez le neutropénique y compris avec une radiographie thoracique
concomitante normale. En effet les données actuelles permettent de promouvoir
le scanner thoracique comme examen de première intention pour le diagnostic
79
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
d’API
[142, 147, 153, 155]
. Chez le patient neutropénique, la présence d’un halo,
caractérisé par du verre dépoli entourant le nodule, de même qu’un croissant
gazeux au sein du nodule ou des plages de condensation alvéolaire nécrotiques,
sont très évocateurs d’API [156]. Le signe du halo qui est très précoce, apparaît au
cours de la première semaine de l’évolution de l’infection et durant la phase
d’aplasie. Le signe du croissant gazeux apparaît de façon tardive vers la
deuxième semaine de l’évolution de l’infection. [143]
Par manque de moyens, notre malade n’a pas bénéficié d’une TDM
thoracique.
La scanographie thoracique a un autre intérêt potentiel
[157]
, elle précise la
topographie des lésions et guide les prélèvements à visée microbiologique ou
anatomopathologique: lavage bronchoalvéolaire (LBA) dans les atteintes
localisées, biopsies en cas d’image nodulaire pouvant évoquer une localisation
tumorale,
une
aspergillose
ou
une
nocardiose,
ou
encore
repérage
d’adénopathies avant médiastinoscopie.
Les API s’associent fréquemment (30 %) à une atteinte cérébrale, justifiant
la réalisation systématique d’une TDM (ou IRM) cérébrale (qui explore en outre
les sinus)
[144, 147]
. La localisation cérébrale est considérée comme un des pires
critères pronostiques au cours de l’aspergillose invasive.
Les hémocultures ne sont presque jamais positives d’après la littérature
[143]
. La troisième hémoculture réalisée chez la malade était positive mettant en
évidence des filaments mycéliens en faveur d’Aspergillus et la culture de la
couche leucocytaire des prélèvements sanguins sur EDTA identifie l’espèce
Aspergillus flavus.
80
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Aspergillus fumigatus est responsable de 90 % des atteintes respiratoires,
puis viennent Aspergillus flavus et Aspergillus niger. [158]
La recherche d’Aspergillus dans les crachats et les sécrétions nasales est
hautement indicative devant un contexte clinico-radiologique évocateur; mais
elle est rarement positive et demande à être répétée. [143]
La sensibilité des examens mycologiques est faible pour les expectorations
(environ 30 %) et le lavage bronchoalvéolaire (environ 40 %). [154]
La
découverte
de
colonies
d’Aspergillus
sur
un
prélèvement
microbiologique ne doit pas être abusivement attribuée à une contamination, et
ce même si le malade n’est pas neutropénique car tout retard à la mise en route
du traitement compromet le pronostic. [159]
Le LBA réalisé chez notre patiente a confirmé le diagnostic en montrant
des filaments mycéliens et des têtes aspergillaires à l’examen direct (figure 28),
par contre les cultures sont revenues négatives.
La fibroscopie bronchique avec LBA est l’examen de choix. Elle peut
visualiser des lésions trachéales ou bronchiques parfois évocatrices. La
muqueuse est irrégulière, hémorragique au contact, recouverte parfois de fausses
membranes. [143, 160]
Chez les patients immunodéprimés, l’isolement d’Aspergillus sur un LBA
signifie une aspergillose pulmonaire aiguë invasive dans 2/3 des cas
[161]
. La
valeur prédictive positive dépend du groupe à risque concerné: elle est de 82 %
pour les greffés médullaires et d’environ 60 % pour les patients recevant une
corticothérapie au long cours. [146]
81
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
La positivité de l’antigénémie aspergillaire (sang, LBA, LCR, urines) est
hautement prédictive de l’infection chez l’immunodéprimé
[143]
. L’antigénémie
aspergillaire repose sur l’identification dans le sérum ou dans le liquide de
lavage broncho-alvéolaire d’un exoantigène polysaccharidique ubiquitaire de
l’organe de fructification d’Aspergillus: le galactomannane (GM). [146]
Des études prospectives réalisées sur des cohortes de patients atteints
d’hémopathie maligne ont démontré une sensibilité et une spécificité globales
proches de 90 % pour le diagnostic d’aspergillose aiguë invasive. [162]
La première technique commercialisée pour la détection de l’antigène
galactomannane d’Aspergillus
est l’agglutination au latex de spécificité
avoisinant les 99 % mais de sensibilité faible oscillant autour de 35 à 45 %
et ne permet le plus souvent qu’un diagnostic tardif contemporain des signes
cliniques
sandwich
[163, 164]
[158]
. Récemment, la mise au point d’une technique ELISA double
permettant de détecter 1 ng d’antigène/ml de sérum, a permis
d’améliorer nettement la sensibilité (50 % à 80 %) et d’obtenir un diagnostic
plus précoce. La positivité de l’antigénémie peut parfois précéder les signes
cliniques et/ou radiologiques d’une à plusieurs semaines. [143, 163, 165]
La perfusion intraveineuse de pipérilline + tazobactam ou d’amoxicilline +
acide clavulanique peut occasionner des faux positifs. [146]
Il importe de retenir pour la pratique clinique que la négativité de la
détection du galactomannane par ELISA ne permet cependant pas d’exclure le
diagnostic d’API chez le neutropénique et que toute positivité doit être contrôlée
au moins une fois. [155]
82
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
La détection de l’antigène galactomannane d’Aspergillus chez notre
patiente était faite sur sérum par ELISA double sandwich. Elle était positive sur
deux prélèvements.
L’apport de la PCR dans le diagnostic de l’API paraît très intéressant mais
son
application
reste
D’après Alfandari et al
limitée
à
quelques
laboratoires
[143]
.
[142]
: La PCR (Aspergillus ou Candida) ne peut être
recommandée en routine devant l’absence de standardisation et de réplicabilité
des résultats obtenus à ce jour. Il est recommandé de l’évaluer prospectivement
dans le cadre d’un protocole de recherche.
Le diagnostic d’API est difficile à asseoir avec certitude, surtout chez un
patient neutropénique. C’est pourquoi de nombreuses définitions de catégories
diagnostiques sont proposées par plusieurs auteurs. À l’initiative de l’EORTC
(European Organization for Research and Treatment of Cancer) et du NIAID
(National Institute of Allergy and Infectious Diseases) un consensus
international vient de proposer une classification en trois catégories « prouvée »,
« probable », et « possible » [124, 142, 166]:
Infection prouvée: soit présence de filaments de type moisissure
et/ou tête aspergillaire à l’examen histo- ou cytologique d’une biopsie ou
aspiration à l’aiguille et signe d’une atteinte tissulaire (soit au microscope,
soit en cas d’absence de doute par imagerie); soit culture positive d’un
prélèvement obtenu de manière aseptique d’un site stérile et anomalies
cliniques ou radiologiques évoquant une infection (excepté les urines et les
muqueuses).
83
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
Infection probable: Présence d’au moins un critère lié à l’hôte et un
critère microbiologique et un critère clinique majeur (ou deux mineurs) d’un
site évoquant une pathologie infectieuse.
Infection possible: Présence d’au moins un critère lié à l’hôte et un
critère microbiologique ou un critère clinique majeur (ou deux mineurs) d’un
site évoquant une pathologie infectieuse.
On se basant sur les critères obtenus chez notre patiente nous avons retenu
un diagnostic d’API prouvée.
Le traitement de l’API repose sur l’Amphotéricine B IV qui reste le
traitement de choix
[144]
. Elle est utilisée à la dose de 1 à 2 mg/kg/j pendant une
durée de 12 semaines au moins. Son taux d’efficacité est de l’ordre de 50 %.
Néanmoins, sa toxicité et sa tolérance peuvent limiter son utilisation notamment
chez les populations de patients immunodéprimés recevant fréquemment des
médications néphrotoxiques
[149]
. Dans ce cas, les formulations lipidiques de
l’amphotéricine B (AmB-L, Ambisome®; AmB-LC, Abelcet®) peuvent être
proposées en raison de leur moindre toxicité rénale par rapport à
l’amphotéricineB conventionnelle et même les doses peuvent être augmentées
jusqu’à 4 mg/kg/j et aussi les concentrations tissulaires sans augmenter la
toxicité
[52,
167]
.
Cependant,
le
taux
d’efficacité
est
identique
à celui de l’Ampho B IV.
Le voriconazole représente une alternative thérapeutique de première
intention recommandée depuis la conférence de consensus 2004
[143]
et, en cas
d’échec, l’acétate de caspofungine peut être utilisé en monothérapie ou en
association. Dès l’amélioration clinique, en l’absence de malabsorption
84
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
digestive, un relais per os sera pris par voriconazole ou itraconazole
avec une durée de traitement d’environ 3 mois, dépendant de la gravité initiale,
de l’immunodépression et de l’évolution radioclinique.
Notre malade a été mise sous l’Ampho B IV mais elle a présenté une
insuffisance rénale. Pour surmonter cette néphrotoxicité, l’AmphoB a été
remplacée par sa forme liposomale. Cependant notre patiente est décédée après
sept jours de traitement dans un tableau de sepsis.
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Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
CONCLUSION
86
Apport du laboratoire dans le diagnostic de l’API (à propos d’une seule observation, HER)
L’aspergillose pulmonaire invasive(API) est une maladie essentiellement
opportuniste qui attaque le plus souvent les patients atteints de leucémie aigué à
cause de l’intensification de la chimiothérapie utilisée dans le traitement de cette
hémopathie.
L’API
reste
encore
de
pronostic
redoutable
chez
les
patients
immunodéprimés. Une amélioration du pronostic peut être obtenue en
combinant de façon plus optimale les stratégies diagnostique et thérapeutique.
Chez les neutropéniques, un diagnostic précoce peut être obtenu grâce à la
combinaison du scanner thoracique et de la recherche de l’antigénémie
aspergillaire, tandis que l’intérêt des techniques de biologie moléculaire reste
encore à préciser
L’ensemble des critères liés à l’hôte, cliniques, radiologiques et
microbiologiques nous donnent le type de diagnostic de l’API qui nous permet
d’établir la meilleure stratégie thérapeutique.
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