Utilisation et validation des méthodes PCR en temps réel

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Utilisation et validation des méthodes PCR
en temps réel pour la détection des agents
pathogènes dans les aliments
Sarah Denayer, Laurence Delbrassinne, Katelijne Dierick et Nadine Botteldoorn
WIV-ISP, rue Juliette Wytsmans 14, 1050 Bruxelles
Alors que la détection des agents pathogènes d’origine alimentaire dans un laboratoire de routine est encore
principalement basée sur des méthodes microbiologiques conventionnelles, on observe une forte progression
des méthodes de détection moléculaire. La détection et l’isolement de bactéries pathogènes à partir de denrées
alimentaires à l’aide des méthodes classiques requièrent plusieurs étapes, ce qui nécessite souvent beaucoup de
main-d’œuvre et un délai d’analyse assez long (5-14 jours). Bien que ces techniques soient incontournables au
sein d’un laboratoire de microbiologie alimentaire, les techniques moléculaires offrent une solution à ces inconvé-
nients. Le screening d’échantillons enrichis au moyen de la PCR en temps réel permet en effet de libérer rapide-
ment les échantillons négatifs (≤ 24h), ce qui constitue un aspect important pour le fabriquant.
Introduction des techniques moléculaires dans le laboratoire
Pour mettre en application des méthodes moléculaires – parmi lesquelles la PCR en temps réel –au sein d’un
laboratoire, un certain nombre de mesures de précaution doivent être prises. L’Organisation internationale de
normalisation (ISO) a rassemblé dans plusieurs normes ISO les différentes exigences applicables au laboratoire et
les exigences générales pour l’analyse des denrées alimentaires au moyen de méthodes basées sur la PCR (ISO
22174:2005, ISO 20837:2006, ISO 20838:2006, ISO 22118:2011 et ISO 22119:2010).
Tableau 1: Directives ISO pour les méthodes basées sur la PCR
ISO Titre
Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments -
22174:2005 Exigences générales et définitions
20837:2006 Exigences relatives à la préparation des échantillons pour la détection qualitative
20838:2006 Exigences relatives à l’amplification et à la détection pour les méthodes qualitatives
22118:2011 Caractéristiques de performance des méthodes de détection moléculaire
22119:2010 PCR en temps réel – Exigences générales et définitions

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Validation des méthodes PCR en temps réel : approche modulaire
Une première norme ISO basée sur un screening initial de l’échantillon par PCR en temps réel pour la détec-
tion spécifique d’agents pathogènes dans les aliments a été publiée en novembre 2012, à savoir la norme ISO
13136:2012 pour la détection des E. coli pathogènes. Suivra probablement bientôt la méthode de référence ISO
pour la détection du Norovirus et de l’Hépatite A dans les aliments, qui est simplement basée sur la détection
par PCR en temps réel. Le Comité européen de Normalisation (CEN) soutient également le développement de
méthodes standardisées pour la détection entre autres de Vibrio parahaemolyticus et V. vulnificus, Clostridium botu-
linum, Yersinia enterocolitica et Y. pseudotuberculosis suivant la même méthodologie.
Ces méthodes sont composées de deux grandes étapes, à savoir la détection de l’agent pathogène par PCR en
temps réel et – en cas de résultat positif du point de vue des critères fixés – l’isolement subséquent du germe.
Cela signifie que lorsqu’on souhaite introduire de telles méthodes au sein du laboratoire sous une accréditation
(ISO 17025), une validation modulaire est requise pour ces deux étapes (Figure 1). Cela implique que la sélectivité,
la limite de détection, la répétabilité et la reproductibilité de la méthode doivent être démontrées tant pour le
screening que pour l’étape d’isolement. La participation à un test interlaboratoire est également requise afin de
déterminer la justesse de la méthode.
Figure 1: Reproduction schématique de l’approche modulaire en microbiologie alimentaire
(basée sur Kagkli et al., 2011)
Module A: Prise d’essai de la matrice alimentaire
p.ex. légumes, produits laitiers, viande, …
Module B: Pré-enrichissement/enrichissement
(sélectif ou non)
Module C: Extraction d’ADN
(méthode développée au laboratoire, kit, …)
Module D: PCR en temps réel
Module E: Confirmation, isolement
(étalement, sérotypage,…)
OUI
OUI
OUI
OUI
NON
NON
NON
NON
Les critères fixés sont
respectés
Actions correctives
Les critères fixés sont
respectés
Les critères fixés sont
respectés
Les critères fixés sont
respectés
Actions correctives
Actions correctives
Actions correctives

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Stratégie de validation en fonction de la méthode
Pour la détection d’un agent pathogène par PCR en temps réel (technique de screening), le laboratoire peut
choisir d’utiliser soit les réactifs décrits dans la directive ISO (p.ex. ISO13136:2012 VTEC), soit des kits commerciaux
alternatifs ou encore une méthode qu’il aura lui-même développée.
1 Réactifs tels que décrits dans la méthode ISO
Le laboratoire peut choisir d’utiliser les amorces et la sonde spécifiées dans la directive ISO. Il peut commander lui-
même les amorces et la sonde auprès d’un fournisseur de son choix ou utiliser un kit commercial qui comporte
les mêmes amorces et sonde que celles spécifiées dans la directive ISO. Dans les deux cas, la limite de détection
visée est définie dans la directive ISO ou dans le manuel du kit commercial utilisé, et le laboratoire doit prouver
que cette limite est atteinte. Par ailleurs, les autres paramètres de validation, tels que décrits plus haut, doivent
également être déterminés.
2 Méthodes alternatives : kits commerciaux
Le laboratoire peut également opter pour des kits commerciaux basés sur la détection par PCR en temps réel d’un
agent pathogène au lieu de la méthode ISO microbiologique classique (p.ex. Listeria et Salmonella). Pour les direc-
tives ISO basées sur la PCR en temps réel, des kits commerciaux peuvent aussi être utilisés qui n’emploient pas les
réactifs tels que décrits dans celles-ci. On parle dans ce cas d’une méthode alternative. L’Agence fédérale pour la
Sécurité de la Chaîne alimentaire (AFSCA) autorise l’utilisation de telles méthodes dans le cadre du programme
officiel de contrôle, à condition qu’elles soient reprises dans la liste des méthodes microbiologiques reconnues,
qui est disponible sur le site internet de l’AFSCA (http://www.favv.be/laboratoria/erkendelaboratoria/dienstno-
tas/_documents/2012-04-12_Lijst-microbio-methoden_v12.pdf). La condition pour figurer dans cette liste est
une validation ISO 16140 du kit par rapport à la méthode de référence (normes ISO) pour l’agent pathogène
concerné. Cette liste est mise à jour chaque année.
La validation se définit comme la confirmation qu’une méthode satisfait aux exigences fixées, ce pour un usage
visé spécifique, il faut dès lors tenir compte du champ d’application du kit commercial. Un protocole peut en effet
différer suivant la matrice à analyser (échantillon humain, eau, aliment, prélèvement issu de l’environnement).
Dans ce cas, le kit a fait l’objet d’une validation ISO 16140 par le fournisseur pour une matrice spécifique suivant la
procédure publiée. Le laboratoire peut utiliser le dossier de validation du fournisseur pour démontrer la sélectivité
(inclusivité/exclusivité) du kit commercial mais il doit également vérifier s’il atteint la limite de détection spéci-
fiée. L’introduction de contrôles d’extraction pour le suivi de l’extraction de l’ADN et de contrôles internes pour la
vérification de l’absence d’inhibition et d’une amplification correcte sont indispensables aux méthodes de PCR en
temps réel. Même si les kits commerciaux comportent souvent un contrôle interne, un contrôle d’extraction n’est
pas toujours prévu. Enfin, le laboratoire doit définir dans le dossier de validation les autres paramètres de valida-
tion tels que la répétabilité, la reproductibilité et la justesse, ce aussi bien pour la partie screening que pour les
étapes ultérieures d’isolement du germe.

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3 Méthode développée par le laboratoire
Si le laboratoire souhaite mettre au point sa propre méthode de PCR en temps réel pour la détection d’un germe
et la soumettre à l’accréditation, c’est uniquement possible si la méthode est validée au sein du laboratoire selon
la norme ISO 16140 ‘in house method’.
Conclusion
L’introduction de méthodes de détection moléculaire dans le laboratoire de microbiologie implique donc davan-
tage qu’une validation classique et peut également nécessiter une adaptation de l’infrastructure. Les méthodes
de détection moléculaire ont comme avantage une libération rapide des échantillons conformes (dans les 24h).
L’isolement d’un germe reste toutefois indispensable pour confirmer la présence d’un agent pathogène dans la
matrice analysée et pour la détermination ultérieure de sa virulence.
Références :
- ISO 16140:2003 - Microbiologie des aliments – Protocole pour la validation des méthodes alternatives
- ISO 17025:2005 - Exigences générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnages et d’essais
- ISO 22174:2005 - Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche
de micro-organismes pathogènes dans les aliments – Exigences générales et définitions
- ISO 20837:2006 - Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection
des micro-organismes pathogènes dans les aliments – Exigences relatives à la préparation des échantillons
pour la détection qualitative
- ISO 20838:2006 - Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection
des micro-organismes pathogènes dans les aliments – Exigences relatives à l’amplification et à la détection
pour les méthodes qualitatives
- ISO 22118:2011 - Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection
et la quantification des micro-organismes pathogènes dans les aliments - Caractéristiques de performance
- ISO 22119:2010 - Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel
pour la détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments – Exigences générales et définitions
- Kagkli, D-M., Weber, T.P., Van den Bulcke, M., Folloni, S., Tozzoli, R., Morabito, S., Ermolli, M., Gribaldo, L. & Van
den Eede, G. (2011). Application of the modular approach to an In-House validation study of Real-Time PCR
methods for the detection and serogroup determination of verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl Env
Microbiol 77 (19), 6954-6963
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