Biologie cellulaire : 3ème cours Peltier du 30 janvier Les récepteurs membranaires. Définition : -Ligant : Désigne une molécule capable de reconnaître spécifiquement une autre molécule ou édifice moléculaire et de s’y fixer. C’est le médiateur soluble -Récepteur : Toute protéine à laquelle s’attache les molécules de signalisation et qui provoque une réponse cellulaire. C’est en général un édifice moléculaire. -Effecteur primaire : c’est une enzyme situé dans la membrane ou à proximité, dont la fonction va être activé par le récepteur et qui conduit à la production d’un second messager. L’exemple est l’adénylate cyclase. -Seconde messager : molécule de signalisation intracellulaire dont la concentration augmente ou diminue très rapidement suite à l’activation d’un récepteur. Exemple : AMPc, calcium, DAG, IP3. Un second messager est produit rapidement et dégradé rapidement ou recapter afin que le signal qu’il porte disparaisse rapidement. -Effecteur secondaire : est un système enzymatique mis en jeux par le second messager. On définit donc le mécanisme de transduction du signal qui est la conversion d’un message extracellulaire en message intracellulaire et qui comprends les étapes concernant le ligant, le récepteur et l’effecteur primaire. Le récepteur est une notion ancienne de 1910 avec Erlich qui a postulé que « pour qu’une substance agisse, elle doit se fixer ». Il y a pourtant une exception : c’est le NO dont on verra qu’il agit directement sur une enzyme intracellulaire sans s’y fixer, c’est une simple interaction. On considère que ce postula est vrai. C’est l’expression d’un récepteur qui va conditionner la sensibilité d’une cellule à une molécule de signalisation. Ces récepteurs membranaires sont des protéines membranaires intrinsèques. Leurs structure est quasiment constante avec 3 domaines : - Un extracellulaire : est hydrophile et glycosylée, qui correspond au site de reconnaissance et de fixation du ligant. - Un transmembranaire : il est hydrophobe car constitué d’AA hydrophobe. - Un intracellulaire : C’est un domaine fonctionnel qui donne naissance au signal intracellulaire. En réalité, les récepteurs fonctionnent souvent groupés en multimère d’unités identiques ou différentes. La liaison du ligant à son récepteur n’est pas covalente. Elle se fait grâce à des liaisons d’énergie faible c’est à toute liaison qui n’est pas covalente. Ces liaisons sont en grand nombre et il peut y avoir une fixation assez forte. Le fait que ce soit des liaisons faibles et notamment ioniques vont faire qu’elles sont sensibles à l’environnement et notamment au PH et à la force ionique qui peut stabiliser ou déstabiliser cette interaction -Cette interaction est réversible et à l’équilibre de cette réaction la vitesse d’association est égale à celle de dissociation du complexe ligant récepteur et la proportion des formes liées et libres dépends de l’affinité du récepteur. En règle générale, les récepteurs ont une forte affinité pour leur ligant donc c’est surtout sous forme lié que ces éléments existent. On utilise la constante de dissociation Kd pour relater cette affinité. Le Kd est en molaire, c’est la concentration pour laquelle la moitié des sites va être occupé. Plus le Kd est faible plus l’affinité est forte. En règle général il est de 10-8 molaire ce qui est proche des concentrations des médiateurs circulant. 1 -Spécificité d’un récepteur : capacité du récepteur à distinguer des molécules proches. Exemple de l’insuline et IGF-1 qui sont deux ligants du récepteur à l’insuline, qui vont tous les deux activer ce récepteur donc on peut pas dire que le récepteur à l’insuline est spécifique de l’insuline car il lit d’autres molécules naturelles. -Il y a un nombre finit de récepteurs à la surface de cellule donc il y a une capacité de fixation à la surface de cellule. -Quand il y a communication via un signal extracellulaire, ça active le récepteur, il y a des relais intracellulaires qui vont amplifier le signal et se répartir sur différents sites des activités métaboliques, de l’expression de gènes ou la modification du cytosquelette pour changer la forme ou l’adhérence de la cellule. Comment ce signal extracellulaire passe dans le domaine intracellulaire ? 2 modèles : 1- Modèle allostérique : inventer en premier. On imagine qu’un ligant va se fixer à son récepteur, cette fixation induit un changement de conformation du récepteur qui va se propager jusque dans le domaine intracellulaire et celui ci acquière alors des nouvelles fonctions : enzymatiques ou de l’affinité pour d’autres molécules intracellulaires. Le problème c’est qu’entre les deux domaines extra et intracellulaires il y a un transmembranaire qui est une séquence hydrophobe figé très compacte et il est difficile d’imaginer que ce domaine puisse changer et transmettre un changement de conformation d’un domaine à un autre. 2- Modèle de la coopération : Le récepteur du VEGF est activé quand il est en dimère car les deux domaines intracellulaires en relation forme l’activation. Le VEGF circule sous le forme de dimère donc il est facile d’imaginer que ce dimère va s’associer à deux unités de récepteurs, les regrouper et ainsi les récepteurs regroupés seront activés. On peut démontrer ce modèle si on utilise un anticorps anti VEGF-R dont chaque bras va lié un récepteur sans pour autant l’activer (rien avoir avec la fixation du ligant) mais ça permet un pontage entre deux récepteurs et le message du VEGF va passer à ce moment là sans VEGF donc le rapprochement de deux récepteurs est ici responsable de l’activation. Beaucoup de molécules circulent de façon unitaire donc on peut imaginer que le ligant se lit à la partie extracellulaire, modifie sa conformation de sorte que cette partie extracellulaire va avoir une affinité importante pour les autres récepteurs de même type et c’est à cause du domaine extracellulaire que les récepteurs vont se lier ce qui associe les parties intracellulaires et faire naître le signal intracellulaire. Dans tout les cas c’est le rapprochement des domaines intracellulaires qui est responsable de l’activation. Ces deux modèles ne sont pas exclusifs : dans la plupart des cas la vérité est entre les deux, les modèles sont mixtes. Mise en évidence de la présence de récepteurs sur cellule On prends une culture de cellule, on utilise un ligant qu’on marque en radioactif. On incube ce ligant marqué sur les cellules, retirer ensuite cette suspension de ligant, faire des lavages pour conserver ce qui est spécifique (forte affinité) et ensuite on mesure la radioactivité qui reste fixer à la surface des cellules donc on met en évidence qu’il y a ou non fixation du ligant aux cellules et qu’il y a ou non des récepteurs. Capacité de liaison : On mesure la radioactivité donc la quantité de ligant lié à la surface des cellules en fonction de la quantité de ligant marqué ajouté. A partir d’un certain moment il y a un plateau donc on a saturé les sites potentiel de fixation du ligant. On peut donc déterminer le nombre de site 2 qu’il y a à la surface de cette population cellulaire ou d’une cellule. En général il y a entre 104 et 106 récepteurs par cellule pour une cellule qui réponds à un ligant. Si la fixation était aspécifique, on aurait jamais de plateau : le ligant que l’on met se fixe n’importe où. Spécificité de liaison : On prends la condition précédente : on attends que la plateau soit atteint donc on a saturé les sites de fixation au niveau des cellules et maintenant on rajoute un compétiteur : un autre ligant dont on veut tester s’il se fixe au récepteur mais celui ci ne sera pas marqué : froid. -1er cas : Ca ne change pas la radioactivité donc ce compétiteur ne s’est pas mis du tout à la place de l’autre, il a laissé le ligant marqué lié donc il n’a pas d’affinité pour le récepteur (ou inversement). En d’autre terme ici le récepteur est spécifique du ligant marqué vis à vis du compétiteur 1. -2ème cas : Un deuxième compétiteur est ajouté, ça diminue un peu la radioactivité à la surface de cellule donc il s’est mis un peu à la place du ligant marqué donc que le récepteur n’est plus tout à fait spécifique d’un ligant par rapport à l’autre. -3ème cas : Ce compétiteur supprime complètement la radioactivité donc il prends la place de toutes les molécules qui étaient marquées et liées aux récepteurs. Donc le récepteur n’est pas spécifique du ligant marqué vis à vis de ce C3 mais surtout sans doute que ce compétiteur a une plus forte affinité que l’autre, l’a chassé complètement. Est ce que tout ligant active le récepteur ? Non. 1- Ligant agoniste : Se fixe au récepteur, change la conformation : l’active et induit un signal intracellulaire. 2- Ligant antagoniste : Se fixe au même site mais n’induit aucun changement de conformation du récepteur donc aucun signal intracellulaire. On pourrait dire qu’il n’a aucun effet mais c’est faux car il empêche le ligant agoniste de ce fixer donc il diminue la réponse de l’agoniste. -Les antagonistes compétitifs : -les antihistaminiques : l’histamine est un médiateur de l’inflammation impliqué dans l’allergie. Les anti histaminiques sont des antagonistes compétitifs de l’histamine donc prennent la place de l’histamine au niveau du récepteur et n’induire aucun effet donc diminuer l’effet de l’histamine au niveau de l’inflammation et l’allergie. Si on prends des antihistaminiques, il y a un effet secondaire de somnolence donc il faudrait pouvoir dissocier les deux effets et pour cela on essai de comprendre quels sont les récepteurs mis en cause puisqu’il y a 3 types de récepteurs : H1, H2, H3 qui sont exprimés en différents sites de l’organisme et peut être qu’on peut dissocier la somnolence de l’antiallergie donc il faudra trouver un antagoniste spécifique de l’effet inflammatoire. -Bêta bloquants : Antagoniste compétitif du récepteur bêta adrénergique utilisé dans les troubles cardio vasculaires, d’hypertension ou du rythme. Pour mieux visualiser ces antagonistes : Voici le récepteur cholinergique nicotinique. Il y a plusieurs antagonistes pour ce récepteur : -le curare et l’alpha bungarotoxine qui sont des antagonistes compétitifs c’est à dire qu’ils se mettent au même site que l’acétylcholine qui est le ligant naturel et empêcher sa fixation donc ils se mettent ici sur les deux sous unités alpha. -Antagonistes non compétitifs : la tétracaine et proadifen qui se mettent dans d’autres sites sans interaction avec l’acétylcholine. Puisque ce récepteur est un canal, si le proadifen se met dans le canal ça bloque le canal donc l’effet de ce récepteur et l’Ach peut encore venir se fixer mais n’aura aucune fonction. 3 Effet biologique : -Exemple 1 : Effet du FGF sur le FGF-R3. Le FGF-R3 est exprimé sur les cellules épithéliales ou des cellules de la lignée hématopoïétique B et d’autres part des chondrocytes responsables de l’expansion des os longs. Donc le point commun est un même facteur, le même récepteur, 2 groupes cellulaires différents. Lorsque FGF se fixe au récepteur, les effets sont opposés puisque dans un cas on augmente la prolifération, dans l’autre on la diminue. Il existe des mutations de ce récepteur qui sont activatrices constitutives ce qui veut dire que le récepteur se retrouve sous forme activé en permanence même s’il n’y a pas de ligant. Ce qui veut dire que dans un cas la prolifération va être augmenté en permanence, dans l’autre cas elle sera diminué en permanence. Dans le 1er cas, si c’est une mutation acquise au cours du temps ça peut déboucher sur un phénomène de cancérisation car cycle cellulaire dérégulé. Si la mutation est congénital, il y a une hypoplasie, un défaut de croissance des os long donc un anisme donc ici une hypochondroplasie pour la forme légère jusqu’au nanisme thanatophore c’est à dire létal. Donc avec le même facteur, même récepteur on peut avoir effet opposé. -Exemple 2 : Le VEGF est une famille de 4 facteur de A à D et il y a 4 récepteurs de 1 à 4. Toutes les combinaisons ne sont pas possibles : Le VEGF-A va se fixer et activer VEGF-R1 et VEGF-R2 à la surface des cellules endothéliales (plusieurs récepteurs pour le même ligant). Le VEGF-B ne peut se fixer qu’au VEGF-R2 et va l’activer. On montre donc qu’il peut y avoir plusieurs ligants pour un seul récepteur. Est-ce utile d’avoir deux facteurs se fixant sur le même récepteur, d’avoir un facteur se fixant sur 2 récepteur ? Les deux récepteurs vont médier des signaux différents : Le VEGF-R1 va plutôt activer la migration des cellules endothéliales lors de l’angiogénèse et le VEGF-R2 plutôt la prolifération des cellules endothéliales. Pour les VEGF, ils ne sont pas synthétisés par les mêmes cellules, pas simultanément et ils ne circulent pas aux mêmes concentrations. Donc ils ont des effets réellement différents : ce système est complexe. Le récepteur à la surface des cellules endothéliales impliqué aussi dans l’angiogénèse : c’est le récepteur Tie-2 dont les ligants sont les angiopoiétines. Ce système Tie-2 et angiopoiétine est responsable des interactions des cellules endothéliales avec la MEC et avec les cellules musculaires lisses dans les phases tardives de l’angiogénèse c’est à dire la maturation des vaisseaux. Donc ce système est plutôt là pour activer l’angiogénèse, celui ci est plutôt là pour l’éteindre et c’est aussi important. L’angiopoiétine 1 se fixe et active le récepteur, elle va donner un message de survie cellulaire aux cellules endothéliales. Il existe un antagoniste compétitif naturel du récepteur Tie-2 : l’angiopoiétine3 qui va aussi ce fixer à ce récepteur, ne pas l’activer mais bloquer l’effet de l’angiopoiétine 1 et donc au final faire pencher la balance vers la mort cellulaire. L’angiopoiétine 2 peut médier l’un ou l’autre : Ce n’est pas au hasard, ça dépends du VEGF. L’ang-2 va médié la survie cellulaire en présence de VEGF et sera responsable de l’apoptose des cellules endothéliales en absence de VEGF. -Conclusion : Un ligant peut se fixer à plusieurs récepteurs, plusieurs ligants sur un seul récepteur, un ligant sur un récepteur peut avoir différents effets sur différentes cellules donc au final pour comprendre une réponse logique il faut définir tous les paramètres c’est à dire le ligant, le récepteur, le type cellulaire et peut être plus comme avec Tie et VEGF-R. Purification des récepteurs Essentiel à leurs compréhension, c’est difficile à faire car ce sont des protéines rares de faible densité à la surface des cellules et elles sont enchâssées dans la membrane donc si on veut les récupérer il faut utiliser des détergents pour les retirer de la membrane. 3 techniques de purification. Toutes ces techniques nécessite de connaître et de détenir le ligant correspondant. 4 1- Marquage d’affinité Le récepteur et le ligant sont des protéines donc groupement amine à la surface de ces composés. Il existe des réactifs de pontage comme NHS qui sont des molécules qui font un pont entre 2 amines voisines. Donc si on incube une culture cellulaire qui exprime le récepteur avec le ligant correspondant qui est marqué, qu’ensuite on fait agir ce réactif de pontage on va associé de façon covalente les deux composés qui seront donc solidaire par la suite donc on a fait un marquage radioactif du récepteur de façon intermédiaire. A partir de là, on peut faire des études, lyser les cellules, récupérer toutes les protéines, faire une électrophorèse et visualiser le complexe ligant/récepteur qui sera visualisable grâce à la radioactivité du ligant donc on pourra déterminer la masse du récepteur, le purifier, l’extraire du gel d’électrophorèse donc on aura purifié ce complexe. 2- Chromatographie d’affinité Des colonnes de chromatographies avec un gel à l’intérieur qui contient des billes, à la surface de ces billes on a attaché par covalence le ligant du récepteur que l’on recherche. Sur cette colonne on va faire passer un extrait cellulaire contenant potentiellement le récepteur qui correspond au ligant. Donc ce récepteur va se lier au ligant dans la colonne, ensuite on fait des lavages pour qu’il ne reste plus que cette association qui est spécifique et assez forte. Enfin on va éluer c’est à dire décrocher le récepteur par 2 techniques : - Rajouter une solution de ligant qui va rentrer en compétition avec celui immobiliser sur la colonne et au passage ce ligant diffusible libre va emmener avec lui le récepteur qui était accroché donc on aura au fond des tubes le récepteur + son ligant. - Cette interaction est sensibles à l’environnement donc on peut faire un saut de PH : diminuer le PH par exemple à 2,5 acide qui va déstabiliser cette interaction donc le récepteur descendra, sera éluer seul cette fois ci donc le récepteur aura été réellement purifié. Cette technique est applicable dès que deux protéines ont une affinité l’une pour l’autre. 3- Clonage par expression Il nous faut 2 types cellulaires : un qui exprime à coup sur le récepteur et l’autre qui ne l’exprime pas. La cellule qui exprime le récepteur exprime la protéine mais avant cela elle exprime l’ARNm et c’est celui ci qu’on va aller rechercher. Donc on va extraire les ARNm de cette cellule, on fait une rétro transcription pour avoir de l’ADNc qui est beaucoup plus stable (plus facile de travailler avec de l’ADNc). Donc ici on a tous les ADNc correspondant à tous les ARNm exprimés par la cellule. Chaque ADNc individuellement va être mis dans un vecteur : un plasmide. L’ensemble de ces plasmides constitue une banque d’expression. Ces plasmides sont mis dans des bactéries afin d’amplifier la quantité de matériel. Donc chaque clone bactérien contient l’équivalent de l’ADNc de cette cellule d’origine donc pour avoir tous les ARNm de cette cellule on aura peut être une population de milliers de bactéries différentes pour représenter tout ce que la cellule peut exprimer. Ensuite on extrait ces ADNc et on va les injecter dans des cellules qui sont R- (qui n’expriment pas ce récepteur) donc on aura autant de culture cellulaire qu’on avait de clones bactériens. Et on va faire un criblage avec le ligant marqué c’est à dire qu’on met en contact ces populations cellulaires avec un ligant marqué et voir laquelle ne retenait pas et maintenant retient le ligant à sa surface, lequel exprime le récepteur. Donc celle qu’on aura retenu car elle retient le ligant, on récupère l’ADNc cloné correspondant au plasmide qu’on a mis à l’intérieur et en déterminer la séquence. - Etapes pour purifier, identifier, connaître un récepteur dans les deux 1er techniques: On fait un micro séquençage de la protéine, on en déduit la séquence en AA donc possiblement une séquence oligonucléotidique, on fait des sondes, rechercher l’ARNm correspondant dans les cellules qui expriment le récepteur et à partir de là faire un séquençage 5 de ce gène. Le clonage par expression donne directement la séquence de l’ADNc du récepteur correspondant. Donc ces techniques qui sont lourdes nécessitent un travail très long. Différentes familles de récepteurs. 2 familles : -à activité enzymatique propre tel que récepteur à activité tyrosine kinase ou tyrosine phosphatase. -sans activité enzymatique : les récepteurs canaux, couplé au protéine G, ou les récepteurs aux cytokines. I/ Les récepteurs canaux ioniques Un canal ionique est un pore donc un canal transmembranaire qui va permettre le passage des ions de façon passive donc selon le gradient électrochimique. Un récepteur canal ionique est un canal ionique ligant dépendant dont l’activité sera dépendant de la fixation d’un ligant. Ils sont à opposer aux canaux ioniques voltage dépendant dont l’activation dépends d’une différence de potentiel. - Les récepteurs ionotropiques : le récepteur est également le pore c’est donc réellement un canal ligant dépendant. C’est le récepteur cholinergique nicotinique : l’Ach se fixe à la structure dont la conformation s’ouvre pour que les ions passent à travers ce canal. Le récepteur et le canal sont confondus. - Les récepteurs métabotropiques : Il y a 2 structures : le récepteur et le canal d’autre part relié par des effecteurs intracellulaires. Le ligant se fixe à son récepteur qui va activer une enzyme, donner naissance à des seconds messagers qui vont activer le canal qui est distend du récepteur. Un grand nombre de récepteur canaux ioniques pour les structures nerveuses donc en réponse aux neurotransmetteurs au niveau des cellules excitables qui sont les neurones ou les cellules musculaires. Pour l’acétylcholine il y a un récepteur ionotropique et un récepteur métabotropique. Il y a les 2 types pour le glutamate, pour le GABA. D’autres neurotransmetteurs ont un récepteur ou un autre récepteur mais pas de récepteurs dans les 2 familles. Les récepteurs cholinergiques Celui qui est ionotropique est le récepteur nicotinique : Il est rapide car quand le ligant se fixe il y a ouverture du canal instantanément donc passage d’ions. En même temps il est bref donc s’arrête rapidement. Il est excitateur donc dépolarisant avec une entrée de cations ou sortie d’anions. Celui qui est muscarinique est métabotropique : Action lente et prolongé car quand l’Ach se fixe sur le récepteur il faut induction de la production de second messager ou la modification de l’activité intracellulaire qui vont conduire à l’ouverture d’un canal distant donc il y a un délais avant l’ouverture du canal et c’est prolongé car il faut du temps pour éteindre tous ces signaux né pendant l’activation. Dans le SNC, c’est surtout les récepteurs métabotropiques. Au niveau périphérique, il n’y a pas chevauchement de l’expression de ces récepteurs. Il peut avoir la fonction excitateur ou inhibiteur en fonction de la cascade intracellulaire et du récepteur qui est au bout de la chaîne de signalisation. 1) Le récepteur nicotinique C’est le récepteur ionotropique le mieux connu. C’est une structure pentamèrique : 2 alpha qui sont la sous unité de fixation de l’Ach donc deux Ach peuvent se fixer sur ce récepteur ; Bêta, gamma ou epsilon. Epsilon étant chez l’adulte et Gamma chez l’embryon. L’ensemble de cette structure a une taille considérable : 300kD. Pour chaque sous unité, il y a 4 hélices alpha 6 donc 4 domaines transmembranaires M1 à M4. Seul M2 a une composition hydrophile, c’est donc la partie M2 de chaque entité qui va se retrouver au centre de la structure pour délimiter un canal hydrophile. Séquence partielle de M2 : Il y a 4 glutamates chargés négativement qui vont permettent le filtrage des ions c’est à dire que les ions + vont être attirer et les – seront repoussés. Le fait que ce soit seulement des ions sodium qui passent est le résultat d’autres AA pas mis en évidence ici qui vont repoussés les autres ions de charge +. Quand 2 Ach se fixent sur les 2 unités alpha, le canal s’ouvre pendant environ ½ seconde et laisse passer 10 millions ce qui va induire ou favoriser une dépolarisation. L’arrêt de ce signal sera le résultat soit de la dissociation de l’Ach de ce récepteur et potentiellement de la dégradation de l’Ach lorsqu’elle est décroché. Soit de modification des récepteurs comme des phosphorylations au niveau du domaine intracellulaire qui vont le bloquer qu’il y a de l’Ach ou non. La jonction neuro-musculaire. On voit l’axone présynaptique, l’élément post synaptique. Dans l’axone il y a des vésicules de sécrétion de l’Ach. Au niveau de la cellule musculaire il y a un grand nombre de mitochondries et les fibres musculaires elles mêmes -structure de la fibre musculaire : Il y a le sarcolemme qui est la membrane plasmique de cette cellule. Le sarcoplasme est son cytoplasme. On retrouve le réticulum sarcoplasmique qui entoure les fibres musculaires. Il existe des invaginations du sarcolemme qu’on appel Tubule T qui vont aller au contact du réticulum sarcoplasmique (c’est de la membrane plasmique qui se retrouve à l’intérieur de la cellule) et cette association étroite entre tubule T et RS va constitué l’élément essentiel qui va conduire à la contraction musculaire. - Séquence des événements quand activation de la jonction : Le neurone libère l’Ach. Au niveau de la cellule musculaire (élément post synaptique) il y a des récepteurs nicotiniques qui en réponse à l’Ach vont s’ouvrir, laisser rentrer du sodium qui va créer localement une dépolarisation. Autour de cette jonction neuromusculaire il y a des canaux sodium qui sont voltage dépendant et qui vont propager cette dépolarisation tout le long de la cellule. Cette dépolarisation arrive au niveau des tubules T et là ce sont d’autres canaux qui entrent en fonction : ce sont des canaux à calcium voltage dépendant qui laissent entrer le calcium donc propage l’influx à l’intérieur de la cellule et en réponse à l’activation de ces canaux du tubule T, il y aura une activation d’autres canaux calciques à la surface du RS qui vont libérer du calcium du RS dans le cytoplasme. Tout ce calcium provenant du tubule T ou du RS va activer la contraction musculaire. Retenir que c’est essentiellement le calcium du RS qui est responsable, le calcium qui rentre via le tubule T de l’extérieur de la cellule est secondaire dans l’induction de la contraction musculaire. Ensuite le calcium est repompé au niveau du RS pour mettre fin à ce signal. Dans le RS, il est complexé à la Calsequestrin, c’est sa forme de stockage. -En détail ce qui se passe entre le tubule T et le RS : Il y a 2 canaux calcium : le 1er est voltage dépendant c’est le récepteur à la dihydropyridine qui va s’activer lorsque la dépolarisation arrive à son niveau donc il va faire rentrer du calcium dans la cellule et le deuxième sera activé par l’activation du premier et va libérer du calcium du RS. Ce canal là n’est pas voltage dépendant mais s’active uniquement en interaction avec ce récepteur à la dihydropyridine activé. La jonction neuromusculaire est une structure importante, le message transmis du motoneurone à la cellule musculaire doit être efficace, rapide et s’arrêter vite pour qu’une autre contraction puisse avoir lieu. Pour cela il y a l’Ach estérase qui est concentré au niveau de la jonction neuromusculaire et qui va dégradé l’Ach de cette jonction à une vitesse importante car 300000 molécules d’Ach par minute qui sont dégradés pour une molécule d’Ach estérase. - Le carbachol a une structure développé proche de l’Ach c’est un agoniste du récepteur nicotinique. Le carbachol se fixe au récepteur, l’active et cette petite différence de structure 7 fait qu’il n’est pas reconnu ni dégradé par l’Ach estérase donc l’effet est prolongé et utilisé quand il y a des insuffisances de libération d’Ach dans certains syndromes. - Le tubocurarine (ou curare) est un antagoniste compétitif du récepteur nicotinique donc elle se fixe à la place de l’Ach et empêcher celle ci d’agir. Elle est utilisé comme myorelaxant en chirurgie. - La physostigmine inhibe l’Ach estérase donc va prolonger l’effet de l’Ach. - La toxine botulique utilisé en chirurgie plastique agit sur la jonction neuromusculaire et en faite elle bloque les canaux au niveau du motoneurone et empêcher la libération de cette façon la libération de l’Ach. -Pathologies : La myasténie est un problème de communication au niveau de la jonction. Si on dose l’Ach on va trouver la même quantité, la même structure par contre si on dose le nombre de récepteur à la surface de la cellule musculaire c’est un nombre très réduit donc fatigabilité importante du sujet qui ne peut pas soutenir une activité physique. Ce nombre diminué est la conséquence d’une réaction immunitaire dirigée contre le récepteur qui vont dégrader ces récepteurs donc pour corriger cela on administre des inhibiteurs de l’Ach estérase comme la physostigmine pour amplifier l’effet de l’Ach qui arrive au niveau des récepteurs (détresse respiratoire si pas corrigé). 2) Le récepteur muscarinique A 7 traversées transmembranaires. Associé à une protéine G. La partie N terminal est extra et C terminal est intracellulaire. Quand le récepteur est activé, la protéine G interagit avec la 3ème boucle intracellulaire mais il y a dans la partie C terminal des AA susceptibles être phosphorylés et s’ils le sont ça empêche interaction de la protéine G avec la boucle donc bloquer l’effet du récepteur. Les différents récepteurs muscariniques sont à l’origine de différentes cascades qui vont induire l’entrée ou la sortie de cations ou d’anions donc avoir soit un effet dépolarisant soit hyper polarisant. Etude des récepteurs par le Patch Clamp Permet de mesurer la différence de potentiel entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule donc d’évaluer les flux ioniques qui s’effectuent au niveau de cette membrane. Ces flux ioniques vont être modifiés en fonction de l’action de neurotransmetteur. On a une cellule contre laquelle on pose une pipette en verre si fine qu’il est susceptible d’y avoir au niveau de cette pipette qu’un seul récepteur (ou très faible nombre de R) donc on va mesurer les flux ioniques au niveau de cette pipette uniquement donc au niveau d’un récepteur. En pratique : la pipette en verre séquestre une partie de la membrane donc un seul récepteur. Si on ajoute un ligant dans la pipette et qu’on observe un flux ionique au travers de la pipette ça veut dire que le canal et le récepteur sont une seul et même structure donc un récepteur ionotropique. Si on ajoute le ligant en dehors et qu’on observe également un flux nerveux uniquement au niveau de la pipette, ça veut dire qu’il y a une structure réceptrice quelque part et un canal autre part qui ont communiqués donc le canal est métabotropique. Il y a eu production d’un second messager à l’intérieur de la cellule qui est aller jusqu’au canal pour l’activer. Lorsqu’on imagine que l’on a identifié un second messager responsable de cet effet on va le tester : on arrache la partie de membrane qu’on avait au niveau de la pipette et ajouter à l’extérieur le second messager. Si le second messager induit un flux ionique, ça veut dire que la structure qui était dans la membrane est bien sensible à ce second messager c’est donc bien un récepteur métabotropique. 8 II/ Récepteurs à tyrosine kinase -Généralités de la phosphorylation de protéine dans cellule. On utilise des cellules en culture, on ajoute dans le milieu de culture du phosphate radioactif. A partir de ce P, les cellules vont produire de l’ATP radioactif qui sera ultérieurement utilisé dans les phosphorylations. Si on ajoute directement de l’ATP dans le milieu de culture celui ci ne passe pas dans les cellules donc ne peut pas être utilisé donc pas de phosphorylation à partir d’un phosphate marqué. A ce moment là, on stimule les cellules en ajoutant un facteur de croissance ou autre stimulus, on récupère les protéines de ces cellules et les séparer dans une électrophorèse SDS-page. Après une coloration des protéines, on voit des protéines abondantes qui sont des bandes denses, peu abondantes avec des bandes fines donc on voit toutes les protéines qui sont séparés en fonction de leurs tailles mais on ne voit pas les protéines qui sont phosphorylés donc on met un film sensible au rayonnement au dessus et révéler les bandes radioactives correspondant un P32. On a la condition témoin où pas fait de stimulus et la deuxième où on a stimulé la cellule donc il faut faire la soustraction des deux pour avoir l’effet spécifique du stimulus et on voit que seul 2 bandes sont issues du stimulus donc 2 protéines phosphorylés. Pourquoi des protéines phosphorylés sans stimulus ? La phosphorylation est important dans la vie cellulaire et communication. Il y a toujours des protéines phosphorylés. Cette technique est délicate car : -Quand on lyse les protéines, on va dé compartimenter toutes les protéines de la cellule et mettre en contact toutes les protéines ensembles. Dans ces protéines il y a des protéines qui vont empêcher, défaire la phosphorylation et si on fait pas attention le peu de protéines qu’on a phosphorylé va disparaître avant de les avoir analyser. Donc on met des inhibiteurs de ces enzymes pour renforcer le signal. -La phosphorylation est important dans la vie cellulaire et communication donc le simple fait de bouger la boite de culture donne une induction de certain mécanisme cellulaire (chaud, froid) donc on analyse pas que le stimulus mais aussi la manipulation de la culture donc on risque d’avoir un effet non spécifique de ce qu’on voulait étudier. -La phosphorylation est l’ajoute d’un P sur une cellule. Cette opération est réalité par une enzyme nommé kinase à partir de l’ATP qui est le donneur de phosphate et seul le dernier phosphate en gamma est donné pendant cette réaction. Donc la protéine va être phosphorylé mais cette phosphorylation est réversible par le biais d’enzymes : les protéines phosphatases qui retirent le phosphate de la protéine. -Donc 2 notions à intégrer : -la réversibilité de cette fonction qui fait qu’on phosphoryle ou déphosphoryle une protéine. -Il peut y avoir des signaux cellulaires qui aboutissent à l’activation d’une protéine kinase, d’autres à l’activation de cette phosphatase et l’effet sera l’intégration des deux sur la protéine. La phosphorylation se fait sur des AA qui porte une fonction OH : c’est la thréonine, sérine et la tyrosine. 2 groupes d’enzymes responsables de la phosphorylation de ces 3AA : - les tyrosines kinase phosphorylent que les tyrosines : récepteur à l’EGF et l’insuline récepteur. - ceux qui phosphorylent la thréonine ou la sérine ou les deux comme les Map kinase, Pka et Pkc. Dans ce groupe il y a donc une moins bonne spécificité du substrat. 9 Intérêt et qu’est ce que la phosphorylation ? C’est un interrupteur biochimique c’est à dire c’est un signal qui va activer ou désactiver une protéine : une enzyme. Mais il ne faut pas associer phosphorylation et activation ou déphosphorylation et désactivation. C’est un processus important dans la signalisation cellulaire : tout signal qui parvient à une cellule conduit à la phosphorylation ou déphosphorylation de protéines intracellulaires. Protéine Kinase A : C’est une sérine thréonine kinase activé par l’AMPc. Celui ci est produit à partir d’ATP par l’adénylate cyclase. L’AMPc produit va soit activer la Pka soit être dégrader par la phosphodiestérase en 5’ AMP qui n’a aucune action sur la Pka. Il existe des substances qui vont bloquer la phosphodiestérase donc l’AMPc restera plus longtemps fonctionnel donc effet de la Pka augmenté. La Pka est un tétramère, composé de 2 sous unités catalytiques de 38 kDa associées à 2 sous unités régulatrices de 49kDa. Quand chaque sous unité régulatrice va fixé deux AMPc, celles ci vont avoir une configuration qui va changer et en conséquence elles vont libérer les sous unités catalytiques qui pourront alors phosphoryler leurs substrats. Leurs substrats ont en commun qu’elles ont cette séquence consensus c’est à dire 5 AA : 2 arginines, n’importe quel AA, sérine ou thréonine qui est phosphorylé, et n’importe quel AA. Chaque fois qu’une protéine comporte cette séquence, elle est phosphorylable au niveau sérine ou thréonine. Au niveau de la sous unité catalytique, il existe cette séquence pseudo substrat qui ressemble fortement mais ça n’en est pas et à place de la sérine ou thréonine elle contient une alanine qui n’a pas de fonction « OH » donc ne peut pas être phosphorylé. Cette séquence, lorsque la Pka est inactive se retrouve au niveau du site catalytique de la sous unité catalytique et bloque ce site. On peut imaginer bloquer la sous unité catalytique avec tout peptide qui ressemble à cela, c’est donc l’origine d’agents pharmacologiques pour bloquer la fonction de la Pka. Puisqu’on connaît la séquence reconnu par la Pka et maintenant qu’on connaît la totalité du génome humain il suffit de rechercher dans tous les gènes les protéines qui vont contenir ce genre de séquence et on saura ainsi qu’il y a x protéines potentiellement phosphorylables par la Pka. 10