Ionascu Gabriel Compte Rendu de T.P. Analyse d`acides nucléiques

Ionascu Gabriel
Compte Rendu de T.P.
Analyse d'acides nucléiques

Techniques de Southern et de Northern
Dans les années 70, le biochimiste britannique Edwin Mallor Southern avait développé
un procédé qui permettait une détection ciblée de fragments d'ADN dans un mélange
complexe de fragments. Ce procédé, dénommé «Southern Blot», repose sur la liaison de
fragments d'ADN monobrin (ou monocaténaires) complémentaires par appariement de
bases. Dans la forme modifiée du «Northern Blot» (jeu de mots pour souligner la
modification de la méthode), le procédé utilise des ARN messagers obtenus à partir de
cellules comme matériel de départ. Il renseigne sur la fréquence avec laquelle certains
gènes sont exprimés. En 1994, ces procédés ont été considérablement affinés grâce à
l'apport de techniques issues de la fabrication de semi-conducteurs.
Les techniques de Southern et de Northern diffère dans la préparation du gel contenant
l'ADN l'ARN étudié avant que celui ci soit transféré sur une membrane de nitrocellulose
et ensuite hybridé.
Le Southern et le Northern sont deux techniques différentes car elles ne s'appliquent pas
aux memes éléments, en effet le southern est utilisé pour l'ADN et le northern est utilisé
pour l'ARN.
Dans le cas du southern blot, l'ADN est digéré par des enzymes de restriction avant de
subir une électrophorèse en gel d'agarose.
L'ARN subit également une électrophorèse mais sans avoir été digéré et en conditions
dénaturantes.
Après la séparation des fragments par électrophorèse l'ADN est dénaturé par incubation
du gel dans une solution de soude.
L'ADN est ensuite transféré sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon par un flux
de liquide entraînant l'ADN vers celle ci.
On réalise ensuite une fixation covalente de l'ADN sur la membrane par cuisson
(nitrocellulose) ou exposition aux U.V courts (nylon).
Pour l'ARN la manipulation est la même.
La membrane de nylon avec le ADN fixé est alors mise à incuber dans un sac contenant
une solution d'une sonde radioactive complémentaire du fragment de ADN qu'on
recherche, à une température assez basse pour que l'hybride se forme mais assez élevée
pour que cet hybride soit parfaitement complémentaire.
On lave la membrane des molécules de la sonde qui ne sont pas fixées à leur ADN
complémentaire, puis on la met en présence d'un film radiographique vierge dans une
enceinte opaque pour que la sonde radioactive fixée sur les fragments de ADN
complémentaires impressionne le film.

On révèle le film où des taches noires (sur le négatif) correspondent aux emplacements
où ont migré les fragments de ADN complémentaires de la sonde. On compare les
distances de migration avec des fragments de ADN radioactifs de tailles connues qui
servent de marqueurs de taille.
Questions :
1) Qu'apporte la réhydratation du Northern avec la sonde ribosomique?
La sonde ribosomique sert de témoin pour cette expérience. Cette sonde sert a vérifier
que le northern s'est bien déroulée, en effet on s'attend a trouver une marque d'ADN
ribosomique dans tous les tissus étudiés. S'il n'y avait pas présence d'ADN ribosomique,
cela voudrait dire que le Northern ne s'est pas bien déroulé. La sonde ribosomique sert
dans le cadre d'une normalisation de l'expérience.
2) Pourquoi les chercheurs ont-ils réalisé des expositions de durée differente pour
cette analyse?
Les chercheurs ont réalisé des expositions de durée différente pour faire apparaitre les
intensités d'AMH faibles. Si les chercheurs n'avaient pas exposé le gel plus longtemps,
aucune trace n'aurait été visible près 5h pour l'ovaire gauche.
3) Comparez l'expression de l'AMH
a. Dans les testicules au cours du développement de l'embryon et chez l'adulte.
Au cours du développement de l'embryon on constate que de grandes quantités d'AMH
dans les testicules. Plus l'embryon se développe plus la quantité d'AMH baisse jusqu'a
etre très faible chez l'adulte. Il faut une très longue exposition pour voir une trace de la
présence d'AMH dans les tésticules d'un adulte.

b. Entre les différents organes étudiés.
Dans le coeur, on observe qu'il n'y a pas d'AMH même apres une longue exposition. Il ne
s'agit pas d'une mauvaise manipulation car la sonde ribosomique est bien présente.
Dans l'ovaire gauche, on voit qu'il y a de l'AMH mais en faible quantité car l'exposition a
été plus longue, la quantité d'hormone est la même chez l'embryon et chez l'adulte. La
quantité d'hormone est importante.
4) Quelle(s) hypothèse(s) pouvez vous faire pour expliquer l'absence de signal pour
les ADN génomique de tortue et d'humain?
L'ADN génomique de tortue et d'humain sont différents de l'ADN génomique du poulet,
les gênes sont différents car suite a une longue évolution les nucléotide ont mutés. Les
tortues et les humains sont deux espèces très éloignées du poulet, leurs ADN génomiques
sont donc très différents c'est pour cela que l'on peut expliquer l'absence de signal chez la
tortues et l'humain alors que l'on en voit un chez le poulet.
On peut egalement souligner que la fixation dépend du lavage, ce qui pourrait etre une
autre raison de cette absence.
5) Pourquoi les fragments détectés pour l'ADN de poulet présentent-ils des
intensités différentes?
L'ADN de poulet a été digéré par trois enzymes de réstrictions différentes : Eco RI, Hind
III et Bam HI. Chacune de ces enzymes possèdent son lieu de coupe particulier, suivant
que l'on coupe avec l'une de ces trois enzymes, on obtient un certains nombres de
morceaux differents. C'est pour cela que l'on obtient des fragments d'intensités différentes
car ils n'ont le même taille-poid.
6) Précisez le sens de transcriptin du locus du gêne de L'AMH?
Pour préciser le sens de transcription du locus du gêne de l'AMH, on utilise les gels
effectués avec des sondes qui marquent le début ou la fin de l'ADNc de l'AMH. L'ADNc
a été digéré par EcoRI ou Hind III ou les deux.
Après digestion par Hind III, on observe que la sonde "début" marque un fragment
d'ADN d'environ 20 Kb, alors que la sonde "fin" marque un fragment d'environ 3.5 Kb.
Lorsque l'on compare ces résultats à la carte de réstriction page 37, on remarque que le
fragment de 3.5 Kb correspond au segment comprenant une grande partie du gêne de
l'AMH entre les deux sites de restriction Hind III. Le fragment "début" de 20 Kb
correspond quand a lui au segment situé a "gauche" du gêne comprenant une partie du
gêne de l'AMH et une majeure partie du vecteur. On peut donc ainsi situé le début et la

fin de l'ADNc de l'AMH, le début etant a gauche et la fin a droite, le sens de transcription
est donc de la gauche vers la droite.
7) Quel fragment de restriction doit-on cloner pour isoler le promoteur du gène de
l'AMH?
Pour isoler le promoteur du gêne, il nous faut prélever la région précedent le début de
l'ADNc de l'AMH. Pour ce faire on peut utiliser la digestion par les enzymes Eco R1 +
Hind III et prélever le fragment de 5.5 kB précedant le début de L'ADNc de l'AMH.