Transformation - Transfection

Transformation - Transfection – Ciblage
I.
Transfert de l’ADN à cloner dans la cellule hôte
 La plupart des cellules ne sont pas naturellement aptes à capter de l’ADN étranger : nécessité de
perturber la membrane pour permettre la capture
- Pour de l’ADN non phagique :
o Si la cellule hôte est une bactérie, on parle de transformation bactérienne
o Si la cellule hôte est une cellule eucaryote, on parle de transfection
- Lorsque l’on utilise des phages ou des virus, on parle d’infection
A) Techniques de transformation
-
1) Agents chimiques
CaCl2
PEG (polyethylène glycol) + DMSO
Agents chaotropes
↘
→
+ choc thermique
2) Electroporation
Les bactéries sont exposées à des champs électriques intenses
 Perméabilisation de la membrane, utilisée pour des bactéries difficiles à transformer ; bonne efficacité
Remarque sur la transformation d’E. coli :
-
Une petite proportion de cellules devient compétentes
1 : 10 000 molécules d’ADN circulaires sont captées par la cellule
1 : 100 000 molécules d’ADN linéaires sont captées
Des plasmides supérieurs à 10kb entrent difficilement dans la cellule
B) Infection phagique de bactéries
-
Les phages infectent naturellement leurs bactéries hôtes avec une bonne efficacité
Efficacité 1000 fois supérieure à l’efficacité obtenue avec des composés chimiques
Ex :
o Transformation de E. coli avec de l’Adn phagique en utilisant CaCl2 : 105 pfu / µg d’ADN
o Infection avec le même ADN véhiculé par un phage : 108 pfu / µg d’ADN
(pfu = plaque forming unit)
C) Transfection des cellules eucaryotes
-
Méthode au phosphate de calcium
Liposomes
Electroporation
Vecteurs non-viraux : PEI, lipofectamine
Microinjection
Vecteurs viraux
(cf. cours thérapie génique – animaux transgéniques)
II.
Criblage
Exemple d’une transformation bactérienne
 Vecteur vide + vecteur recombiné (avec insert d’ADN) → Transformation → Obtention de plusieurs types
de colonies :
- Colonies n’ayant pas incorporé l’ADN (vecteur vide)
- Colonies ayant incorporé le vecteur recombiné
→
seules colonies intéressantes
- Colonies n’ayant incorporé aucun vecteur
A) Criblage utilisant la résistance aux antibiotiques
Exemple du plasmide de clonage pBR322 :
 Clivage par BamH1 → insertion d’un fragment d’ADN → Transformation
Criblage par antibiotiques :
- Plateau traité par l’ampiciline → Transfert → Incubation plusieurs heures à 37°C
 Par différence on trouve avec le plasmide recombiné
B) Criblage sur la couleur des colonies blanc / bleu
Ex : vecteurs pUC et dérivés
 Gène lac Z’ : code partie NH2 terminale de la β-galactosidase
- Propriété de la β-galactosidase :
o Partie N-terminale inactive : codée par lac Z’ (plasmide pUC)
o Partie C-terminale inactive : codée par le gène lac ZΔM15 (génome de la cellule hôte)
o Association des deux parties active = α-complémentation
- Mise en évidence de l’activité β-galactosidase → substrat chromogène
 X-gal (incolore) → β-galactosidase → produit bleu
- Utilisation du système lac Z’ / X-gal : insertion, transformation, étalement des bactéries → colonies
bleues (-) et blanches (+) (utilisation d’un substrat chromogène : Xgal → 5-bromo 4-chloro 3-indoyl βD-galactoside)
C) Criblage par utilisation d’une sonde marquée radioactive
 Hybridation sur colonie
- Sonde : oligonucléotide simple brin de taille supérieur à 20 nucléotides, marqué, de séquence
complémentaire à la séquence recherchée
 Réalisation d’une copie à l’aide de velours fixé sur un système → Transfert des colonies sur un support de
nitrocellulose → Hybridation → Autoradiographie
- Origine de la sonde :
o Partie du gène même
o Orthologue d’une autre espèce
o Oligonucleotide synthétique
D) Criblage par PCR
Principe :
-
Design d’amorces de part et d’autre de la région de clonage
-
PCR
Migration sur gel d’agarose
Détermination de la taille de l’amplimètre
Le criblage par PCR peut se faire :
-
Directement sur des colonies bactériennes prélevées sur la boîte de Pétri et lysées (cf. TP
Biotechnologie)
Après extraction et purification du plasmide des colonies bactériennes à tester
E) Criblage par anticorps (radioactivité ou immunocytochimie)
-
-
Si l’on souhaite tester l’expression de la protéine codée par le gène cloné :
o Utilisation d’anticorps spécifiques de la protéine recherchée
o Utilisation d’anticorps reconnaissant les étiquettes présentes sur la protéine recombinante
Les étapes du criblage par anticorps :
o Transformation
o Transfert des colonies sur un plateau de réplication, lyse bactérienne pour exposer les
protéines
o Transfert des protéines sur une feuille de nitrocellulose
o Addition d’anticorps radiomarqués spécifiques des protéines d’intérêt
o Autoradiographie