Electrophorèse capillaire
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Electrophorèse capillaire L’électrophorèse capillaire se définit comme une technique de séparation electrophoretique effectuée dans un tube de diamètre interne < à 100 m , rempli d’un milieu électrolyte. Cette nouvelle technique permet la séparation rapide de molécule très variée, avec une grande résolution. Au cours de ce TP, nous avons mis en pratique l’electrophorese capillaire en solution libre FSCE But : Analyse des ions de faible poids moléculaire contenu dans divers produits alimentaires dont l’eau.( Cl- , NO2- , NO3- , SO42- ) , séparés en fonction de leur charge dans un électrolyte aqueux. Principe : La séparation des molécules se fait par leur propre mobilité electrophoretique sur laquelle vient s’ajouter le flux electro-osmotique, plus ou moins important , engendre par le capillaire de silice qui attire les charges positives de l’électrolyte. En effet, les molécules sont soumises à 2 flux : Le flux électrophorétique qui entraîne les cations vers la cathode et les anions vers l’anode : Dans une solution on a deux types de molécules : les neutres et les chargées. Les molécules neutres ne sont pas concernées par ce phénomène. En revanche, les molécules chargées lorsqu’elles sont soumises à un champs électrique se déplacent à une vitesse caractéristique constante qui est fonction de leur taille et de leur charge. Le flux éléctro-osmotique : c’est un phénomène particulier au capillaire de silice, en effet les groupements Silanol sont très acide et donnent facilement S-O-, ce qui donne une charge interne négative. Dans le tampon on a des molécules chargées positivement, celles-ci vont venir s’adsorber à la paroi interne , et lorsqu’on impose un courant dans le capillaire « la gaine positive » va être entraînée vers la cathode. Cette migration crée un flux que l’on peut assimiler à un courant ou à «un tapis roulant ». Ce flux s’applique à toutes les molécules, qu’elles soient chargées ou non. La somme de ces deux phénomènes va donner la vitesse caractéristique de la molécule étudiée. On a : Vitesse de migration = Vitesse électrophorétique + Vitesse électro-osmotique. La migration se fait dans un capillaire constitué de polymères de silicate d’un diamètre inférieur à 100 m (ici 50 m). Il est rempli d’une solution tampon ; on injecte à l’anode et on détecte à la cathode. On applique une tension aux bornes du capillaire et le déplacement des espèces est régi par les deux phénomènes que sont l’électromigration et l’électro-osmose. En règle générale, la migration se fait de l’anode à la cathode quel que soit le pH. 1 En effet soit Ve la vitesse electrphorétique du soluté et V0 la vitesse du flux electroosmotique. A pH faible : - + + A pH fort V0 - Ve + - Vo>Ve donc la migration se fait de l’anode vers la cathode. D’après ces 2 schémas on remarque bien que la migration du soluté se fasse de l’anode vers la cathode indépendamment du pH. La limite à cette technique est qu’elle ne détecte pas les molécules neutres. Sur les types d’appareils utilisés lors du TP, la détection se fait par spectrophotométrie (Uv-visible). La mesure s’effectue directement à travers le capillaire de silice dénudé de sa gaine flexible. Il est utilisé comme cellule de détection avec un trajet optique de l’ordre de 50µm. Les spectres obtenus s’expliquent par une diminution de l’absorbance du chromophore contenue dans le tampon lors du passage de l’ion devant le faisceau et le signal apparaîtra dérivé sur la gauche. L’appareillage : Capillaire DETECTEUR Electrodes Enregistreur Tampon Echantillons 2 Dosage des ions Cl- , NO2- , NO3- , SO42Matériel : -Un injecteur -Un générateur -Un détecteur -Un enregistreur -Capillaire de silice -Sonicateur Et le matériel traditionnel de laboratoire. Pour les solutions : -Du nitrate de sodium -Du nitrite de sodium -Du chlorure de sodium -Du sulfatede sodium -Du tampon d’analyse -De l’eau milliQ -De la soude à 1 et 0.1N. Le tampon d’analyse est un tampon pour anions inorganiques -Le bichromate de potassium joue le rôle de chromophore -Le diéthylénetriamine joue le rôle d’inverseur de flux. -De pH compris entre 7 et 8. Méthode Au niveau de l’appareil. Le prélavage : Avant toutes manipulations : -2 min NaOH 1M -2 min NaOH 0.1M -2 min H2O milliQ -2 min tampon d’analyse La tension Fixée à – 15Kv. En effet nous analysons des ions chargés négativement, si on laisse une tension positive , les ions vont migrer naturellement de la cathode vers l’anode alors que nous les injectons à l’anode . Il faut donc inverser la polarité des éléctrodes pour que les ions soient détectés. Détection Injection Détection Injection 3 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ++++++++++++++ Ve ++++++++++++++ Vo - + Vo ++++++++++++++ - - - - - - - - - - - - +15kV + Ve ++++++++++++++ - - - - - - - - - - - - -15kV A cela il faut rajouter un inverseur de flux pour que le flux électro-osmotique soit dirigé dans le même sens de migration que le flux électrophorétique. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - +++++++++++++++++++++ Ve + Vo +++++++++++++++++++++ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - La longueur d’onde : Elle est fixée à 265 nm car c’est la max du chromophore du tampon d’analyse. Préparation des solutions On veut un mélange de 50ppm des 4 ions soit 50mg.l-1 On prépare des solutions mères de chaque ions à 2000 ppm que l’on diluera à 200 ppm pour faciliter la pesée. Pour cela, on utilise des fioles jaugées de 50ml. On veut 2000 mg 1000 ml ?x 50ml x = 50 * 2000/1000 = 100 mg soit 0.1 g de chaque ions dans 50 ml d’eau milliQ. Ensuite on réalise une dilution au 10éme de chaque solution. Pour cela on utilise les fioles de 20ml. On veut une concentration finale de 200 ppm. Dans un volume final de 20 ml.. A partir d’une concentration initiale de 2000 ppm. CiVi = CfVf Vi = 200 * 20/2000= 2 ml 4 Donc on prend 2 ml de chaque solution dans 20 ml. Ensuite on réalise le mélange volume à volume de chaque ions de façon à les avoir en concentration = 50 ppm. Ci = 200 ppm Cf = 50 ppm Vf = 1 ml Vi = 0.25 ml Soit 250 ml de chaque ions pour un volume final de 1 ml. De ce melange on fait ensuite les dilutions à 40 , 30 , 20 10 ppm [ ] mére ( ppm ) 50 50 50 50 [ ] finale ( ppm ) 40 30 20 10 Vol finale ( ml ) 1 1 1 1 Vol init (ml ) 0.8 0.6 0.4 0.2 Il faut donc préparer 3 fois plus de solution mére à 50 ppm. ( pour les dilutions et l’échantillon à analyser.) Analyse : Il faut d’abord rechercher la meilleure amplification des spectres. Pour cela, on reste à 10 ppm et on fait varier la tension , la et nous doublons voir triplons les manipulations pour observer les temps moyens d’analyse et de détection. On ajuste aussi la meilleure vitesse, la meilleure tension et la meilleure . Ensuite on analyse les différents échantillons afin d’obtenir une courbe étalon. Résultats : Nos résultats vont être exprimés sous forme de courbes que nous allons analyser. Afin d’affiner les réglages et d’optimiser la reproductibilité, nous prenons l’échantillon à 10ppm et nous réalisons une série de trois courbes sur lesquelles nous regardons les temps de détection dans les conditions ci-dessus. D’après la première courbe, le temps de détection est de 30sec. Nous obtenons Rise 0.5 Range 0.01 Tension –15Kv Intensité 17 µA 265 nm 10 ppm 5 sensiblement les mêmes résultats avec les deux suivantes, donc avec ces paramètres la méthode est reproductible. La série suivante de courbes nous ont permis d’observer le résultat de la variation d’un des paramètres : -Tension –15Kv –20Kv Nous observons une diminution des pics due à l’augmentation de la vitesse de passage devant le détecteur ; -Longueur d’onde 265-220nm ; 265nm correspond au max du chromophore du tampon d’analyse. en diminuant cette longueur d’onde à 220nm nous observons des pics différents pour le nitrite et le nitrate, en effet tous les deux absorbent à 220nm et donnent donc des pics d’absorption (inverses aux autres). 6 les réglages étant terminés nous pouvons procéder à l’analyse de nos différents échantillons, qui nous permettrons d’établir une courbe étalon pour chacun. ClNO2NO3SO4²- hauteur des pics Courbes étalons 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 ppm Maintenant nous pouvons par comparaison étudier des échantillons comme par exemple de l’eau du robinet : On constate ainsi , une absence normale de Nitrite et par extrapolation avec la courbe étalon établir les concentrations en ions. 7 Conclusion : L’électrophorése capillaire permet de séparer des anions et des cations avec de faibles concentrations en échantillons. Elle est très utilisée pour connaître la composition en ions , de solution comme le vin ou l’eau. Son facteur limitant est qu’elle ne détecte pas les molécules neutres. 8
