Organisme bénéficiaire : Université Victor Segalen Bordeaux 2 (UB2) Unité ayant effectué les travaux: Laboratoire de Physiologie Cellulaire Respiratoire Adresse : 146 rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux Cedex Responsables des travaux : Roger Marthan Date : 10/09/2005 Tel: 05 57 57 16 94 ; Fax : 05 57 57 16 95 ; e-mail : [email protected] Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les effets des polluants atmosphériques sur les bronches sensibilisées par des allergènes ou exposées à une hypoxie chronique. Molecular and cellular mechanisms involved in pollutantinduced effects in bronchi sensitized by allergens or exposed to chronic hypoxia Programme PRIMEQUAL-PREDIT Rapport de fin de contrat Roger Marthan N° de contrat Ademe : 0262019 Date du contrat : 10 septembre 2002 Durée du contrat : 32 mois Confidentialité : NON Ces travaux font suite au contrat : "Interactions entre polluants atmosphériques et hyperréactivité bronchique et vasculaire pulmonaire : rôle d'affections préexistantes" N° de contrat Ademe : 99 62 035 Résumé L'objectif général de la présente proposition de recherche qui faisait suite au contrat n° 9962035 du programme PRIMEQUAL-PREDIT était d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont impliqués dans les interactions "pollution intérieure" (sensibilisation aux allergènes) – pollution atmosphérique – maladie bronchique préexistante. Le premier objectif spécifique concernait les mécanismes de la sensibilisation aux allergènes. Un aspect majeur de la pollution intérieure est en rapport avec la sensibilisation aux allergènes intérieurs et notamment aux acariens. Cette sensibilisation aux acariens déclenche une réponse de l'organisme médiée par les immunoglobulines de type E (IgE) qui peut s'accompagner du développement d'une hyperréactivité bronchique et d'un asthme. Certains aspects de cette sensibilisation peuvent être reproduits, in vitro, à l'aide de sérum riche en IgE et de solutions d'allergènes majeurs d'acariens. Cette sensibilisation impliquant les mastocytes bronchiques et les enzymes mastocytaires comme la tryptase, l'étude a été focalisée sur les effets de la tryptase sur des bronches humaines isolées. Le second objectif spécifique concernait les effets des polluants atmosphériques précédemment étudiés au laboratoire (ozone et aldéhydes) sur la libération mastocytaire et les effets musculaires de la tryptase. Enfin, le dernier objectif spécifique concernait les mécanismes des interactions entre les effets de l'hypoxie chronique sur les voies aériennes et ceux des polluants atmosphériques avec une attention particulière pour le mécanisme de la modification de sensibilité au calcium de l'appareil contractile. En effet, ces variations de sensibilité au calcium de l'appareil contractile semblent jouer un rôle déterminant dans de nombreuses situations physiologiques ou pathologiques qui s'accompagnent de modifications de la contractilité musculaire lisse. Au cours de la réalisation de ce contrat, l'objectif spécifique n° 1 a été complètement atteint et les résultats ont fait l’objet d'une publication dans le FASEB Journal. Nos résultats indiquent que la tryptase mastocytaire, en agissant sur un récepteur spécifique présent à la surface du muscle bronchique active la sécrétion, par les 2 cellules musculaires, de cytokines (notamment le TGF-1) qui attirent les mastocytes vers ces cellules musculaires lisses (chimiotactisme). Il s'établit ainsi une boucle d'auto-activation dans laquelle les mastocytes, par l'intermédiaire de la tryptase, activent les cellules musculaires lisses qui, en retour, attirent d'autres mastocytes qui pérennisent l'activation des cellules musculaires. L'objectif spécifique n° 2 a été atteint pour un seul des 2 polluants proposés. Nous avons montré que les aldéhydes (acroléine) potentialisent la libération de tryptase par les mastocytes pulmonaires humains isolés. Ainsi, cette famille de polluant pourrait contribuer à induire et maintenir la boucle d'auto-activation décrite dans l'objectif n°1. Ces résultats, qui intègrent la description de la technique de séparation des mastocytes pulmonaires humains, sont en cours de rédaction pour publication. Enfin, si des travaux faisant mention du soutien du contrat ont été conduit sur les effets de l'hypoxie chronique, l'étude du mécanisme de l'effet des polluants (décrit au cours de la réalisation du contrat précédent), objectif spécifique n°3, n'a pas été abordé par manque de temps. Les travaux réalisés au cours de ce contrat ont permis d'identifier certains des éléments permettant un dialogue entre le mastocyte et la cellule musculaire lisse bronchique. Il s'établit une boucle d’auto activation résultante d’une conséquence majeure de la pollution ”intérieure”, la sensibilisation allergénique. Enfin, cette boucle peut également être la cible de la pollution atmosphérique photo oxydante. 3 Summary The general aim of the present proposal that followed the grant n° 9962035 of the PRIMEQUAL PREDIT program was to examine cellular and molecular mechanisms implicated in the interaction between in door pollution (sensitization to allergens) outdoor pollution and pre-existing lung diseases. The first specific objective concerned the molecular mechanisms of airway sensitization to allergen. In previous studies, we found that this sensitization implicated mast cells and mast cells derived enzymes such as tryptase. The objective was thus to examine the effect of tryptase in human airway smooth muscle. The second specific objective concerned the effect of pollutants previously investigated in the laboratory (ozone and aldehydes) on mast cell release of tryptase. The third specific objective concerned the interaction between chronic hypoxia and the effect of pollutant with special attention to the calcium sensitivity of the contractile apparatus of airway smooth muscle. At completion of the proposal, specific objective n° 1 has been fully achieved. We have shown that tryptase, via its specific receptor PAR-2 located at the site of the human airway smooth muscle cell, causes smooth muscle secretion of cytokines including TGF- leading to mast cell chemotaxis and further tryptase release thus generating an auto activation loop. These results have been published in an article in the FASEB Journal. The specific objective n° 2 has been achieved for only one of the 2 proposed pollutants. We have shown that aldehydes (i.e., acrolein) potentiate release of tryptase by purified human lung mast cells. As a consequence, these pollutants may re-enforce the auto-activation loop described above. The results that include the technical aspect of human lung mast cell isolation are being submitted for publication. Finally, although studies acknowledging the present grant have been published in the field of chronic hypoxia, the mechanism of the effect of pollutants under such conditions has not yet been investigated because of lack of time. 4 Sommaire Liste des publications issues du contrat Rapport I. Rappel des objectifs II. Méthodes III. Résultats IV. Discussion V. Références Conclusion Annexe : Tirés – à - part des articles 5 Publications faisant mention du soutien du contrat Articles originaux 1. Berger P, Girodet PO, Begueret H, Ousova O, Perng DW, Marthan R, Walls AF, Tunon de Lara JM. Tryptase-stimulated human airway smooth muscle cells induce cytokine synthesis and mast cell chemotaxis. FASEB Journal. 2003, 14:2139-41 2 Ouedraogo N, Marthan R, Roux E. The effects of propofol and etomidate on airway contractility in chronically hypoxic rats. Anesthesia Analgesia. 2003, 96:1035-41. 3. Pauvert O, Bonnet S, Rousseau E, Marthan R, Savineau JP. Sildenafil alters calcium signaling and vascular tone in pulmonary arteries from chronically hypoxic rats. American Journal of Physiology: Lung Cell Mol Physiol. 2004, 287: L577-83. 4 Nouette-Gaulain K, Malgat M, Rocher C, Savineau JP, Marthan R, Mazat JP, Sztark F. Time course of differential mitochondrial energy metabolism adaptation to chronic hypoxia in right and left ventricles. Cardiovascular Research 2005, 66:132-40. Chapitre d'ouvrage 1. Savineau JP, Guibert C, Marthan R. Agonist-mediated regulation of Ca2+ transients in pulmonary arterial smooth muscle cells In Ion channels in the pulmonary vasculature Ed J XJ Yuan, Lung Biology in Health and disease Volume 197, Taylor and Francis, USA, 2005 pp167-184 6 Rapport I. Rappels des objectifs L'objectif général de la présente proposition de recherche qui faisait suite au contrat n° 9962035 du programme PRIMEQUAL-PREDIT est d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont impliqués dans les interactions "pollution intérieure" (sensibilisation aux allergènes) – pollution atmosphérique – maladie bronchique préexistante. Le premier objectif spécifique concerne les mécanismes de la sensibilisation aux allergènes. Un aspect majeur de la pollution intérieure est en rapport avec la sensibilisation aux allergènes intérieurs et notamment aux acariens. Cette sensibilisation aux acariens déclenche une réponse de l'organisme médiée par les immunoglobulines de type E (IgE) qui peut s'accompagner du développement d'une hyperréactivité bronchique et d'un asthme. Certains aspects de cette sensibilisation peuvent être reproduits in vitro à l'aide de sérum riche en IgE et de solutions d'allergènes majeurs d'acariens. Cette sensibilisation impliquant les mastocytes bronchiques et les enzymes mastocytaires comme la tryptase, l'étude sera focalisée sur les effets de la tryptase sur des bronches humaines isolées. Le second objectif spécifique concerne les effets des polluants atmosphériques précédemment étudiés au laboratoire (ozone et aldéhydes) sur la libération mastocytaire et les effets musculaires de la tryptase. Le dernier objectif spécifique concerne les mécanismes des interactions entre les effets de l'hypoxie chronique sur les voies aériennes et ceux des polluants atmosphériques avec une attention particulière pour le mécanisme de la modification de sensibilité au calcium de l'appareil contractile. En effet, ces variations de sensibilité au calcium de l'appareil contractile semblent jouer un rôle déterminant dans de nombreuses situations physiologiques ou pathologiques qui s'accompagnent de modifications de la contractilité musculaire lisse. 7 II. Méthodes II.1. Obtention et préparation du tissu pulmonaire humain Les spécimens pulmonaires humains utilisés lors de ces expérimentations proviennent de pièces opératoires de pneumectomies ou de lobectomies pratiquées en général pour carcinome bronchique primitif. Les spécimens sélectionnés proviennent de patients dont la fonction ventilatoire est les limites de la normale. Immédiatement après exérèse, les pièces collectées au bloc opératoire de Chirurgie Thoracique sont transportées au laboratoire dans une solution physiologique de type Krebs-Henseleit (composition en mM: 118.4 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2.2H2O, 1.2 MgSO4.7H2O, 1.2 KH2PO4, 25.0 NaHCO3, 11.1 D-glucose) préalablement refroidie à 4 °C et oxygénée (O2 = 95 % ; CO2 = 5 %). Pour chaque spécimen pulmonaire, les bronches proximales (diamètre interne de 3 à 5 mm, 3 ème à 5ème génération bronchique), et distales (diamètre interne de 0.5 à 1 mm, 7ème à 9ème génération bronchique) sont disséquées à partir d'une zone macroscopiquement saine, débarrassées du parenchyme pulmonaire. Selon la technique expérimentale, les bronches sont découpées de façon radiaire en fragments de 2/2 mm, pour l'étude immunohistochimique ; découpées en anneaux d'environ 3 à 5 mm de long, pour étude de la contraction isométrique, l'étude microspectrofluorimétrique ou la culture cellulaire. Deux techniques permettant l'obtention de cellules musculaires lisses bronchiques humaines sont utilisées : la culture cellulaire et la dissociation enzymatique de cellules musculaires lisses fraîchement isolées. Pour la dissociation cellulaire, la bronche humaine est placée dans une solution saline physiologique (PSS, acronyme de Physiological Saline Solution) de dissection (composition en mM: 130.0 NaCl, 5.6 KCl, 10.0 Hepes, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 11.0 D-glucose). Sous loupe binoculaire, les bandes musculaires sont prélevées, débarrassées de l'épithélium et découpées en petits rectangles d'environ 2 mm2. Le tissu musculaire ainsi préparé est incubé 10 minutes dans du PSS de dissociation (composition en mM: 130.0 NaCl, 5.6 KCl, 10.0 Hepes, 0.0 CaCl2, 0.0 MgCl2, 11.0 D-glucose). Les tissus sont ensuite soumis à une incubation enzymatique de 14 h à 4°C dans 2 ml de PSS de dissociation contenant 500 µg.ml-1 de collagénase type I (377 U/mg), 350 g.ml-1 de g.ml pronase, et 31.25 -1 d'élastase type III ainsi que 1 mg/ml de l'inhibiteur SBTI. A l'issue de la digestion enzymatique, le tissu est remis en suspension dans du PSS de dissociation et les cellules sont dispersées mécaniquement. Les cellules ainsi isolées sont concentrées par centrifugation (120g, 5 min). Pour la culture de cellules musculaires lisses des voies aériennes, une bronche proximale (3 à 5 mm de diamètre) est prélevée dans des conditions d'asepsie, placée dans un milieu de culture (DMEM, GibcoBRL). Chaque faisceau de muscle lisse est disséqué à l'aide de micro-ciseaux chirurgicaux et découpé en petits fragments de 2 à 3 mm 2 placés dans des puits d'un plateau de culture à 6 puits. Les fragments sont recouvert de DMEM supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (Gibco-BRL), 1 % d'acides aminés non essentiels (Sigma), 2 mM de L-glutamine (Gibco-BRL), 1 mM de pyruvate de sodium (Sigma) et 1 % d'une solution antibiotique/antimycotique (Gibco-BRL) contenant de la pénicilline (50 U/ml), streptomycine (50 mg/ml) et g/ml). Le milieu de culture est changé toutes les 4872 h. La viabilité des cellules est appréciée quotidiennement. Après 8-10 semaines de culture, les cellules confluentes sont trypsinisées (trypsin-EDTA, Gibco-BRL) pour un premier passage et incubées dans des flacons de culture (75 cm 2). Après 1-2 semaines, les cellules de nouveau confluentes, sont trypsinisées pour un deuxième passage, et scindées sur différents supports : des flacons de culture (75 cm2) pour croissance cellulaire ; des plateaux à 96 puits pour l'étude de la prolifération cellulaire ; des plateaux à 24 puits pour l'étude de la synthèse de cytokines. Seuls les passages 2 à 5 sont étudiés. La pureté de la population cellulaire en culture est estimée pour chaque passage par immunofluorescence. La séparation des mastocytes pulmonaires humains est obtenue à partir de la digestion enzymatique de parenchyme pulmonaire suivie d'une dispersion mécanique à la seringue et de nombreuses étapes de filtration à l’aide de membranes de nylon de maillages différents afin d’obtenir une suspension cellulaire hétérogène contenant des mastocytes. La séparation utilise des billes magnétiques détachables préalablement couplées à un anticorps anti-CD117. Les mastocytes sont ensuite détachés des billes grâce à une DNase. Les prélèvements biopsiques sont obtenus chez des patients suivis au sein du pôle cardio-thoracique du CHU de Bordeaux. Le médecin investigateur recueille les données démographiques, évalue le contrôle de l’asthme grâce à un questionnaire validé et fait pratiquer une exploration fonctionnelle respiratoire. La fibroscopie est réalisée sous anesthésie locale selon les recommandations internationales. Des biopsies sont fixées dans l’acétone + inhibiteurs 8 de protéases (PMSF, iodacétamide) pour l’immunohistochimie, ou dans le glutaraldéhyde pour la microscopie électronique. Certaines biopsies seront gardées à l’état frais pour la culture cellulaire et d’autres congelées à –80 °C pour la biologie moléculaire. Enfin, la purification de la tryptase pulmonaire est réalisée à partir d'extraits de tissus pulmonaires. Dans un premier temps, une série d'extractions en milieu hyposodé (0.15 M) est effectuée. A ce stade la tryptase et la chymase sont liées aux proteoglycans et sont donc insolubles. Puis une série d'extractions en milieu hypersodé (2 M) est réalisée. On utilise ensuite les propriétés d'affinité de la tryptase pour l'héparine. Après filtration m) et dialyse, une chromatographie sur colonne d'héparineagarose (pore 0.45 permet de lier la tryptase en milieu hyposodé (0.4 M), mais aussi la chymase à ce stade. L'élution de ces protéases est effectuée par le fractionnement d'un nouveau passage pourvu d'un gradient sodique entre 0.4 et 2 M sur cette même colonne de chromatographie. Après sélection des fractions ayant une activité enzymatique tryptique sans activité chymotryptique, une sélection supplémentaire de la tryptase est effectuée soit par une deuxième chromatographie sur héparineagarose, soit préférentiellement par une nouvelle chromatographie à vitesse lente (0.15 ml/min) sur colonne de benzamidine-agarose (Sigma). Une dernière chromatographie sur gel de filtration (Sephacryl S-300) est alors réalisée permettant la collection d'une trentaine de fractions de 5 ml après éviction d'un volume initial de 130 ml. En parallèle, la concentration de protéine dans les échantillons est mesurée par l'étude de l'absorbance à 280 nm par spectrophotométrie. En effet, l'absorbance à 280 nm d'un échantillon de 1 mg/ml est de 2.80. La relation est en fait pratiquement linéaire entre densité optique et concentration protéique. La tryptase ainsi purifiée est concentrée dans un volume total inférieur à 1 ml pour une conservation à -80 C. II.2. Techniques utilisées Quantification des transcrits de cytokines et molécules d’adhésion exprimés par les CML et les mastocytes par RT-PCR quantitative en temps réel. Analyse des protéines exprimées par les CML et les mastocytes par ELISA (R&D), Western Blot, cytométrie en flux (Dako Galaxy). Etude du chimiotactisme des mastocytes en chambre de Boyden. Evaluation de l’adhésion des mastocytes aux CML bronchiques après incorporation de thymidine tritiée (ICN) par compteur . II.3. Exposition aux polluants gazeux Une famille de polluants a été étudiées : les aldéhydes (acroléine) dans la mesure où nous disposons d'informations dosimétriques sur ces polluants. Dans la mesure où l'acroléine est utilisable en solution aqueuse l'exposition a été réalisée directement sur cellules. L'acroléine peut être utilisée à des concentrations variables, de l'ordre du µM pendant des temps d'exposition variables de l'ordre de 20 à 60 min avant d'être rincée. 9 III. Résultats III.1. Résultats objectif n°1 Ce paragraphe a pour objet de résumer ce qui a été mis en évidence dans le cadre de cet objectif n° 1 c'est-à-dire l'étude des effets de la tryptase sur des bronches humaines isolées pour comprendre les mécanismes de la sensibilisation qui impliquent les mastocytes bronchiques et les enzymes mastocytaires comme la tryptase. L'ensemble des résultats est présenté dans l'article n°1 joint en annexe. Des travaux précedents conduits au laboratoire avait montré que la tryptase mastocytaire (i) active la signalisation calcique des cellules musculaires lisses bronchiques humaines i.e., contracte le muscle lisse et (ii) favorise sa prolifération. Dans le cadre de la réalisation du présent contrat, nous avons montré que la tryptase libérée par les mastocytes active la sécrétion, par les cellules musculaires lisses de cytokines (notamment le TGF-1) qui attirent les mastocytes vers ces cellules musculaires lisses (chimiotactisme). Il s'établit ainsi une boucle d'autoactivation dans laquelle les mastocytes par l'intermédiaire de la tryptase, activent les cellules musculaires lisses qui, en retour, attirent d'autres mastocytes qui pérennisent l'activation des cellules musculaires lisses etc… Cette boucle d'activation, qui pourrait donc contribuer à la sensibilisation bronchique par les allergènes, est représentée ci-après. 10 Figure 1 Effet de la tryptase sur les bronches humaines isolées III.2. Résultats objectif n°2 La figure 2 montre le principe de l’obtention d’une suspension de mastocytes pulmonaires humains obtenus par dispersion enzymatique et purification par bille magnétique à partir de fragments de spécimens pulmonaires humain. - Billes magnétiques - Ac anti-CD117 - Dispersion cellulaire Figure 2 Principe de la séparation des mastocytes par billes 11 La figure 3 montre le résultat de ce type de séparation Mastocytes sans billes x 20 x 40 Figure 3 Mastocytes humains isolés (grossissement x20 et X40) La libération de tryptase par ces mastocytes a été analysée en réponse à une stimulation spécifique par anti-IgE. Cette libération a été exprimée, d’une part, en terme d’activité enzymatique (en mU/mol) et, d’autre part, en pourcentage de libération maximale induite par une stimulation non spécifique maximale par un ionophore calcique (A 23 187, 1 µM). L’incubation des mastocytes isolés en présence d’acroléine, dans des conditions expérimentales optimales préalablement déterminées au laboratoire pour d’autres cellules isolées pulmonaires (Roux et al., 1999) i.e., 0,3 µM pendant 10 minutes, potentialise la libération de tryptase (Figure 4). L’augmentation de la libération de tryptase atteint environ 45% à la fois en terme d’activité enzymatique et en terme de pourcentage de libération par rapport au A 23187. 12 Activité tryptase (mU/ml) Activité tryptase (% de l’activité max avec A23187 150 100 50 0 5 4 3 2 1 0 -5,5 -5,5 -5 -4,5 -4 -3,5 -3 Anti-IgE (log) -5 -4,5 -4 -3,5 Anti-IgE (log) -3 Acroléine (-) Acroléine (+ 0.3µm 10min) Figure 4 Potentialisation par l'acroléine de la libération de tryptase Ces résultats indiquent que l’acroléine potentialise la libération de tryptase mastocytaire donc, que cet effet pourrait contribuer à renforcer la boucle d’auto activation décrite en réponse à l’objectif 1. Ce résultat pourrait donc rendre compte de l’effet additif polluant atmosphérique - sensibilisation aux allergènes (Figure 5). Polluants (aldéhydes, PD…) activation mastocytes Tryptase sécrétion PAR-2 prolifération contraction Figure 5 Potentialisation de l'activation mastocytaire par les polluants 13 III.3 - Résultats – Objectif n° 3 Nous avons conduit plusieurs études pour approfondir la compréhension des effets de l’hypoxie chronique sur les voies aériennes et la circulation pulmonaire. Les résultats obtenus sont détaillés dans les articles joints en annexe. Les principaux résultats ont été les suivants : L’hypoxie chronique ne modifie pas l’effet relaxant bronchique induit par les anesthésiques intra veineux (article n° 2). Les effets de l’hypoxie chronique sur le circulation pulmonaire sont modifiés par un inhibiteur de phosphodiestérase de type 5 (PDE 5) le sildenafil (article n°3). Enfin, l’hypoxie chronique diminue le métabolisme mitochondrial au niveau du cœur, mais cet effet est retardé dans le ventricule droit par rapport au ventricule gauche, du fait de l’hypertrophie compensatrice du ventricule droit (article n°4). L’étude du mécanisme de l’effet des polluants atmosphériques sur les conséquences de l’hypoxie chronique n’a cependant pas encore été conduite par faute de temps. 14 IV – Discussion De nombreux travaux épidémiologiques ont mis en évidence le rôle de l’environnement dans la morbidité et la mortalité d’origine respiratoire (1, 2). En particulier, il existe un lien étroit entre environnement et pathologie respiratoire immuno-allergique (3). L’augmentation de la prévalence de l’allergie est constante en France depuis plusieurs années, de l’ordre de 25% tous les 10 ans. De plus, des maladies allergiques sont responsables d’importantes dépenses de santé non seulement en raison de leur fréquence mais également à cause du fort retentissement socio-économique des formes les plus sévères de ces maladies souvent mal équilibrées. L’asthme est la principale maladie allergique respiratoire dont la prévalence est, en France, d’environ 6% chez l’adulte et 10% chez l’enfant (4). L'asthme se caractérise par une inflammation des bronches associée à une hyperréactivité bronchique, c'està-dire une réponse contractile “excessive”, “démesurée” à la stimulation des voies aériennes par rapport à celle des sujets normaux. Les mécanismes responsables de la maladie asthmatique ont fait l’objet de très nombreuses études mais restent encore très incomplètement élucidés. En effet, l’origine immuno-allergique de l’asthme repose sur l’hypothèse classique faisant intervenir l’orientation de la réponse lymphocytaire auxiliaire vers une réponse de type Th2 au détriment d’une réponse Th1. La production de cytokines de type Th2 initie, d'une part, et entretient, d'autre part la réaction inflammatoire intervenant au sein de l’arbre bronchique des patients asthmatiques. Cette hypothèse a été récemment modifiée par la découverte de différentes populations lymphocytaires T régulatrices (Tr1, Th3, Treg) dont le rôle est probablement déterminant (5, 6). En effet, des observations récentes montrent que des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+ peuvent inhiber la prolifération de lymphocytes T spécifiques de l’allergène ainsi que la production de cytokines Th2 alors que cette sous population lymphocytaire est déficiente chez le sujet allergique (7). Quelle que soit l’hypothèse considérée, il est désormais établi que les conditions environnementales associées à la pollution extérieure (”atmosphérique”, particulaire et non particulaire) et la pollution intérieure (chimique, infectieuse et surtout allergénique) favorise la production de cytokine de type Th2 aboutissant, in fine, à l’inflammation, support de l’hyperréactivité bronchique. De plus, l’exposition chronique à l’allergène pourrait induire des lésions de remodelage bronchique (8). 15 En effet, il est bien démontré que l’inflammation bronchique peut conduire à un phénomène de remodelage, c'est-à-dire un processus anormal de réparation contribuant à la genèse de lésions peu sensibles au traitement, voire irréversibles (8). Le remodelage bronchique est caractérisé par des lésions épithéliales, un dépôt de matériel collagène sous la membrane basale, une altération des glandes sousmuqueuses, une modification de la matrice extra-cellulaire et une hypertrophie du muscle lisse bronchique (9). Le rôle de l’environnement sur cet aspect fondamental de la physiopathologie de l’asthme reste encore méconnu. Dans l’asthme allergique résultant d’une sensibilisation aux aéro-allergènes, une série de travaux récents insistent sur l’importance particulière de l’infiltration mastocytaire au sein de la couche musculaire lisse de la paroi bronchique (10-15). Dans ce contexte nous avons étudié (objectif n°1) les mécanismes de cette infiltration (micro-localisation) qui résulte d’un dialogue qui s’établit au cours de la sensibilisation entre le mastocyte et la cellule musculaire lisse aboutissant à la constitution d’une boucle d’auto activation (11). Cette boucle est responsable de l’activation de la cellule musculaire lisse conduisant à la bronchoconstriction (16) et à la prolifération musculaire lisse (17, 18) qui contribue au remodelage bronchique. Elle participe à la production locale de cytokines qui contribuent à l’infiltration inflammatoire (12, 19). Cette boucle d’auto activation résultante d’une conséquence majeure de la pollution ”intérieure”, la sensibilisation allergénique, peut également être la cible de la pollution atmosphérique photo oxydante (20). Dans ce contexte nous avons montré (objectif n° 2) qu'un aldéhyde, l'acroléine potentialise la libération de tryptase mastocytaire. Ainsi à la suite des expériences in vitro de sensibilisation de bronches humaines isolée par du sérum de patients asthmatiques allergiques qui ont montré qu’une forte proportion de mastocytes fixant les IgE du serum était localisée au sein de la couche musculaire (27), des travaux sur les bronches de patients spontanément sensiblisés aux aéro-allergènes in vivo examinées in vitro ont également retrouvé une infiltration mastocytaire du muscle lisse bronchique (15). De plus, deux groupes ont clairement récemment démontré que cette infiltration mastocytaire spécifique est retrouvée dans l’asthme. D’une part, Brightling et coll. (13) ont mis en évidence une localisation spécifique de mastocytes dans le muscle lisse de bronches d’asthmatique par 16 comparaison avec des bronches de sujets normaux ou de patients souffrant de bronchite non asthmatique. D’autre part, Caroll et coll. (28) ont également retrouvé cette infiltration mastocytaire dans des bronches d’asthmatiques associée à une dégranulation mastocytaire plus importante chez les patients décédés de leur asthme. Enfin, très récemment, Amin et coll. ont retrouvé une infiltration mastocytaire du muscle lisse bronchique significativement plus importante chez les malades sensibilisés vis à vis des aéroallergènes de leur environnement (10) indiquant là qu’il existe une relation pertinente entre asthme allergique, environnement et remodelage bronchique. Les travaux réalisés au cours de ce contrat ont permit d'identifier certains des éléments permettant un dialogue entre le mastocyte et la cellule musculaire lisse bronchique. D’une part, le mastocyte est une source majeure de tryptase, une protéase neutre dont la concentration est augmentée dans le sérum ou le liquide de lavage broncho-alvéolaire de malades asthmatiques allergiques (29). La tryptase peut agir que les cellules musculaires lisses bronchiques humaines qui expriment un récepteur membranaire spécifiquement activé par la tryptase, le PAR-2 qui appartient à la famille des “proteinase activating recpetor” i.e., des récepteurs dont l’activation dépend d’une protéolyse spécifique (16, 17, 30). La tryptase mastocytaire libérée lors de la dégranulation active le PAR-2 des cellules musculaires pour engendrer contraction, prolifération et sécrétion (16-18, 30, 31). D’autre part, les cytokines secrétés par les cellules musculaires lisses bronchiques peuvent interagir avec des récepteurs spécifiques présents sur les mastocytes pour produire chimiotactisme et adhérence (11, 12, 32). Enfin, il apparaît que les polluants peuvent amplifier ce phénomène. Au toal les objectifs 1 et 2 permettent de conclure que la boucle d’auto activation mastocyte – cellules musculaires lisses impliquant la tryptase résulte d’une conséquence majeure de la pollution ”intérieure”, la sensibilisation allergénique et peut également être la cible de la pollution atmosphérique photo oxydante (20). Enfin, si des travaux faisant mention du soutien du contrat ont été conduit sur les effets de l'hypoxie chronique, l'étude du mécanisme de l'effet des polluants (décrit au cours de la réalisation du contrat précédent), objectif spécifique n°3 n'a pas été abordé par manque de temps. 17 V – Références 1. Burney, P. G., Luczynska, C., Chinn, S., and Jarvis, D. (1994) The European Community Respiratory Health Survey. Eur Respir J 7, 954-960 2. Janson, C., Anto, J., Burney, P., Chinn, S., de Marco, R., Heinrich, J., Jarvis, D., Kuenzli, N., Leynaert, B., Luczynska, C., Neukirch, F., Svanes, C., Sunyer, J., and Wjst, M. (2001) The European Community Respiratory Health Survey: what are the main results so far? European Community Respiratory Health Survey II. Eur Respir J 18, 598-611 3. Burney, P., Malmberg, E., Chinn, S., Jarvis, D., Luczynska, C., and Lai, E. (1997) The distribution of total and specific serum IgE in the European Community Respiratory Health Survey. J Allergy Clin Immunol 99, 314-322 4. Charpin, D., Raherison, C., Dutau, H., and Taytard, A. (2000) [Epidemiology of respiratory allergies: current data]. Rev Mal Respir 17, 139-158 5. Akdis, M., Verhagen, J., Taylor, A., Karamloo, F., Karagiannidis, C., Crameri, R., Thunberg, S., Deniz, G., Valenta, R., Fiebig, H., Kegel, C., Disch, R., Schmidt-Weber, C. B., Blaser, K., and Akdis, C. A. (2004) Immune responses in healthy and allergic individuals are characterized by a fine balance between allergen-specific T regulatory 1 and T helper 2 cells. J Exp Med 199, 1567-1575 6. Roncarolo, M. 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Faseb J 19, 798-800 19 Conclusion Les travaux réalisés au cours de ce contrat ont permis d'identifier certains des éléments permettant un dialogue entre le mastocyte et la cellule musculaire lisse bronchique. Il s'établit une boucle d’auto activation résultante d’une conséquence majeure de la pollution ”intérieure”, la sensibilisation allergénique. Enfin, cette boucle peut également être la cible de la pollution atmosphérique photo oxydante. 20 Annexes : articles Article n° 1 : Berger P, Girodet PO, Begueret H, Ousova O, Perng DW, Marthan R, Walls AF, Tunon de Lara JM. Tryptase-stimulated human airway smooth muscle cells induce cytokine synthesis and mast cell chemotaxis. FASEB Journal. 2003, 14:2139-41 21 Annexes : articles Article n° 2 : Ouedraogo N, Marthan R, Roux E. The effects of propofol and etomidate on airway contractility in chronically hypoxic rats. Anesthesia Analgesia. 2003, 96:1035-41. 22 Annexes : articles Article n° 3 : Pauvert O, Bonnet S, Rousseau E, Marthan R, Savineau JP. Sildenafil alters calcium signaling and vascular tone in pulmonary arteries from chronically hypoxic rats. American Journal of Physiology: Lung Cell Mol Physiol. 2004, 287: L577-83. 23 Annexes : articles Article n° 4 : Nouette-Gaulain K, Malgat M, Rocher C, Savineau JP, Marthan R, Mazat JP, Sztark F. Time course of differential mitochondrial energy metabolism adaptation to chronic hypoxia in right and left ventricles. Cardiovascular Research 2005, 66:132-40. 24 25