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Organisme bénéficiaire : Université Victor Segalen Bordeaux 2 (UB2)
Unité ayant effectué les travaux: Laboratoire de Physiologie Cellulaire Respiratoire
Adresse : 146 rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux Cedex
Responsables des travaux : Roger Marthan
Date : 10/09/2005
Tel: 05 57 57 16 94 ; Fax : 05 57 57 16 95 ; e-mail : [email protected]
Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les
effets des polluants atmosphériques sur les bronches
sensibilisées par des allergènes ou exposées à une
hypoxie chronique.
Molecular and cellular mechanisms involved in pollutantinduced effects in bronchi sensitized by allergens or exposed to
chronic hypoxia
Programme PRIMEQUAL-PREDIT
Rapport de fin de contrat
Roger Marthan
N° de contrat Ademe : 0262019
Date du contrat : 10 septembre 2002
Durée du contrat : 32 mois
Confidentialité : NON
Ces travaux font suite au contrat : "Interactions entre polluants atmosphériques et
hyperréactivité bronchique et vasculaire pulmonaire : rôle d'affections préexistantes"
N° de contrat Ademe : 99 62 035
Résumé
L'objectif général de la présente proposition de recherche qui faisait suite au contrat
n° 9962035 du programme PRIMEQUAL-PREDIT était d'étudier les mécanismes
cellulaires et moléculaires qui sont impliqués dans les interactions "pollution
intérieure"
(sensibilisation aux allergènes) – pollution atmosphérique – maladie
bronchique préexistante.

Le premier objectif spécifique concernait les mécanismes de la sensibilisation
aux allergènes. Un aspect majeur de la pollution intérieure est en rapport avec la
sensibilisation aux allergènes intérieurs et notamment aux acariens. Cette
sensibilisation aux acariens déclenche une réponse de l'organisme médiée par
les immunoglobulines de type E (IgE) qui peut s'accompagner du développement
d'une hyperréactivité bronchique et d'un asthme. Certains aspects de cette
sensibilisation peuvent être reproduits, in vitro, à l'aide de sérum riche en IgE et
de solutions d'allergènes majeurs d'acariens. Cette sensibilisation impliquant les
mastocytes bronchiques et les enzymes mastocytaires comme la tryptase, l'étude
a été focalisée sur les effets de la tryptase sur des bronches humaines isolées.

Le second objectif spécifique concernait les effets des polluants atmosphériques
précédemment étudiés au laboratoire (ozone et aldéhydes) sur la libération
mastocytaire et les effets musculaires de la tryptase.

Enfin, le dernier objectif spécifique concernait les mécanismes des interactions
entre les effets de l'hypoxie chronique sur les voies aériennes et ceux des
polluants atmosphériques avec une attention particulière pour le mécanisme de
la modification de sensibilité au calcium de l'appareil contractile. En effet, ces
variations de sensibilité au calcium de l'appareil contractile semblent jouer un rôle
déterminant dans de nombreuses situations physiologiques ou pathologiques qui
s'accompagnent de modifications de la contractilité musculaire lisse.
Au cours de la réalisation de ce contrat, l'objectif spécifique n° 1 a été complètement
atteint et les résultats ont fait l’objet d'une publication dans le FASEB Journal. Nos
résultats indiquent que la tryptase mastocytaire, en agissant sur un récepteur
spécifique présent à la surface du muscle bronchique active la sécrétion, par les
2
cellules musculaires, de cytokines (notamment le TGF-1) qui attirent les mastocytes
vers ces cellules musculaires lisses (chimiotactisme). Il s'établit ainsi une boucle
d'auto-activation dans laquelle les mastocytes, par l'intermédiaire de la tryptase,
activent les cellules musculaires lisses qui, en retour, attirent d'autres mastocytes qui
pérennisent l'activation des cellules musculaires.
L'objectif spécifique n° 2 a
été atteint pour un seul des 2 polluants proposés.
Nous avons montré que les aldéhydes (acroléine) potentialisent la libération de
tryptase par les mastocytes pulmonaires humains isolés. Ainsi, cette famille de
polluant pourrait contribuer à induire et maintenir la boucle d'auto-activation décrite
dans l'objectif n°1. Ces résultats, qui intègrent la description de la technique de
séparation des mastocytes pulmonaires humains, sont en cours de rédaction pour
publication.
Enfin, si des travaux faisant mention du soutien du contrat ont été conduit sur les
effets de l'hypoxie chronique, l'étude du mécanisme de l'effet des polluants (décrit au
cours de la réalisation du contrat précédent), objectif spécifique n°3, n'a pas été
abordé par manque de temps.
Les travaux réalisés au cours de ce contrat ont permis d'identifier certains des
éléments permettant un dialogue entre le mastocyte et la cellule musculaire lisse
bronchique. Il s'établit une boucle d’auto activation résultante d’une conséquence
majeure de la pollution ”intérieure”, la sensibilisation allergénique. Enfin, cette boucle
peut également être la cible de la pollution atmosphérique photo oxydante.
3
Summary
The general aim of the present proposal that followed the grant n° 9962035 of the
PRIMEQUAL PREDIT program was to examine cellular and molecular mechanisms
implicated in the interaction between in door pollution (sensitization to allergens) outdoor pollution and pre-existing lung diseases.
The first specific objective concerned the molecular mechanisms of airway
sensitization to allergen. In previous studies, we found that this sensitization
implicated mast cells and mast cells derived enzymes such as tryptase. The
objective was thus to examine the effect of tryptase in human airway smooth muscle.
The second specific objective concerned the effect of pollutants previously
investigated in the laboratory (ozone and aldehydes) on mast cell release of tryptase.
The third specific objective concerned the interaction between chronic hypoxia and
the effect of pollutant with special attention to the calcium sensitivity of the contractile
apparatus of airway smooth muscle.
At completion of the proposal, specific objective n° 1 has been fully achieved. We
have shown that tryptase, via its specific receptor PAR-2 located at the site of the
human airway smooth muscle cell, causes smooth muscle secretion of cytokines
including TGF- leading to mast cell chemotaxis and further tryptase release thus
generating an auto activation loop. These results have been published in an article in
the FASEB Journal.
The specific objective n° 2 has been achieved for only one of the 2 proposed
pollutants. We have shown that aldehydes (i.e., acrolein) potentiate release of
tryptase by purified human lung mast cells. As a consequence, these pollutants may
re-enforce the auto-activation loop described above. The results that include the
technical aspect of human lung mast cell isolation are being submitted for
publication.
Finally, although studies acknowledging the present grant have been published in
the field of chronic hypoxia, the mechanism of the effect of pollutants under such
conditions has not yet been investigated because of lack of time.
4
Sommaire
Liste des publications issues du contrat
Rapport
I.
Rappel des objectifs
II.
Méthodes
III.
Résultats
IV.
Discussion
V.
Références
Conclusion
Annexe : Tirés – à - part des articles
5
Publications faisant mention du soutien du contrat
Articles originaux
1. Berger P, Girodet PO, Begueret H, Ousova O, Perng DW, Marthan R, Walls AF,
Tunon de Lara JM.
Tryptase-stimulated human airway smooth muscle cells induce cytokine synthesis
and mast cell chemotaxis.
FASEB Journal. 2003, 14:2139-41
2 Ouedraogo N, Marthan R, Roux E.
The effects of propofol and etomidate on airway contractility in chronically hypoxic
rats.
Anesthesia Analgesia. 2003, 96:1035-41.
3. Pauvert O, Bonnet S, Rousseau E, Marthan R, Savineau JP.
Sildenafil alters calcium signaling and vascular tone in pulmonary arteries from
chronically hypoxic rats.
American Journal of Physiology: Lung Cell Mol Physiol. 2004, 287: L577-83.
4 Nouette-Gaulain K, Malgat M, Rocher C, Savineau JP, Marthan R, Mazat JP,
Sztark F.
Time course of differential mitochondrial energy metabolism adaptation to chronic
hypoxia in right and left ventricles.
Cardiovascular Research 2005, 66:132-40.
Chapitre d'ouvrage
1. Savineau JP, Guibert C, Marthan R.
Agonist-mediated regulation of Ca2+ transients in pulmonary arterial smooth muscle
cells
In Ion channels in the pulmonary vasculature Ed J XJ Yuan, Lung Biology in Health
and disease Volume 197, Taylor and Francis, USA, 2005 pp167-184
6
Rapport
I.
Rappels des objectifs
L'objectif général de la présente proposition de recherche qui faisait suite au contrat
n° 9962035 du programme PRIMEQUAL-PREDIT est d'étudier les mécanismes
cellulaires et moléculaires qui sont impliqués dans les interactions "pollution
intérieure"
(sensibilisation aux allergènes) – pollution atmosphérique – maladie
bronchique préexistante.

Le premier objectif spécifique concerne les mécanismes de la sensibilisation aux
allergènes. Un aspect majeur de la pollution intérieure est en rapport avec la
sensibilisation aux allergènes intérieurs et notamment aux acariens. Cette
sensibilisation aux acariens déclenche une réponse de l'organisme médiée par
les immunoglobulines de type E (IgE) qui peut s'accompagner du développement
d'une hyperréactivité bronchique et d'un asthme. Certains aspects de cette
sensibilisation peuvent être reproduits in vitro à l'aide de sérum riche en IgE et de
solutions d'allergènes majeurs d'acariens. Cette sensibilisation impliquant les
mastocytes bronchiques et les enzymes mastocytaires comme la tryptase, l'étude
sera focalisée sur les effets de la tryptase sur des bronches humaines isolées.

Le second objectif spécifique concerne les effets des polluants atmosphériques
précédemment étudiés au laboratoire (ozone et aldéhydes) sur la libération
mastocytaire et les effets musculaires de la tryptase.

Le dernier objectif spécifique concerne les mécanismes des interactions entre les
effets de l'hypoxie chronique sur les voies aériennes et ceux des polluants
atmosphériques avec une attention particulière pour le mécanisme de la
modification de sensibilité au calcium de l'appareil contractile. En effet, ces
variations de sensibilité au calcium de l'appareil contractile semblent jouer un rôle
déterminant dans de nombreuses situations physiologiques ou pathologiques qui
s'accompagnent de modifications de la contractilité musculaire lisse.
7
II.
Méthodes
II.1.
Obtention et préparation du tissu pulmonaire humain
Les spécimens pulmonaires humains utilisés lors de ces expérimentations proviennent de pièces
opératoires de pneumectomies ou de lobectomies pratiquées en général pour carcinome bronchique
primitif. Les spécimens sélectionnés proviennent de patients dont la fonction ventilatoire est les limites
de la normale. Immédiatement après exérèse, les pièces collectées au bloc opératoire de Chirurgie
Thoracique sont transportées au laboratoire dans une solution physiologique de type Krebs-Henseleit
(composition en mM: 118.4 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2.2H2O, 1.2 MgSO4.7H2O, 1.2 KH2PO4, 25.0
NaHCO3, 11.1 D-glucose) préalablement refroidie à 4 °C et oxygénée (O2 = 95 % ; CO2 = 5 %). Pour
chaque spécimen pulmonaire, les bronches proximales (diamètre interne de 3 à 5 mm, 3 ème à 5ème
génération bronchique), et distales (diamètre interne de 0.5 à 1 mm, 7ème à 9ème génération bronchique)
sont disséquées à partir d'une zone macroscopiquement saine, débarrassées du parenchyme
pulmonaire. Selon la technique expérimentale, les bronches sont découpées de façon radiaire en
fragments de 2/2 mm, pour l'étude immunohistochimique ; découpées en anneaux d'environ 3 à 5 mm
de long, pour étude de la contraction isométrique, l'étude microspectrofluorimétrique ou la culture
cellulaire.
Deux techniques permettant l'obtention de cellules musculaires lisses bronchiques humaines sont
utilisées : la culture cellulaire et la dissociation enzymatique de cellules musculaires lisses fraîchement
isolées. Pour la dissociation cellulaire, la bronche humaine est placée dans une solution saline
physiologique (PSS, acronyme de Physiological Saline Solution) de dissection (composition en mM:
130.0 NaCl, 5.6 KCl, 10.0 Hepes, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 11.0 D-glucose). Sous loupe binoculaire, les
bandes musculaires sont prélevées, débarrassées de l'épithélium et découpées en petits rectangles
d'environ 2 mm2. Le tissu musculaire ainsi préparé est incubé 10 minutes dans du PSS de dissociation
(composition en mM: 130.0 NaCl, 5.6 KCl, 10.0 Hepes, 0.0 CaCl2, 0.0 MgCl2, 11.0 D-glucose). Les
tissus sont ensuite soumis à une incubation enzymatique de 14 h à 4°C dans 2 ml de PSS de
dissociation contenant 500 µg.ml-1 de collagénase type I (377 U/mg), 350 g.ml-1 de g.ml pronase, et
31.25 -1 d'élastase type III ainsi que 1 mg/ml de l'inhibiteur SBTI. A l'issue de la digestion enzymatique,
le tissu est remis en suspension dans du PSS de dissociation et les cellules sont dispersées
mécaniquement. Les cellules ainsi isolées sont concentrées par centrifugation (120g, 5 min). Pour la
culture de cellules musculaires lisses des voies aériennes, une bronche proximale (3 à 5 mm de
diamètre) est prélevée dans des conditions d'asepsie, placée dans un milieu de culture (DMEM, GibcoBRL). Chaque faisceau de muscle lisse est disséqué à l'aide de micro-ciseaux chirurgicaux et découpé
en petits fragments de 2 à 3 mm 2 placés dans des puits d'un plateau de culture à 6 puits. Les
fragments sont recouvert de DMEM supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (Gibco-BRL), 1 %
d'acides aminés non essentiels (Sigma), 2 mM de L-glutamine (Gibco-BRL), 1 mM de pyruvate de
sodium (Sigma) et 1 % d'une solution antibiotique/antimycotique (Gibco-BRL) contenant de la
pénicilline (50 U/ml), streptomycine (50 mg/ml) et g/ml). Le milieu de culture est changé toutes les 4872 h. La viabilité des cellules est appréciée quotidiennement. Après 8-10 semaines de culture, les
cellules confluentes sont trypsinisées (trypsin-EDTA, Gibco-BRL) pour un premier passage et incubées
dans des flacons de culture (75 cm 2). Après 1-2 semaines, les cellules de nouveau confluentes, sont
trypsinisées pour un deuxième passage, et scindées sur différents supports : des flacons de culture (75
cm2) pour croissance cellulaire ; des plateaux à 96 puits pour l'étude de la prolifération cellulaire ; des
plateaux à 24 puits pour l'étude de la synthèse de cytokines. Seuls les passages 2 à 5 sont étudiés. La
pureté de la population cellulaire en culture est estimée pour chaque passage par
immunofluorescence.
La séparation des mastocytes pulmonaires humains est obtenue à partir de la digestion
enzymatique de parenchyme pulmonaire suivie d'une dispersion mécanique à la seringue et de
nombreuses étapes de filtration à l’aide de membranes de nylon de maillages différents afin d’obtenir
une suspension cellulaire hétérogène contenant des mastocytes. La séparation utilise des billes
magnétiques détachables préalablement couplées à un anticorps anti-CD117. Les mastocytes sont
ensuite détachés des billes grâce à une DNase. Les prélèvements biopsiques sont obtenus chez des
patients suivis au sein du pôle cardio-thoracique du CHU de Bordeaux. Le médecin investigateur
recueille les données démographiques, évalue le contrôle de l’asthme grâce à un questionnaire validé
et fait pratiquer une exploration fonctionnelle respiratoire. La fibroscopie est réalisée sous anesthésie
locale selon les recommandations internationales. Des biopsies sont fixées dans l’acétone + inhibiteurs
8
de protéases (PMSF, iodacétamide) pour l’immunohistochimie, ou dans le glutaraldéhyde pour la
microscopie électronique. Certaines biopsies seront gardées à l’état frais pour la culture cellulaire et
d’autres congelées à –80 °C pour la biologie moléculaire.
Enfin, la purification de la tryptase pulmonaire est réalisée à partir d'extraits de tissus pulmonaires.
Dans un premier temps, une série d'extractions en milieu hyposodé (0.15 M) est effectuée. A ce stade
la tryptase et la chymase sont liées aux proteoglycans et sont donc insolubles. Puis une série
d'extractions en milieu hypersodé (2 M) est réalisée. On utilise ensuite les propriétés d'affinité de la
tryptase pour l'héparine. Après filtration m) et dialyse, une chromatographie sur colonne d'héparineagarose (pore 0.45 permet de lier la tryptase en milieu hyposodé (0.4 M), mais aussi la chymase à ce
stade. L'élution de ces protéases est effectuée par le fractionnement d'un nouveau passage pourvu
d'un gradient sodique entre 0.4 et 2 M sur cette même colonne de chromatographie. Après sélection
des fractions ayant une activité enzymatique tryptique sans activité chymotryptique, une sélection
supplémentaire de la tryptase est effectuée soit par une deuxième chromatographie sur héparineagarose, soit préférentiellement par une nouvelle chromatographie à vitesse lente (0.15 ml/min) sur
colonne de benzamidine-agarose (Sigma). Une dernière chromatographie sur gel de filtration
(Sephacryl S-300) est alors réalisée permettant la collection d'une trentaine de fractions de 5 ml après
éviction d'un volume initial de 130 ml. En parallèle, la concentration de protéine dans les échantillons
est mesurée par l'étude de l'absorbance à 280 nm par spectrophotométrie. En effet, l'absorbance à
280 nm d'un échantillon de 1 mg/ml est de 2.80. La relation est en fait pratiquement linéaire entre
densité optique et concentration protéique. La tryptase ainsi purifiée est concentrée dans un volume
total inférieur à 1 ml pour une conservation à -80 C.
II.2.
Techniques utilisées
Quantification des transcrits de cytokines et molécules d’adhésion exprimés par les CML et les
mastocytes par RT-PCR quantitative en temps réel. Analyse des protéines exprimées par les CML et
les mastocytes par ELISA (R&D), Western Blot, cytométrie en flux (Dako Galaxy). Etude du
chimiotactisme des mastocytes en chambre de Boyden. Evaluation de l’adhésion des mastocytes aux
CML bronchiques après incorporation de thymidine tritiée (ICN) par compteur .
II.3.
Exposition aux polluants gazeux
Une famille de polluants a été étudiées : les aldéhydes (acroléine) dans la mesure où nous disposons
d'informations dosimétriques sur ces polluants. Dans la mesure où l'acroléine est utilisable en solution
aqueuse l'exposition a été réalisée directement sur cellules. L'acroléine peut être utilisée à des
concentrations variables, de l'ordre du µM pendant des temps d'exposition variables de l'ordre de 20 à
60 min avant d'être rincée.
9
III.
Résultats
III.1. Résultats objectif n°1
Ce paragraphe a pour objet de résumer ce qui a été mis en évidence dans le cadre
de cet objectif n° 1 c'est-à-dire l'étude des effets de la tryptase sur des bronches
humaines isolées pour comprendre les mécanismes de la sensibilisation qui
impliquent les mastocytes bronchiques et les enzymes mastocytaires comme la
tryptase. L'ensemble des résultats est présenté dans l'article n°1 joint en annexe.
Des travaux précedents conduits au laboratoire avait montré que la tryptase
mastocytaire (i) active la signalisation calcique des cellules musculaires lisses
bronchiques humaines i.e., contracte le muscle lisse et (ii) favorise sa prolifération.
Dans le cadre de la réalisation du présent contrat, nous avons montré que la
tryptase libérée par les mastocytes active la sécrétion, par les cellules musculaires
lisses de cytokines (notamment le TGF-1) qui attirent les mastocytes vers ces
cellules musculaires lisses (chimiotactisme). Il s'établit ainsi une boucle d'autoactivation dans laquelle les mastocytes par l'intermédiaire de la tryptase, activent les
cellules musculaires lisses qui, en retour, attirent d'autres mastocytes qui
pérennisent l'activation des cellules musculaires lisses etc…
Cette boucle d'activation, qui pourrait donc contribuer à la sensibilisation bronchique
par les allergènes, est représentée ci-après.
10
Figure 1 Effet de la tryptase sur les bronches humaines isolées
III.2. Résultats objectif n°2
La figure 2 montre le principe de l’obtention d’une suspension de mastocytes
pulmonaires humains obtenus par dispersion enzymatique et purification par bille
magnétique à partir de fragments de spécimens pulmonaires humain.
- Billes magnétiques
- Ac anti-CD117
- Dispersion cellulaire
Figure 2 Principe de la séparation des mastocytes par billes
11
La figure 3 montre le résultat de ce type de séparation
Mastocytes sans billes
x 20
x 40
Figure 3 Mastocytes humains isolés (grossissement x20 et X40)
La libération de tryptase par ces mastocytes a été analysée en réponse à une
stimulation spécifique par anti-IgE. Cette libération a été exprimée, d’une part, en
terme d’activité enzymatique (en mU/mol) et, d’autre part, en pourcentage de
libération maximale induite par une stimulation non spécifique maximale par un
ionophore calcique (A 23 187, 1 µM).
L’incubation des mastocytes isolés en présence d’acroléine, dans des conditions
expérimentales optimales préalablement déterminées au laboratoire pour d’autres
cellules isolées pulmonaires (Roux et al., 1999) i.e., 0,3 µM pendant 10 minutes,
potentialise la libération de tryptase (Figure 4). L’augmentation de la libération de
tryptase atteint environ 45% à la fois en terme d’activité enzymatique et en terme de
pourcentage de libération par rapport au A 23187.
12
Activité tryptase
(mU/ml)
Activité tryptase
(% de l’activité max avec A23187
150
100
50
0
5
4
3
2
1
0
-5,5
-5,5 -5 -4,5 -4 -3,5 -3
Anti-IgE (log)
-5 -4,5 -4 -3,5
Anti-IgE (log)
-3
Acroléine (-)
Acroléine (+ 0.3µm 10min)
Figure 4 Potentialisation par l'acroléine de la libération de tryptase
Ces résultats indiquent que l’acroléine potentialise la libération de tryptase
mastocytaire donc, que cet effet pourrait contribuer à renforcer la boucle d’auto
activation décrite en réponse à l’objectif 1. Ce résultat pourrait donc rendre compte
de l’effet additif polluant atmosphérique - sensibilisation aux allergènes (Figure 5).
Polluants
(aldéhydes, PD…)
activation
mastocytes
Tryptase
sécrétion
PAR-2
prolifération
contraction
Figure 5 Potentialisation de l'activation mastocytaire par les polluants
13
III.3 - Résultats – Objectif n° 3
Nous avons conduit plusieurs études pour approfondir la compréhension des effets
de l’hypoxie chronique sur les voies aériennes et la circulation pulmonaire. Les
résultats obtenus sont détaillés dans les articles joints en annexe.
Les principaux résultats ont été les suivants :

L’hypoxie chronique ne modifie pas l’effet relaxant bronchique induit
par les anesthésiques intra veineux (article n° 2).

Les effets de l’hypoxie chronique sur le circulation pulmonaire sont
modifiés par un inhibiteur de phosphodiestérase de type 5 (PDE 5) le
sildenafil (article n°3).

Enfin, l’hypoxie chronique diminue le métabolisme mitochondrial au
niveau du cœur, mais cet effet est retardé dans le ventricule droit par
rapport au ventricule gauche, du fait de l’hypertrophie compensatrice
du ventricule droit (article n°4).
L’étude du mécanisme de l’effet des polluants atmosphériques sur les
conséquences de l’hypoxie chronique n’a cependant pas encore été conduite
par faute de temps.
14
IV – Discussion
De nombreux travaux épidémiologiques ont mis en évidence le rôle de
l’environnement dans la morbidité et la mortalité d’origine respiratoire (1, 2). En
particulier, il existe un lien étroit entre environnement et pathologie respiratoire
immuno-allergique (3). L’augmentation de la prévalence de l’allergie est constante
en France depuis plusieurs années, de l’ordre de 25% tous les 10 ans. De plus, des
maladies allergiques sont responsables d’importantes dépenses de santé non
seulement en raison de leur fréquence mais également à cause du fort
retentissement socio-économique des formes les plus sévères de ces maladies
souvent mal équilibrées.
L’asthme est la principale maladie allergique respiratoire dont la prévalence est, en
France, d’environ 6% chez l’adulte et 10% chez l’enfant (4). L'asthme se caractérise
par une inflammation des bronches associée à une hyperréactivité bronchique, c'està-dire une réponse contractile “excessive”, “démesurée” à la stimulation des voies
aériennes par rapport à celle des sujets normaux. Les mécanismes responsables de
la maladie asthmatique ont fait l’objet de très nombreuses études mais restent
encore très incomplètement élucidés. En effet, l’origine immuno-allergique de
l’asthme repose sur l’hypothèse classique faisant intervenir l’orientation de la
réponse lymphocytaire auxiliaire vers une réponse de type Th2 au détriment d’une
réponse Th1. La production de cytokines de type Th2 initie, d'une part, et entretient,
d'autre part la réaction inflammatoire intervenant au sein de l’arbre bronchique des
patients asthmatiques. Cette hypothèse a été récemment modifiée par la découverte
de différentes populations lymphocytaires T régulatrices (Tr1, Th3, Treg) dont le rôle
est probablement déterminant (5, 6). En effet, des observations récentes montrent
que des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+ peuvent inhiber la prolifération de
lymphocytes T spécifiques de l’allergène ainsi que la production de cytokines Th2
alors que cette sous population lymphocytaire est déficiente chez le sujet allergique
(7). Quelle que soit l’hypothèse considérée, il est désormais établi que les conditions
environnementales associées à la pollution extérieure (”atmosphérique”, particulaire
et non particulaire) et la pollution intérieure (chimique, infectieuse et surtout
allergénique) favorise la production de cytokine de type Th2 aboutissant, in fine, à
l’inflammation, support de l’hyperréactivité bronchique. De plus, l’exposition
chronique à l’allergène pourrait induire des lésions de remodelage bronchique (8).
15
En effet, il est bien démontré que l’inflammation bronchique peut conduire à un
phénomène de remodelage, c'est-à-dire un processus anormal de réparation
contribuant à la genèse de lésions peu sensibles au traitement, voire irréversibles
(8). Le remodelage bronchique est caractérisé par des lésions épithéliales, un dépôt
de matériel collagène sous la membrane basale, une altération des glandes sousmuqueuses, une modification de la matrice extra-cellulaire et une hypertrophie du
muscle lisse bronchique (9). Le rôle de l’environnement sur cet aspect fondamental
de la physiopathologie de l’asthme reste encore méconnu.
Dans l’asthme allergique résultant d’une sensibilisation aux aéro-allergènes, une
série de travaux récents insistent sur l’importance particulière de l’infiltration
mastocytaire au sein de la couche musculaire lisse de la paroi bronchique (10-15).
Dans ce contexte nous avons étudié (objectif n°1) les mécanismes de cette
infiltration (micro-localisation) qui résulte d’un dialogue qui s’établit au cours de la
sensibilisation entre le mastocyte et la cellule musculaire lisse aboutissant à la
constitution d’une boucle d’auto activation (11). Cette boucle est responsable de
l’activation de la cellule musculaire lisse conduisant à la bronchoconstriction (16) et
à la prolifération musculaire lisse (17, 18) qui contribue au remodelage bronchique.
Elle participe à la production locale de cytokines qui contribuent à l’infiltration
inflammatoire (12, 19). Cette boucle d’auto activation résultante d’une conséquence
majeure de la pollution ”intérieure”, la sensibilisation allergénique, peut également
être la cible de la pollution atmosphérique photo oxydante (20). Dans ce contexte
nous avons montré (objectif n° 2) qu'un aldéhyde, l'acroléine potentialise la libération
de tryptase mastocytaire.
Ainsi à la suite des expériences in vitro de sensibilisation de bronches humaines
isolée par du sérum de patients asthmatiques allergiques qui ont montré qu’une forte
proportion de mastocytes fixant les IgE du serum était localisée au sein de la couche
musculaire (27), des travaux sur les bronches de patients spontanément sensiblisés
aux aéro-allergènes in vivo examinées in vitro ont également retrouvé une infiltration
mastocytaire du muscle lisse bronchique (15). De plus, deux groupes ont clairement
récemment démontré que cette infiltration mastocytaire spécifique est retrouvée
dans l’asthme. D’une part, Brightling et coll. (13) ont mis en évidence une localisation
spécifique de mastocytes dans le muscle lisse de bronches d’asthmatique par
16
comparaison avec des bronches de sujets normaux ou de patients souffrant de
bronchite non asthmatique. D’autre part, Caroll et coll. (28) ont également retrouvé
cette infiltration mastocytaire dans des bronches d’asthmatiques associée à une
dégranulation mastocytaire plus importante chez les patients décédés de leur
asthme. Enfin, très récemment, Amin et coll. ont retrouvé une infiltration
mastocytaire du muscle lisse bronchique significativement plus importante chez les
malades sensibilisés vis à vis des aéroallergènes de leur environnement (10)
indiquant là qu’il existe une relation pertinente entre asthme allergique,
environnement et remodelage bronchique.
Les travaux réalisés au cours de ce contrat ont permit d'identifier certains des
éléments permettant un dialogue entre le mastocyte et la cellule musculaire lisse
bronchique. D’une part, le mastocyte est une source majeure de tryptase, une
protéase neutre dont la concentration est augmentée dans le sérum ou le liquide de
lavage broncho-alvéolaire de malades asthmatiques allergiques (29). La tryptase
peut agir que les cellules musculaires lisses bronchiques humaines qui expriment un
récepteur membranaire spécifiquement activé par la tryptase, le PAR-2 qui
appartient à la famille des “proteinase activating recpetor” i.e., des récepteurs dont
l’activation dépend d’une protéolyse spécifique (16, 17, 30). La tryptase mastocytaire
libérée lors de la dégranulation active le PAR-2 des cellules musculaires pour
engendrer contraction, prolifération et sécrétion (16-18, 30, 31). D’autre part, les
cytokines secrétés par les cellules musculaires lisses bronchiques peuvent interagir
avec des récepteurs spécifiques présents sur les mastocytes pour produire
chimiotactisme et adhérence (11, 12, 32). Enfin, il apparaît que les polluants peuvent
amplifier ce phénomène. Au toal les objectifs 1 et 2 permettent de conclure que la
boucle d’auto activation mastocyte – cellules musculaires lisses impliquant la
tryptase résulte d’une conséquence majeure de la pollution ”intérieure”, la
sensibilisation allergénique et peut également être la cible de la pollution
atmosphérique photo oxydante (20).
Enfin, si des travaux faisant mention du soutien du contrat ont été conduit sur les
effets de l'hypoxie chronique, l'étude du mécanisme de l'effet des polluants (décrit au
cours de la réalisation du contrat précédent), objectif spécifique n°3 n'a pas été
abordé par manque de temps.
17
V – Références
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19
Conclusion
Les travaux réalisés au cours de ce contrat ont permis d'identifier certains des
éléments permettant un dialogue entre le mastocyte et la cellule musculaire lisse
bronchique. Il s'établit une boucle d’auto activation résultante d’une conséquence
majeure de la pollution ”intérieure”, la sensibilisation allergénique. Enfin, cette boucle
peut également être la cible de la pollution atmosphérique photo oxydante.
20
Annexes : articles

Article n° 1 :
Berger P, Girodet PO, Begueret H, Ousova O, Perng DW, Marthan R, Walls AF,
Tunon de Lara JM.
Tryptase-stimulated human airway smooth muscle cells induce cytokine synthesis
and mast cell chemotaxis.
FASEB Journal. 2003, 14:2139-41
21
Annexes : articles

Article n° 2 :
Ouedraogo N, Marthan R, Roux E.
The effects of propofol and etomidate on airway contractility in chronically hypoxic
rats.
Anesthesia Analgesia. 2003, 96:1035-41.
22
Annexes : articles

Article n° 3 :
Pauvert O, Bonnet S, Rousseau E, Marthan R, Savineau JP.
Sildenafil alters calcium signaling and vascular tone in pulmonary arteries from
chronically hypoxic rats.
American Journal of Physiology: Lung Cell Mol Physiol. 2004, 287: L577-83.
23
Annexes : articles

Article n° 4 :
Nouette-Gaulain K, Malgat M, Rocher C, Savineau JP, Marthan R, Mazat JP,
Sztark F.
Time course of differential mitochondrial energy metabolism adaptation to chronic
hypoxia in right and left ventricles.
Cardiovascular Research 2005, 66:132-40.
24
25