Comment produire une souris knock

Comment produire une souris knock-out (La Recherche n°311, 1998)?
Un gène muté (rouge) est inséré par recombinaison homologue dans des cellules souches
embryonnaires (cellules ES) en culture, où il remplace le gène endogène. Les cellules ES sont
dérivées d'une lignée de souris de couleur agouti (brune). Les cellules ES sont des cellules
totipotentes, capables de se différencier et de donner naissance à tous les tissus de l'animal.
Les cellules ES portant la mutation, sont sélectionnées et microinjectées dans un blastocyste
de souris de couleur noire. Les blastocystes microinjectés sont réimplantés dans une mère
pseudo-gestante. Les souriceaux qui naissent sont des chimères, au poil bicolore. Leurs tissus
dérivent des cellules du blastocyste (couleur noire) et des cellules ES microinjectées (couleur
agouti). Pour repérer ceux d'entre eux qui portent la mutation dans leurs gamètes (cas où il y a
transmission germinale du gène muté), on les croise avec des souris sauvages. Cela donne des
animaux F1 dont une partie porte la mutation sur un des 2 allèles. Les animaux F1
hétérozygotes sont ensuite croisés entre eux. La portée F2 est constituée de souris
homozygotes pour le gène muté, d'hétérozygotes, et de souris sauvages.
Souris "knock-out"
La procédure dite du "knock-out" consiste à modifier les gènes dans les cellules souches
embryonnaires. Les cellules souches sont pluripotentes, ce qui signifie qu’après le stade
embryonnaire, elles se divisent et forment différentes sortes de cellules dans l’organisme.
Les chercheurs qui s’intéressent à un gène en particulier suppriment ou inactivent ("knockout") le gène présent dans une cellule souche, puis introduisent cette cellule dans un embryon
qui vient d’être fertilisé. Le moment de l’intervention est essentiel car il est préférable
d’introduire cette cellule modifiée lorsque l’embryon ne comporte qu’un petit nombre de
cellules.
La cellule ainsi manipulée se divise, puis se développe dans différents tissus. On obtient ainsi
une souris dans laquelle certaines cellules proviennent de cellules souches embryonnaires
inactivées. Lorsque la souris knock-out se reproduit, les chercheurs espèrent que le gène
manipulé sera transmis à la progéniture de la souris, processus qui s’appelle transmission des
cellules souches. Lorsque la transmission est terminée, il est alors possible d’élever des souris
chez lesquelles le gène a été supprimé et d’autres chez qui il est présent. Ce deuxième groupe
sert de groupe témoin.
"Les souris knock-out sont utilisées de différentes manières", "Elles permettent de vérifier les
fonctions spécifiques de gènes donnés. On peut donc utiliser des souris knock-out pour
déterminer le processus qui régule ce gène en particulier. Quels phénomènes activent-ils et
désactivent-ils? Chez la souris, on peut observer ces phénomènes alors que cela serait
impossible dans un milieu de culture.
Souris transgéniques
Contrairement à la technique knock-out qui revient à altérer le gène d’une cellule hôte, la
technologie transgénique consiste à ajouter des gènes aux chromosomes ou à transférer des
gènes d’une espèce à l’autre.
En termes simplifiés, quatre étapes président à la création des souris transgéniques :
l’isolation, l’injection, l’intégration et l’implantation.
1. Isolation : les chercheurs isolent un gène humain, par exemple un gène qui, selon eux, est à
l’origine d’une pathologie donnée. Pour identifier ce gène, ils ont au préalable procédé à des
études familiales et à des tests génétiques.
2. Injection : un fragment d’ADN contenant le gène humain soupçonné est injecté dans le
noyau d’un oeuf de souris\récemment fertilisé. Une fois encore, le moment de l’intervention
est essentiel : le gène doit être injecté avant que les cellules ne commencent à se différencier
dans différents tissus.
3. Intégration : il est impossible de savoir avec certitude si le gène injecté sera intégré aux
chromosomes de la souris. Les techniciens les plus habiles peuvent obtenir un taux de succès
de l’ordre de un sur quatre.
4. Implantation : l’embryon avec le gène injecté est implanté dans l’utérus d’une souris adulte.
Les souris issues de ce processus sont examinées pour voir si elles sont porteuses de la
mutation "génétique". Celles qui en sont porteuses seront accouplées à des souris nontransgéniques. La moitié de la descendance sera formée de souris transgéniques et l’autre de
souris normales. Ce groupe servira de groupe témoin.
KNOCK-OUT : Souris dont un gène spécifique a été délété (ou rendu inactif) au
niveau de toutes ces cellules.
TRANSGÉNIQUE : Souris possédant un gène étranger au niveau de toutes ces
cellules. Ces souris transmettent ce nouveau caractère à leurs descendants.