Expériences et interprétations

TP de Physiologie animale Chateigner Aurélien
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Physiologie animale : les grandes fonctions
Compte rendu de TP :
Mesure de la masse sanguine chez le Rat.
But : Dans ce TP, notre but sera de mesurer le volume de sang (déduit du volume plasmatique et de
l’hématocrite) circulant chez le rat pour en déduire la masse sanguine par rapport à la masse
corporelle.
I. Introduction : le compartiment sanguin
A. Composition
Le sang est un tissu conjonctif : il se compose d’éléments solides, appelés éléments figurés, qui sont
dispersés dans un fluide, le plasma. Il est relativement visqueux (5 fois la viscosité de l’eau) et
possède une densité de 1,05.
1. Le plasma
C’est de l’eau à 90%. La composition en substances minérales est la même que celle des milieux
extracellulaires : on y trouve principalement du sodium (Na) et du chlore(Cl) (d’où l’utilisation de
sérum physiologique (à 0,9% NaCl), qui préserve l’osmolarité du milieu sanguin) mais il y a également
du fer, du cuivre, du zinc et des iodures. On y trouve des substances organiques telles que les
protéines plasmatiques (albumine et globulines). Des substances azotées comme l’urée (produit de
dégradation des protéines), des acides aminés, de l’acide urique (produit de dégradation des
nucléotides), de la bilirubine (produit de dégradation de l’hémoglobine) ou encore de l’ammoniaque,
sont présentes. Il se compose également de glucose (glycémie = 1g/L) et de lipides variés
(triglycérides, phospholipides, cholestérol…).
2. Système tampon
Le pH de l’organisme oscille autour de 7,4. Pour maintenir cet équilibre le sang possède différentes
façon de rétablir l’équilibre acido-basique en cas de variations.
3. Les éléments figurés
On peut les regrouper en différentes famille de cellules : les érythrocytes, les leucocytes
(polynucléaires, monocytes, lymphocytes) et les thrombocytes. Ils ont tous pour origine les cellules
souches de la moelle osseuse. Ce sont les leucocytes qui sont impliqués dans les défenses
immunitaires de l’organisme. La proportion des différents type de globules blancs (leucocytes) défini
la formule sanguine : chez le rat, on parle de formule sanguine inversée, c’est à dire qu’il y a plus de
lymphocytes que de polynucléaires. Les érythrocytes sont chargés du transport de l’oxygène dans
tout l’organisme ; pour ce faire ils contiennent une protéine, l’hémoglobine, contenant un atome de
fer qui donne sa couleur rouge au sang, qui fixe l’oxygène afin de la transporter. Les thrombocytes
(plaquettes) sont chargés de débuter le phénomène de coagulation.

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B. Rôle du sang et système vasculaire
Le sang est propulsé par le cœur à travers le système vasculaire. C’est un système de liquide en vase
clos sans citerne. Cependant le système veineux joue indirectement ce rôle ; en effet celui-ci
renferme 60 à 70% du volume sanguin. On retrouve 10 % de sang dans les artères, environ 5% dans
les capillaires, 10% dans les poumons et moins de 10% dans le cœur. Le sang est maintenu sous
pression dans ce système, ce qui permet son déplacement dans les vaisseaux. Ce système permet au
sang d’accomplir son rôle qui est d’apporter les nutriments et l’oxygène à tous les tissus de
l’organisme, et d’en évacuer les déchets (du métabolisme par exemple).
II. Principe des manipulations
On utilisera des techniques opératoires : le cathétérisme de la veine jugulaire et de l’artère carotide.
Après la pose des cathéters, on injecte une solution d’héparine à 1% (anticoagulant) par la jugulaire
pour, d’une part éviter la formation de caillots, et d’autre part pour l’analyse du sang : en effet il est
nécessaire que le sang ne coagule pas pour réaliser les mesures.
Sang hépariné : Si le sang n’est pas hépariné, il coagule : ce qui fait apparaitre 2 phases, l’une étant
le sérum et l’autre étant le « coagulum ». Lors de la coagulation, une protéine plasmatique est mise
en jeu, le fibrinogène qui, une fois convertie en fibrine par la thrombine (une autre protéine), forme
une maille qui emprisonne les éléments figurés (érythrocytes, thrombocyte et leucocytes). Le sérum
est donc le plasma sans le fibrinogène. L’héparine bloque ce phénomène en empêchant la formation
de thrombine. On peut séparer le plasma des éléments figurés d’un sang hépariné en le
centrifugeant.
A. Cathétérisme de la jugulaire
Le Cathéter posé au niveau de la jugulaire nous permettra d’injecter un colorant, le Bleu Evans, qui
va diffuser et être dilué dans le volume sanguin. On injecte une quantité déterminée Q d’une
solution du colorant à 2g/L. L’injection dans la jugulaire permet un passage rapide par le cœur et
donc une diffusion rapide dans tout le système vasculaire.
Avantages de l’utilisation du Bleu d’Evans : c’est un composé non toxique. Il demeure dans le sang
du fait de sa liaison aux protéines plasmatiques (au moins le temps de notre expérience) : il sera alors
mesurable dans le plasma après centrifugation. Il n’est pas métabolisé (pas durant l’expérience). Il
est mesurable facilement en utilisant un spectrophotocolorimètre (à 580 nm)
B. Cathétérisme de la carotide
On pourra ensuite récupérer du sang, par le cathéter de la carotide (Le prélèvement se fait à partir
de l’artère Carotide car on a un débit sanguin plus important, celle-ci arrivant directement de la
crosse aortique, située à la sortie du ventricule gauche, qui propulse le sang oxygéné dans tout
l’organisme), afin de déterminer la concentration C en Bleu Evans et alors déterminer la dilution
effective et en déduire le volume plasmatique Vp. En fait, on centrifuge le sang : on aura 2 phases, le
surnageant étant le plasma qui contient le colorant. On détermine alors la concentration C en bleu
d’Evans dans le plasma grâce à une gamme étalon réalisée au préalable. On doit aussi réaliser un
Hématocrite Ht (mesure du pourcentage des érythrocytes = volume globulaire Vg) pour pouvoir
ensuite déterminer le volume sanguin Vs.

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Vp = Q / C
Vp (en %) = 100% - V globulaire(en%) : Vs = Vp x (100/(100-Ht))
III. Expérience et résultats
On a injecté un volume de Bleu d’Evans, à 2 g/l, en fonction du poids de l’animal : 0,5 ml / kg
Notre Rat pesait 340 grammes : 0,5 x 0,340 = 0,17 ml ; on injecte alors 170 µl du colorant au niveau
de la veine jugulaire, ce qui représente 340 µg.
On récupère, au bout de 5 minutes après la fin de l’injection, du sang par le Cathéter de la carotide
et, après centrifugation, on récupère le surnageant pour lire l’absorbance à 580 nm.
A. Problème : lecture directe impossible
On est en présence d’une solution trop concentrée pour une lecture fiable du spectrophotomètre :
en effet la mesure d’absorbance doit être comprise entre 0,05 et 1,2. Or la concentration est telle
que la mesure d’absorbance est plus grande que 1,2. On réalise alors une dilution de la solution pour
que sa concentration soit telle que la valeur d’absorbance soit comprise entre 0,05 et 1,2. On dilue la
solution au 1/6ème : on trouve une valeur d’absorbance A égale à 0,612.
B. Courbe d’étalonnage
Pour faire une courbe étalon, on réalise des dilutions à partir de la solution de départ pour obtenir
des valeurs d’absorbances comprises dans l’intervalle fiable (entre 0,05 et 1,2). La solution de départ
est à 2g/L.
Dilution par rapport à la solution mère
Concentration (en g/L)
Absorption
1/160
1,25E-02
1,176
1/320
6,25E-03
0,622
1/640
3,13E-03
0,330
1/960
2,08E-03
0,221
1/1280
1,56E-03
0,193
1/1720
1,16E-03
0,130
1/2560
7,81E-04
0,095
On peut alors positionner les points sur le graphique ci-dessous.
On trace une droite de régression linéaire : on constate qu’elle passe par 0 et que le coefficient de
détermination R2 est très proche de 1. La droite est donc relativement fidèle aux points
expérimentaux.
On utilise ensuite l’équation de la droite, y = 96,37x, pour déterminer la concentration en Bleu Evans.
(y correspond à l’absorbance et x à la concentration)
Concentration plasmatique = Cp = (A / 96,37) x 6 (dilution au 6ème) = 3,81.10-2 g.L-1

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On doit calculer le volume total de notre produit, comme vu précédemment : Vp = Q/C. On doit
déterminer Q. Notre solution est à 0,2 %, on a donc Q = 170 x 0,2 = 0,34 µg de produit injecté.
Vp = 0,34 (µg) / 3,81.10-2 (µg/ml) = 8,92 ml
L’hématocrite nous a permis de mesurer la proportion en éléments figurés : Il y en a environ 47%
dans le sang. On en déduit alors le volume sanguin total.
C. Volume et masse sanguine
Vs = Vp x (100 / (100-Ht))
Ici, Vp = 8,92 mL
Ht = 47% Donc Vs = 8,92 x (100 / (100-47))= 16,21 mL
On en déduit la masse sanguine : en supposant une masse spécifique du sang à 1g/mL, on obtient
une masse sanguine de 16,21 g.
On peut en déduire en pourcentage, le rapport masse sanguine/ masse corporelle :
(16,21 / 340) x 100 = 4,8 %
On remarque que ce rapport est assez bas. Ceci est dû à quelques problèmes rencontrés lors des
manipulations.
y = 96.37x
R² = 0.9945
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
0.00E+00 2.00E-03 4.00E-03 6.00E-03 8.00E-03 1.00E-02 1.20E-02 1.40E-02
Absorbance
Concentration en Bleu d'Evans en g/l
Courbe étalon : Absorbance en fonction de la
concentration en Bleu Evans

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IV. Interprétation des résultats et analyse des erreurs cumulées
Comme nous l’avons signalé précédemment, nous avons rencontré un certain nombre de
mésaventures pendant nos manipulations.
En effet, nous avons provoqué des pertes de sang, au cours de la pose des cathéters. En dégageant
les couches de muscles pour accéder à la carotide, nous avons provoqué une hémorragie,
possiblement due à la lésion de la jugulaire.
De plus, Une carotide a été sectionnée, à cause d’une erreur lors de l’introduction du cathéter,
provoquant de ce fait une forte hémorragie, limitée tant bien que mal par la pose d’une pince clamp.
Une dernière hémorragie, d’origine plus profonde et inconnue, est survenue lors de la 2ème tentative
de pose de cathéter carotidien (qui fut au final un succès).
Toutes ces maladresses ont fait perdre à notre rat une forte quantité de sang, le volume sanguin
mesuré par l’expérience est donc faussé, nos résultats étant inférieurs à ceux attendus. On aurait
théoriquement du trouver un volume de sang d’environ 30 mL. Il aurait fallu évaluer la quantité de
sang perdu lors des hémorragies pour s’approcher de la valeur réelle.
Nos résultats nous conduisent à un volume sanguin restreint (16,21 mL), on suppose donc que l’on a
perdu entre 10 mL et 20 mL de sang, au cours de notre expérience.
Des erreurs peuvent également survenir lors de l’injection du colorant. En effet, on injecte un volume
très faible, ce qui augmente le pourcentage d’erreurs possible, en relation avec la précision du
matériel utilisé. Cependant, en manipulant avec précision, on peut rendre ce quasiment nul.
On peut également imputer des erreurs à l’établissement de la gamme étalon, les dilutions ayant été
faites en cascade, si la première était faussée (erreur de pipetage par exemple), toutes les autres
l’étaient aussi. Le matériel utilisé (micropipette) étant précis, il permet, à conditions de manipuler
correctement, d’être confiant par rapport à la précision des dilutions effectuées. On constate une
bonne qualité de la gamme étalon, le coefficient de détermination R2 (mise en évidence du taux
d’erreur) étant quasiment égal à 1 (voir courbe étalon).
V. Conclusion
Ce TP nous a permis de déterminer le volume sanguin restant après les hémorragies. On a donc pu
déterminer la masse sanguine correspondante, malheureusement, on ne peut pas déterminer la
masse réelle, à cause des différents problèmes rencontrés.
Pour conclure sur la méthode employée, on peut dire qu’elle peut s’avérer très intéressante et
précise, dans le cas d’une manipulation parfaite (sans hémorragies). On ne pourrait pas obtenir de si
bons résultats en « saignant » l’animal, car une partie du sang resterait dans les vaisseaux sanguins.
En effet, le produit diffusant dans tout le système vasculaire, on peut en déduire avec précision le
volume total de sang, grâce à la dilution effective. Le temps de diffusion étant assez court, on limite
également l’élimination rénale, qui pourrait fausser les résultats dans le cas d’une diffusion plus
longue.