L`ère des biotechnologies - Raymond Rodriguez SVTperso
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RR - 16/04/17 - 840904185 - 1/8 Spécialité Chapitre 3.3 4 semaines L'ère des biotechnologies : depuis 1970 I. Le génie génétique ouvre des perspectives dans la manipulation et la connaissance du génome A. Les enzymes de restriction permettent d'isoler des fragments de molécule d'ADN B. On peut coller deux fragments d'ADN C. Deux méthodes permettent de multiplier de l'ADN D. On peut séquencer l'ADN E. Le génie génétique a permis de découvrir les gènes morcelés ► TP 1. Enzymes de restriction et polymorphisme génique II. Les biotechnologies ont des applications en agronomie A. La transgénèse permet d'obtenir des OGM B. La trangénèse végétale a de nombreuses applications ► TP 2. Débat OGM Pas de fichier C. Les OGM sont l'objet d'un débat III. Les biotechnologies ont des applications en génétique humaine A. On peut dépister et diagnostiquer une maladie génique B. On peut dépister et diagnostiquer une anomalie chromosomique comme la trisomie 21 C. La thérapie génique somatique permet de pallier la déficience d’un gène OBJECTIF Le génie génétique est l'ensemble des techniques utilisées pour isoler, transférer ou modifier un gène. Il fait partie des biotechnologies qui utilisent les êtres vivants (animaux, végétaux ou micro-organismes) ou leurs composants à des fins agricoles, scientifiques ou thérapeutiques. On cherche à faire le point sur les méthodes du génie génétique et à préciser les applications des biotechnologies dans les domaines de l'agronomie et de la génétique humaine. RR - 16/04/17 - 840904185 - 2/8 I. Le génie génétique ouvre des perspectives dans la manipulation et la connaissance du génome A. Les enzymes de restriction permettent d'isoler des fragments de molécule d'ADN ► FIGURE 1. Enzymes de restriction dans Nathan p. 76 doc. 1. ► FIGURE 2. Orientation de la molécule d’ADN Une enzyme de restriction est isolée à partir d'une bactérie "protégée " contre son action. Elle lui permet de se défendre contre des infections virales. L'enzyme porte le nom de la bactérie suivi du numéro d'ordre de sa mise en évidence. Une enzyme de restriction (= endonucléase = ciseau moléculaire) coupe une molécule d'ADN de n'importe quelle espèce chaque fois qu'elle rencontre un site de restriction (= site de coupure) qui est une séquence nucléotidique ( et palindromique), que l'enzyme reconnaît spécifiquement. Un palindrome est un mot, ou un groupe de mots, qui peut être lu indifféremment de gauche à droite ou de droite à gauche (Ex. Ésope reste ici et se repose). Selon l'enzyme, la coupure est franche ou décalée. ► FIGURE 3. Electrophorèse de fragments de restriction dans Bordas p. 127 et Nathan p. 95. L'utilisation de plusieurs enzymes sur une même molécule d'ADN permet d'obtenir un grand nombre de fragments de tailles diverses. Par électrophorèse on peut ensuite isoler les fragments en fonction de leur taille. L'ADN fragmenté est déposé sur un gel d'agarose à pH provoquant une charge négative de l’ADN. Grâce à un champ électrique les fragments migrent vers l'anode à une vitesse inversement proportionnelle à leur taille évaluée (en kilobases (kb) ou en paires de bases (pb)) par comparaison avec la migration de fragments de taille connue. Ils sont enfin visualisés par coloration. B. On peut coller deux fragments d'ADN ► FIGURE 4. Enzymes de restriction et ADN recombinant dans Nathan p. 77 fig. 3. L'ADN bactérien est toujours circulaire (pas d’extrémités 3’ et 5’). A coté de leur chromosome unique, les bactéries possèdent de petites molécules d"ADN, les plasmides qui sont faciles à extraire et à purifier. Chaque fragment d'ADN libéré par une enzyme de restriction possède deux extrémités cohésives (= " bouts collants ") qui peuvent s’associer avec des nucléotides complémentaires). Il est possible de fabriquer un ADN recombinant par soudure de deux fragments d'ADN possédant des extrémités cohésives complémentaires en présence d'une enzyme ADN ligase. VOIR. Universalité de la molécule d'ADN dans le cours de seconde chapitre 2.2 Du fait de l'universalité de la molécule d'ADN, les différents segments d'un ADN recombinant peuvent provenir d'espèces différentes et même de règnes différents. ► TP 1. Enzymes de restriction et polymorphisme génique Possible aussi après I. RR - 16/04/17 - 840904185 - 3/8 C. Deux méthodes permettent de multiplier de l'ADN Limites (ne sont pas exigibles). Les techniques de séquençage et de clonage des gènes. 1. In vivo , par clonage de gène ► FIGURE 5. Produire un clone contenant un plasmide dans Nathan p. 78 et 79 fig. 2. Ici le plasmide initial est résistant à deux antibiotiques (A et B). L’ADN à cloner est inséré au sein du gène de résistance A qui devient inopérant. Après introduction de l’ADN recombinant à des bactéries sensibles à A et B. On sélectionne celles qui demeurent sensibles à B et non à A. Un plasmide à ADN recombinant est intégré à une bactérie. On associe à la séquence de clonage un gène de sélection (généralement un gène de résistance à un antibiotique ou à un herbicide) afin de sélectionner les bactéries transformées (résistantes). Les bactéries se reproduisant très vite (une génération toutes les 20 min) on obtient rapidement de multiples copies du gène inséré. 2. In vitro par PCR ► VOIR. Amplifier un gène par PCR dans Nathan p. 79 fig. 3. La polymérisation en chaîne ( = PCR = Polymérase Chain Réaction) permet d'amplifier (= multiplier) rapidement une séquence quelconque d'ADN. Dans un milieu de pH contrôlé sont placés, outre l'ADN à reproduire (= séquence d'intérêt), les quatre bases A, T, C et G (désoxynucléosides triphosphates), une ADN polymérase thermostable, des amorces (séquences monobrin de 15 à 30 nucléotides permettant d'encadrer la zone à dupliquer). On peut alors effectuer n cycles de quelques minutes (températures de 60 à 90 °C) permettant chacun de doubler la quantité d'ADN. D. On peut séquencer l'ADN ► VOIR. Des outils pour séquencer le génome dans Nathan p. 80 et 81. Le séquenceur automatique utilise le résultat d'une électrophorèse où : - chaque type de nucléotide est marqué par une substance fluorescente différente ; - les nucléotides sont dans le même ordre que dans l'ADN. Les différents fragments d'ADN provenant d'un même organisme peuvent ensuite être ordonnés en repérant les séquences de nucléotides qui se chevauchent. On peut ainsi retrouver la séquences de chromosomes entiers. ► VOIR. Séquençage du génome humain dans Nathan p. 98. Les premières versions " complètes " de séquençage du génome humain ont été publiées en 2001. E. Le génie génétique a permis de découvrir les gènes morcelés Accompagnement. On signale que les techniques du génie génétique ont permis de mettre en évidence le polymorphisme des gènes et de faire évoluer la notion de gène, mais ces notions ne peuvent pas faire l'objet d'une question au baccalauréat. ► FIGURE 6. Le gène morcelé de l’ovalbumine dans Bordas p. 130. Chez les procaryotes l'ARN messager est l'exacte réplication de l'ADN. Chez les eucaryotes, l'hybridation d'un ARNm avec le gène correspondant dénaturé (ADN simple brin) montre que l'ARN est beaucoup plus court que l'ADN (nombreuses boucles). RR - 16/04/17 - 840904185 - 4/8 Chez les eucaryotes, l'ARN messager mature est le produit de l'excision (élimination de séquences non codantes ou introns) d'un ARN prémessager et de l'épissage (soudure des séquences codantes restantes ou exons). Les gènes sont morcelés. ► FIGURE 7. L’épissage alternatif dans Bordas p. 131. Un gène unique peut générer plusieurs combinaisons d'exons différentes (= épissage alternatif) et donc gouverner la synthèse de plusieurs polypeptides différents. ► VOIR. Immunologie : segments variables des molécules d'anticorps dans cours de TS obligatoire (chapitre 7.3. § IA) Notre génome peut ainsi coder beaucoup plus de protéines qu'il ne possède de gènes. Pour trois raisons on ne peut pas dire qu'à un gène correspond une protéine : - une même protéine fonctionnelle est souvent formée de plusieurs chaînes polypeptidiques codées par des gènes différents (cas de l’insuline, des chaînes L et H d'une molécule d'immunoglobuline) ; - un même gène peut coder plusieurs séquences polypeptidiques (cas des segments variables des chaînes L et H d'une molécule d'immunoglobuline). - certains gènes codent seulement un ARN (ex. ARN ribosomal). Un gène est une association de segments d'ADN (le plus souvent), qui constituent ensemble une unité d'expression conduisant à la formation d'un ARN. Ces divers segments sont : - l'unité de transcription, pouvant coder un ou plusieurs ARN (épissage alternatif), segment continu codant le transcrit primaire qui se retrouvera dans l'ARN définitif (intron(s), séquences d'espacement, queue) ; - le promoteur de base responsable de l'initiation correcte de la transcription ; - la (les) séquence(s) régulatrice(s) responsables du contrôle de la transcription. Un gène n'est donc pas une unité structurale mais une unité fonctionnelle. ► TP 1. Enzymes de restriction et polymorphisme génique Si pas fait après I.A II. Les biotechnologies ont des applications en agronomie A. La transgénèse permet d'obtenir des OGM ► FIGURE 8. Les étapes de la fabrication d’un OGM dans Nathan p. 89. La transgénèse consiste à introduire, un gène d'intérêt (= transgène modifié ou étranger) dans un organisme pour lui faire acquérir des propriétés nouvelles. Après avoir été isolé, le gène d'intérêt, accompagné des séquences d'ADN nécessaires à son insertion et à son expression, est inoculé : - soit associé à un vecteur (= virus non pathogène ou bactérie comme Agrobactérium qui parasite naturellement la plante) ; - soit par transfert direct (action d'un agent chimique, d'un champ électrique (= électroporation) ou micro-injection de microparticules métalliques recouvertes d'ADN (= biolistique)) dans les cellules (protoplastes) de l'organisme cible. Le transfert simultané d'un gène de sélection permet d'isoler les cellules cibles effectivement transformées. VOIR. Multiplication in vitro dans cours de 1e S. RR - 16/04/17 - 840904185 - 5/8 Par multiplication in vitro les cellules cibles transformées reproduisent et expriment le gène d'intérêt et produisent des protéines recombinantes (codées par le gène d’intérêt). La transgénèse, réalisée au niveau cellulaire, se traduit alors au niveau de tout l'Organisme Génétiquement Modifié (OGM). Les virus (adénovirus à ADN ou, rétrovirus à ARN) sont des vecteurs particulièrement commodes. Ils possèdent tout l'équipement permettant d'identifier la cellule cible et d'y "injecter" leur ADN de façon à ce qu'il s'associe à celui de la cellule hôte. ► VOIR. Immunologie dans Cours de TS enseignement commun. La transgénèse peut être réalisée aussi bien chez les végétaux que chez les animaux. On parle de Plante Génétiquement Modifiée ou PGM pour qualifier un OGM végétal. B. La trangénèse végétale a de nombreuses applications Résistance à des herbicides, à des insectes ravageurs, à des maladies causées par des virus et des champignons, au gel, à la sécheresse. Modification de la teneur des organes consommables en vitamines, en oligoéléments, en acides gras ou en acides aminés. Diminution de la teneur en lignine (bois) des arbres utilisés pour produire la pâte à papier (c'est la cellulose qui est intéressante). Meilleure conservation des fruits et légumes par maturation retardée. Production de molécules thérapeutiques (insuline, interféron, hormone de croissance, facteur VIII de la coagulation), et de vaccins ("fruits vaccinants"). Etc. Au fond des objectifs qui ressemblent à ce que les agronomes cherchent à obtenir par l'hybridation depuis le XIXe siècle. Des bénéfices sont ainsi attendus dans la protection de l'environnement par la diminution des traitements chimiques, la réduction des pertes de production agricole, l'amélioration de la qualité nutritionnelle des aliments. ► TP 2. Les OGM en débat Pas de fichier ► VOIR. Le débat ouvert sur les OGM dans Nathan p. 90 et 91. ► VOIR. Textes récents sur la transgénèse C. Les OGM sont l'objet d'un débat La culture d'OGM suscite des interrogations concernant les risques pour l'environnement et la santé humaine. Les transgènes introduits dans les variétés cultivées risquent-ils de se transmettre à des plantes sauvages ? Les plantes transgéniques "insecticides" risquent-elles de favoriser la résistance aux toxines d'insectes nuisibles ? de détruire des insectes utiles ? Les produits consommés, dérivés d'OGM, peuvent-ils augmenter la fréquence des allergies alimentaires ? Deux groupes industriels (Novartis et Monsanto) sont en mesure d’avoir un monopole mondial sur des semences et des produits phytosanitaires utilisés sur la planète. RR - 16/04/17 - 840904185 - 6/8 Lors des premiers essais en laboratoire des gènes de résistance à des antibiotiques ont été transmis pour tester la transmission du transgène. Cette méthode n'a jamais été utilisée au champ du fait du risque de dissémination. III. Les biotechnologies ont des applications en génétique humaine A. On peut dépister et diagnostiquer une maladie génique On appelle maladie génique une maladie transmise des parents à l’enfant par l’intermédiaire des gènes portés par les gamètes. ► FIGURE 9. Exemples de maladies géniques dans Bordas p. 148 et 149. Mucoviscidose. Pourquoi dit-on que la maladie est récessive ? Déterminer la probabilité pour que l’individu III-3 soit malade. Chorée de H. Pourquoi dit-on que la maladie est dominante ? Déterminer la probabilité pour que l’individu IV-2 soit malade. Myopathie de D. Pourquoi dit-on que la maladie est récessive ? Une fille peut-elle être malade ? Avant leur naissance, quelle étaient les probabilités pour que IV-1, IV-2 et IV-3 soient malades ? Accompagnement. Pour cette étude, la localisation du gène sur les chromosomes et le mode de transmission (dominance ou récessivité) sont donnés. La plupart des maladies géniques sont autosomiques récessives (ex. mucoviscidose) car le gène impliqué est porté par un autosome et l’allèle responsable de la maladie ne s’exprime qu’à l’état homozygote. D'autres sont liées au sexe (myopathie de Duchenne) car le gène impliqué est porté par le chromosome X. Une seule (à ma connaissance) est autosomique dominante (chorée de Huntington). L’existence d’un malade dans la famille proche et/ou l'examen d'un arbre généalogique permet parfois d'évaluer un risque statistique de maladie génique chez un fœtus ou un individu. Ce risque statistique peut être confirmé de plusieurs manières. 1. Par comparaison d’ADN. Si la mutation fait apparaître ou disparaître un site de restriction, les fragments mutés et non mutés n'ont pas la même taille et ne migrent pas à la même vitesse lors d'une électrophorèse. 2. Par sondes radioactives. Après électrophorèse on dénature les fragments d'ADN isolés (on sépare les deux brins par action de la soude). On met alors en présence les fragments d'ADN simple brin avec une séquence radioactive complémentaire de la séquence cherchée. une autoradiographie permet de la repérer s’il y a hybridation (= renaturation). ► FIGURE 10. Diagnostic prénatal de la mucoviscidose dans Hatier p. 111 fig. 13. ► INTERPRETER la figure 10. XV2C sert à révéler. ► VOIR. Dépister une anomalie génique (Chorée de H.) dans Nathan p. 94 et 95. VOIR. Une autre méthode de dépistage (hétéroduplex) dans Bordas p. 151. Le diagnostic précoce des maladies géniques pose de nombreux problèmes éthiques car souvent il n'existe pas de traitement. D'une part les parents sont placés devant un choix difficile, d'autre part on peut craindre que des compagnies d'assurances ou des employeurs se servent ce type de résultats (= discrimination sociale). RR - 16/04/17 - 840904185 - 7/8 Le diagnostic préimplantatoire fait planer le spectre d'un enfant "zéro défaut" (tri d'embryons) mais permet à des couples à risques d'envisager sereinement une grossesse. ► FIGURE 11. Tests de médecine légale dans Nathan p. 103. La même technique (PCR + enzymes de restriction + électrophorèse + sondes radioactives) peut être utilisée pour déterminer l'empreinte génétique d'un individu. Dans ce cas : - on recherche des séquences d'ADN " non codant " (90 % de l'ADN génomique) qui sont répétitives et qui portent de nombreuses mutations ; - on utilise successivement un jeu d'enzymes de restriction et un jeu de sondes radioactives. La médecine légale parvient ainsi à distinguer deux individus à partir de quelques cellules seulement (grâce à la PCR) et en profitant du fait que l'ADN isolé se conserve très longtemps (plusieurs années au moins). B. On peut dépister et diagnostiquer une anomalie chromosomique comme la trisomie 21 Accompagnement. L'étude d'anomalies chromosomiques et de leur dépistage se limite au cas de la trisomie 21. Cet exemple, traité en enseignement commun, ne peut faire l'objet de questions spécifiques à l'enseignement de spécialité au baccalauréat. ► FIGURE 12. Diagnostic et dépistage d'une maladie chromosomique dans Nathan p. 92. ► FIGURE 13. Diagnostic et dépistage d'une maladie chromosomique dans Nathan p. 93. ► VOIR. Trisomie 21 dans cours TS enseignement commun. VOIR. Diagnostic de la trisomie 21 (caryotype) dans Belin p. 188, 189 et Bordas p. 152 et 153 (hybridation in situ). Le risque statistique de trisomie 21 augmente avec l'âge de la mère. À partir de 38 ans il n'est pas négligeable. Le risque est accru chez les femmes ayant déjà eu un enfant trisomique. Deux marqueurs sériques permettent de repérer une grossesse à risque (test systématique par arrêté ministériel du 23 janvier 1997). Un taux d'HCG (Human Chorionic Gonadotrophine) supérieur à la moyenne ou un taux d'AFP (alpha fœto-proteines) inférieur à la moyenne sont des signes d'alerte. L'échographie reste une technique efficace, mais tardive de diagnostic anténatal (clarté nucale). La trisomie 21 peut être ensuite diagnostiquée avec certitude par le caryotype quand le risque est supérieur à 1/250 (choriocentèse entre 10 et 11 semaines d'aménorrhée, amniocentèse entre 15 et 17 , cordocentèse à partir de la 20e). Les risques encourus lors du prélèvement de cellules fœtales et le coût de l’examen conduisent ne pratiquer un caryotype que lors d’un doute important. Dans la plupart des situations on observe 3 chromosomes 21. Dans de rares cas il n'y a que deux chromosomes 21 mais un des chromosomes 14 ou 10 est plus long que l'autre. Il s'agit, chez l'un des parents, du transfert d'un chromosome 21 sur le chromosome 14 (= translocation). C. La thérapie génique somatique permet de pallier la déficience d’un gène C’est la trangénèse appliquée à l’Homme. RR - 16/04/17 - 840904185 - 8/8 La thérapie génique germinale consisterait à injecter le gène-médicament dans un œuf ou une cellule souche d’un embryon malade. Ce gène serait alors présent dans toutes les cellules de l’organisme, y compris les cellules reproductrices. Il serait transmissible à la descendance. L’idée de sélectionner les « bons gènes » est refusée pour des raisons éthiques et interdite par la loi de Bioéthique de 1994 (avis du CCNE de décembre 1990). ► VOIR. Ethique et génétique dans Nathan p. 56. ► FIGURE 13. Introduire un allèle sain dans une cellule dans Nathan p. 97. Chez les autres animaux et les végétaux le transfert de gène à des cellules germinales est utilisé pour les OGM. La thérapie génique somatique consiste à introduire, grâce à un virus vecteur, le gène-médicament dans des cellules somatiques du malade (= cellules non reproductrices). Elle est autorisée car elle n’est pas transmissible à la descendance. Le premier succès de thérapie génique date de 2000. Deux enfants atteints de DICS (= déficit immunitaire combiné sévère) ont retrouvé une vie normale. Leurs défenses immunitaires sont restaurées. L’efficacité de la thérapie génique doit encore être prouvée car on manque de recul sur la stabilité de la guérison. Limites (ne sont pas exigibles). méthodes de thérapie génique. La connaissance des différents essais de BILAN Outre ses applications agronomiques et biomédicales le génie génétique est applicable aux animaux pour la production d’animaux d’élevage ou de modèles expérimentaux. Les biotechnologies ouvrent des perspectives car elles permettent l'obtention rapide de variétés animales ou végétales en fonction des besoins humains. Sur le plan thérapeutique elles permettent de diagnostiquer et d'envisager de soigner des maladies actuellement incurables. Elles posent cependant de nombreux problèmes éthiques généralement liés à leurs applications commerciales. Au cours du XXIe siècle des accords internationaux devront préciser la marge de manœuvre des scientifiques.
